[0001] 本发明涉及生物医学工程领域，尤其涉及一种基于大蓝闪蝶翅膀的工程化心肌组织的制备方法及其应用。

[0002] 心血管疾病是目前世界范围包括中国在内因病致死的首要原因。以心肌梗死为代表的心血管疾病通常导致心脏不可逆转地损失高达数以亿计的功能性心肌细胞，这些坏死的心肌细胞逐渐被成纤维细胞所形成的瘢痕组织替代，心脏随之发生心室重构，使患者逐渐从稳定的缺血性心脏病状态发展为不稳定的心力衰竭直至最终死亡。因此，迫切需要寻求新的细胞来源对心梗患者丢失的心肌细胞进行有效的补充。利用人多能性干细胞分化的心肌细胞构建的工程化心肌组织对心肌梗死患者丢失的心肌细胞进行有效的补充是降低心室不良重构、提高心功能的理想手段。如WANG LEYU,等(Injectable and conductive cardiac patches repair infarcted myocardium in rats and minipigs)首次构建了可微创递送的高导电性心肌补片，并将其应用在小型猪的心梗治疗上，具体地，利用甲基丙烯酸酯化明胶、甲基丙烯酸酯化弹性蛋白以及碳纳米管制备了高导电超弹性水凝胶，其中，高浓度碳纳米管形成的密集导电网络赋予了水凝胶高导电性，分级多孔结构以及冷冻成胶方式赋予了水凝胶弹性、接近零的压缩泊松比以及水驱动的形状记忆功能。由此水凝胶形成的可注射导电心肌补片被卷起来放进医用软导管中，在胸腔镜下可通过微创递送方式成功输送到小型猪心脏表面，在水流驱动下心肌补片可完全恢复至预制的结构形态，且注射前后补片的结构以及细胞活力无明显差异。将未装载/已装载心肌细胞心肌细胞的可注射导电心肌补片分别移植入大鼠及小型猪的梗死心脏表面，4周后检测发现两种心肌补片均可有效提升梗死心脏的心功能及促进梗死心脏的再血管化，装载有心肌细胞的可注射导电心肌补片显示出更好的促心梗修复效果。董宝军(组织工程化心肌的构建及其相关基础研究)以新生大鼠心肌细胞为种子细胞，以液态I型胶原为支架材料，在无Matrigel胶加入条件下，在体外成功构建了具有节律性自主收缩功能的工程化心肌组织。同时，还将大鼠肺微血管内皮细胞与新生大鼠心肌细胞联合应用作为种子细胞，成功构建了具有一定血管化水平的组织工程化心肌，并在构建中加入VEGF及其纳米粒来提高再造心肌组织中心肌细胞的存活率，在一定程度上促进组织工程化心肌血管化。但是目前的瓶颈是工程化心肌组织结构和功能上不成熟，不能准确模拟成体的心肌组织，移植也可能导致心律不齐、代谢紊乱等问题。目前有课题组将心肌细胞修饰于闪蝶鳞翅的表面，组装后的心肌细胞得益于周期性平行的翅膀纳米线，可恢复自主搏动能力，并具有良好的细胞定向和收缩性能，由于搏动过程伴随着心肌细胞的伸长和收缩，弹性蝴蝶翅膀基底也会经历相同的变形周期，从而导致其结构颜色和光子带隙的同步变化，从而实现自我报告。但其仅实现了老鼠原代心肌细胞的自主跳动，通过心肌细胞的跳动实现传感，该技术中并未形成成熟的心肌组织，将该心肌组织用于生物医学工程。因此，亟需寻找一种能够促进工程化心肌组织结构和功能成熟的方法，拓展其在心梗等心血管疾病中的应用。

[0003] 为解决上述技术问题，本发明通过构建各向异性且导电性优异的培养基底促进人多能干细胞来源心肌细胞的有序排列和电信号的高效传导，促进工程化心肌组织成熟，成熟的工程化心肌组织作为心肌补片移植于心肌梗死小鼠体内能够有效改善心梗小鼠心功能，抑制心肌纤维化。

[0004] 本发明的第一个目的是提供一种基于大蓝闪蝶翅膀的工程化心肌组织的制备方法，包括以下步骤：

[0005] S1、在大蓝闪蝶翅膀表面修饰导电纳米材料，采用碱溶液和酸溶液对修饰后的大蓝闪蝶翅膀进行处理；

[0006] S2、对S1处理后的大蓝闪蝶翅膀进行表面修饰，将包括人多能干细胞来源心肌细胞在内的细胞接种于大蓝闪蝶翅膀表面进行培养，得到上述工程化心肌组织。

[0007] 申请人发现，大蓝闪蝶鳞翅上培养的心肌细胞钙信号完成更高效，证明大蓝闪蝶鳞翅能够促进心肌细胞成熟。由于心肌细胞的跳动特性、基因表达谱、超微结构、肌节长度、线粒体密度、T‑管、氧化代谢能力和钙信号等都需要电信号的调节，因此，大蓝闪蝶鳞翅结合导电材料是促进心肌组织结构和功能成熟的新方法，在心梗等心血管疾病中具有应用潜力。

[0008] 进一步地，在步骤S1中，导电纳米材料包括但不限于石墨烯、碳纳米管、MXenes等，如二维MXenes、二维石墨烯、一维碳纳米管，优选为超顺碳纳米管。对大蓝闪蝶翅膀进行修饰时，顺着翅膀结构定向填充导电纳米材料，导电纳米材料通过物理吸附于翅膀表面。

[0009] 进一步地，翅膀表面修饰3‑20层导电纳米材料，优选为5层。

[0010] 进一步地，在步骤S1中，碱溶液选自浓度为0.5‑2M的氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液，优选为1M氢氧化钠溶液。

[0011] 进一步地，在步骤S1中，酸溶液选自浓度为0.1‑2M的盐酸溶液、硝酸溶液或醋酸溶液，优选为1M盐酸溶液。

[0012] 进一步地，在步骤S2中，采用多聚鸟氨酸、多聚赖氨酸和Matrigel中的一种或多种对大蓝闪蝶翅膀进行表面修饰，具体地，利用1％‑3％多聚鸟氨酸、0.5％‑2％多聚赖氨酸、1％‑3％Matrigel等浸泡翅膀完成表面修饰。优选地，将翅膀浸泡在1％Matrigel溶液中12小时。

[0013] 进一步地，在步骤S2中，包括人多能干细胞来源心肌细胞在内的细胞可仅包括人多能干细胞来源心肌细胞，也可包括人多能干细胞来源心肌细胞和支持细胞。人多能干细胞来源心肌细胞可为人胚胎干细胞来源心肌细胞和/或人多能干细胞来源心肌细胞，支持细胞包括人源内皮细胞、人源成纤维细胞、人源平滑肌细胞和人源间充质干细胞中的一种或多种。

[0014] 优选地，将人多能干细胞来源心肌细胞、人源内皮细胞和人源间充质干细胞按照一定比例在翅膀表面进行共培养。

[0015] 进一步地，人多能干细胞来源心肌细胞、人源内皮细胞和人源间充质干细胞共培养比例选自2:1:1、3:1:1、4:2:1中任一种，优选为按2:1:1比例接种人多能干细胞来源心肌细胞、人源内皮细胞和人源间充质干细胞。

[0016] 进一步地，人源间充质干细胞包括人脐带间充质干细胞、人骨髓间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞中任一种。

[0017] 进一步地，细胞接种后24小时内选用含有B27的RPMI‑1640培养基，24小时后换成CDM3培养基培养，并每间隔24小时换液。

[0018] 进一步地，在步骤S2中，进行表面修饰前，还包括对大蓝闪蝶翅膀进行灭菌的步骤，具体地：等离子体处理翅膀表面，然后将翅膀在紫外光下照射，然后按照90‑100％、70‑80％、45‑55％、20‑30％、5‑10％酒精浓度梯度处理，最后用灭菌水浸泡清洗。

[0019] 在心肌组织工程中，体外心肌组织成熟化的实现是一个重要环节，如Wang Y等通过单细胞测序尝试揭示心肌细胞成熟机制，张兆铭等以铂纳米粒子为载体构建了一个Pt‑PDMS平台来促进体外心肌细胞成熟，周斌构建了交变磁场刺激系统，对生长在定向电磁复合水凝胶支架上的心肌细胞进行长时磁场刺激，发现交变磁场和定向电磁复合水凝胶支架共同作用能够促进心肌组织成熟。心肌细胞的成熟依赖于有序的细胞排列和间隙连接蛋白表达的增加，本发明通过对生物工程基底的几何结构和导电性的选择实现了工程化心肌组织结构和功能成熟。

[0020] 本发明提供了一种基于大蓝闪蝶构建成熟工程化心肌组织的新方法，克服了目前工程化心肌组织结构和功能上不成熟的问题，能够培养形成跳动的工程化心肌组织，并通过翅膀表面的各向异性拓扑结构结合导电基底协同作用促进心肌组织成熟。

[0021] 本发明的第二个目的是提供一种促进心肌组织体外成熟的方法，包括以下步骤：

[0022] S1、在大蓝闪蝶翅膀表面修饰导电纳米材料，并采用碱溶液和酸溶液对修饰后的大蓝闪蝶翅膀进行处理；

[0023] S2、对处理后的大蓝闪蝶翅膀进行表面修饰，将包括心肌细胞在内的细胞接种于大蓝闪蝶翅膀表面进行培养，从而促进心肌组织的成熟。

[0024] 进一步地，采用多聚鸟氨酸、多聚赖氨酸和Matrigel中的一种或多种表面修饰。

[0025] 进一步地，采用分子生物学、活细胞成像、透射电子显微镜(TEM)、细胞能量代谢分析、钙成像和膜片钳等手段研究工程化心肌组织结构和功能成熟。

[0026] 本发明的第三个目的是提供上述工程化心肌组织在制备心脏疾病治疗产品(如心肌补片)中的应用。成熟的工程化心肌组织作为心肌补片移植于心肌梗死小鼠体内能够有效改善心梗小鼠心功能，抑制心肌纤维化，当然，其也可用于制备其他与心肌损伤相关疾病治疗产品。

[0027] 进一步，采用永久性结扎冠状动脉左前降支的方式构建小鼠心肌梗死模型，将成熟后的心肌组织作为心肌补片贴附在心梗区域，然后关胸，缝合皮肤。分别在3天、7天、14天和28天不同的时间点使用小动物心超检测小鼠射血分数和短轴缩短率等心功能参数，并采用HE和Masson'sTrichrome染色检测心梗区域损伤程度和纤维化程度。

[0028] 本发明的第四个目的是提供上述工程化心肌组织在制备心血管疾病模型中的应用。

[0029] 本发明的第五个目的是提供上述工程化心肌组织在制备心脏药物筛选模型中的应用。

[0030] 本发明的第六个目的是提供上述工程化心肌组织在制备药物心脏毒性评价模型中的应用。

[0031] 在药物研发中，心脏毒性是新药上市前安全性评估的重要部分，也是候选药物是否成功的主要原因之一。目前以动物模型和体外细胞培养分析为代表的传统药物筛选方法，由于无法复制人体内真实情况，难以准确预测药效和药物毒性，导致药物研发成本高、耗时长。工程化心肌组织可以代替传统药物筛选方法，但人干细胞来源的心肌细胞不成熟的表型限制了其在药物筛选中的应用，因此，本发明申请提供的成熟的工程化心肌组织突破了上述限制，在心血管疾病研究及其药物筛选中具有极大的应用价值。

[0032] 借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

[0033] (1)本发明选择的大蓝闪蝶翅膀表面具有定向有序的拓扑结构，能够调控细胞的生长方向，促进人多能干细胞来源心肌细胞的有序排列和成熟，其作为工程化心肌组织基底，省略了繁琐昂贵的图案化加工过程。

[0034] (2)心脏的主要生理功能是通过兴奋收缩耦联为身体提供营养支持，而心脏的收缩耦联依赖于心肌细胞的有序排列和电信号的有效传导。石墨烯、碳纳米管、MXenes等导电纳米材料具有优异导电性，能够协同各向异性基底促进工程化心肌组织成熟。

[0035] 上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。

[0036] 为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。

[0037] 图1为本发明的工程化心肌组织的构建和应用示意图；

[0038] 图2为大蓝闪蝶翅膀表面定向有序拓扑结构的扫描电镜图；

[0039] 图3为实施例1制备的大蓝闪蝶翅膀表面心肌组织的免疫荧光染色图片，图中所示蛋白cTNT和α‑actinin是心肌细胞的肌丝和肌节蛋白；

[0040] 图4为实施例1制备的大蓝闪蝶翅膀表面心肌组织的钙瞬变图；

[0041] 图5为通过钙成像对比显示翅膀表面心肌组织更成熟的结果；

[0042] 图6为采用实施例2的心肌组织制备的心肌补片移植改善心梗小鼠心功能的心超示意图；

[0043] 图7为采用实施例2的心肌组织制备的心肌补片移植改善心梗小鼠心功能的左心室射血分数和短轴缩短率心功能参数比较。

[0044] 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

[0045] 实施例1工程化心肌组织的构建

[0046] (1)取大蓝闪蝶翅膀标本用75％酒精清洗(翅膀表面结构如图2所示)。

[0047] (2)在75％酒精中顺着翅膀结构定向铺排直径为10‑50nm碳纳米管5层，并晾干。

[0048] (3)在1M氢氧化钠溶液中浸泡翅膀48小时；用去离子水清洗翅膀4遍。

[0049] (4)在1M盐酸中浸泡翅膀24小时；用去离子水清洗翅膀4遍并且晾干备用。

[0050] (5)对翅膀表面进行2min等离子体处理，在紫外光下照射30min后按照100％,75％,50％,25％,5％酒精浓度梯度处理，并用灭菌水浸泡清洗3‑6次。

[0051] (6)灭菌后的翅膀表面采用含1％Matrigel的PBS浸泡12小时。

[0052] (7)在翅膀表面接种人多能干细胞分化并纯化的心肌细胞，细胞接种后24小时内用含有B27的RPMI‑1640培养基培养，24小时后换成CDM3培养基培养8天，期间每天换液一次。

[0053] (8)翅膀表面的心肌细胞培养形成功能化心肌组织，并且采用免疫化学染色和钙成像评估心肌组织的成熟度(如图3‑5所示)，其中，图5a为对照组，对照组取常规细胞扒片用75％酒精清洗后在紫外光下照射30min，然后用灭菌水浸泡清洗3‑6次。灭菌后的细胞扒片表面采用含1％Matrigel的PBS浸泡12小时。之后在细胞扒片表面接种人多能干细胞分化并纯化的心肌细胞，细胞接种后24小时内用含有B27的RPMI‑1640培养基培养，24小时后换成CDM3培养基培养8天，期间每天换液一次。

[0054] 实施例2

[0055] (1)取大蓝闪蝶翅膀标本用75％酒精清洗。

[0056] (2)在75％酒精中顺着翅膀结构定向铺排10层石墨烯，并晾干。

[0057] (3)在2M氢氧化钾溶液中浸泡翅膀48小时；用去离子水清洗翅膀4遍。

[0058] (4)在2M醋酸中浸泡翅膀24小时；用去离子水清洗翅膀4遍并且晾干备用。

[0059] (5)对翅膀表面进行2min等离子体处理，在紫外光下照射30min后按照100％,75％,50％,25％,5％酒精浓度梯度处理，并用灭菌水浸泡清洗3‑6次。

[0060] (6)灭菌后的翅膀表面采用含1％多聚鸟氨酸和2％多聚赖氨酸的PBS浸泡12小时。

[0061] (7)在翅膀表面接种人多能干细胞分化并纯化的心肌细胞，细胞接种后24小时内用含有B27的RPMI‑1640培养基培养，24小时后换成CDM3培养基培养8天，期间每天换液一次。

[0062] (8)翅膀表面的心肌细胞培养形成功能化心肌组织，并且采用免疫化学染色和钙成像评估心肌组织的成熟度。

[0063] 实施例3

[0064] (1)取大蓝闪蝶翅膀标本用75％酒精清洗。

[0065] (2)在75％酒精中顺着翅膀结构修饰一层MXene薄膜，并晾干。

[0066] (3)在0.5M氢氧化钠溶液中浸泡翅膀48小时；用去离子水清洗翅膀4遍。

[0067] (4)在0.5M硝酸中浸泡翅膀24小时；用去离子水清洗翅膀4遍并且晾干备用。

[0068] (5)对翅膀表面进行2min等离子体处理，在紫外光下照射30min后按照100％,75％,50％,25％,5％酒精浓度梯度处理，并用灭菌水浸泡清洗3‑6次。

[0069] (6)将灭菌后的翅膀采用含1％多聚鸟氨酸的PBS浸泡12小时。

[0070] (7)在翅膀表面分别接种等量的下列细胞：①人多能干细胞来源的心肌细胞，②人多能干细胞来源心肌细胞、人源内皮细胞和人源间充质干细胞共培养比例为2:1:1，③人多能干细胞来源心肌细胞、人源内皮细胞和人源间充质干细胞共培养比例为3:1:1，④人多能干细胞来源心肌细胞、人源内皮细胞和人源间充质干细胞共培养比例为4:2:1。细胞接种后24小时内用含有B27的RPMI‑1640培养基培养，24小时后换成CDM3培养基培养8天，期间每天换液一次。

[0071] (8)翅膀表面的心肌细胞培养形成功能化心肌组织，并且采用免疫化学染色和钙成像评估心肌组织的成熟度。

[0072] 实施例4基于大蓝闪蝶翅膀构建工程化心肌组织应用于心肌梗死治疗[0073] (1)采用永久性结扎冠状动脉左前降支的方式构建小鼠心肌梗死模型，将实施例2成熟后的心肌组织作为心肌补片贴附在心梗区域，然后关胸，缝合皮肤。

[0074] (2)分别在第3天、7天、14天和28天不同的时间点使用小动物心超检测小鼠射血分数和短轴缩短率等心功能参数(如图6和7所示)。

[0075] (3)采用HE和Masson's Trichrome染色检测心梗区域损伤程度和纤维化程度。

[0076] (4)采用免疫组织化学染色CD31观察心梗区域血管新生程度。

[0077] 由以上结果可知，本法民制备的心肌补片改善心梗小鼠的心功能，抑制心肌纤维化。

[0078] 实施例5构建疾病模型

[0079] 使用如儿茶酚胺的神经递质高强度刺激本发明制备的工程化心肌组织，引发类器官产生心力衰竭的行为，采用细胞免疫荧光染色、qPCR等技术手段检测此模型是否有收缩功能障碍、心肌肥大、心肌细胞死亡和N端‑B型钠尿肽前体释放，从而评估心力衰竭模型是否构建成功。同时使用α‑肾上腺素受体拮抗剂苯氧苄胺和β‑肾上腺素受体拮抗剂美托洛尔对此心力衰竭模型的治疗效果。

[0080] 从MYH7基因突变的肥厚型心肌病患者皮肤细胞获得hiPSCs，再将hiPSCs诱导分化为心肌细胞，以此细胞来构建本发明的工程化心肌组织。通过检测心肌肥大、心肌组织结构排列有序性和异常钙处理活性收缩功能等指标，评估肥厚型心肌病模型是否构建成功。

[0081] 显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。