益生菌缓释载体和缓释滴丸 |
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| 申请号 | CN202222584177.3 | 申请日 | 2022-09-28 | 公开(公告)号 | CN219920184U | 公开(公告)日 | 2023-10-31 |
| 申请人 | 江苏恒康生物科技有限公司; | 发明人 | 李明松; 梁文; 孙文扬; | ||||
| 摘要 | 本实用新型提供一种 益生菌 缓释载体和缓释滴丸，该缓释载体包含油相芯层、含第一高分子物质的中层及含第二高分子物质的外层，其中，外层和中层之间有微孔结构。本实用新型的缓释载体可有效解决 现有技术 中多层滴丸结构难以达到理想的定向结肠缓释效果的问题，该缓释滴丸对待释放物质的包埋率好、存活率高，耐胃酸和胆盐效果好，能够定向在结肠中停留和缓释， 稳定性 优异，制备工艺安全简便，适合工业化生产。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种益生菌缓释载体，其特征在于，包含： |
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| 说明书全文 | 益生菌缓释载体和缓释滴丸技术领域[0001] 本实用新型涉及保健品领域，具体地，本实用新型涉及一种益生菌缓释载体和缓释滴丸。 背景技术[0002] 缓释滴丸应用于食品、药品等多个领域。缓释滴丸具备多种优点，最为突出的是缓释滴丸的包埋作用能够防止敏感物质化学和物理降解，能够使相互接触会不利的物质分离，能够掩盖物质的原有气味、颜色或味道，能够控制物质的分散性，且能够防止被包封物质被破坏。 [0003] 益生菌作为一类益生功能成分，其功能作用逐渐被消费者所接受，科学研究也逐渐揭开益生菌对人体健康影响的机制。常规益生菌产品以粉剂、片剂、胶囊剂为主，一方面无法达到很好的肠溶效果，导致益生菌在胃酸中破坏，另一方面没有很好的肠道停留能力，使得益生菌在肠道中过早释放或过晚释放。 [0004] 为了解决益生菌肠溶缓释问题，益生菌缓释滴丸作为一种开发方向，但现有益生菌缓释滴丸存在以下问题：单层益生菌滴丸不能耐受胃酸，不能保证滴丸内部益生菌活着到达肠道，因此目前多采用双层或三层滴丸。例如，专利CN201711334957.X公开了一种双层益生菌滴丸，其设置了耐胃酸层和芯层，然而，耐胃酸层进入小肠后即崩解，在小肠处释放益生菌，使得胆盐敏感型益生菌被胆盐所灭活，不能保证胆盐敏感型益生菌的活性；又如，专利CN201880063102.4公开了一种由非氢化油脂构成的三层结构胶囊，其设置外层(耐胃酸层)、中层(保护层)和益生菌芯层，然而普通的三层结构胶囊，外层脱落时易带走中层结构，难以达到理想的定向结肠缓释效果；专利CN202111098705.8公开了一种胃肠道控释型益生菌珠，其为三层滴丸，采用固态油相材料作为中层。但固态油相在肠道内会软化并被小肠胆汁所分解，无法保证完全避免胆汁对芯层益生菌的杀伤。 [0006] 本实用新型的一个主要目的在于克服上述现有技术的至少一种缺陷，提供一种缓释载体及应用该缓释载体的缓释滴丸，该缓释载体具有三层结构，在外层和中层之间有特定的微孔结构，从而保证外层脱落时可与中层完全剥离开，而不影响中层结构的完整性，进而有利于缓释滴丸中益生菌的定向缓释，以解决现有技术中多层滴丸结构难以达到理想的定向结肠缓释效果的问题。采用该缓释载体的缓释滴丸，其待释放物质的包埋率好、存活率高，耐胃酸和胆盐效果好，定向在结肠中停留和缓释，稳定性优异，制备工艺安全简便，适合工业化生产。 [0007] 为了实现上述目的，本实用新型采用如下技术方案： [0008] 本实用新型的第一个方面提供了一种缓释载体，如图1所示，包含：油相芯层100、中层102以及外层104，其中，外层和中层之间有微孔结构103，其中微孔结构103的放大示意图见图2。 [0009] 根据本实用新型，所述外层也称为耐胃酸层，所述中层也可称为保护层。现有技术中的三层缓释载体结构在进入体内作用时，外层脱落时易带走中层结构，难以达到理想的定向结肠缓释效果。本实用新型的发明人发现，通过在外层和中层之间设定微孔结构，可以保证外层脱落时与中层完全剥离开，而不影响中层结构的完整性，进而有利于缓释滴丸中益生菌的定向缓释。 [0010] 根据本实用新型的一些实施方式，上述缓释载体还可以包括下列附加技术特征中的至少之一： [0011] 根据本实用新型的一个实施方式，所述中层分散有第一高分子物质。 [0012] 根据本实用新型的一个实施方式，所述外层分散有第二高分子物质。 [0013] 根据本实用新型的一个实施方式，该缓释载体的外层还分散有酸。 [0015] 根据本实用新型的一个实施方式，所述微孔结构为纳米微气孔。根据本实用新型，该纳米微气孔可更好地实现外层与中层剥离，从而保证外层完全脱落而不影响中层。 [0017] 根据本实用新型的一个实施方式，所述外层的pH值为2.5～3.0，例如2.5、2.6、2.8、3.0等。 [0019] 根据本实用新型的一个实施方式，所述碳酸盐优选为纳米级碳酸盐颗粒，所述纳米级碳酸盐颗粒的粒径为200nm～600nm，例如，200nm、250nm、300nm、310nm、400nm、500nm、600nm。 [0020] 根据本实用新型的一个实施方式，所述碳酸盐为碳酸钙，优选为碳酸钙颗粒，更优选粒径为300nm～600nm的碳酸钙颗粒。 [0021] 根据本实用新型的一个实施方式，所述第一高分子物质选自卡拉胶、结冷胶或果胶，优选为结冷胶，例如低酰基结冷胶。 [0022] 根据本实用新型的一个实施方式，前述的第二高分子物质包括明胶、琼脂、结冷胶或卡拉胶果胶。 [0023] 根据本实用新型的一个实施方式，所述第二高分子物质包括明胶。 [0024] 根据本实用新型的一个实施方式，所述明胶包括小肠溶明胶蛋白，更优选地，所述小肠溶明胶蛋白的分子量为23‑33kDa。使用23‑33kDa的小肠溶明胶蛋白，可有效提高滴丸的耐胃酸效果，阻止滴丸结构被胃酸中的酶液所破坏，并保证滴丸进入小肠后外层迅速脱落，暴露出中层，本领域技术人员可以理解，所述第二高分子物质不受特别限制，只要是具有较好的耐胃酸效果的可食用或者药用的高分子即可。 [0025] 根据本实用新型的一个实施方式，所述中层还分散有益生菌。 [0026] 根据本实用新型的一个实施方式，所述益生菌包括吸附结肠的益生菌。 [0027] 根据本实用新型的一个实施方式，所述吸附结肠的益生菌包括对结肠细胞吸附率不低于12cfu/cell的益生菌。 [0028] 根据本实用新型的一个实施方式，所述益生菌的活性不低于10‑20亿个/g。 [0029] 根据本实用新型的一个实施方式，所述益生菌包括乳杆菌。 [0030] 根据本实用新型的一个实施方式，所述乳杆菌包括罗伊氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌或植物乳杆菌。上述罗伊氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌都具有吸附结肠黏膜的特异性。 [0031] 根据本实用新型的一个实施方式，所述中层中分散的益生菌、第一高分子物质及碳酸盐的质量比包括(4～11)：(1～3)：(0.1～0.5)，例如，4:1:0.1、5:2:0.4、10:1.5:0.3等。本领域技术人员可以理解，只要使得所上述中层具有良好的特异性和耐胃酸效果，所述中层中分散的益生菌、第一高分子物质及碳酸盐的质量比可以根据需要进行调整。 [0032] 根据本实用新型，通过在中层中添加吸附结肠的益生菌菌体，能够使中层具备吸附结肠黏膜的效果，从而延缓滴丸在结肠中的缓释时间，进一步保证油相芯层中益生菌定向缓释在结肠处。此外，使用第一高分子物质代替现有技术中的固态油相作为中层结构支撑材料，具备两方面作用：一是保证含有吸附结肠的益生菌菌体的中层完整通过小肠，让中层中的特异性吸附因子能在结肠处发挥效果；二是所述中层耐胆酸盐腐蚀，且使中层具备一定强度而不在小肠中被破坏，有效防止小肠液中胆汁酸、胆盐、胰酶等成分破坏油相芯层中的益生菌。 [0034] 根据本实用新型的一个实施方式，所述食品上可接受的辅料包括增塑剂。 [0036] 根据本实用新型的一个实施方式，所述外层中的所述第二高分子物质与增塑剂的质量比包括(8～10)：(5～8)。所述外层中的所述第二高分子物质与增塑剂的质量比可以根据实际需求进行调整。 [0039] 根据本实用新型的一个实施方式，所述植物油包括大豆油、葵花籽油或橄榄油。 [0040] 根据本实用新型的一个实施方式，所述油相芯层还分散有熔点调节剂。 [0041] 根据本实用新型的一个实施方式，所述熔点调节剂包括蜂蜡、氢化棕榈油、起酥油或谷甾醇。 [0042] 根据本实用新型的一个实施方式，所述熔点调节剂的熔点包括40℃～100℃。 [0043] 根据本实用新型的一个实施方式，所述熔点调节剂的熔点包括60℃～80℃。 [0044] 根据本实用新型，分散的熔点调节剂可保证油相芯层在常温条件下处于固态，固体的芯层可固定待释放物质，保证内部待释放物质在贮藏过程中均匀分布，减少聚集；且固体的芯层在结肠中释放时，具有缓释功能，可以有效扩大待释放物质释放范围。 [0045] 本实用新型的第二个方面，本实用新型提供了一种缓释滴丸。根据本实用新型的一些实施方式，所述缓释滴丸包括前述的缓释载体及待释放物质，所述待释放物质分散于所述缓释载体的油相芯层100中。 [0046] 根据本实用新型的一个实施方式，上述缓释滴丸还可以进一步包括下列附加技术特征中的至少之一： [0047] 根据本实用新型的一个实施方式，所述待释放物质为益生菌菌群。 [0048] 根据本实用新型的一个实施方式，所述益生菌包括乳杆菌、双歧杆菌、乳球菌或酵母菌。 [0049] 根据本实用新型的一个实施方式，所述乳杆菌包括嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌或植物乳杆菌。 [0050] 根据本实用新型的一个实施方式，所述双歧杆菌包括两歧双歧杆菌、青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、短双歧杆菌或长双歧杆菌。 [0051] 根据本实用新型的一个实施方式，所述乳球菌包括乳酸乳球菌。 [0052] 根据本实用新型的一个实施方式，所述益生菌菌群也可以包含多种益生菌，所述多种益生菌可以按照等比例混合、配合或接种使用。所述等比例包括等重量比、体积比、摩尔比、活力比或重量体积比。本领域技术人员也可以根据常规的益生菌搭配方式将多种益生菌进行混合使用。示例性的，当所述益生菌菌群包含植物乳杆菌、干酪乳杆菌和嗜酸乳杆菌时，所述植物乳杆菌、干酪乳杆菌和嗜酸乳杆菌的重量比为1：1：1；所述益生菌菌群包含副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和乳酸乳球菌时，所述副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和乳酸乳球菌的重量比为1：1：1：1；当所述益生菌菌群包含两歧双歧杆菌、青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、短双歧杆菌和长双歧杆菌时，所述两歧双歧杆菌、青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、短双歧杆菌和长双歧杆菌的重量比为1：1：1：1：1。 [0053] 根据本实用新型的一个实施方式，所述益生菌菌群活性为2000～4000亿个/g。 [0054] 根据本实用新型的一个实施方式，所述缓释载体中熔点调节剂的含量占所述缓释载体中的油相芯层和所述待释放物质总重量的1％～10％，例如，1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％。本领域技术人员可以根据需要调整所述熔点调节剂的上述占比。 [0055] 根据本实用新型的一个实施方式，所述缓释载体中熔点调节剂的含量占缓释载体中所述油相芯层和所述待释放物质总重量的3％～5％。在一些具体的实施方式中，所述待释放物质包裹在所述缓释载体中，因此，在计算各个组分占比时，采用的是各组分与所述油相芯层和所述待释放物质的总重量占比。 [0056] 根据本实用新型的一个实施方式，所述待释放物质占所述缓释载体中的所述油相芯层和所述待释放物质总重量的2％～20％，例如，2％、3％、5％、8％、9％、10％、13％、15％、17％、20％等。本领域技术人员可以根据需要调整所述待释放物质的上述占比。 [0057] 根据本实用新型的一个实施方式，所述待释放物质占所述缓释载体中所述油相芯层和所述待释放物质总重量的5％～10％。 [0058] 根据本实用新型的一个实施方式，所述缓释载体中植物油的含量占所述缓释载体中的油相芯层和所述待释放物质总重量的70％～97％，例如，70％、72％、75％、80％、92％、93％、96％、97％等。本领域技术人员可以根据需要调整所述植物油的上述占比。 [0059] 根据本实用新型的一个实施方式，所述缓释载体中的外层、中层和油相芯层与所述待释放物质总重量的重量比为(2～4)：(1～3)：(4～6)，例如，3:2:5、2:2:5、1:2:4、3:1:6、3:3:4等，优选重量比为3:2:5。本领域技术人员可以根据需要调整所述缓释载体中的外层、中层和油相芯层与所述待释放物质总重量的重量比。 [0060] 本领域技术人员可以理解，所述滴丸的直径和重量可以根据实际需要进行调整，例如，本实用新型中所述缓释滴丸的直径为25±3mm，所述缓释滴丸的重量为20±3mg。 [0062] 图1显示了本实用新型一个实施方式的所述缓释载体的结构示意图，包括油相芯层100，中层102，微孔结构103，外层104； [0063] 图2显示了本实用新型一个实施方式的所述缓释载体的微孔结构103放大示意图； [0064] 图3显示了本实用新型试验例4的肠溶明胶蛋白的分离纯化样品的SDS‑PAGE电泳图，其中：样品1为明胶，样品2为经胃蛋白酶水解的明胶，样品3为先后经胃蛋白酶和胰蛋白酶水解的明胶，样品4为经分离纯化的23‑33kDa明胶蛋白，样品5为经胰蛋白酶水解的23‑33kDa明胶蛋白。 具体实施方式[0065] 下面详细描述本实用新型的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本实用新型，而不能理解为对本实用新型的限制。 [0066] 此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本实用新型的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。 [0067] 在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。 [0068] 本文中，“小肠溶明胶蛋白”，指明胶中一类可耐胃蛋白酶消化，可被胰蛋白酶消化的明胶蛋白。 [0069] 本文中，“高分子物质”，是指以由重复单元连接成的线型长链为基本结构的高分子量化合物，是存在于动物、植物及生物体内的高分子物质。示例性地，所述高分子物质可以包括下列中的至少之一：多肽、蛋白质、酶等；多聚磷酸酯、核糖核酸、脱氧核糖核酸等；多糖如淀粉、肝糖、菊粉、纤维素、甲壳素等；橡胶类如巴西橡胶、杜仲胶等；树脂类如阿拉伯树脂、琼脂、褐藻胶等。本申请中所述第一高分子物质和第二高分子物质可以为植物来源或动物来源的高分子物质，其中，所述第一高分子物质优选为植物来源，所述第二高分子物质优选为动物来源高分子，在本实用新型的一些具体的实施例中，所述第一高分子物质使用的是结冷胶，所述第二高分子物质使用的是明胶中的小肠溶明胶蛋白。 [0070] 本文中，“明胶”是指是一种大分子的亲水胶体，是胶原部分水解后的产物，任一种或多种食用明胶或明胶蛋白片段均可以用于制备本实用新型中的所述缓释载体和/或缓释滴丸，例如，小肠溶明胶蛋白和/或分子量为23‑33kDa的小肠溶明胶蛋白。 [0071] 本文中，“益生菌”是指通过定殖在人体或动物体内，改变宿主某一部位菌群组成的一类对宿主有益的活性微生物。 [0072] 本文中，“植物油”是指由高级脂肪酸和甘油反应而成的化合物，广泛分布于自然界中，是从植物的果实、种子、胚芽中得到的油脂，示例性地，如大豆油、葵花籽油、橄榄油、蓖麻油、花生油、菜籽油、芝麻油、棉籽油、亚麻籽油和红花籽油、蓖麻油等。 [0073] 本文中，“熔点调节剂”是指具有影响所述植物油或油相芯层的熔点作用的物质，用于调节一种或多种植物油或者一种或多种植物油与其它物质组成的混合物的熔点，例如，本实用新型中以蜂蜡、氢化棕榈油、起酥油或谷甾醇来降低所述油相芯层的熔点。 [0075] 本实用新型的有益效果至少包括： [0076] 本实用新型提出了一种新的缓释载体及应用于该缓释载体的缓释滴丸，该缓释载体具有三层结构，即油相芯层、中层和外层，利用纳米微孔技术在外层和中层之间设置微孔结构，使得该结构可有效保证缓释载体在体内发挥作用时，外层完全脱落而不影响中层，进而有利于缓释滴丸中益生菌的定向缓释，以解决现有技术中多层滴丸结构难以达到理想的定向结肠缓释效果的问题。进一步地，本实用新型还可设置了各层的组成以及相应的配比关系，以达到更优异的定向缓释效果。 [0077] 总之，本实用新型的缓释载体应用于缓释滴丸中，可实现待释放物质，如益生菌包埋完整、存活率高，耐胃酸和胆盐效果好，可将待释放益生菌定向传递到结肠处停留和缓释，该结构的稳定性优异，工艺安全简便，适合工业化生产。 [0078] 下面参考具体实施例，对本实用新型进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本实用新型。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。 [0079] 本实用新型所有试剂及益生菌均可由市售购买所得。 [0080] 实施例1缓释滴丸的制备 [0081] 外层：将10g小肠溶明胶蛋白(23‑33kDa)，5g甘油混合，用1M稀盐酸调节pH值至2.5，加纯化水溶解定容至100mL； [0082] 中层：将10g特异性吸附结肠的罗伊氏乳杆菌菌体(菌体不低于100亿个)、1.5g低酰基结冷胶、0.2g纳米级碳酸钙颗粒混合，加纯化水溶解定容至100mL； [0083] 含益生菌的油相芯层：将5g蜂蜡和90g大豆油融化均匀，加入10g益生菌菌群(植物乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌按照重量比1:1:1混合，其活力不低于20000亿个)，混匀。 [0084] 滴制滴丸：将前述所得三层物料经三层同心圆滴头一次滴制成型，滴入到气体冷却柱中冷凝成滴丸。 [0085] 实施例2缓释滴丸的制备 [0086] 外层：将8g小肠溶明胶蛋白(23‑33kDa)，6.5g甘油混合，用1M稀盐酸调节pH值至2.7，加纯化水溶解定容至100mL； [0087] 中层：将8g特异性吸附结肠的嗜酸乳杆菌菌体(菌体不低于100亿个)、1.7g低酰基结冷胶、0.3g纳米级碳酸钙颗粒混合，加纯化水溶解定容至100mL； [0088] 含益生菌的油相芯层：将3g氢化植物油和90g葵花籽油融化均匀，加入5g益生菌菌群(副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、乳酸乳球菌按照重量比1:1:1:1混合，其活力为15000亿个)，混匀。 [0089] 滴制滴丸：将前述所得三层物料经三层同心圆滴头一次滴制成型，滴入到气体冷却柱中冷凝成滴丸。 [0090] 实施例3缓释滴丸的制备 [0091] 外层：将9g小肠溶明胶蛋白(23‑33kDa)，8g甘油混合，用1M稀盐酸调节pH值至3.0，加纯化水溶解定容至100mL； [0092] 中层：将5g特异性吸附结肠的植物乳杆菌菌体(菌体不低于100亿个)、2g低酰基结冷胶、0.4g纳米级碳酸钙颗粒混合，加纯化水溶解定容至100mL； [0093] 含益生菌的油相芯层：将3g谷甾醇、3g起酥油和85g橄榄油融化均匀，加入8g益生菌菌群(两歧双歧杆菌、青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、短双歧杆菌和长双歧杆菌按照重量比1:1:1混合，其活力不低于16000亿个)，混匀。 [0094] 滴制滴丸：将前述所得三层物料经三层同心圆滴头一次滴制成型，滴入到气体冷却柱中冷凝成滴丸。 [0095] 实施例4缓释滴丸的制备 [0096] 外层：将10g小肠溶明胶蛋白(23‑33kDa)，5g甘油混合，用1M稀盐酸调节pH值至2.5，加纯化水溶解定容至100mL； [0097] 中层：将10g特异性吸附结肠的罗伊氏乳杆菌菌体(菌体不低于100亿个)、1.5g低酰基结冷胶、0.2g纳米级碳酸钙颗粒混合，加纯化水溶解定容至100mL； [0098] 含益生菌的油相芯层：将5g蜂蜡和90g大豆油融化均匀，加入10g益生菌菌群(植物乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌按照重量比1:1:1混合，其活力不低于20000亿个)，混匀。 [0099] 滴制滴丸：将前述所得三层物料经三层同心圆滴头一次滴制成型，滴入到液体石蜡冷凝液中冷凝成滴丸。 [0100] 实施例5缓释滴丸的制备 [0101] 在制备外层的步骤中，不使用小肠溶明胶蛋白，使用10g普通明胶液，其余实验步骤和条件与实施例1相同，得到滴丸。 [0102] 对比例1 [0103] 在制备外层的步骤中，不调节pH值(不含酸)；在制备中层的步骤中，不添加纳米级碳酸钙颗粒，其余实验步骤和条件与实施例1相同，得到滴丸。 [0104] 对比例2 [0105] 在制备中层的步骤中，采用等体积含90％大豆油、5％蜂蜡的油相替换1.5％的低酰基结冷胶，其余实验步骤和条件与实施例1相同，得到滴丸。 [0106] 试验例1 [0107] 本试验例用于评价不同配方对结肠崩解及外层和中层脱落情况的影响。 [0108] 按照《中华人民共和国药典》第三部(通则0921)崩解时限检查法，检测各样品是否符合结肠崩解，以及外层和中层脱落情况。具体步骤为： [0109] 取供试品6粒，先在人工胃液(盐酸16.4ml，加水约800mL与胃蛋白酶10g)中不加挡板检查2小时，记录每粒裂缝或崩解现象；将吊篮取出，用少量水洗涤后，再按上述方法，在人工小肠液(pH6.8磷酸盐缓冲液100mL，胰酶10g)中不加挡板检查3小时，记录每粒裂缝或崩解现象；续将吊篮取出，用少量水洗涤后，每管加入挡板，再按上述方法，改在人工结肠液(pH 7.8磷酸盐缓冲液)中检查，记录1小时内崩解情况。实验结果如表1所示。 [0110] 表1 [0111] [0112] 试验结果：实施例1‑3在人工胃酸中模拟消化2h后外层小肠溶明胶层没有变形或破损；在人工小肠液中模拟消化3h后外层完全脱落，暴露出中层，中层无破损，而后中层在人工结肠液模拟消化中崩解，暴露出含益生菌的油相芯层，进行益生菌缓释。可见实施1‑3的益生菌缓释滴丸为结肠溶。 [0113] 实施例5在模拟人工消化时，外层普通明胶在人工胃液和小肠液模拟消化中均未破，在人工结肠液模拟消化中相继脱落，芯层超过1h缓释完全；因此，普通明胶无法达到小肠溶明胶蛋白的小肠溶效果，也无法做到结肠溶，不适合作为结肠溶滴丸的外层材料。 [0114] 对比例1模拟人工消化时，外层小肠溶明胶蛋白在人工胃液模拟消化中未破损，在人工小肠液模拟消化中裂开但未脱落，外层和中层在人工结肠液模拟消化中一起脱落，芯层超过1h溶解；因此，当没有在外层和中层间设置纳米微孔结构时，外层不能完全从中层脱落，影响中层的正常暴露。 [0115] 对比例2模拟人工消化时，外层小肠溶明胶蛋白在人工胃液模拟消化中未破损，在人工小肠液模拟消化中完全脱落后，中层和芯层也在人工小肠液中破碎；所以，中层以油状物作为保护层时无法起到保护作用。 [0116] 试验例2 [0117] 本试验例用于评价不同配方对于待释益生菌的活性影响 [0118] 按照《GB4789.35食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》标准进行样品的活菌检测，对各组样品在崩解时限检测中活菌的变化进行测试。具体步骤为： [0119] 各组样品取样1g，按照《中华人民共和国药典》第三部(通则0921)崩解时限检查法的处理规范，人工胃液、人工小肠液分别在模拟消化后取样，人工结肠液在模拟消化1h或芯层消失时取样，按照国标GB4789.35进行活菌计数；模拟消化前的各组样品需要进行均质处理，将滴丸粉碎，样品按照1％比例添加到生理盐水中，在20000r/min下冰浴均质5min，取均质液按照国标GB4789.35进行活菌计数。实验结果如表2所示。 [0120] 表2 [0121] [0122] 从上表2可以看出，实施例1获得样品的活菌总数为2.1×1010cfu，由于芯层在人工胃液和人工小肠液中模拟消化未破损，芯层内活菌未缓释，故人工胃液和人工小肠液中检10 测不到活菌；人工结肠液模拟消化后，芯层1h内缓释完全，活菌总数为2.3×10 cfu，相对模拟消化前的活菌总数没有降低。 [0123] 实施例5获得样品的活菌总数为2.1×1010cfu，由于芯层在人工胃液和人工小肠液中模拟消化未破损，芯层内活菌未缓释，故人工胃液和人工小肠液中检测不到活菌；人工结8 肠液模拟消化后，芯层超过1h没有缓释完全，检测活菌总数7.7×10cfu，相对模拟消化前的活菌数出现显著降低，故缓释达不到实施例1的效果。 [0124] 对比例1获得样品的活菌总数为2.0×1010cfu，由于芯层在人工胃液和人工小肠液中模拟消化未破损，芯层内活菌未缓释，故人工胃液和人工小肠液中检测不到活菌；人工结8 肠液模拟消化后，芯层超过1h没有缓释完全，检测活菌总数1.9×10cfu，相对模拟消化前的活菌数出现显著降低，故缓释达不到实施例1的效果。 [0125] 对比例2获得样品的活菌总数为2.1×1010cfu,由于芯层在人工胃液中模拟消化未破损，芯层内活菌未缓释，故人工胃液中检测不到活菌；中层和芯层在人工小肠液中模拟消6 化完全破损，人工小肠液检测活菌4.8×10cfu，相对模拟消化前的活菌数出现显著降低，活菌被小肠液腐蚀，故缓释达不到实施例1的效果。 [0126] 试验例3 [0127] 本试验例用于评价不同配方对贮藏稳定性的影响。 [0128] 将所得滴丸样品放置密封袋中，在4℃和25℃条件下放置6个月，到期后将样品按照1％比例添加到生理盐水中，在20000r/min下冰浴均质5min，取均质液按照国标GB4789.35进行活菌计数。实验结果如表3所示。 [0129] 表3 [0130] 样品 0个月/(cfu/g) 4℃、6个月/(cfu/g) 25℃、6个月/(cfu/g)10 10 9 实施例1 2.1×10 1.9×10 1.7×10 10 10 9 实施例2 2.1×10 2.0×10 2.2×10 10 10 9 实施例3 2.2×10 1.9×10 1.1×10 10 10 9 实施例5 2.1×10 1.2×10 1.3×10 10 9 8 对比例1 2.0×10 5.6×10 2.9×10 10 9 8 对比例2 2.1×10 6.9×10 3.4×10 [0131] 由上表3可知，实施例1、2、3制备的结肠溶益生菌缓释滴丸的贮藏稳定性显著优于其他实施例和对比例。 [0132] 试验例4 [0133] 本试验例用于筛选肠溶明胶蛋白的影响。 [0134] 样品1：15％明胶液 [0135] 样品2：配制15％明胶液，调节pH值到2.0，每克明胶添加2000单位牛胃蛋白酶，在37℃、50r/min水解2h得经胃蛋白酶水解的明胶； [0136] 样品3：样品2中添加十分之一体积1M磷酸盐缓冲液，调节pH值至6.8，添加2000单位牛胰蛋白酶，在25℃、50r/min水解2h得先后经胃蛋白酶和胰蛋白酶水解的明胶； [0137] Mark：三色预染蛋白质分子量标准品(GoldBand Plus 3‑color Regular Range Protein Marker(8‑70kDa)) [0138] 方法：分别取样品1未水解样品、样品2牛胃蛋白酶水解样品、样品3牛胃蛋白酶和牛胰蛋白酶水解样品进行SDS‑PAGE凝胶电泳。 [0139] 结果：如图3样品1、2、3所示，检测耐牛胃蛋白酶水解且可被牛胰蛋白酶水解的蛋白分子量分布在23‑33kDa。由上述实验结果可知，肠溶明胶蛋白分子量分布在23‑33kDa。 [0140] 试验例5 [0141] 本试验例用于肠溶明胶蛋白的分离纯化及验证 [0142] 分离纯化：利用蛋白层析系统，对5％明胶液进行凝胶过滤层析，收集目标分子量蛋白；使用减压浓缩系统，将收集到的蛋白液浓缩到10％质量浓度。 [0143] 结果：如图3样品4，分离纯化后的肠溶明胶蛋白经过(分子量23‑33kDa)测定分量为分子量23‑33kDa。 [0144] 验证：将分离纯化得到的明胶蛋白(分子量23‑33kDa)经胰蛋白酶水解后进行SDS‑PAGE凝胶电泳，电泳结果如图3样品5所示。 [0145] 试验例6 [0146] 本试验例用于特异性吸附结肠菌株吸附量测定。 [0147] HT‑29细胞用DEME培养基传代3次，胰酶消化，调整细胞浓度为100000cells/mL，在含细胞爬片的24孔板中每孔添加1mL HT‑29细胞液，于37℃、5％二氧化碳培养至完全分化的单细胞层；待选菌株用BS或MRS培养基活化，37℃培养24h，5000r/min离心收集菌体，用PBS(0.1M、pH＝6.8)缓冲液清洗三遍后，再用相同PBS调整细菌浓度至1亿cfu/ml；每孔HT‑29细胞内添加1mL待选菌株液，37℃、5％二氧化碳孵育60min，用PBS清洗5次，再用无水甲醇固体20min；取出孔板中细胞爬片，进行革兰氏染色，使用油镜随机观察和计数20个视野，计算平均细菌数量。 [0148] 检测结果得到吸附量在12cells/cfu以上的益生菌菌株，如表4所示。 [0149] 表4 [0150]菌株 吸附量(cells/cfu) 罗伊氏乳杆菌 22 嗜酸乳杆菌 16 植物乳杆 13 德氏乳杆菌 6 乳酸乳球菌 3 湿热链球菌 1 [0151] 由上表4可以看出，罗伊氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌能特异性吸附结肠细胞。 [0152] 试验例7 [0153] 本试验例用于纳米微孔结构的优化。 [0154] 对于本实用新型的缓释滴丸，其外层的酸性与中层中碳酸钙反应生产二氧化碳气孔，保证外层脱落时可以不影响中层完整性。以外层从中层上脱落情况作为标准，优化碳酸钙颗粒与pH值；使用微型行星式球磨仪制作不同粒度的碳酸钙颗粒，使用0.1M稀盐酸调节外层pH值，滴丸制作方法参照实施例1进行；各组样品按照《中华人民共和国药典》第三部(通则0921)崩解时限检查法，观察和记录外层脱落时情况，确定外层脱落对中层完整性的影响。实验结果如表5所示。 [0155] 表5 [0156] [0157] [0158] 由上表5可以看出，较优的制备参数为：碳酸钙颗粒粒度在300nm‑600nm、添加量在0.2％～0.4％，外层pH值在2.5～3.0。 [0159] 在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本实用新型的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。 [0160] 尽管上面已经示出和描述了本实用新型的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本实用新型的限制，本领域的普通技术人员在本实用新型的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。 |
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