一种通过增强侧链降解能力提高甾醇转化的方法 |
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| 申请号 | CN202311510665.2 | 申请日 | 2023-11-13 | 公开(公告)号 | CN117821347A | 公开(公告)日 | 2024-04-05 |
| 申请人 | 天津科技大学; | 发明人 | 王敏; 申雁冰; 高园园; 范云爽; 石畅; 苏振华; 夏梦雷; | ||||
| 摘要 | 本 发明 属于 生物 催化技术领域，具体涉及一种通过增强 侧链 降解能 力 提高甾醇转化的方法。所述方法是通过在具有甾体药物中间体生产能力的菌株中敲除转录因子FdmR编码基因，同时对异 柠檬酸 裂解酶ICL和 琥珀酸 脱氢酶SDH中的至少一种进行过表达获得的。本发明首次证明了转录因子FdmR在利用甾醇生产甾体药物中间体过程中的独特作用，为提升甾体药物中间体生产菌株的生产能力提供了新方法。该方法也可用于其他工业生产菌株侧链降解能力的加强，具有广泛的应用价值。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一株能够进行甾醇转化的基因工程菌，其特征在于，所述菌株是将出发菌株中的转录因子FdmR编码基因进行敲除获得的； |
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| 说明书全文 | 一种通过增强侧链降解能力提高甾醇转化的方法技术领域： [0002] 甾体药物是仅次于抗生素的第二大类药物，拥有巨大的市场和发展前景。以植物甾醇为原料，可生产的甾药中间体主要有C19‑甾体(AD、ADD、9‑OH‑AD)和C22‑甾体(20‑羧 基‑孕甾‑4‑烯‑3‑酮、4‑BNC、20‑羟甲基‑孕甾‑4‑烯‑3‑酮、4‑BNA)两大类。其中，雄甾‑4‑烯‑ 3,17‑二酮(Androstenedione，AD)可用来生产雄激素、蛋白同化激素、螺内酯等药物；由AD 经C1,2位脱氢生成的雄甾‑1,4‑二稀‑3,17‑二酮(Androsta‑diene‑dione，ADD)可用来合成 19‑去甲甾体系列雌激素，如雌酮(Estrone)，炔诺酮(Norethisterone)和黄体酮 (Progestin)等。除了合成性激素外，还可在AD的酮基上引入皮质激素侧链使之能够应用于 皮质激素的生产，或通过在不同位点上进行羟基化，生产更多类型的甾药中间体，如9α‑OH‑ AD、5α‑OH‑AD、11α‑OH‑AD等。由此可见，AD几乎可以合成所有的甾体药物，因此其在市场上 极为畅销，目前甾药中间体的市场规模位列药物市场第二位。 [0003] 目前，AD的生产方法主要以微生物转化法为主，其中分枝杆菌属微生物是甾体药物中间体的主要生产菌株。分枝杆菌属微生物在将植物甾醇、胆固醇等甾醇类物质转化为 甾体药物前体时，主要经过甾醇吸收、初步氧化和甾醇侧链降解三个过程。甾醇转化生成AD 过程是一个多酶促反应，其中最关键的步骤则是C17侧链降解的过程。 [0005] 对于AD的增产，主要是通过基因工程手段对代谢途径中关键基因的增强或减弱，以实现不同节点处甾药中间体的积累。然而无论是原始菌株还是工程菌株均具有较长的转 化周期(≥120h)，且在转化中后期菌株的转化效率的急剧降低，这也是造成甾药中间体生 + 产成本高昂的原因之一。在甾醇侧链降解生产甾药中间体过程中NAD和辅酶A等辅因子被 转化为NADH、丙酰辅酶A和乙酰辅酶A。乙酰辅酶A连接着糖酵解、TCA循环等重要代谢途径， 是生物合成的重要中心，而异柠檬酸裂解能够催化异柠檬酸形成乙醛酸与琥珀酸流向TCA 循环中，作为TCA循环的一个分支，增强乙醛酸循环能够有效提高TCA循环的的速率。琥珀酸 脱氢酶的表达可增强琥珀酸的代谢，降低琥珀酸积累。在甾醇侧链降解的过程中，中间产物 的过量积累对甾醇类物质转化为甾体药物前体的代谢过程具有抑制作用，是影响甾体药物 中间体高效生成的原因之一。 发明内容： [0006] 本发明的目的是提供一种通过增强侧链降解能力提高甾醇转化的方法，并利用该方法构建基因工程菌，从而解决微生物法甾药中间体生产过程中，甾醇侧链降解代谢途径 冗长导致甾醇转化率降低，继而导致甾药中间体价格高昂的问题。为了解决上述技术问题， 本发明采用以下技术方案： [0007] 本发明提供的技术方案之一，是一株能够进行甾醇转化的基因工程菌，所述菌株是将出发菌株中的转录因子FdmR编码基因进行敲除获得的； [0008] 进一步地，所述基因工程菌还对异柠檬酸裂解酶ICL和琥珀酸脱氢酶SDH中的至少一种进行过表达； [0009] 进一步地，所述琥珀酸脱氢酶SDH包括：琥珀酸脱氢酶的A亚基SDHA、琥珀酸脱氢酶的B亚基SDHB、琥珀酸脱氢酶的C亚基SDHC和琥珀酸脱氢酶的D亚基SDHD四个亚基，分别由 sdhA、sdhB、sdhC和sdhD编码；通过对上述四个亚基中的至少一个进行过表达，从而实现对 琥珀酸脱氢酶SDH的过表达；优选sdhD； [0010] 进一步地，所述出发菌株为具有甾体药物中间体生产能力的菌株； [0011] 所述的甾体药物中间体，包括但并不限于雄甾‑4‑烯‑3,17‑二酮(androst‑4‑ene‑3,17‑dione，AD)、9α‑羟基雄甾‑4‑烯‑3,17‑二酮(9α‑hydroxyandrost‑4‑ene‑3,17‑dione， 9α‑OH‑AD)、雄甾‑1,4‑二烯‑3,17‑二酮(Androst‑1,4‑diene‑3,17‑dione，ADD)等； [0012] 进一步地的，所述出发菌株为大肠杆菌BL21菌株、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),分枝杆菌(Mycobacterium sp.)NRRLB‑3683、分枝杆菌(Mycobacterium sp.) NRRLB‑3805、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatism)、偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)、微黄分枝杆菌(Mycobacterium gilvum)、新金分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum)、草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)等； [0013] 优选地，所述出发菌株为快速生长型新金分枝杆菌(Mycobacterium sp.)MNR M3，该菌株已保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CICC 21097； [0014] 更优选地，所述能够进行甾醇转化的基因工程菌，是以快速生长型新金分枝杆菌(Mycobacterium sp.)MNR M3为出发菌株，通过敲除FdmR编码基因，过表达异柠檬酸裂解酶 ICL和琥珀酸脱氢酶SDH的D亚基编码基因获得； [0015] 进一步地，所述转录因子FdmR的编码基因fdmR，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示； [0016] 进一步地，所述异柠檬酸裂解酶ICL的编码基因icl，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示； [0017] 进一步地，所述的sdhA，核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示； [0018] 进一步地，所述的sdhB，核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示； [0019] 进一步地，所述的sdhC，核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示； [0020] 进一步地，所述的sdhD，核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示； [0021] 进一步地，所述的基因工程菌是通过敲除载体对FdmR编码基因进行敲除的； [0022] 进一步地，所述的基因工程菌是利用基因工程表达载体对ICL、SDHA、SDHB、SDHC和SDHD中的至少一种编码基因进行过表达的； [0023] 进一步地，所述的基因工程敲除载体是细菌敲除载体； [0024] 优选的，所述的细菌敲除载体是分枝杆菌敲除载体； [0025] 进一步地，所述的基因工程表达载体是细菌表达载体； [0026] 优选的，所说的细菌表达载体是分枝杆菌表达载体； [0027] 更优选的，所述的分枝杆菌表达载体是pMV306和pMV261分枝杆菌‑大肠杆菌穿梭表达载体；所述的分枝杆菌敲除载体含有p2NIL、pGOAL19质粒全部或部分序列。 [0028] 本发明提供的技术方案之二，是技术方案一所述基因工程菌在生产甾体药物中间体中的应用，特别是在生产AD中的应用； [0029] 进一步地，在生产AD中的应用具体如下： [0030] 将基因工程菌种子培养液以2～10％的接种量转接于发酵培养基中，在25～35℃，50～200rpm条件下培养24～168h；AD产量可以达到0.3～30g/L，摩尔转化率可以达到50％ ～100％； [0031] 发酵培养基组成：K2HPO4 0.1～3g/L，MgSO4 0.1～3g/L，柠檬酸铁铵0.01～0.2g/L，柠檬酸1～5g/L，磷酸氢二铵1～10g/L，葡萄糖5～50g/L，植物甾醇1～50g/L，其余为水， pH6.0～7.5。 [0032] 有益效果： [0033] 本发明通过在甾体药物中间体生产菌MNR M3中单独敲除fdmR基因获得M3ΔfdmR，在发酵过程中，其胞内乙酰辅酶A含量比出发菌株MNR提高33％以上，在96h时AD转化率达 85.41％，比同期出发菌株M3的AD转化率提高14.58％；同时发现，敲除fdmR基因后，在96h由 于乙酰辅酶A的迅速大量积累使得细胞活力比出发菌株M3降低了10.41％；通过在M3ΔfdmR中 单独过表达icl基因获得菌株M3ΔfdmR‑icl，加强了菌株中乙酰辅酶A的代谢，提高菌体活力，提 高甾醇的转化效率。在发酵过程中，其胞内乙酰辅酶A含量比出发菌株增加了21.34％以上， 细胞活力与出发菌株M3相近，在120h最高AD转化率达到95.25％，比同期出发菌株M3的AD转 化率提高25％；通过在M3ΔfdmR‑icl中串联表达sdhD基因获得菌株M3ΔfdmR‑icl‑sdhD，在发酵过程 中，其琥珀酸含量降低28.68％，在96h时AD的转化率可达到93.34％，转化效率明显提升，且 120h最高AD转化率达99.44％，比同期出发菌株M3的AD转化率提高了29％。本发明首次证明 了转录因子FdmR在利用甾醇生产甾体药物中间体过程中的独特作用，为提升甾体药物中间 体生产菌株的生产能力提供了新方法。该方法也可用于其他工业生产菌株侧链降解能力的 加强，具有广泛的应用价值。 [0034] 如图8所示，M3、M3ΔfdmR、M3ΔfdmR‑icl、M3ΔfdmR‑icl‑sdhA、M3ΔfdmR‑icl‑sdhB、M3ΔfdmR‑icl‑sdhC、M3ΔfdmR‑icl‑sdhD各菌株的AD摩尔转化率，七种基因工程菌株的AD摩尔转化率始终高于原始菌株M3。在72h，菌株M3ΔfdmR、M3ΔfdmR‑icl、M3ΔfdmR‑icl‑sdhA、M3ΔfdmR‑icl‑sdhB、M3ΔfdmR‑icl‑sdhC和M3ΔfdmR‑icl‑sdhD的AD摩尔转化率分别为72.01％、75.60％、66.35％、74.06％、64.43％和 83.16％，分别是原始菌株M3的1.38倍、1.44倍、1.27倍、1.41倍、1.23倍和1.59倍，；在96h， 菌株M3ΔfdmR、M3ΔfdmR‑icl、M3ΔfdmR‑icl‑sdhA、M3ΔfdmR‑icl‑sdhB、M3ΔfdmR‑icl‑sdhC和M3ΔfdmR‑icl‑sdhD的AD摩尔转化率分别为85.41％、90.95％、80.00％、87.39％、80.36％和93.34％，明显提高了甾醇 的转化效率；在120h，特别是菌株M3ΔfdmR‑icl‑sdhD的AD摩尔转化率达到了99.44％。 附图说明： [0035] 图1为pYKdel‑fdmR敲除质粒构建过程的酶切验证图谱 [0036] 其中泳道M是DNA标准marker，泳道pYKdel‑fdmR是pYKdel‑fdmR敲除载体经PacⅠ单酶切结果。 [0037] 图2为单交换菌株SCOΔfdmR的PCR验证 [0038] 其中泳道M是DNA标准marker，泳道M3是含有完整fdmR基因扩增条带，泳道SCOΔfdmR是单交换后在2840bp及2240bp处有长短两条扩增条带。 [0039] 图3为fdmR敲除菌基因型的验证 [0040] 其中泳道M是DNA标准marker，泳道M3是含有完整fdmR基因扩增条带，泳道M3ΔfdmR是敲除后含有缺失600bp的fdmR基因扩增条带(出发菌株在2840bp有扩增条带，敲除菌株因 缺失了fdmr，因此在2240bp处有条带，缺失的600bp即为fdmr)。 [0041] 图4为icl基因的扩增产物核酸电泳图 [0042] 其中泳道M是DNA标准marker，泳道1‑2是icl基因扩增条带。 [0043] 图5为pMV261‑icl过表达载体构建过程的酶切验证图谱 [0044] 其中泳道M是DNA标准marker，泳道1‑2是pMV261‑icl HindⅢ单酶切结果。 [0045] 图6是原始菌株M3、fdmR敲除菌株M3ΔfdmR和fdmR敲除及icl过表达菌株M3ΔfdmR‑icl1菌株乙酰辅酶A含量的变化。 [0046] 图7是原始菌株M3、fdmR敲除菌株M3ΔfdmR、fdmR敲除及icl过表达菌株M3ΔfdmR‑icl菌株活力的变化。 [0047] 图8原始菌株M3、fdmR敲除菌株M3ΔfdmR、fdmR敲除icl过表达菌株M3ΔfdmR‑icl和fdmR敲除、icl及sdh过表达菌株M3ΔfdmR‑icl1‑sdhA、M3ΔfdmR‑icl1‑sdhB、M3ΔfdmR‑icl1‑sdhC、M3ΔfdmR‑icl1‑sdhD七种菌株中AD生产变化图。 具体实施方式： [0049] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆实验指南(第四版)》(科学出版社2017)中所述的条件进行。 [0050] 以下通过具体实施例对本发明作进一步地解释说明。 [0051] 实施例1FdmR编码基因缺失工程菌的构建 [0052] 构建分枝杆菌基因敲除质粒，将其电转化至分枝杆菌感受态中，利用潮霉素和卡那霉素进行双抗筛选并同时进行蓝白斑筛选。对筛选正确的菌株进行蔗糖平板筛选并同时 进行卡那霉素抗性复筛以获得基因敲除阳性克隆子。利用PCR方法对基因敲除克隆子进行 验证。具体步骤如下： [0053] 1.M3感受态细胞制备：将M3菌株(CICC 21097)接种到LB培养基中，30℃培养至OD600为1.0左右，按10％接种量转接到种子培养基中进行二级种子培养；24h后加入2％甘氨 酸继续培养24h。离心收集菌体，分别用1倍、3/4倍、1/2倍和1/4倍种子液体积的10％预冷甘 油冲洗悬浮菌体并离心，最后加入1/25倍的10％甘油悬浮菌体，并分装保存； [0054] 2.敲除质粒构建：设计fdmR基因上、下臂引物，以M3的基因组DNA为模板，扩增fdmR的上、下游同源臂。 [0055] 上臂引物QC‑PDU‑F和QC‑PDU‑R： [0056] QC‑PDU‑F：taaactaccgcattaaagcttgatatcgcctcgctgtccac； [0057] QC‑PDU‑R：ccggccgcgatggcatccat； [0058] 下臂引物QC‑PDD‑F和QC‑PDD‑R： [0059] QC‑PDD‑F：atggatgccatcgcggccggggcgggcgaggcgatc； [0060] QC‑PDD‑R：actatagaatacataggatccgggaagaaccgagagcactga。 [0061] 分别将目标基因fdmR的上、下游同源臂基因利用PCR技术进行扩增，连接在经BamHⅠ和HindⅢ双酶切的分枝杆菌基因敲除质粒p2NIL上。之后，分别用PacI酶切上述质粒和 pGOAL19质粒后利用T4连接酶进行连接，构建基因敲除质粒pYKdel‑fdmR，酶切已验证(图 1)。 [0062] 3.取10μL pYKdel‑fdmR敲除质粒加入到100μL M3感受态菌体中放置30分钟后转入电转杯进行点击。电击条件2kV/cm，25μF，720Ω条件下电转3～6ms后冰上放置5min后转 入新灭菌1.5mL离心并加入500μL新鲜灭菌LB培养基，30℃200rpm进行复苏3～24小时。涂布 在含有hyg 50μg/ml、Kan 20μg/ml、X‑gal 50μg/ml的LB固体培养基上培养5～7天，挑取带 蓝斑菌落，利用上游正向引物(QC‑PDU‑F)和下游反向引物(QC‑PDD‑R)进行PCR验证正确(图 2)的即为单交换菌株。将验证好的单交换菌涂布含2％蔗糖平板上，培养3～7天挑取白色菌 落提取基因组利用上游正向引物(QC‑PDU‑F)和下游反向引物(QC‑PDD‑R)进行PCR验证(图 3)，fdmR基因缺失菌株命名为M3ΔfdmR。 [0063] 实施例2ICL编码基因的获得，单基因过表达载体构建 [0064] 本实施例仅以PCR方法为例，从M3中克隆ICL编码基因icl的SEQ ID NO.2序列。 [0065] PCR引物为icl‑F和icl‑R。以M3的基因组DNA为模板进行PCR扩增以获得M3的icl基因(SEQ ID NO.2所示)。扩增产物经核酸电泳检测(图4，1284bp)后测序。测序结果表明所获 得的核苷酸片段即为icl基因。 [0066] 利用pMV261质粒构建用于icl基因自身过表达基因工程表达载体，其过程包括：将上述获得的icl基因胶回收后，与经EcoRI和HindIII双酶切胶回收的pMV261质粒混合，利用 Minerva Super Fusion Cloning Kit无缝克隆试剂盒进行连接，连接产物经化学转化的方 法转入Escherichia coli DH5α，经卡那霉素筛选得到阳性克隆。提取阳性克隆中的质粒经 HindIII单酶切验证(图5，pMV261‑icl质粒经HindIII单酶切后在5771bp处应有条带)和测 序后，得到构建成功的用于icl基因自身过表达基因工程表达载体pMV261‑icl。 [0067] 表1ICL、SDHA、SDHB、SDHC和SDHD编码基因的获得所用引物 [0068] [0069] 实施例3SDHA、SDHB、SDHC和SDHD编码基因的获得，串联过表达载体的构建 [0070] 以M3的基因组DNA为模板，利用表1中的引物sdhA‑F/R、sdhB‑F/R、sdhC‑F/R、sdhD‑F/R，分别扩增获取含有SDHA、SDHB、SDHC和SDHD编码基因的扩增产物。将各扩增产物分别进 行胶回收后与经HindIII与HpaI双酶切胶回收的pMV261‑icl酶切产物进行无缝克隆连接构 建相应质粒。根据其上含有的基因分别命名为pMV261‑icl‑sdhA，pMV261‑icl‑sdhB， pMV261‑icl‑sdhC，pMV261‑icl‑sdhD。 [0071] 实施例4构建FdmR基因缺失ICL、SDHA、SDHB、SDHC和SDHD编码基因加强菌株 [0072] M3ΔfdmR感受态细胞制备：将M3ΔfdmR菌株接种到LB培养基中，30℃培养至0D600为1.0左右，按10％接种量转接到种子培养基中进行二级种子培养；24h后加入2％甘氨酸继续培 养24h。离心收集菌体，分别用1倍、3/4倍、1/2倍和1/4倍发酵液体积的10％预冷甘油冲洗悬 浮菌体并离心，最后加入1/25倍的10％甘油悬浮菌体，并分装保存； [0073] fdmR基因缺失icl基因加强菌株，取10μL实施例2获得的pMV261‑icl基因工程表达载体，加入到100μL M3ΔfdmR感受态菌体中放置30分钟后转入电转杯进行点击。电击条件与 实施例1相同，后冰上放置5min后转入新灭菌1.5mL离心并加入500μL新鲜灭菌LB培养基，30 ℃，200rpm进行复苏3～6小时。 [0074] 重组子筛选与验证：将复苏后的培养物，涂布于含有卡那霉素(50mg/L)LB培养基平板上，30℃静置培养4～7d，挑取单菌落至LB培养基培养2～3d后，提取质粒经测序验证。 验证正确的阳性转化子命名为重组菌M3ΔfdmR‑icl。 [0075] 在重组菌M3ΔfdmR的基础上，按照上述同样的方法，将过表达载体pMV261‑icl‑sdhA，pMV261‑icl‑sdhB，pMV261‑icl‑sdhC，pMV261‑icl‑sdhD分别转化至M3ΔfdmR感受中，对 icl和SDHA、SDHB、SDHC和SDHD编码基因中的一种进行过表达，获得的阳性转化子分别命名 为M3ΔfdmR‑icl‑sdhA，M3ΔfdmR‑icl‑sdhB，M3ΔfdmR‑icl‑sdhC，M3ΔfdmR‑icl‑sdhD。 [0076] 实施例5 M3、M3ΔfdmR、M3ΔfdmR‑icl在侧链降解过程中胞内乙酰辅酶A含量的比较 [0077] 1.菌株活化及种子制备 [0078] 将菌株M3、M3ΔfdmR、M3ΔfdmR‑icl分别转接于新鲜LB培养基上，30℃培养3d，用20mL 0.5％的Tween 80无菌水溶液洗菌，吸取l mL洗脱液加入到50mL种子培养基中，在30℃， 200rpm条件下摇床培养36h得种子液； [0079] 种子培养基组成：K2HPO4 0.5g/L，MgSO4 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，硝酸铵2g/L，甘油20g/L，葡萄糖5g/L，CaCO3 1g/L，其余为水，pH 7.2。 [0080] 2.AD生产过程 [0082] 发酵培养基组成:K2HPO4 0.5g/L，MgSO4 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，磷酸氢二铵3.5g/L，葡萄糖10g/L，羟丙基β‑环糊精38g/L，植物甾醇5g/L，其余为水，pH 7.2。每隔24h取样一次。 [0083] 3.乙酰辅酶A含量检测 [0084] 定时取发酵液，离心收集0.1g菌体后快速冷冻并粉碎，通过PCA沉淀对样品进行脱蛋白，之后用于乙酰辅酶A检测。乙酰辅酶A检测试剂盒购于默克生命科学，按照表2的试剂 配比用于胞内乙酰辅酶A含量的测定。 [0085] 首先，样品准备及背景去除：取50μL的标准品于标准孔中，取50μL样品分别加入样品孔和样品背景孔中。为了校正由游离辅酶A和琥珀酰辅酶产生的背景，在标准孔、样品孔 和样品背景孔中加入10μL乙酰辅酶A淬灭剂。室温下孵育5分钟。再加入2μL淬火去除剂，混 合均匀，再孵育5分钟。 [0086] 其次，根据表2中的方案，准备反应混合物。在每个标准孔和样品孔中加入50μL标准孔及样品孔反应混合物，在每个背景样品孔中加入50μL背景反应混合物，用水平摇床或 移液器将其混合均匀，并将反应物37℃避光孵化10分钟。最后，使用酶标仪测量荧光强度， 最大激发波长为535nm，发射波长为587nm。 [0087] 表2反应混合物(试剂来自乙酰辅酶A检测试剂盒) [0088]成分 标准品及样品反应混合物 样品背景反应混合物 乙酰辅酶A测定缓冲液 40μL 41μL 乙酰辅酶A底物混合物 2μL 2μL 转化酶 1μL ‑ 乙酰辅酶A酶混合物 5μL 5μL 荧光探针 2μL 2μL [0089] 4.结果比较 [0090] 图6显示了M3、M3ΔfdmR、M3ΔfdmR‑icl1各菌株胞内乙酰辅酶A含量的变化。fdmR的敲除及fdmR的敲除和icl的过表达的联合应用均能增加胞内乙酰辅酶A水平，胞内乙酰辅酶A含 量增加21％以上，其中fdmR的敲除的效果最为明显，在48小时可使胞内乙酰辅酶A含量最高 增加97％，但过量的积累可能对于细胞生长产生抑制，而fdmR的敲除和icl的过表达的联合 应用又有效缓解了乙酰辅酶A在胞内过量的积累。 [0091] 实施例6 M3、M3ΔfdmR、M3ΔfdmR‑icl在AD生产中菌体活力水平 [0092] 1.菌株活力检测 [0093] 按照实施例5的方法利用利用M3、M3ΔfdmR、M3ΔfdmR‑icl菌株进行AD的生产，无菌条件下取样1mL进行菌株活力检测。 [0094] 菌株活力检测采用改进的CCK‑8法，检测方法如下：2‑(2‑甲氧基‑4‑硝苯基)‑3‑(4‑硝苯基)‑5‑(2,4‑二磺基苯)‑2H‑四唑单钠盐(WST‑8)在电子载体存在的情况下能够被 细菌的脱氢酶还原成橙黄色的水溶性的Formazan，其生成量和菌株活性呈正相关。 Formazan在450nm处有最大吸收峰，可通过检测450nm下的吸光值(A450)反映菌体活力。取 样液用pH 7.2Tris‑HCl缓冲液将OD600值调为1后，取190μL加入到96孔板中，每孔中分别加 入WST‑810μL，30℃孵育1小时后使用Infinite M200 Pro检测450nm的吸收值。 [0095] 2.结果比较 [0096] M3、M3ΔfdmR、M3ΔfdmR‑icl菌体活力变化情况如图7所示，在整个生产过程中所有菌的活力均呈现先上升后下降的趋势，菌株M3ΔfdmR‑icl始终高于M3、M3ΔfdmR。特别是在96h，M3ΔfdmR 的菌株活力比M3的菌体活力降低了10.41％，而M3ΔfdmR‑icl的菌体活力与M3相近。因此fdmR的 敲除和icl的过表达的联合应用使菌种活力得到改善，提高了单敲除fdmR菌株的菌体活力， 也验证胞内乙酰辅酶A含量的积累会对于细胞活力产生抑制。 [0097] 实施例7 M3、M3ΔfdmR、M3ΔfdmR‑icl、M3ΔfdmR‑icl‑sdhA、M3ΔfdmR‑icl‑sdhB、M3ΔfdmR‑icl‑sdhC、M3ΔfdmR‑icl‑sdhD在AD生产中琥珀酸含量变化 [0098] 1.琥珀酸含量检测 [0099] 按照实施例5的方法利用M3、M3ΔfdmR、M3ΔfdmR‑icl、M3ΔfdmR‑icl‑sdhA、M3ΔfdmR‑icl‑sdhB、M3ΔfdmR‑icl‑sdhC、M3ΔfdmR‑icl‑sdhD菌株进行AD生产，在生产过程中无菌条件下取样1mL，4℃12000rpm离心5分钟收集上清液进行琥珀酸含量的检测。 [0100] 琥珀酸含量的检测采用高效液相的方法：色谱柱Aminex HPX‑87H 300x7.8(mm)，紫外检测器波长215nm，流动相5mM H2SO4，检测温度30℃，并以0.6mL/min的流速进行检测。 [0101] 2.结果比较 [0102] M3、M3ΔfdmR、M3ΔfdmR‑icl、M3ΔfdmR‑icl‑sdhA、M3ΔfdmR‑icl‑sdhB、M3ΔfdmR‑icl‑sdhC、M3ΔfdmR‑icl‑sdhD琥珀酸含量变化情况如表3所示，fdmR的敲除及fdmR的敲除和icl的过表达的联合应用均能提高琥珀酸水平；在fdmR的敲除和icl的过表达的联合应用的基础上再串联表达sdh均能降 低琥珀酸含量，其中串联表达sdhA的菌株由于亚基A和亚基B直接与琥珀酸接触，在发酵后 期将琥珀酸完全代谢使其琥珀酸含量降低为0g/L。 [0103] 表3 M3、M3ΔfdmR、M3ΔfdmR‑icl、M3ΔfdmR‑icl‑sdhA、M3ΔfdmR‑icl‑sdhB、M3ΔfdmR‑icl‑sdhC、M3ΔfdmR‑icl‑sdhD在AD生产中琥珀酸含量(g/L) [0104] M3 M3ΔfdmR M3ΔfdmR‑icl M3ΔfdmR‑icl‑sdhA M3ΔfdmR‑icl‑sdhB M3ΔfdmR‑icl‑sdhC M3ΔfdmR‑icl‑sdhD72h 0.345 0.367 0.421 0.177 0.288 0.152 0.350 96h 0.227 0.325 0.380 0.065 0.230 0.134 0.282 120h 0.265 0.288 0.351 0 0.106 0.120 0.189 144h 0.247 0.233 0.335 0 0 0.086 0.168 [0105] 实施例8 M3、M3ΔfdmR、M3ΔfdmR‑icl、M3ΔfdmR‑icl‑sdhA、M3ΔfdmR‑icl‑sdhB、M3ΔfdmR‑icl‑sdhC、M3ΔfdmR‑icl‑sdhD在AD生产中转化能力比较 [0106] 按照实施例5的方法利用M3、M3ΔfdmR、M3ΔfdmR‑icl、M3ΔfdmR‑icl‑sdhA、M3ΔfdmR‑icl‑sdhB、M3ΔfdmR‑icl‑sdhC、M3ΔfdmR‑icl‑sdhD菌株进行AD生产，在生产过程中无菌条件下取样0.8mL。 [0107] AD生成量的检测：用等体积的乙酸乙酯超声萃取取样液，10000rpm离心10min，取0.1mL上清于1.5mL管中，自然风干后加入流动相溶解，过0.22μm膜后进行高效液相色谱分 析。色谱条件：C18柱，流动相为甲醇:水(4:1)流速为1mL/min，柱温30℃，检测波长为254nm。 摩尔转化率的计算公式为：摩尔产率％＝(Cp×Ms)/(Cs×Mp)×100％，其中Cp为产物浓度 (g/L)，Cs为底物浓度(g/L)，Mp为产物摩尔质量，Ms为底物摩尔质量(本发明均采用该方法 进行测定和计算)。 [0108] 3.结果比较 [0109] 如图8所示，M3、M3ΔfdmR、M3ΔfdmR‑icl、M3ΔfdmR‑icl‑sdhA、M3ΔfdmR‑icl‑sdhB、M3ΔfdmR‑icl‑sdhC、M3ΔfdmR‑icl‑sdhD各菌株的AD摩尔转化率，七种基因工程菌株的AD摩尔转化率始终高于原始菌株M3。在72h，菌株M3ΔfdmR、M3ΔfdmR‑icl、M3ΔfdmR‑icl‑sdhA、M3ΔfdmR‑icl‑sdhB、M3ΔfdmR‑icl‑sdhC和M3ΔfdmR‑icl‑sdhD的AD摩尔转化率分别为72.01％、75.60％、66.35％、74.06％、64.43％和 83.16％，分别是原始菌株M3的1.38倍、1.44倍、1.27倍、1.41倍、1.23倍和1.59倍；在96h，菌 株M3ΔfdmR、M3ΔfdmR‑icl、M3ΔfdmR‑icl‑sdhA、M3ΔfdmR‑icl‑sdhB、M3ΔfdmR‑icl‑sdhC和M3ΔfdmR‑icl‑sdhD的AD摩尔转化率分别为85.41％、90.95％、80.00％、87.39％、80.36％和93.34％，明显提高了甾醇的 转化效率；在120h，特别是菌株M3ΔfdmR‑icl‑sdhD的AD摩尔转化率达到了99.44％。因此负调控 因子fdmR的敲除及icl和sdhD基因过表达有利于AD转化率的提高，并且从120h的结果来看， 作为琥珀酸脱氢酶SDH的不同亚基，并不是都能与负调控因子fdmR的敲除及icl的过表达产 生正面协同作用的，负调控因子fdmR的敲除及icl和sdhD基因过表达产生了预料不到的技 术效果。 |
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