技术领域
[0001] 本
发明涉及一种用于测定辣根过氧化酶(HRP)含量的方法，具体涉及在缓冲液环境下，特定的氧化底物和还原底物在HRP的催化作用下发生酶促反应，反应产物在
电极上具有良好的伏安峰，通过测定伏安峰便可测定HRP的浓度，从而建立起以HRP为标记酶的伏安酶联免疫分析法，属于医疗技术领域。
背景技术
[0002] 辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)，是临床检验
试剂中的常用酶。其比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，该产品不但广泛用于多个生化检测项目，也广泛运用于免疫类(ELISA)
试剂盒。过氧化物酶作为多个试剂盒显色体系的关键成分，对试剂盒的
质量有重要影响。
[0003] HRP广泛分布于
植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕色的
铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为pH＝3～9，酶催化的最适pH因供氢体不同而稍有差异，但多在pH＝5左右。酶溶于
水和58％以下
饱和度硫酸铵溶液。
[0004] 现阶段测定HRP的主要方法有分光光度法、
荧光光度法和
化学发光法，但分光光度法测定灵敏度不高，随后发展起来的荧光底物和化学发光底物显著提高了灵敏度,但面临的共同问题是检测仪器价格昂贵,从而限制了其应用。另外这两种方法自身也都存在一些
缺陷:荧光
信号易饱和、易猝灭,以及自发荧光对实验结果产生干扰；化学发光必须随时采集,光积分时间长等。
[0005] 因此为了克服上述问题，急需开发一种简单方便，成本低，灵敏度高的测定法。
发明内容
[0006] 为了弥补现有的对HRP的测定技术存在的不足，本发明的目的是在于将免疫分析的高特异性和电化学分析的高灵敏度相结合，提供一种通过电化学检测手段实现快速、简单、准确、灵敏、特异性检测HRP含量的方法。
[0007] 为了实现上述技术目的，本发明提供了一种基于电化学定量检测辣根过氧化酶的方法，该方法包括以下步骤：
[0008] 1)将一系列不同浓度的辣根过氧化酶标准溶液分别加入至含氧化底物和还原底物的缓冲溶液中，催化氧化底物和还原底物进行
氧化还原反应；
[0009] 2)通过
伏安法分别检测各组氧化还原反应所得产物的
电流值，并记录所述产物在特征峰电位产生的电流峰值，建立电流峰值与辣根过氧化酶溶液浓度的标准曲线；
[0010] 3)将待测辣根过氧化酶溶液按1)和2)进行操作，并通过伏安法检测氧化还原反应所得产物的电流值，并记录所述产物在特征峰电位产生的电流峰值，依据标准曲线得出待测辣根过氧化酶溶液的浓度。
[0011] 本发明的技术方案，充分利用HRP
生物酶具有特异性催化特定氧化底物和还原底物发生酶促反应的特点，结合电化学方法检测反应产物在特征峰电位产生的电流峰值，可以建立HRP和电流峰值的线性关系，从而实现了HRP电化学方法检测。特征峰电位是指产物在电极上发生氧化或还原反应，将会产生氧化峰或还原峰，该峰电流所在的电位就是该物质的特征峰电位。
[0012] 优选的方案，氧化底物为过
硼酸钠(NaBO3·4H2O)、过
碳酸钠(2Na2CO3·3H2O2)和过氧化氢(H2O2)中的至少一种；较优选为过硼酸钠，过硼酸钠相对
稳定性好，可以提高检测的准确性，为最佳的氧化底物。过硼酸钠(NaBO3·4H2O)在缓冲溶液中的浓度范围为0.1mM～10mM，最优选为6mM。
[0013] 优选的方案，还原底物为邻
氨基
苯酚(OAP)、邻苯二胺(OPD)、3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)、邻联
甲苯胺(OT)、邻联茴香胺(ODA)中至少一种；较优选的还原底物为邻苯二胺，邻苯二胺与过硼酸钠为最佳的氧化-还原组合。邻苯二胺(OPD)在缓冲溶液中的浓度范围为0.1mM～100mM，最优选为50mM。
[0014] 优选的方案，缓冲溶液为pH＝1.5～9的Britton-Robinson缓冲液(由
磷酸、硼酸和
醋酸混合而成)、pH＝4～6的
柠檬酸-磷酸缓冲溶液、pH＝3～6的醋酸-醋酸钠、pH＝5～8的磷酸氢二
钾-磷酸二氢钾缓冲液或pH＝8～10的氨-
氯化铵缓冲液。
[0015] 优选的方案，氧化还原反应条件为：
温度为10℃～50℃，时间为5min～120min。最优的氧化还原反应条件为：反应温度35℃，反应时间为40min。
[0016] 优选的方案，伏安法为
循环伏安法、线性伏安法、差分脉冲伏安法或方波伏安法；最优选为方波伏安法。
[0017] 较优选的方案，包括以下步骤：
[0018] 1)将一系列不同浓度的辣根过氧化酶标准溶液分别加入至含过硼酸钠和邻苯二胺的缓冲溶液中，催化过硼酸钠和邻苯二胺进行氧化还原反应；
[0019] 2)通过方波伏安法分别检测各氧化还原反应所得产物的电流值，并记录所述产物在特征峰电位产生的电流峰值，建立电流峰值与辣根过氧化酶溶液浓度的标准曲线；
[0020] 3)将待测辣根过氧化酶溶液按1)和2)进行操作，并通过方波伏安法检测氧化还原反应所得产物的电流值，并记录所述产物在特征峰电位产生的电流峰值，依据标准曲线得出待测辣根过氧化酶溶液的浓度。
[0021] 进一步优选的方案，辣根过氧化酶标准溶液的浓度在0.12μg/L～6μg/L范围内。
[0022] 进一步优选的方案，通过方波伏安法检测的条件为：其起始点位为0.00V～0.20V，终止点位为-0.70～-0.40V，电位增量为0.005V～0.040V，振幅为0.010V～0.080V，
频率为2.5Hz～50Hz，静止时间为3s～16s。最优选的条件为：起始点位为0.00V，终止点位为-0.50，电位增量为0.015V，振幅为0.025V，频率为25Hz，静止时间为5s。
[0023] 本发明的基于电化学检测HRP的方法包括以下具体步骤：
[0024] (1)准备反应所需的缓冲溶液备用；
[0025] (2)分别在缓冲液中配置一定浓度的氧化底物和还原底物；
[0026] (3)测试之前，取一定量上述氧化底物的溶液和还原底物的溶液混合，配制成若干组含氧化底物和还原底物的缓冲溶液，再将一系列不同浓度的HRP标准液分别加入至各组缓冲溶液中，在一定条件下反应一定时间；
[0027] (4)取出部分上述反应产物加入
电解池，再加缓冲液，通过电化学方法记录电流信号，检测产物在特征峰电位产生的还原峰；随着HRP浓度的增大，峰电流相应增大，在0.12μg/L～6μg/L范围内，峰电流值与HRP浓度呈线性关系，其
检测限为0.06μg/L；
[0028] (5)将待测HRP溶液按上述步骤进行操作，通过计算，得到HRP的含量。
[0029] 优选的方案，氧化还原反应过程中采用的缓冲液为醋酸-醋酸钠、柠檬酸-磷酸缓冲液、Britton-Robinson缓冲液(由磷酸、硼酸和醋酸混合而成)、
磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液、氨-氯化铵缓冲液缓冲液之一。测定反应产物过程中采用的缓冲液为Britton-Robinson缓冲液(由磷酸、硼酸和醋酸混合而成)、磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液、柠檬酸-磷酸缓冲液之一。
[0030] 较优选的方案，氧化还原反应过程中采用的缓冲液为醋酸-醋酸钠溶液，其pH值范围为3.0～6.0；最优选pH值为5.0。测定反应产物过程中采用的缓冲液为Britton-Robinson缓冲液(由磷酸、硼酸和醋酸混合而成)，其pH值范围为1.5～3.0；最优选pH值为2.0。
[0031] 本发明的氧化底物和还原底物在HRP的催化作用下发生酶促反应，其反应机理可分以三步，完成了底物之间的氧化和还原过程，反应步骤如下：
[0032] 第一步，形成有活性的酶-底物复合物Ⅰ：
[0033]
[0034] 第二步，复合物Ⅰ转变成红色有活性的复合物Ⅱ：
[0035] 复合物Ⅰ+AH→复合物Ⅱ+A
[0036] 第三步，复合物Ⅱ被还原，释放出酶：
[0037] 复合物Ⅱ+AH→HRP+A+H2O
[0038] AH：表示氢供体还原底物；
[0039] 在一定程度上复合物Ⅱ可自发地分解成HRP和产物(P):
[0040] 复合物Ⅱ→HRP+P。
[0041] 相对
现有技术，本发明的技术方案带来的有益技术效果：
[0042] (1)本发明充分利用HRP生物酶具有特异性催化特定氧化底物和还原底物发生酶促反应的特点，结合电化学方法检测反应产物在特征峰电位的电流峰值，可以建立HRP和电流峰值的线性关系，从而实现了HRP电化学方法检测。
[0043] (2)本发明采用电化学方法对HRP进行定量检测，操作方便，其设备相对简单，即可用于实验室测定，也可做成便携式设备。
[0044] (3)本发明检测过程中采用的相关试剂成本低，配置简单快速，没有复杂的混合物。
[0045] (4)本发明检测过程快速，检测温度10℃～50℃，适应范围广，灵敏度高，其检测限为0.06μg/L。
附图说明
[0046] 【图1】包含氧化底物和还原底物的反应体系中，加入HRP前后紫外可见吸收
光谱曲线的变化情况。
[0047] 【图2】包含氧化底物和还原底物的反应体系中，加入HRP前后方波伏安曲线的变化情况。
[0048] 【图3】完整的反应体系中，不同pH值的反应缓冲液对酶促反应峰电流的影响。
[0049] 【图4】完整的反应体系中，不同温度对酶促反应峰电流的影响。
[0050] 【图5】完整的反应体系中，不同浓度HRP存在时酶促反应峰电流的变化。
具体实施方式
[0051] 以下
实施例旨在进一步说明本发明内容，而不是对本发明
权利要求的保护范围的限制。
[0052] 实施例1
[0053] 用浓度均为40mM的H3PO4、HAc和H3BO3溶液等体积混合，加入200mM的NaOH溶液，配制pH＝2.0的B-R缓冲溶液备用。分别配制0.1mol/L HAc溶液及0.1mol/L NaAc溶液，用HAc溶液加入NaAc溶液调节其PH＝5备用。用10mM的PBS溶液准备浓度为HRP溶液并储存在4℃的
冰箱里。OPD溶液现用现配，先用少量甲醇溶解，再用醋酸-醋酸钠缓冲溶液定容，使得缓冲溶液中OPD的最终浓度为50mM；NaBO3·4H2O溶液现用现配，使得缓冲溶液中NaBO3·4H2O的最终浓度为6mM。测试之前，取1.5mL上述的OPD溶液与1.5mLNaBO3·4H2O溶液于10mL比色管中混合，加入50μL浓度为1μg/L的HRP溶液，摇匀，于35℃水浴中反应40min后取出，加入2.0mL pH＝2.0的B-R缓冲溶液，同时，按照相同步骤准备不加HRP的空白对照溶液。此时，空白溶液无色，而加入HRP后溶液变为橙红色，紫外可见吸收光谱曲线的变化情况见图1。将此溶液移入
电解池中，于电化学分析仪上记录酶促反应产物的方波伏安峰。仪器条件:始点位为0.00V，终止点位为-0.50V，电位增量为0.015V，振幅为0.025V，频率为25Hz，静止时间为
5s。空白与反应液方波伏安曲线的变化情况见图2。
[0054] 实施例2
[0055] 用浓度均为40mM的H3PO4、HAc和H3BO3溶液等体积混合，加入200mM的NaOH溶液，配制pH分别为3、4、5、6、7、8、9的B-R缓冲溶液备用。分别配制0.1mol/L HAc溶液及0.1mol/L NaAc溶液，用HAc溶液加入NaAc溶液分别调节其pH至3、4、5、6备用。用10mM的PBS溶液准备浓度为HRP溶液并储存在4℃的冰箱里。OPD溶液现用现配，先用少量甲醇溶解，再分别用上述不同pH值的B-R缓冲溶液和醋酸-醋酸钠缓冲溶液定容，使得不同pH值缓冲溶液中OPD的最终浓度均为50mM；NaBO3·4H2O溶液现用现配，使得不同PH值缓冲溶液中NaBO3·4H2O的最终浓度均为6mM。测试之前，分别取1.5mL上述的OPD溶液与PH值相同的1.5mL NaBO3·4H2O溶液于10mL比色管中混合出共11组溶液，分别加入50μL浓度为1μg/L的HRP溶液，摇匀，于35℃水浴中反应40min后取出，加入2.0mL pH＝2.0的B-R缓冲溶液，将此溶液移入电解池中，于电化学分析仪上记录酶促反应产物的方波伏安峰。仪器条件:始点位为0.00V，终止点位为-0.50V，电位增量为0.015V，振幅为0.025V，频率为25Hz，静止时间为5s。不同pH值缓冲溶液对酶促反应峰电流的影响情况见图3。
[0056] 实施例3
[0057] 用浓度均为40mM的H3PO4、HAc和H3BO3溶液等体积混合，加入200mM的NaOH溶液，配制pH＝2.0的B-R缓冲溶液备用。分别配制0.1mol/L HAc溶液及0.1mol/L NaAc溶液，用HAc溶液加入NaAc溶液调节其pH＝5备用。用10mM的PBS溶液准备浓度为HRP溶液并储存在4℃的冰箱里。OPD溶液现用现配，先用少量甲醇溶解，再用醋酸-醋酸钠缓冲溶液定容，使得缓冲溶液中OPD的最终浓度为50mM；NaBO3·4H2O溶液现用现配，使得缓冲溶液中NaBO3·4H2O的最终浓度为6mM。测试之前，取1.5mL上述的OPD溶液与1.5mLNaBO3·4H2O溶液于10mL比色管中混合，加入浓度为1μg/L的HRP溶液组成相同的5组反应液，摇匀，分别于20℃、30℃、35℃、40℃、50℃水浴中反应40min后取出，分别加入2.0mL pH＝2.0的B-R缓冲溶液。将此溶液移入电解池中，于电化学分析仪上记录酶促反应产物的方波伏安峰。仪器条件:始点位为
0.00V，终止点位为-0.50V，电位增量为0.015V，振幅为0.025V，频率为25Hz，静止时间为5s。
不同温度对酶促反应峰电流的影响情况见图4。
[0058] 实施例4
[0059] 用浓度均为40mM的H3PO4、HOAc和H3BO3溶液等体积混合，加入200mM的NaOH溶液，配制pH＝2.0的B-R缓冲溶液备用。分别配制0.1mol/L HAc溶液及0.1mol/L NaAc溶液，用HAc溶液加入NaAc溶液调节其PH＝5备用。用10mM的PBS溶液准备浓度为HRP溶液并储存在4℃的冰箱里。OPD溶液现用现配，先用少量甲醇溶解，再用醋酸-醋酸钠缓冲溶液定容，使得缓冲溶液中OPD的最终浓度为50mM；NaBO3·4H2O溶液现用现配，使得缓冲溶液中NaBO3·4H2O的最终浓度为6mM。测试之前，取1.5mL上述的OPD溶液与1.5mLNaBO3·4H2O溶液于10mL比色管中混合，加入浓度分别为0μg/L、10μg/L、500μg/L、100μg/L、200μg/L、400μg/L的HRP溶液组成6组反应液，摇匀，于35℃水浴中反应40min后取出，分别加入2.0mLpH＝2.0的B-R缓冲溶液。将此溶液移入电解池中，于电化学分析仪上记录酶促反应产物的方波伏安峰。仪器条件:始点位为0.00V，终止点位为-0.50V，电位增量为0.015V，振幅为0.025V，频率为25Hz，静止时间为5s。反应液方波伏安曲线的变化情况见图5，随着HRP浓度的增大，峰电流相应增大，在0.12μg/L～6μg/L范围内，峰电流值与HRP浓度呈线性关系，其检测限为0.06μg/L。
