尿酸氧化酶
阅读：78发布：2020-05-11
专利汇可以提供尿酸氧化酶专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且概括地说，本 发明 涉及尿酸 氧 化酶 (尿酸酶)蛋白和编码它们的核酸分子。具体地说，本发明涉及特别有用的尿酸酶蛋白，例如作为中间体而特别有用的尿酸酶蛋白；所述中间体用于制造改进的、修饰的、具免疫源性降低且增加 生物 利用度的尿酸酶蛋白。，下面是尿酸氧化酶专利的具体信息内容。
1.重组尿酸酶嵌合蛋白，其由304个氨基酸构成，所述304个氨基酸的前225个氨基酸N端部分是猪尿酸酶的第1-225号氨基酸，且所述304个氨基酸的其余79个氨基酸是狒狒尿酸酶的第226-304号氨基酸。
2.重组尿酸酶嵌合蛋白，其由304个氨基酸构成，所述304个氨基酸的前288个氨基酸N端部分是猪尿酸酶的第1-288号氨基酸，且所述304个氨基酸的其余16个氨基酸是狒狒尿酸酶的第289-304号氨基酸。
3.重组尿酸酶嵌合蛋白，其选自SEQ ID NO：2和4。
4.分离且纯化的核酸分子，其编码权利要求1的重组尿酸酶嵌合蛋白。
5.分离且纯化的核酸分子，其编码权利要求2的重组尿酸酶嵌合蛋白。
6.分离且纯化的核酸分子，其编码权利要求3的重组尿酸酶嵌合蛋白。
7.权利要求6的分离且纯化的核酸分子，其由SEQ ID NO：1的碱基序列构成。
8.权利要求6的分离且纯化的核酸分子，其由SEQ ID NO：3的碱基序列构成。
9.载体，其包含权利要求6的核酸分子。
10.宿主细胞，其包含权利要求9的载体。
11.SEQ ID NO：2的尿酸酶和聚乙二醇的缀合物，其中SEQ ID NO：2已被修饰成插入1个赖氨酸残基，其中所述缀合物保留未经缀合的SEQ ID NO：2的酶的至少约60％的尿酸分解活性。
尿酸氧化酶
[0002] 本申请要求1998年8月6日提交的、美国临时申请第60/095,489号的权利，通过引用将该申请的全部内容结合到本文中。
[0003] 用由国立卫生研究院给予的、拨款号为DK48529的美国政府资助，创造了在此公开的本发明，在本发明中，美国政府有某些权利。
[0004] 概括地说，本发明涉及尿酸氧化酶(尿酸酶)蛋白和编码它们的核酸分子。具体地说，本发明涉及例如作为中间体而特别有用的尿酸酶蛋白，所述中间体用于制造免疫源性降低及生物利用度增加的、改进的、修饰的尿酸酶。本发明优选的、修饰的尿酸酶包括共价结合聚乙二醇或聚环氧乙烷的尿酸酶蛋白。因此，本发明提供尿酸酶蛋白、与这些蛋白特异性结合的抗体、编码所述尿酸酶蛋白的核酸分子及其有用片段、包含所述核酸分子的载体、含有所述载体的宿主细胞以及使用和制造所述尿酸酶蛋白与核酸分子的方法。
[0005] 背景
[0006] 在年龄超过40岁的男人中，痛风是最普通的炎性关节疾病(Roubenoff 1990)。当提高的血液尿酸水平(高尿酸血症)导致在关节中发作形成尿酸单钠一水合物的微晶体时，就发生痛苦的痛风性关节炎。在时间方面，慢性高尿酸血症也能在关节周围、在软组织中以及在某些器官里产生破坏性的结晶尿酸沉积物(痛风石)(Hershfield 1996)。尿酸在尿中的溶解度有限，且如果过量排泄(高尿酸尿)，尿酸可引起肾结石(尿酸结石)。在患有某些恶性肿瘤、特别是白血病和淋巴瘤的患者中，显著的高尿酸血症和高尿酸尿(由于在化疗期间增强的肿瘤细胞转换(turnover)和分解)造成急性阻塞性肾衰竭严重的危险(Sandberg等，1956；Gold和Fritz1957；Cohen等，1980；Jones等，1990)。严重的高尿酸血症和痛风与出于不同起因的肾功能障碍有关，包括为了防止器官同种移植排斥的环孢菌素治疗(West等，1987；Venkataseshan等，1990；Ahn等，1992；Delaney等，1992；George和Mandell 1995)。
[0007] 高尿酸血症既可由尿酸生产过多而产生，又可由尿酸分泌不足而产生(Hershfield和Seegmiller 1976；Kelley等，1989；Becker和Roessler 1995)。如果高尿酸血症是轻度的，则可以用饮食控制它；但当宣告了高尿酸血症且其与严重的临床后果相关时，则需要用药物治疗它；或者用促进尿酸排泄的促尿酸尿剂(如果肾功能降低则无效)，或者用阻断尿酸盐形成的黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌呤醇治疗。在患有痛风石性痛风、肾功能不全、白血病和某些遗传病的患者患者方面，别嘌呤醇是主要的治疗依靠药物。对高尿酸血症的治疗一般是有效且耐受性良好；然而，对于所有的常规疗法，某些患有毁损外形、使人残废的痛风石痛风的患者是难治的(Becker1988；Fam 1990；Rosenthal和Ryan1995)。此外，用别嘌呤醇治疗的～2％的患者产生过敏性反应，并且在～0.4％的患者中出现严重的超敏反应综合征(Singer和Wallace 1986；Arellano和Sacristan 1993)。这种常常威胁生命的综合征可引起急性肾衰竭和肝衰竭、以及严重的皮肤损伤(毒性表皮坏死松解、剥脱性皮炎、多形红斑、斯蒂文斯-约翰逊(Stevens-Johnson)综合征)。而且，别嘌呤醇干扰用于治疗白血病的药物和用于防止器官同种移植排斥的药物硫唑嘌呤和6-巯基嘌呤的代谢，在上述病症中产生显著高尿酸血症并且可能引起严重的痛风或威胁肾功能。
[0008] 根本地，高尿酸血症是在进化过程中尿酸氧化酶(尿酸酶)的人基因突变失活的结果(Wu等，1989；Wu等，1992)。在非人类灵长目动物和其它哺乳动物的肝过氧化物酶体中的活性尿酸酶将尿酸盐转变为尿囊素(+CO2和H2O2)；尿囊素的可溶性超过尿酸可溶性的80-100倍；并且由肾更有效地处理。在法国和意大利，已用从黄曲霉(Aspergillus flavus)制备的非肠道尿酸酶(Uricozyme ，Clin-Mily，巴黎)治疗与白血病化疗有关的严重高尿酸血症达20年以上(London和Hudson 1957；Kissel等，1968；Brogard等，1972；Kissel等，1972；Potaux 等，1975；Zittoun等，1976；Brogard等，1978；Masera 等，1982)；
并且在美国，已在近来的临床试验中将所述尿酸酶运用于白血病患者(Pui等，1997)。尿酸酶比别嘌呤醇具有更快的作用开始(Masera等，1982；Pui等，1997)。在痛风患者方面，尿酸酶输注可以阻断急性发作并减小痛风石的体积(Kissel等，1968；Potaux等，1975；Brogard等，1978)。
并且在美国，已在近来的临床试验中将所述尿酸酶运用于白血病患者(Pui等，1997)。尿酸酶比别嘌呤醇具有更快的作用开始(Masera等，1982；Pui等，1997)。在痛风患者方面，尿酸酶输注可以阻断急性发作并减小痛风石的体积(Kissel等，1968；Potaux等，1975；Brogard等，1978)。
[0009] 虽然黄曲霉尿酸酶对在短暂的化疗过程期间治疗急性高尿酸血症有效，但对于治疗复发性痛风或痛风石性痛风，每日输注黄曲霉尿酸酶会是须认真对待的缺点。另外，在产生抗尿酸酶抗体的患者体内，黄曲霉尿酸酶的功效迅速减小(Kissel等，1968；Brogard等，1978；Escudier等，1984；Mourad等，1984；Sibony等，1984)；已发生了包括过敏性反应的严重变应性反应(Donadio等，1981；Montagnac和Schillinger 1990；Pui等，1997)。对于长期治疗，显然需要较长效的、免疫源性较低的尿酸酶制剂。
[0010] 用于使外源酶与蛋白酶以及免疫系统分离的一种方法包含：将惰性且无毒的聚合物单甲氧基聚乙二醇(PEG)共价连接到蛋白的表面上(Harris和Zalipsky 1997)。首先显示出在动物中使用Mr～1,000至大于10,000的不同PEG，延长了几种外来蛋白的循环寿命，并减少了这几种外来蛋白的免疫源性(Abuchowski等，1977a；Abuchowski等，1977b；Davis等，1981a；Abuchowski等，1984；Davis等，1991)。为了治疗因ADA缺陷引起的重症联合免疫缺陷病(Hershfield等，1987)，在1990年，用Mr 5000的PEG修饰的牛腺苷脱氨酶(ADA)(PEG-ADA，ADAGEN ，由Enzon，Inc.制造)成为第一种经美国食品及药品管理局批准的PEG基团化的(PEGylated)蛋白。在过去12年期间的经验已显示：在用PEG-ADA长期治疗期间，于大多数患者中，通过灵敏的ELISA，可检测到抗ADA的抗体；但没有了变应性反应或超敏反应；在少数产生抗ADA抗体的患者体中，出现了加速清除PEG-ADA，但这常常是短暂的效应(Chaffee等，1992；Hershfield 1997)。应该意识到：患有ADA缺陷的患者的免疫功能在用PEG-ADA治疗期间通常不变得正常(Hershfield 1995；Hershfield和Mitchell 1995)。因而，发展用于长期治疗具有正常免疫功能的患者的PEG基团化酶方面，免疫源性可能是一个更重要的问题。
[0011] 本领域技术人员会理解，免疫源性与通过注射抗原制剂(例如PEG修饰的蛋白或未修饰的蛋白)诱导免疫应答有关；而抗原性指的是抗原和先前存在的抗体的反应。总起来说，把抗原性和免疫源性称为免疫反应性。在先前的PEG-尿酸酶研究中，用各种各样的方法评价了免疫反应性；所述方法包括：体外PEG-尿酸酶和使用的抗体的反应，测定诱导的抗体合成，以及在重复注射后的加速清除率。
[0012] 已表明PEG基团化在动物中减少真菌和猪的尿酸酶的免疫源性，并延长这两种尿酸酶的循环寿命(Chen等，1981；Savoca等，1984；Tsuji等，1985；Veronese等，1997)。在5个血尿酸正常的志愿人员中，PEG修饰的念珠菌属(Candida)尿酸酶迅速将血清尿酸降低到不可探测的水平(Davis等，1981b)。使用由Enzon，Inc.生产的PEG基团化的节杆菌属(Arthrobacter)尿酸酶，在同情的基础上治疗一位对别嘌呤醇过敏的患有淋巴瘤的患者，该患者表现出肾衰竭和显著的高尿酸血症(Chua等，1988；Greenberg和Hershfield
1989)。在大约两周期间给予四次肌内注射，在这短暂的期间，控制了高尿酸血症，且通过ELISA在该患者的血浆中没能检测到抗尿酸酶的抗体。没继续进行该制剂的进一步应用和临床发展。
1989)。在大约两周期间给予四次肌内注射，在这短暂的期间，控制了高尿酸血症，且通过ELISA在该患者的血浆中没能检测到抗尿酸酶的抗体。没继续进行该制剂的进一步应用和临床发展。
[0013] 到此为止，还没有开发出具有适当长的循环寿命和为了在长期治疗中安全及可靠的使用而充分减少了免疫源性的尿酸酶类型或PEG-尿酸酶类型。本发明的目的是提供一种改进的尿酸酶类型，这种改进的尿酸酶类型与PEG基团结合能满足这些要求。本发明是唯一的起源于哺乳动物的重组尿酸酶，通过以一种方式突变已修饰了该尿酸酶；所述方式即已被证明增强PEG基团化遮蔽潜在免疫源性表位的能力。
[0014] 发明概述
[0015] 本发明总的目的是提供新的尿酸酶蛋白和编码它们的核酸序列。
[0016] 本发明的另一目的是提供纯化重组产生的尿酸酶蛋白的方法，例如在本文中描述的那些。
[0017] 本发明的再一个目的是提供一种方法；即通过给予哺乳动物包含本发明的尿酸酶蛋白的组合物，从而减少哺乳动物体液中尿酸量的方法。
[0018] 本发明的又一个目的是提供针对本文描述的尿酸酶蛋白的抗体。
[0019] 本发明的另一目的是提供包含本文描述的核酸序列的载体和宿主细胞，并提供运用它们产生由所述核酸序列编码的所述尿酸酶蛋白的方法。
[0020] 本发明提供尿酸酶蛋白，可用所述尿酸酶蛋白生产基本上无免疫源性的PEG-尿酸酶；该PEG-尿酸酶保留未修饰尿酸酶的全部或几乎全部的尿酸分解活性。在本文以每毫克蛋白的国际单位(IU)表示尿酸分解活性，其中，把尿酸分解活性的一个国际单位定义为每分钟消耗一个毫摩尔尿酸的酶量。
[0021] 本发明提供已修饰的插入一个或更多个赖氨酸残基的、哺乳动物种的重组尿酸酶蛋白。当用于本文时，重组蛋白指的是任一人工制造的蛋白，并且不同于天然产生的蛋白(即在仅仅具有特定的关注蛋白的天然基因之动物的组织中产生的蛋白)。蛋白包括肽和氨基酸序列。本发明的重组尿酸酶蛋白可以是两种或多种哺乳动物蛋白、肽或氨基酸序列的嵌合体或杂种。在一个实施方案中，可用本发明制造一种哺乳动物种的重组尿酸酶蛋白，该蛋白已被修饰，以将赖氨酸数目增加至这样一种程度，使得在该重组尿酸酶蛋白的PEG基团化后，PEG基团化尿酸酶产物基本上有和未修饰的尿酸酶一样的酶活性，并且该PEG基团化尿酸酶产物的免疫源性不是不可接受的。也设想了其中尿酸酶的氨基和/或羧基末端可能不存在的本发明尿酸酶的截短形式。最好是，不截短该尿酸酶到除去赖氨酸的程度。
[0022] 普通技术人员将懂得缀合的尿酸酶-载体复合物不必包含如此多的键以致大大地减少所述尿酸酶的酶活性、或者几乎没什么键以致保持不可接受的免疫源性。最好是，与未修饰的尿酸酶蛋白相比，在缀合物更稳定的同时，该缀合物能保留未修饰尿酸酶蛋白的至少约70％至约90％的尿酸分解活性，以致它在哺乳动物血浆和/或血清中贮藏时，于生理温度下保持其酶活性。保留至少约80％至约85％的尿酸分解活性倒是可接受的。此外，在一个优选的实施方案中，所述缀合物提供比未修饰尿酸酶蛋白大大减少的免疫源性和/或免疫反应性。在一个实施方案中，本发明提供本文描述的尿酸酶蛋白，所述尿酸酶蛋白可通过将一无毒且无免疫源性的药学上可接受的载体例如PEG经共价键连接到至少一个包含于尿酸酶蛋白中的赖氨酸上而被修饰。可选择地，通过将尿酸酶蛋白经由其氨基酸序列的、少于约10个的赖氨酸共价连接到一载体上，修饰该尿酸酶蛋白。设想了连接到2、3、4、5、6、7、8或9个赖氨酸的任一类为作可选择实施方案。
[0023] 本发明的尿酸酶蛋白是包括猪和狒狒肝尿酸酶蛋白的多个区段的重组分子。而且提供了一种修饰的狒狒序列。在一个实施方案中，本发明提供一种嵌合的猪-狒狒尿酸酶(PBC尿酸酶(SEQ ID NO：2))，所述嵌合的猪-狒狒尿酸酶包括猪尿酸酶(SEQ ID NO：7)的第1-225号氨基酸(aa)和狒狒尿酸酶(SEQ ID NO：6)的第226-304号氨基酸(也参见在图5中的序列)。在另一个实施方案中，本发明提供一种嵌合的猪-狒狒尿酸酶(PKS尿酸酶)，所述嵌合的猪-狒狒尿酸酶包括猪尿酸酶的第1-288号氨基酸和狒狒尿酸酶的第289-304号氨基酸(SEQ ID NO：4)。也仔细考虑了PBC和PKS的截短的衍生物。优选的截短形式是截短缺失掉6个氨基末端氨基酸或3个羧基末端氨基酸、或者其两者的PBC和PKS；在SEQ ID NO：8(截短氨基端的PBC)、9(截短羧基端的PBC)、10(截短氨基端的PKS)和11(截短羧基端的PKS)中给出了代表性的序列。PBC尿酸酶、PKS尿酸酶以及它们的截短形式中每一种，具有比在已克隆的其它哺乳动物尿酸酶中发现的赖氨酸多一至四个的赖氨酸。
[0024] 本发明提供核酸(DNA和RNA)分子(序列)，包括分离形式、纯化形式和/或克隆形式的核酸分子，它们编码本文描述的尿酸酶蛋白和截短的蛋白。在SEQ ID NO：1(PBC尿酸酶)和SEQ ID NO：3(PKS尿酸酶)显示了优选的实施方案。
[0025] (表达和克隆)载体包括同样由本发明提供的这些核酸分子。
[0026] 此外，本发明提供含有这些载体的宿主细胞。
[0027] 也提供特异性地结合到本发明尿酸酶的抗体。在检测PBC或其它类似的嵌合蛋白方面，如果联合使用针对猪尿酸酶氨基端部分的抗体和针对狒狒尿酸酶羧基端部分的抗体，则应该是有用的。优选地是，针对嵌合尿酸酶氨基端部分的抗体将不识别狒狒尿酸酶氨基端部分，并且类似地，针对嵌合尿酸酶羧基端部分的抗体将不识别猪尿酸酶羧基端部分。更优选的是，提供特异性地结合PBC或PKS、但不结合天然蛋白的抗体，所述天然蛋白例如猪尿酸酶和/或狒狒尿酸酶。
[0028] 在另一个实施方案中，可用本发明制备用于减少例如尿和/或血清或血浆的体液中尿酸量的药用组合物；所述组合物至少包含一种本文描述的尿酸酶蛋白或尿酸酶缀合物以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
[0029] 在用于减少哺乳动物体液中的尿酸量的方法方面，也可以使用本发明。该方法包括将降低尿酸有效量的组合物给予哺乳动物；该组合物包含本发明尿酸酶蛋白或尿酸酶缀合物以及载体、稀释剂或赋形剂，所述载体、稀释剂或赋形剂最好是药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。待治疗的哺乳动物最好是人。
[0030] 所述给予步骤例如可以是通过静脉内、皮内、皮下、肌内或腹膜内途径的注射。升高的尿酸水平可以存在于血或尿中，并可与痛风、痛风石、肾功能不全、器官移植或恶性疾病有关。
[0031] 在另一个实施方案中，本发明提供用于从尿酸酶溶液中分离和或纯化尿酸酶的方法，所述尿酸酶溶液包含来自例如一重组生产过程的、例如细胞和亚细胞的碎片。最好是，该纯化方法利用哺乳动物尿酸酶在低pH下的有限溶解性(Conley等，1979)；在大约pH 7至大约pH 8.5时，通过洗涤粗制重组体的提取物，除去大多数在这低pH范围中溶解的蛋白；此后在缓冲液中溶解有活性的尿酸酶，优选碳酸钠缓冲液，在大约pH10-11的范围，优选约pH 10.2。然后可以将溶解的活性尿酸酶上阴离子交换柱，所述柱例如Q琼脂糖凝胶柱；用在大约pH 8.5的缓冲液中的、从低到高的盐梯度洗涤该柱，在这之后，通过用溶于大约pH 10至pH 11的且优选大约pH 10.2的碳酸钠缓冲液中的氯化钠梯度进行洗脱，获得纯化的尿酸酶。在约pH 10至大约pH 11下，通过凝胶过滤层析，可以进一步纯化该酶。在该阶段，通过降低pH至大约8.5或更低，从而选择性地沉淀尿酸酶而不沉淀溶解性更强的污染物，可进一步地纯化该酶。接着，在低pH(7-8)洗涤后，在大约pH 10.2下溶解该尿酸酶。然后，可用药物制剂技术领域已知的方法分析所述的尿酸酶制剂，所述方法例如高效液相层析(HPLC)、其它层析方法、光散射、离心和/或凝胶电泳中的任何一种。
[0033] 图1：SDS-巯基乙醇聚丙烯酰胺凝胶电泳(12％的凝胶)分析。
[0034] 图2：天然尿酸酶和PEG基团化的PBC尿酸酶的循环寿命。
[0035] 图3：血清尿酸酶活性与血清和尿的尿酸浓度的关系。
[0036] 图4：在屡次注射后，运行的尿酸酶活性水平(用血清测定的)的保持。
[0037] 图5显示猪-狒狒嵌合尿酸酶(PBC尿酸酶)的推断的氨基酸序列(SEQID NO：2)和包含突变R291K与突变T301S的猪尿酸酶(PKS尿酸酶)的推断的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)，且将它们与猪(SEQ ID NO：7)和狒狒(SEQID NO：6)的序列相比较。
[0038] 图6：PKS(SEQ ID NO：4)和猪尿酸酶(SEQ ID NO：7)氨基酸序列的比较。
[0039] 图7：PBC(SEQ ID NO：2)和PKS(SEQ ID NO：4)氨基酸序列的比较。
[0040] 图8：PBC(SEQ ID NO：2)和猪尿酸酶(SEQ ID NO：7)氨基酸序列的比较。
[0041] 图9：猪尿酸酶(SEQ ID NO：7)和D3H(SEQ ID NO：5)氨基酸序列的比较。
[0042] 图10：PBC(SEQ ID NO：2)和D3H(SEQ ID NO：2)氨基酸序列的比较。
[0044] 图12-1和12-2：PKS cDNA编码序列(SEQ ID NO：3)和狒狒尿酸酶cDNA编码序列(SEQ ID NO：13)的Bestfit(GCG软件)比较。
[0045] 图13-1和13-2：PBC cDNA编码序列(SEQ ID NO：1)和猪尿酸酶cDNA编码序列(SEQ ID NO：12)的Bestfit(GCG软件)比较。
[0046] 图14-1和14-2：PBC cDNA编码序列(SEQ ID NO：1)和狒狒尿酸酶cDNA编码序列(SEQ ID NO：13)的Bestfit(GCG软件)比较。
[0047] 发明详述
[0048] 本发明提供尿酸酶蛋白，对于水溶性聚合物与尿酸酶的改进的尿酸酶缀合物，所述尿酸酶蛋白是有用的中间体；所述聚合物优选聚乙二醇或聚环氧乙烷。当用于本文时，如果不另外指出，则尿酸酶包括单独的亚基以及天然的四聚体。
[0049] 虽然人们没获得有活性的酶，但已从人肝脏RNA扩增了尿酸酶mRNA转录物(Wu等，1992)。理论上，翻译某些显示人尿酸酶转录物是可能的，即使肽产物不是全长的产物或者是不稳定的；所述肽产物可以被呈递抗原细胞加工，并且在测定对用于治疗的外源尿酸酶的免疫学反应方面，它们能起作用。在理论上，通过消除两个已知的无义突变而重构建和表达人尿酸酶cDNA是可能的。然而，自从引入第一个无义突变以来，在缺乏选择压力的情况下，很可能地有害的错义突变在数百万年间已积聚在人类的基因中(Wu等，1989；Wu等，1992)。识别并“改正”所有的突变从而获得最大的催化活性和蛋白稳定性会是非常困难的。
[0050] 本发明人已意识到：在推断的人尿酸酶氨基酸序列与推断的猪尿酸酶氨基酸序列之间(86％)、以及在推断的人尿酸酶氨基酸序列与推断的狒狒尿酸酶氨基酸序列之间(92％)，有着高度的同源性(相似性)(参见例如图6至图14的相似性的测定)；而人尿酸酶与黄曲霉尿酸酶之间的同源性(相似性)小于40％(Lee等，1988；Reddy等，1988；Wu等，1989；Legoux等，1992；Wu等，1992)。本发明提供重组产生的、来自两种不同哺乳动物的嵌合尿酸酶蛋白；与关系更远的真菌酶或细菌酶相比，所述嵌合尿酸酶蛋白被设计得对人存在较少的免疫反应性。预期哺乳动物尿酸酶衍生物的使用对于患者和其医生是更可以接受的。
[0051] 经验表明：活化的各种PEG，例如已用来制造PEG-ADA和用来修饰其它蛋白的活化的各种PEG，经由氨基末端残基的伯氨基(当存在且未被封闭时)和赖氨酸的ε-氨基与蛋白连接。这种策略是有用的，既因为可以用温和的反应条件，又因为带正电的赖氨酸趋向于定位在蛋白的表面上。上述的后者是重要的，因为对于任一治疗蛋白而言，PEG基团化的所需效应将部分依赖于PEG聚合物的特性(例如质量、分支结构或未分支结构等等)以及与表位和结构元件有关的蛋白的PEG连接位点的数目和分布；所述表位和结构元件决定该蛋白的功能与清除。已想出了一种策略，即通过半选择性地引进新的、适合于可能的PEG添加的赖氨酸残基，来增强PEG基团化“遮蔽”表位并降低免疫源性的能力(Hershfield等，1991)。这种策略使用诱变，用赖氨酸密码子取代选定的精氨酸的密码子；这种取代保持带正电，并且对表面可能性和抗原性的计算机预测指标具有最小影响(仅仅在已知氨基酸序列时有用)。
[0052] 作为这种策略的一个实验性试验，使用了重组的大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶(EPNP)(Hershfield等，1991)。在3个位点引入从精氨酸到赖氨酸的取代，将每个亚基的赖氨酸数从14增加到17，而不改变催化活性。在用过量的二琥珀酰-PEG5000修饰了～70％可及NH2基团后，纯化的三重突变体保留了全部活性。
[0053] 在PEG基团化前与后的反应性氨基的滴定暗示：该三重突变体比野生型酶可以每个亚基多接受一条PEG链。在小鼠中，PEG基团化既增长野生型EPNP酶的循环寿命，又增长突变型EPNP酶的循环寿命，从～4小时增加到大于6天。在以每周/每两周的间隔进行了一系列腹膜内注射后，不但用未修饰的EPNP处理的所有小鼠，而且用PEG基团化的野生型EPNP注射的16只小鼠中的10只小鼠(60％)，都产生了高水平的抗EPNP抗体，且使所述酶的循环寿命显现出显著的下降。比较起来，在用突变的PEG-EPNP处理的12只小鼠中，仅有2只小鼠(17％)产生快速清除；在这些小鼠中的低水平的抗体与该酶的循环寿命无关。因而在大量地降低免疫源性方面，这种策略是成功的；虽然在用活化的PEG处理后，仅仅修饰了3个新赖氨酸中的一个。
[0054] 所述狒狒的尿酸酶亚基和猪的尿酸酶亚基各包括304号氨基酸，其中29个(即在大约10个残基中有一个)是赖氨酸。最初尝试将两个从精氨酸到赖氨酸的取代引进到克隆的狒狒尿酸酶cDNA中，并在位置208对谷氨酸密码子同样地进行赖氨酸的取代；已知在人尿酸酶基因中位置208为赖氨酸，这种尝试导致表达出一种突变的狒狒蛋白，该蛋白的尿酸酶催化活性大大降低。从这实验中显而易见的是：在哺乳动物DNA序列的精氨酸突变为赖氨酸后，保持尿酸酶酶活性的能力是不可预言的。
[0055] 随后知道了狒狒尿酸酶中的第291号氨基酸残基为赖氨酸，而猪中的相应残基是精氨酸。利用存在于两种cDNA中的ApaI限制性内切酶位点构建一种嵌合尿酸酶，在该嵌合尿酸酶中，前225个氨基酸起源自猪cDNA，而羧基末端的79个起源自狒狒cDNA。所产生的猪-狒狒嵌合(PBC)尿酸酶(SEQ ID NO：2)具有30个赖氨酸，比任一“亲代”酶还多一个赖氨酸。PBC尿酸酶另外的一个特征是：其“狒狒”部分在79个氨基酸残基中的4个不同于人尿酸酶；而在同一区域中，猪尿酸酶与人尿酸酶在10个氨基酸残基上不一致。随后构建了一种修饰形式的PBC，该修饰形式保留了在第291号位置的外加赖氨酸，并且在其它方面仅仅由于在第301个残基上丝氨酸对苏氨酸的取代而不同于猪尿酸酶(“猪KS”尿酸酶(SEQ ID NO：4))。由于在前段描述的结果中，赖氨酸的几种其它插入对活性是有害的；因而想不到是，当与未突变的天然猪尿酸酶相比时，PBC和PKS嵌合尿酸酶是完全同样有活性的，并且所述嵌合尿酸酶比未突变的天然狒狒尿酸酶的活性高大约四倍。
[0056] 本发明提供一种重组的猪-狒狒嵌合尿酸酶，该酶由部分猪的肝尿酸酶序列和部分狒狒肝尿酸酶序列组成。这样的嵌合尿酸酶的一个实例包含来自猪尿酸酶序列(SEQ ID NO：7)的前225个氨基酸和来自狒狒尿酸酶序列(SEQ ID NO：6)的最后79个氨基酸(猪-狒狒尿酸酶，或PBC尿酸酶；图6和SEQ ID NO：2)。这样的嵌合尿酸酶的另一个实例包含来自猪序列(SEQ ID NO：7)的前288个氨基酸和来自狒狒序列(SEQ ID NO：6)的最后16个氨基酸。因为所述的后一序列仅仅在两个位置不同于所述猪序列，即在第291号残基上有赖氨酸(K)代替精氨酸且在第301号残基上有丝氨酸(S)代替苏氨酸，所以把这种突变体称为猪-K-S或PKS尿酸酶。
[0057] 也提供包含编码本发明蛋白的核酸分子的(表达和克隆)载体。优选的载体包括本文举例说明的那些载体。普通技术人员将意识到：可以以合适的方向和适合于表达的正确读框，将核酸分子插入到例如质粒的表达载体中。如有必要，可以将所述核酸(DNA)连接到所需宿主识别的合适的转录和翻译的调节核苷酸序列上；尽管这样的控制元件通常可用于本技术领域运用且已知的表达载体中。然后，通过标准的技术，可将该载体引入到宿主细胞中。通常，不是全部的宿主细胞都将被载体转化。因此，挑选转化的宿主细胞可能是必需的。本技术领域已知的一种这样的选择方法涉及：将具有一些必需控制元件的、编码一选择标记特征(例如抗生素抗性)的DNA序列掺入到表达载体中。可选择地，这样的选择特征的基因可以在另一个用来共转化所需宿主细胞的载体中。所述载体也可以包含一适当的启动子，例如一种能够在以此转化的细菌宿主细胞例如大肠杆菌中表达(转录和翻译)DNA的原核启动子。许多表达系统在本技术领域中是可用的，且是已知的；它们包括细菌(例如大肠杆菌和枯草杆菌)、酵母(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、丝状真菌(例如曲霉属(Aspergillus))、植物细胞、动物细胞和昆虫细胞。
[0058] 合适的载体可包含诸如ColE1 ori之类的原核复制子，用于在例如一种原核生物中增殖。典型的原核载体质粒是从Biorad Laboratories(Richmond CA)可得到的pUC18、pUC19、pUC322和pBR329以及从Pharmacia(Piscataway，NJ)可得到的pTcr99A和pKK223-3。一种典型的哺乳动物细胞载体质粒是可从Pharmacia(Piscataway，NJ)得到的pSVL。这载体使用SV40的晚期启动子驱动克隆基因的表达，在产生T抗原的细胞例如COS-1细胞中，发现最高水平的表达。一种诱导型哺乳动物表达载体的实例是pMSG，同样可得自Pharmacia。这种载体使用小鼠乳腺瘤病毒长末端重复序列的糖皮质激素诱导型启动子来驱动克隆基因的表达。有用的酵母质粒载体是pSR403-406和pSR413-416，且通常是可以从Stratagene Cloning Systems(LaJolla，CA)得到的。质粒pSR403、pSR404、pSR405和pSR406为酵母整合型质粒(Yip)，且掺入了酵母选择标记HIS3、TRP1、LEU2和URA3。质粒pSR413-416是酵母着丝粒质粒(Ycp)。
[0059] 此外，本发明提供包含这些载体的宿主细胞。优选的宿主细胞包括本文举例说明和描述的那些细胞。
[0060] 可以经由一生物学稳定的、无毒的共价键，将本发明的尿酸酶蛋白与数量相对少的PEG链结合，来改进所述蛋白的生物学半衰期和溶解性，并减少其免疫源性。这样的键可包括氨基甲酸乙酯(氨基甲酸酯)键、仲胺键和酰胺键。适合于这样结合的各种各样的活化PEG可从ShearwaterPolymers，Huntsville，AL购买得到的。
[0061] 同样可以用本发明制备作为缀合物的尿酸酶蛋白的药用组合物。这些缀合物基本上无免疫源性，并至少保留未修饰酶尿酸分解活性的70％，优选80％且更优选至少大约90％或更多。适合于用于本发明的水溶性聚合物包括直链和分支的聚乙二醇或聚环氧乙烷，通常将它们全部称为PEG。分支PEG的一个实例是美国专利5,643,575的主题。
[0062] 在本发明的一个实施方案中，每个尿酸酶亚基中插入的赖氨酸的平均数在1和10之间。在一个优选的实施方案中，每个尿酸酶亚基中附加的赖氨酸数在2和8之间。正在了解的是：附加的赖氨酸数不应该如此之多以致成为对尿酸酶催化活性的一种损害。优选通过尿酸酶蛋白的赖氨酸，连接这种缀合物的PEG分子；更优选通过已引入到所设计蛋白的一部分中的一个或多个非天然赖氨酸，连接这种结合的PEG分子；天然情况下，所述的一部分在所述引入位置不含有赖氨酸。
[0063] 本发明提供在尿酸酶蛋白上增加可用的、无害的PEG连接位点的方法，其中，以这样一种方式将天然尿酸酶蛋白突变，使得在天然尿酸酶蛋白中至少引入一个赖氨酸残基；最好是，该方法包括用赖氨酸取代精氨酸。
[0064] 对于降低最好是人的哺乳动物的血和/或尿中尿酸水平(即减少尿酸的量)，利用本发明的PEG-尿酸酶缀合物是有效的；因而，可以使用所述的PEG-尿酸酶缀合物对与疾病有关的升高的尿酸水平进行治疗，所述疾病包括痛风、痛风石、肾功能不全、器官移植和恶性疾病。
[0065] 可以通过许多途径中的任一种将PEG-尿酸酶缀合物引入到具有过高尿酸水平的哺乳动物中，所述途径包括口服、用灌肠剂或栓剂、静脉内、皮下、皮内、肌内和腹膜内的途径。Patton，JS，等，(1992)Adv.DrugDelivery Rev 8：179-228。
[0066] PEG-尿酸酶的有效剂量将取决于个体的尿酸水平和身材。在本发明这方面的一个实施方案中，按照变动范围从10μg到大约1g的剂量，给予药学可接受的赋形剂或稀释剂中的PEG-尿酸酶。在一个优选的实施方案中，给药量大约在100μg和500mg之间。更优选地，以在1mg和100mg之间的剂量，例如5mg、20mg或50mg，给予所述缀合尿酸酶。对于所述实施方案的剂量而表示出的质量，指的是该缀合物中的蛋白量。
[0067] 用常规技术可制备包含PEG-尿酸酶的药物制剂，所述常规技术例如在Remington的Pharmaceutical Sciences，(1985)Easton，PA：MackPublishing Co.中描述的技术。用于制备注射溶液的合适赋形剂包括：例如磷酸缓冲盐溶液、含乳酸的林格氏(Ringer’s)溶液、水、多元醇和甘油。用于非肠道注射的药用组合物包括：药学上可接受的无菌水性或非水液体、分散体、悬浮液、或乳液，以及用于恰好在使用前重新组成为无菌注射溶液或分散体的无菌粉剂。这些制剂可包含附加的成分，例如防腐剂、增溶剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、缓冲剂、抗氧化剂和稀释剂。
[0068] 也可以以控释组合物的形式，提供用于植入到个体中的PEG-尿酸酶，以连续地控制血和尿中升高的尿酸水平。可以和生物学上的活性成分一起配制的、会被生物腐蚀的或可生物降解的材料包括：例如聚乳酸、聚乙醇酸、再生胶原、聚-L-赖氨酸、藻酸钠、吉兰糖胶、脱乙酰几丁质、琼脂糖、多层脂质体和许多其它的常规缓释型制剂。如果植入或注射这些材料，则这些材料逐渐地分解并释放该活性物料到周围组织中。例如，一种将PEG-尿酸酶包胶凝的方法包括公开于美国专利第5,653,974号中方法，通过引用将其结合到本文中。在本发明中，明确地设想了会被生物腐蚀的制剂、可生物降解的制剂和其它缓释型制剂的应用。用于传送PEG-尿酸酶的输注泵的运用和基质包载系统的使用也在本发明的范围内。也可以便利地把PEG-尿酸酶封入胶束或脂质体中。脂质体封装技术在本技术领域是众所周知的；参见：例如Lasic，D等，(Eds.)(1995)StealthLiposomes，Boca Raton，FL：CRC Press。
[0069] 在冒着尿酸诱发的肾衰竭的高度危险的患者(例如器官移植的接受者)中(参见Venkataseshan，VS等，(1990)Nephron 56：317-321)，以及在患有某些恶性疾病的患者中，本文描述的PEG-尿酸酶药用组合物将减少对血液透析的需要。在大量积聚的结晶尿酸盐(痛风石)的患者中，与目前可利用的治疗相比，这样的药用组合物将更快地改进生活质量。
[0070] 下面的实施例阐明上面描述的不同方面；这些实施例无论如何不应被认作是限制本发明。
[0071] 实施例1
[0072] A.PBC尿酸酶cDNA、PKS尿酸酶cDNA和相关尿酸酶cDNA的构建
[0073] 使用标准方法和由试剂制造商提供的合适的说明，来制备细胞总RNA，PCR扩增(美国专利第4,683,195号和第4,683,202号、第4,965,188号和第5,075,216号)尿酸氧化酶cDNA，以及对这些cDNA克隆和测序(Erlich 1989；Sambrook等，1989；Ausubel1998)。基于发表的编码序列(Wu等，1989)，并运用PRIME软件程序(Genetics Computer Group，Inc.)，设计了用于猪和狒狒尿酸氧化酶的PCR引物(表1)。
[0074] 表1用于尿酸氧化酶cDNA的PCR扩增的引物
[0075]猪肝尿酸酶cDNA：
有义：5’gcgcgaattccATGGCTCATTACCGTAATGACTACA 3’
反义：5’gcgctctagaagcttccatggTCACAGCCTTGAAGTCAGC 3’
D3H狒狒肝尿酸酶cDNA：
有义：5’gcgcgaattccATGGCCCACTACCATAACAACTAT 3’
反义：5’gcgcccatggtctagaTCACAGTCTTGAAGACAACTTCCT
有义：5’gcgcgaattccATGGCTCATTACCGTAATGACTACA 3’
反义：5’gcgctctagaagcttccatggTCACAGCCTTGAAGTCAGC 3’
D3H狒狒肝尿酸酶cDNA：
有义：5’gcgcgaattccATGGCCCACTACCATAACAACTAT 3’
反义：5’gcgcccatggtctagaTCACAGTCTTGAAGACAACTTCCT
[0076] 在所述引物的末端引入的限制性内切酶序列(小写字母)为：有义引物(猪和狒狒)，EcoRI和NcoI；反义引物(猪)，NcoI、HindIII、XbaI；反义引物(狒狒)，NcoI。就狒狒有义引物来说，用CAC(组氨酸)取代了出现于狒狒尿酸氧化酶中的第三个密码子GAC(天冬氨酸)(Wu等，1992)；所述CAC即在人尿酸氧化酶假基因的编码序列中该位置上存在的密码子(Wu等，1992)。为此，已给由于使用这些引物而产生的重组狒狒尿酸氧化酶命名为D3H狒狒尿酸氧化酶。
[0077] 用第一条链试剂盒(Pharmacia Biotech Inc.Piscataway，NJ)，逆转录来自猪和狒狒的肝脏的细胞总RNA。在一循环变温加热器中(Ericomp.SanDiego，CA)，用程序[95℃、30秒；55℃、30秒；70℃、60秒]，循环20次；继之以[95℃、30秒；70℃、60秒]循环10次，来完成使用Taq DNA聚合酶(GibcoBRL，Life Technologies，Gaithersburg，MD)的PCR扩增。用EcoRI和HindIII消化所述尿酸氧化酶的PCR产物，并克隆到pUC18中(猪)；且也用TA克隆系统(Invitrogen，Carlsbad，CA)直接克隆所述尿酸氧化酶的PCR产物(猪和D3H狒狒)。将cDNA克隆转化到大肠杆菌菌株XLl-Blue(Stratagene，La Jolla，CA)中。
制备包含克隆的尿酸酶cDNA的质粒DNA，并用标准的双脱氧技术分析该cDNA插入片段序列。根据标准的重组DNA方法学，构建了具有发表的尿酸氧化酶DNA编码序列(除了在表I里描述的狒狒尿酸氧化酶中的D3H取代外)的克隆，并在一系列的随后步骤中检验了所述克隆。
制备包含克隆的尿酸酶cDNA的质粒DNA，并用标准的双脱氧技术分析该cDNA插入片段序列。根据标准的重组DNA方法学，构建了具有发表的尿酸氧化酶DNA编码序列(除了在表I里描述的狒狒尿酸氧化酶中的D3H取代外)的克隆，并在一系列的随后步骤中检验了所述克隆。
[0078] 将包含全长编码序列的所述猪和D3H狒狒的cDNA如下地引入到pET表达载体(Novagen，Madison，WI)中。用NcoI和BamHI限制性内切酶从TA质粒上切割下D3H狒狒尿酸酶cDNA，然后亚克隆到表达质粒pET3d和pET9d的NcoI和BamHI克隆位点中。用EcoRI和HindIII限制性内切酶从一pUC质粒克隆切割下全长的猪尿酸酶cDNA，并将其亚克隆到pET28b的EcoRI和HindIII位点中。在从pET28b的NcoI和BlpI位点切下后，同样把所述猪cDNA编码序列引入到表达质粒pET9d的NcoI和BlpI位点中。
[0079] 通过从pET3d-D3H-狒狒克隆切除D3H狒狒尿酸酶cDNA的624bp的NcoI-ApaI限制性片段，然后用猪cDNA对应的624bp的NcoI-ApaI限制性片段取代这D3H狒狒部分；构建猪-狒狒嵌合(PBC)cDNA。所产生的PBC尿酸氧化酶cDNA包括与狒狒尿酸氧化酶密码子226-304符合读框的猪尿酸氧化酶密码子1-225。
[0080] 通过从pET3d-D3H-狒狒克隆切除D3H狒狒尿酸酶cDNA的864bp的NcoI-NdeI限制性片段，然后用猪cDNA对应的864bp的NcoI-ApaI限制性片段取代这D3H狒狒部分；构建猪-KS尿酸氧化酶(猪KS)cDNA。所产生的PKS尿酸氧化酶cDNA包括与狒狒尿酸氧化酶密码子289-304符合读框的猪尿酸氧化酶密码子1-288。
[0081] 在图5和序列表中显示了D3H狒狒尿酸氧化酶、猪尿酸氧化酶、PBC尿酸氧化酶和PKS尿酸氧化酶的氨基酸序列。运用标准技术制备这些转化子的各自的15％甘油贮存物，并将这些贮存物贮藏在-70℃。当表达这些种中的每一种并分离重组酶时(表2)，所述猪尿酸酶、PBC嵌合尿酸酶和猪KS尿酸酶具有非常相似的比活，所述比活比重组狒狒尿酸酶的比活大约高4-5倍。在几个其它的实验中进一步证实了这种等级。用几种不同的方法制备的PBC尿酸酶的比活在2-2.5倍的范围内变化。
[0082] 表2表达的哺乳动物重组尿酸酶的比较
[0083]构成物 比活* 相对活性
(单位/mg) (嵌合体＝1)
PBC 7.02 1.00
猪KS 7.17 1.02
猪 5.57 0.79
狒狒 1.36 0.19
(单位/mg) (嵌合体＝1)
PBC 7.02 1.00
猪KS 7.17 1.02
猪 5.57 0.79
狒狒 1.36 0.19
[0084] *用Lowry法测定蛋白。用分光光度法测定尿酸酶活性(Priest和Pitts1972)，在一1cm的含有1ml反应混合物(0.1M四硼酸钠，pH8.6，0.1mM尿酸)的石英比色杯中，于23-25℃进行分析。根据在292nm的吸光度的减小来监测尿酸的消失。尿酸酶的一个国际单位(IU)每分钟催化1μmol的尿酸消失。
[0085] 按照pET系统指南(Novagen，Madison WI)中所指导的，将在表2中显示的4种尿酸酶cDNA-pET构成物的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS转化子接种于含有选择性抗生素的LB琼脂平板上(对于pET3d(猪KS)为羧苄青霉素和氯霉素；对于pET9d(PBC、猪、狒狒)为卡那霉素和氯霉素)。用单个的转化子菌落接种5ml培养基(LB加抗生素)，并将其在37℃培养3小时。然后，将各0.1ml的等分试样转移到100ml含有选择性抗生素和0.1％乳糖(诱导尿酸酶表达)的LB培养基中。在37℃生长过夜后，将来自各培养基的各个0.5ml等分试样的各细菌细胞提取到SDS-PAGE加样缓冲液中；并通过SDS-巯基乙醇聚丙烯酰胺凝胶电泳分析它们；这证实在4种培养物的每一种中已表达了可比较水平的尿酸酶蛋白(结果未示出)。通过离心，收集来自每种100ml培养物的、剩下的细胞；并用PBS洗涤它们。接着，将所述细胞重新悬浮于25ml含有1mM AEBSF蛋白酶抑制剂(Carbiochem.San Diego，CA)的、pH 7.4的磷酸缓冲盐溶液(PBS)中；然后，在一细菌细胞破裂器(Microfluidics，Boston MA)中于冰上裂解所述的细胞。通过离心(20,190xg、4℃、15分钟)，沉淀不溶物(包括尿酸酶)。用10ml PBS洗涤沉淀物两次，然后用2ml pH 10.2的1MNa2CO3于4℃将其提取过夜。用水将这提取物稀释到10ml，然后离心(20,190xg、4℃、15分钟)。接着测定尿酸酶活性和蛋白浓度。
[0086] 实施例2
[0088] 按照Novagen pET系统指南中所指导的，将来自甘油贮存物的pET3d-PBC尿酸酶转化子接种于含有羧苄青霉素和氯霉素的LB琼脂平板上。使用pET系统指南中推荐的方法，在一旋转摇床上(250rpm)于37℃用LB-抗生素液体培养基制备从一单个菌落开始的200ml接种物，以最大限度地保留pET质粒。在OD525为2.4时，通过离心收集来自这200ml培养物的细胞，然后将细胞重新悬浮于50ml新鲜培养基中。把这悬浮液转移到一个含有4升包含羧苄青霉素和氯霉素的SLBH培养基(在(Sadler等，1974)中描述了SLBH培养基的组成、以及发酵罐的设计和操作)的、高密度的发酵罐中。在O2下于32℃培养20小时后(OD525＝19)，添加异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至0.4mM，以诱导产生尿酸酶。在附加的6个小时之后(OD525＝37)，通过离心(10,410xg、4℃、10分钟)收集细菌细胞，用PBS将其洗涤一次，然后就在-20℃把它们冰冻贮藏。
[0089] 在200ml PBS中重新悬浮所述细菌细胞(189克)；在用冰/盐浴冷却细菌细胞的同时，通过超声处理(热系统超声处理器XL(Heat SystemsSonicator XL)，CL型探头，Farmingdale，NY)裂解它们，即以100％的强度处理4次，每次突发声波40秒，在两次突发之间有1分钟的休息。通过离心(10,410xg、4℃、10分钟)，沉淀不溶于PBS的物质(这物质包括尿酸酶)；然后用200ml PBS洗涤沉淀物5次。将不溶于PBS的沉淀物中的尿酸酶提取到80ml pH 10.2的、含有1mM苯基甲基磺酰氟(PMSF)和130μg/ml抑肽酶的1M Na2CO3中。通过离心(20,190xg、4℃、2小时)除去不溶的碎片。在4℃进行所有进一步的纯化步骤(在表3中概括了结果)。
[0090] 用1mM PMSF稀释所述pH 10.2的提取物至1800ml(减少Na2CO3到0.075M)。将这稀释液上样于新鲜Q-琼脂糖凝胶柱(2.6×9cm)(Pharmacia Biotech，Inc.，Piscataway，NJ)，该柱已用pH 10.2的0.075MNa2CO3平衡。在加样后，接连地用下述溶液洗涤该柱，所述溶液为：1)pH10.2的0.075M Na2CO3，洗得直到流出物的A280吸光度达到本底为止；2)pH 8.5的10mM NaHCO3，洗得直到流出物的pH下降到8.5为止；3)50ml的10mM NaHCO3(pH 8.5)、0.15M NaCl；4)100ml的在10mMNaHCO3(pH 8.5)中的、0.15M NaCl至1.5M NaCl的梯度；
5)150ml的10mM NaHCO3(pH 8.5)、1.5M NaCl；6)10mM NaHCO3，pH 8.5；7)pH 11的0.1M Na2CO3，洗得直到使流出物的pH升高到11为止。最后，用500ml在pH 11的0.1M Na2CO3中的、从0至0.6M的NaCl梯度，洗脱尿酸酶。洗脱两个A280吸收峰的活性，分开合并所述两个峰的活性物质(级分A和级分B、表3)。然后，通过慢慢加入1M的乙酸，降低该pH到7.1，继之以离心(7000xg、10分钟)；来沉淀这些合并物里的每一种级分中的尿酸酶。将所产生的沉淀物溶解于50ml pH 10.2的1M Na2CO3中，然后把它贮藏于4℃。
5)150ml的10mM NaHCO3(pH 8.5)、1.5M NaCl；6)10mM NaHCO3，pH 8.5；7)pH 11的0.1M Na2CO3，洗得直到使流出物的pH升高到11为止。最后，用500ml在pH 11的0.1M Na2CO3中的、从0至0.6M的NaCl梯度，洗脱尿酸酶。洗脱两个A280吸收峰的活性，分开合并所述两个峰的活性物质(级分A和级分B、表3)。然后，通过慢慢加入1M的乙酸，降低该pH到7.1，继之以离心(7000xg、10分钟)；来沉淀这些合并物里的每一种级分中的尿酸酶。将所产生的沉淀物溶解于50ml pH 10.2的1M Na2CO3中，然后把它贮藏于4℃。
[0091] 表3重组的猪-狒狒嵌合(PBC)尿酸酶的纯化
[0092] IPTG诱导的细胞糊状物＝189.6克
[0093]部分 总蛋白 尿酸酶活性 总尿酸酶单 比活
mg U/ml 位 U/mg
pH 7超声处理标本 74.9
+pH 7洗涤
pH 10.2提取物 4712 82.7 11,170 2.4
Q-琼脂糖
级分A 820 11.5 1,081* 1.9
级分B 1809 31.7 4,080 2.3
pH 7.1沉淀又重新
溶解
级分A 598 35.0 1,748 3.0
级分B 1586 75.5 3,773 2.4
总回收 2184 5,521
mg U/ml 位 U/mg
pH 7超声处理标本 74.9
+pH 7洗涤
pH 10.2提取物 4712 82.7 11,170 2.4
Q-琼脂糖
级分A 820 11.5 1,081* 1.9
级分B 1809 31.7 4,080 2.3
pH 7.1沉淀又重新
溶解
级分A 598 35.0 1,748 3.0
级分B 1586 75.5 3,773 2.4
总回收 2184 5,521
[0094] *在从该柱洗脱后，存在于级分A中的尿酸酶开始自发地沉淀；因此，在纯化的这阶段测定的活性是低估的。
[0095] 实施例3
[0096] 重组PBC尿酸酶的小规模制备和PEG基团化
[0097] 这个实施例表明：可用纯化的重组PBC尿酸酶制造PEG基团化的尿酸酶。在这反应中，所有的尿酸酶亚基都被修饰(图1、第7道)，且保留了大约60％的催化活性(表4)。
[0098] A.小规模PBC尿酸酶的表达和分离(表4、图1)
[0099] 在一旋转摇床上(250rpm)，于37℃培养4升用pET3d-PBC cDNA转化的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS的培养物。在OD525为0.7时，用IPTG(0.4mM、6小时)诱导该培养物。收获细胞，然后于-20℃将其冰冻。通过冻融，使所述细胞(15.3克)破裂；然后用pH 10.2的1M Na2CO3、1mMPMSF提取它们。离心(12,000xg、4℃、10分钟)后，用水1∶10地稀释上清液(85ml)，然后，按照与实施例1中描述的方式相似的一种方式，将其上Q-琼脂糖凝胶柱层析。通过使用PM30膜(Amicon，Beverly，MA)的加压超滤，浓缩从这步骤合并的尿酸酶活性。在平衡了的Sephacryl S-200柱(2.5×100cm)(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)上层析该浓缩物，且用pH 10.2的0.1M Na2CO3洗脱该浓缩物。如上述地合并含有尿酸酶活性的级分，然后通过加压超滤将其浓缩。
[0100] B.PEG基团化
[0101] 让在pH 10.2的0.1M Na2CO3中的100mg浓缩的Sephacryl S-200PBC尿酸酶(5mg/ml，2.9μmol酶，84.1μmol赖氨酸)与2倍过量(PEG的摩尔数：尿酸酶赖氨酸的摩尔数)的PEG的活化形式于4℃反应60分钟；通过切向流渗滤，将PEG基团化的尿酸酶与某些未反应的PEG或水解的PEG分离。在这步骤中，用pH 10.2的0.1M Na2CO3 1∶10地稀释该反应物，并对3.5体积的pH 10.2的0.1M Na2CO3渗滤，然后，对3.5体积的pH 7.2的0.05M磷酸钠、0.15M NaCl渗滤。这种过滤除菌的酶在4℃至少稳定一个月。
[0102] 表4重组猪-狒狒嵌合(PBC)尿酸酶的纯化和PEG基团化的概要
[0103]A.纯化 活性的
级分 总蛋白 总尿酸酶活性 比活 回收率
mg μmol/min μmol/min/mg ％
粗制提取物 1565 1010 0.6 100
Q-琼脂糖凝胶 355 1051 3.0 104
Sephacryl S-200 215 1170 5.5 116
B.PEG基团化
S-200尿酸酶 100 546 5.5 100
PEG-尿酸酶 97 336 3.5 62
级分 总蛋白 总尿酸酶活性 比活 回收率
mg μmol/min μmol/min/mg ％
粗制提取物 1565 1010 0.6 100
Q-琼脂糖凝胶 355 1051 3.0 104
Sephacryl S-200 215 1170 5.5 116
B.PEG基团化
S-200尿酸酶 100 546 5.5 100
PEG-尿酸酶 97 336 3.5 62
[0104] 图1显示在重组猪-狒狒嵌合(PBC)尿酸酶的纯化和PEG基团化期间所得到的各级分的SDS-巯基乙醇聚丙烯酰胺凝胶电泳(12％的凝胶)分析。泳道：1＝分子量标准；2＝未诱导的、用pET3d-PBC cDNA转化的细胞(大肠杆菌BL21(DE3)pLysS)的SDS提取物；3＝IPTG诱导的、用pET-PBCcDNA转化的细胞的SDS提取物；4＝粗制提取物(参见表5)；
5＝浓缩的Q-琼脂糖凝胶尿酸酶合并物；6＝浓缩的Sephacryl S-200尿酸酶合并物；7＝PEG基团化的Sephacryl S-200重组PBC尿酸酶。
5＝浓缩的Q-琼脂糖凝胶尿酸酶合并物；6＝浓缩的Sephacryl S-200尿酸酶合并物；7＝PEG基团化的Sephacryl S-200重组PBC尿酸酶。
[0105] 表4中显示的结果表明：可以修饰纯化的PBC尿酸酶，同时保留大约60％的催化活性。在这PEG基团化反应中，全部的尿酸酶亚基都被修饰(图1泳道7)。在没有展示的研究中，所述PEG基团化的酶与未修饰的PBC尿酸酶具有类似的动力学性质(KM 10-20μM)。重要地是，在生理pH下，所述修饰的酶比未修饰的酶的溶解性大得多(在PBS中大于5mg/ml对＜1mg/ml)。也可以冻干PEG基团化的酶，然后，在pH 7.2的PBS中重建，其活性损失最小。在其它的实验中，我们比较了PEG-PBC尿酸酶的这种制剂和黄曲霉尿酸酶临床制剂的活性。在pH 8.6的硼酸盐缓冲液中，所述黄曲霉的酶的Vmax高高10-14倍和KM高2倍。
然而，在pH 7.2的PBS中，所述PEG-PBC酶和未修饰的真菌酶在尿酸酶活性方面有小于2倍的差别。
然而，在pH 7.2的PBS中，所述PEG-PBC酶和未修饰的真菌酶在尿酸酶活性方面有小于2倍的差别。
[0106] 实施例4
[0107] 未修饰的尿酸酶和PEG基团化的PBC尿酸酶在小鼠中的循环寿命
[0108] 图2显示天然的尿酸酶和PEG基团化的PBC尿酸酶的循环寿命。用1个单位的天然尿酸酶(圆形)或PEG修饰的重组PBC尿酸酶(在实施例3中描述的制剂)(正方形)，腹膜内注射各组小鼠(每个时间点3只)。在指示的时候，从三只小鼠一组的各组小鼠中获得血液，用于测定血清尿酸酶活性。与所述未修饰酶小于2小时的循环寿命比较，所述PEG基团化的尿酸酶(描述于实施例3中)具有大约48小时的循环寿命(图2)。
[0109] 实施例5
[0110] 本发明PEG基团化的尿酸酶的功效
[0111] 图3显示了血清尿酸酶活性与血清及尿中的尿酸浓度的关系。在这实验中，一只纯合的、尿酸酶缺陷的基因剔除小鼠(Wu等，1994)，在0小时和72小时，两次接受0.4IU的、已PEG基团化的重组PBC尿酸酶的注射。因为这些基因剔除小鼠和具有尿酸酶的正常小鼠不同，这些基因剔除小鼠如同人，在其血液和体液中具有高水平的尿酸，且在其尿中排泄出高水平的尿酸，所以在这实验中使用所述尿酸酶缺陷的基因剔除小鼠。这些高水平的尿酸对这些小鼠的肾脏引起严重的损害，这种损害常常是致命的(Wu等，1994)。
[0112] 显示于图3的该实验证实：腹膜内注射重组PBC尿酸酶的PEG基团化的制剂，导致血清中尿酸酶活性的增加，在有尿酸酶缺陷的小鼠中，这伴随有血清尿酸浓度和尿的尿酸浓度的显著下降。
[0113] 实施例6
[0114] 构成物-载体复合物的无免疫源性
[0115] 将PEG基团化的重组PBC尿酸酶重复地注射到纯合的尿酸酶缺陷的小鼠中，却没有诱发加速清除；这与缺乏有意义的免疫源性相一致。通过ELISA证实了这一点。图4显示了重复注射后保持尿酸酶活性的循环水平(用血清测定的)。通过以6-10天的间隔腹膜内注射，给予PEG基团化的PBC尿酸酶。在每次注射后24小时，测定血清尿酸酶活性。
[0116] 实施例7
[0117] 突变引入的赖氨酸的共价键合
[0118] 纯化的重组PBC尿酸酶的PEG基团化应导致PEG连接到新的赖氨酸(残基291)上。在这实验中，通过PEG基团化可以修饰一种PBC尿酸酶的制剂。用本技术领域已知的方法，可以确定是否已通过PEG基团化修饰了包含所述新的赖氨酸(残基291)的肽。
[0119] 参考文献
[0120] Abuchowski A，Kazo GM，Verhoest CR，Jr.，van Es T，Kafkewitz D，Nucci ML，Viau AT等，(1984)用修饰的酶治疗癌症。I.聚乙二醇-天冬酰胺酶缀合物的抗肿瘤特性。Cancer Biochem Biophys 7：175-186
[0121] Abuchowski A，McCoy JR，Palczuk NC，van Es T，Davis FF(1977a)聚乙二醇的连接对于牛肝过氧化氢酶免疫源性和循环寿命的影响。J.BiolChem 252：3582-3586[0122] Abuchowski A，van Es T，Palczuk NC，Davis FF(1977b)通过共价连接聚乙二醇而改变牛血清白蛋白的免疫学性质。J.Biol Chem252：3578-3581
[0123] Ausubel FM(1998)Current Protocols in Molecular Biology John Wiley&Sons[0124] Ahn KJ，Kim YS，Lee HC，Park K，Huh KB(1992)肾移植后环孢菌素诱发的高尿酸血症：临床特征和机制。Transplantation Proceedings24：1391-1392
[0125] Arellano F，Sacristan JA(1993)别嘌呤醇超敏感性综合征：综述。Ann.Pharmacother 27：337-343
[0126] Becker MA(1988)尿酸单钠单水合物结晶沉积疾病(痛风)的临床状况。Rheumatic Disease Clinics of North America 14：377-394
[0127] Becker MA，Roessler BJ(1995)高尿酸血症和痛风。载于：Scriver CR，Beaudet AL，Sly WS，Valle D(eds)The Metabolic and Molecular Bases ofInherited Disease，第7版，McGraw-Hill，New York，第1655-1677页
[0128] Brogard JM，Coumaros D，Frankhauser J，Stahl A，Stahl J(1972)酶促尿酸分解：真菌尿酸氧化酶效果的研究。Eur J Clin Biol Res 17：890-895
[0129] Brogard JM，Stahl A，Stahl J(1978)酶促尿酸分解及其在治疗方面的应用。载于：Kelley WN，Arnold WJ，Weiner IM(eds)Uric Acid，Springer-Verlag，New York，第515-524页
[0130] Chaffee S，Mary A，Stiehm ER，Girault D，Fischer A.Hershfield MS(1992)在患有腺苷脱氨酶缺乏的患者体中对聚乙二醇修饰的腺苷脱氨酶(PEG-ADA)的IgG抗体反应。J Clin Invest 89：1643-1651
[0131] Chen RHL，Abuchowski A，van Es T，Palczuk NC，Davis FF(1981)通过共价连接聚乙二醇修饰的两种尿酸氧化酶的性质。Biochim BiophysActa 660：293-298[0132] Chua CC，Greenberg ML，Viau AT，Nucci M，Brenckman WD，Jr.，Hershfield MS(1988)在患有非霍奇金(Hodgkin)淋巴瘤的患者体中用聚乙二醇修饰的尿酸酶(PEG-尿酸酶)治疗高尿酸血症。Ann.Int Med109：114-117
[0133] Cohen LF，Balow JE，Magrath IT，Poplack DG，Ziegler JL(1980)急性肿瘤裂解综合征：关于患有伯基特淋巴瘤的37位患者的综述。Am J Med64：468-491
[0134] Conley TG，Priest DG(1979)从哺乳动物组织纯化尿酸酶。Preparative Biochemistry 9：197-203
[0135] Davis FF，Kazo GM，Nucci ML，Abuchowski A(1991)减少肽和蛋白的免疫源性并延长肽和蛋白的循环寿命。载于：Lee VHL，(eds)Peptide andProtein Drug Delivery，Marcel Dekker，New York，第831-864页
[0136] Davis S，Abuchowski A，Park YK，Davis FF(1981a)通过连接聚乙二醇而在小鼠中改变牛腺苷脱氨酶的循环寿命和抗原特性。Clin ExpImmunol 46：649-652[0137] Davis S，Park YK，Abuchowski A，Davis FF(1981b)聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶的低尿酸血症效应。Lancet 1：281-283
[0138] Delaney V，Sumrani N，Daskalakis P，Hong JH，Sommer BG(1992)在同种异体肾移植的接受者中的高尿酸血症和痛风。TransplantationProceedings 24：1773-1774[0139] Donadio D，Errera J，Navarro M，Izarn P(1981)在一个患有急性白血病的哮喘儿童身上静脉内注射尿酸氧化酶后的过敏性反应样表现(文字)。Nouv Presse Med 10：711-712
[0140] Erlich HA(1989)PCR技术。用于DNA扩增的原理与应用(PCRTechnology.Principles and applications for DNA amplification)StocktonPress，New York[0141] Escudier B，Leclercq B，Tandonnet F，Nitenberg G(1984)抗尿酸氧化酶的高尿酸血症。高剂量的功效(文字)。Presse Med 13：1340
[0142] Fam AG(1990)治疗痛风和高尿酸血症的策略与争论。Balliere’sClinical Rheumatology 4：177-192
[0143] George T，Mandell BF(1995)在移植患者体内的痛风。J ClinRheumatol 1：328-334
[0144] Gold GL，Fritz BD(1957)与白血病的治疗有关的高尿酸血症。Ann.Int Med 47：428-434
[0145] Greenberg ML，Hershfield MS(1989)用于人血浆中尿酸氧化酶的放射化学高效液相色谱分析。Anal Biochem 176：290-293
[0146] Harris JM，Zalipsky S(Ed.)(1997)聚 乙 二 醇 的 化 学 和 生 物 学 应 用(Poly(ethylene glycol)Chemistry and Biological Applications)ACS，Washington，DC[0147] Hershfield M，S.(1997)聚乙二醇修饰的腺苷脱氨酶(PEG-ADA)的生物化学和免疫学。载于：Harris JM，Zalipsky S(eds)聚乙二醇的化学和生物学应用(Poly(ethylene glycol)Chemistry and Biological Applications)，ACS，Washington，DC，第145-154页[0148] Hershfield MS(1995)用于腺苷脱氨酶缺乏的PEG-ADA替代疗法：8.5年后的革新。Clin Immunol Immunopathol 76：S228-S232
[0149] Hershfield MS(1996)痛风和尿酸代谢。载于：Bennett JC，Plum F(eds)Cecil Textbook of Medicine，第二十版，WB Saunders，New York，第1508-1515页[0150] Hershfield MS Buckley RH，Greenberg ML，Melton AL，Schiff R，Hatem C，Kurtzberg J等(1987)用聚乙二醇修饰的腺苷脱氨酶治疗腺苷脱氨酶缺乏。N Engl J Med316：589-596
[0151] Hershfield MS，Chaffee S，Koro-Johnson L，Mary A，Smith AA，ShortSA(1991)运用定位诱变来增强聚乙二醇共价修饰蛋白的掩盖表位的效果。Proc Natl Acad Sci USA88：7185-7189
[0152] Hershfield MS，Mitchell BS(1995)由腺苷脱氨酶缺乏和嘌呤核苷磷酸化酶缺陷引起的免疫缺陷疾病。载于：Scriver CR，Beaudet AL，Sly WS，Valle D(eds)遗传病的代谢和分子基础(The Metabolic and MolecularBases of Inherited Disease)，第7版，McGraw-Hill，New York，第1725-1768页
[0153] Hershfield MS，Seegmiller JE(1976)痛风和嘌呤生物合成的调节。载于：Quagliariello E(eds)Horizons in Biochemistry and Biophysics，Addison-Wesley，Reading，MA，第134-162页
[0154] Jones DP，Stapleton FB，Kalwinsky D，McKay CP，Kellie SJ，Pui CH(1990)在呈现和复发急性成淋巴细胞白血病时的肾功能障碍与高尿酸血症。Med Pediatr Oncol 18：283-286
[0155] Kelley WN，Fox IH，Pallela TD(1989)痛风和嘌呤代谢的相关疾病。载于：Kelley WN，Harris ED，Ruddy S，Sledge CG(eds)Textbook ofRheumatology，第3版，WB，Saunders，Philadelphia，，第1395-1448页
[0156] Kissel P，Lamarche M，Royer R(1968)由于来自真菌的一种酶的尿酸血症的减轻和尿酸氮的排泄。Nature 217：72-74
[0157] Kissel P，Schmitt J，Streiff F，Makuary G，Schmidt C，Toussain P(1972)尿酸氧化酶：在血液学上其益处在于高尿酸血症的临床医学的预防。AnnMed Nancy 11：519-535[0158] Lee CC，Wu X，Gibbs RA，Cook RG，Muzny DM，Caskey CT(1988)由氨基酸序列指引的cDNA的产生：尿酸氧化酶的克隆。Science239：1288-1291
[0159] Legoux R，Delpech B，Dumont X，Guillemot JC，Ramond P，Shire D，Caput D等(1992)编码黄曲霉尿酸氧化酶的基因在大肠杆菌中的克隆与表达。J Biol Chem 267：8565-8570
[0160] London M，Hudson PM(1957)纯化的尿酸酶在两个人体内的尿酸分解活性。Science 125：937-938
[0161] Masera G，Jankovic M，Zurlo MG，Locasciulli A，Rossi MR，Uderzo C，Recchia M(1982)在儿童期白血病过程中尿酸诱发的肾损害的尿酸氧化酶预防法。J Pediatr 100：152-155
[0162] Montagnac R，Schillinger F(1990)与静脉内注射尿酸氧化酶相关的过敏反应并发症。Nephrologie 11：259
[0163] Mourad G，Cristol JP，Chong G，Andary M，Mion C(1984)在抗尿酸氧化酶的高尿酸血症方面沉淀抗尿酸氧化酶抗体的作用(文字)。Presse Med13：2585
[0164] Potaux L，Aparicio M，Maurel C，Ruedas ME，Martin-Dupont CL(1975)尿酸分解疗法。尿酸氧化酶在治疗高尿酸血症方面的价值。Nouv PresseMed 4：1109-1112[0165] Priest DG，Pitts OM(1972)反应中间体对分光光度尿酸酶分析的影响。Analytical Biochemistry 50：195-205
[0166] Pui C-H，Relling MV，Lascombes F，Harrison PL，Struxiano A，Mondesir J-M，Riberio RC等(1997)预防和治疗与淋巴样恶性肿瘤有关的高尿酸血症的尿酸氧化酶。Leukemia 11：1813-1816
[0167] Reddy PG，Nemali MR，Reddy MK，Reddy MN，Yuan PM，Yuen S，Laffler TG等(1988)大鼠过氧化物酶体尿酸氧化酶的cDNA克隆的分离和序列测定：在大鼠中的肝特异性表达。Proc Natl Acad Sci USA85：9081-9085
[0168] Rosenthal AK，Ryan LM(1995)难治疗的与结晶关联的关节炎的治疗。Rheum Dis Clin North Amer 21：151-161
[0169] Roubenoff R(1990)痛风和高尿酸血症。Rheumatic Disease Clinics ofNorth America 16：539-550
[0170] Sadler JR，Miwa J，Maas P，Smith T(1974)高密度细菌培养物的生长。一种简单的装置。Laboratory Practice 23：632-643
[0171] Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T(1989)分子克隆。实验室手册，第2版。Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，各页
[0172] Sandberg AA，Cartwright GB，Wintrobe MM(1956)关于白血病的研究。I.尿酸排泄。Blood 11：154-166
[0173] Savoca KV，Davis FF，Palczuk NC(1984)在小鼠中由尿酸酶和单甲氧基聚乙二醇修饰的尿酸酶诱发的耐受性。Int Arch Allergy Appl Immunol75：58-67
[0174] Sibony G，North ML，Bergerat JP，Lang JM，Oberling F(1984)抗尿酸氧化酶的高尿酸血症。抗血清沉淀尿酸氧化酶的抗体的作用(文字)。PresseMed 13：443[0175] Singer JZ，Wallace SL(1986)别嘌呤醇超敏感性综合征。不必要的发病率和死亡率。Arthritis Rheum 29：82-87
[0176] Tsuji J，Hirose K，Kasahara E，Naitoh M，Yamamoto I(1985)关于聚乙二醇修饰的尿酸酶的抗原性的研究。Int J Immunopharmacol 7：725-730
[0177] Venkataseshan VS，Feingold R，Dikman S，Churg J(1990)移植后的急性高尿酸血性肾病和肾衰竭。Nephron 56：317-321
[0178] Veronese FM，Caliceti P，Schiavon O(1997)用于酶和脂质体修饰的新的合成聚合物。载于：Harris JM，Zalipsky S(eds)聚乙二醇的化学和生物学应用(Poly(ethylene glycol)Chemistry and Biological Applications)，ACS，Washington，DC，第182-192页[0179] West C，Carpenter BJ，Hakala TR(1987)在肾移植接受者中的痛风发病率。Am J Kidney Dis 10：369-371
[0180] Wu X，Lee CC，Muzny DM，Caskey CT(1989)尿酸氧化酶：一级结构和进化关系。Proc Natl Acad Sci USA 86：9412-9416
[0181] Wu X，Muzny DM，Lee CC，Caskey CT(1992)在尿酸氧化酶丧失方面的两个独立的突变事件。J Mol Evol 34：78-84
[0182] Wu X，Wakamiya M，Vaishnav S，Geske R，Montgomery CM，Jr.，JonesP，Bradley A等(1994)在尿酸氧化酶缺陷小鼠中的高尿酸血症和尿酸盐肾病。Proc Natl Acad Sci USA 91：742-746
[0183] Zittoun R，Dauchy F，Teillaud C，Barthelemy M，Bouchard P(1976)在血液学上用尿酸氧化酶和别嘌呤醇治疗高尿酸血症。Ann Med Interne127：479-482
[0184] * * * * * * *
[0185] 将在上面引用的所有文献通过引用全部结合到本文中。
[0186] 序列表
[0187]
[0188]
[0189]
[0190]
[0191]
[0192]
[0193]
[0194]
[0195]
[0196]
[0197]
[0198]
[0199]
[0200]
[0201]
[0202]
[0203]
[0204]
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈