用于治疗软骨相关疾病的组合物及其制备方法

申请号 CN202280059181.8 申请日 2022-08-11 公开(公告)号 CN117881781A 公开(公告)日 2024-04-12
申请人 青春生物全球株式会社; 发明人 俞承昊; 张智英;
摘要 本 发明 涉及通过施加 电刺激 来制备的用于 治疗 软骨相关 疾病 的药物组合物及其制备方法,具体地,本发明的组合物可以在不导入来源于外部的生长因子的情况下仅通过向干细胞聚集体施加电刺激的方式来制备,可以在不使用昂贵的生长因子的情况下制备,因此可以划时代地降低医疗成本。并且,与现有的为治疗软骨相关疾病而制备的细胞相比,本发明的用于治疗软骨相关疾病的组合物不表达作为成熟的软骨细胞的标记物的COL2,因此具有免疫相关 副作用 比成熟的细胞低的优点。
权利要求

1.一种用于治疗预防软骨相关疾病的药物组合物,其特征在于,
包含软骨祖细胞或其聚集体作为有效成分,
上述软骨祖细胞具有如下特征:
(a)不表达Col2;
(b)上述软骨祖细胞被选自由阿尔新蓝、番红O及甲苯胺蓝组成的组中的一种以上基质染色
2.根据权利要求1所述的用于治疗或预防软骨相关疾病的药物组合物,其特征在于,上述软骨相关疾病选自由骨关节炎、关节炎、半月板异常、类湿关节炎、半月板软骨损伤、三纤维软骨复合体损伤、外伤性软骨损伤、退行性关节炎组成的组中。
3.根据权利要求1所述的用于治疗或预防软骨相关疾病的药物组合物,其特征在于,上述药物组合物的有效成分包含90%以上与上述软骨祖细胞同质的细胞。
4.根据权利要求1所述的用于治疗或预防软骨相关疾病的药物组合物,其特征在于,上述软骨祖细胞从干细胞分化诱导而来。
5.根据权利要求4所述的用于治疗或预防软骨相关疾病的药物组合物,其特征在于,上述干细胞为间充质干细胞。
6.根据权利要求4所述的用于治疗或预防软骨相关疾病的药物组合物,其特征在于,上述分化诱导通过电刺激来实现。
7.根据权利要求6所述的用于治疗或预防软骨相关疾病的药物组合物,其特征在于,上述电刺激具有如下条件:
大于0Hz且小于等于20Hz的频率
‑20V以上且20V以下的振幅;以及
大于0%且小于等于80%的占空比。
8.根据权利要求1所述的用于治疗或预防软骨相关疾病的药物组合物,其特征在于,与间充质干细胞相比,上述软骨祖细胞的选自由COL1及COL5组成的组中的一种以上基因或由该基因编码的蛋白质的表达平减少,
与间充质干细胞相比,上述软骨祖细胞的COL6基因或由该基因编码的蛋白质的表达水平增加。
9.根据权利要求1所述的用于治疗或预防软骨相关疾病的药物组合物,其特征在于,与间充质干细胞相比,上述软骨祖细胞的选自由GJB2、GJC1、PECAM1、CLDN2、CLDN7、CLDN10及CLDN19组成的组中的一种以上基因或由该基因编码的蛋白质的表达水平增加。
10.根据权利要求1所述的用于治疗或预防软骨相关疾病的药物组合物,其特征在于,上述药物组合物为易于直接植入软骨部位的给药剂型形式。
11.根据权利要求1所述的用于治疗或预防软骨相关疾病的药物组合物,其特征在于,上述软骨祖细胞的聚集体聚集为球体形态。
12.根据权利要求8所述的用于治疗或预防软骨相关疾病的药物组合物,其特征在于,上述球体的直径为0.5mm至1.5mm。
13.一种用于治疗或预防软骨相关疾病的药物组合物的制备方法,其特征在于,包括向干细胞施加电刺激来制备软骨祖细胞或其聚集体的步骤,
上述软骨祖细胞具有如下特征:
(a)不表达Col2;
(b)上述软骨祖细胞被选自由阿尔新蓝、番红O及甲苯胺蓝组成的组中的一种以上基质染色。
14.一种治疗或预防软骨相关疾病的方法,其特征在于,
包括向有需要的个体给药软骨祖细胞或其聚集体的步骤,
上述软骨祖细胞具有如下特征:
(a)不表达Col2;
(b)上述软骨祖细胞被选自由阿尔新蓝、番红O及甲苯胺蓝组成的组中的一种以上基质染色。
15.一种软骨细胞或其聚集体在制备用于治疗或预防软骨相关疾病的药剂中的用途,其特征在于,上述软骨祖细胞具有如下特征:
(a)不表达Col2;
(b)上述软骨祖细胞被选自由阿尔新蓝、番红O及甲苯胺蓝组成的组中的一种以上基质染色。

说明书全文

用于治疗软骨相关疾病的组合物及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及通过施加电刺激来制备的用于治疗软骨相关疾病的药物组合物及其制备方法。

背景技术

[0002] 关节软骨的损伤是困扰数百万人的非常普遍的问题。关节软骨组织无血管性且没有干细胞(stem cell),因此,成人的软骨再生受限。影响到软骨下骨的缺陷诱发纤维或纤维软骨性组织形成,修复的组织与透明软骨(hyaline cartilage)存在生化、生物机械性差异,因此经历未成熟退化。在关节出现问题的情况下,会引起疼痛或者活动受到许多限制。过去,由于没有适当的治疗方法,而且平均寿命比现在短,关节年龄与实际寿命没有太大差异,而现在由于老龄化延长了寿命,但关节寿命却因各种环境因素而跟不上实际寿命。由于经常使用膝部而使软骨磨损,同时因膝关节和韧带发生炎症而诱发退行性关节炎,韩国65岁以上老年人每10人中有8人受此困扰。曾认为是老年性疾病的退行性关节炎,近来由于错误的生活习惯以及不恰当的运动引起的外伤性关节炎等,成为使年青一代罹患关节炎的因素。
[0003] 为了治疗这样的软骨相关疾病,正在研究利用含有从肋骨分离的软骨细胞的人工软骨(韩国专利申请号:10‑2006‑0106812)或利用干细胞等来治疗的方法,但利用干细胞的方法主要使用通过添加昂贵的生长因子来分化为软骨细胞的方法,在临床应用方面还需解决成本问题。鉴于上述成本及免疫等问题尚未解决,目前需要开发用于治疗已解决上述问题的软骨相关疾病的治疗剂。

发明内容

[0004] 技术问题
[0005] 在上述背景下,本发明人致力于开发即使不添加生长因子也能够治疗软骨相关疾病的治疗剂,结果,确认到在向干细胞施加电刺激的时,在不表达作为成熟的软骨细胞的标记物的COL2的情况下也可以分化为具有软骨细胞特征的软骨祖细胞,从而完成本发明。
[0006] 于是,本发明的目的在于,提供包含具有如下特征的软骨祖细胞或其聚集体作为有效成分的用于治疗或预防软骨相关疾病的药物组合物:(a)不表达Col2;(b)上述软骨祖细胞被选自由阿尔新蓝(Alcian Blue)、番红O(Safranin O)及甲苯胺蓝(Toluidine blue)组成的组中的一种以上基质染色
[0007] 并且,本发明的再一目的在于,提供用于治疗或预防软骨相关疾病的药物组合物的制备方法,包括向干细胞施加电刺激来制备软骨祖细胞或其聚集体的步骤,上述软骨祖细胞具有如下特征:(a)不表达Col2;(b)上述软骨祖细胞被选自由阿尔新蓝、番红O及甲苯胺蓝组成的组中的一种以上基质染色。
[0008] 并且,本发明的另一目的在于,提供治疗或预防软骨相关疾病的方法,包括向有需要的个体给药软骨祖细胞或其聚集体的步骤,上述软骨祖细胞具有如下特征:(a)不表达Col2;(b)上述软骨祖细胞被选自由阿尔新蓝、番红O及甲苯胺蓝组成的组中的一种以上基质染色。
[0009] 并且,本发明提供软骨祖细胞或其聚集体在制备用于治疗或预防软骨相关疾病的药剂中的用途,上述软骨祖细胞具有如下特征:(a)不表达Col2;(b)上述软骨祖细胞被选自由阿尔新蓝、番红O及甲苯胺蓝组成的组中的一种以上基质染色。
[0010] 然而,本发明所要实现的技术问题不限定于上述提及的技术问题,本发明所属技术领域的普通技术人员可以通过以下的记载明确理解未提及的或其他的问题。
[0011] 课题解决手段
[0012] 为了实现上述本发明的目的,本发明提供包含具有如下特征的软骨祖细胞或其聚集体作为有效成分的用于治疗或预防软骨相关疾病的药物组合物:(a)不表达Col2;(b)上述软骨祖细胞被选自由阿尔新蓝、番红O及甲苯胺蓝组成的组中的一种以上基质染色。
[0013] 在本发明的一实施例中,上述软骨相关疾病可以选自由骨关节炎(Osteoarthritis)、关节炎(Arthritis)、半月板异常(Meniscus derangements)、类湿关节炎(Rheumatoid arthritis)、半月板软骨损伤(Tear of meniscus)、三纤维软骨复合体损伤、外伤性软骨损伤、退行性关节炎组成的组中。
[0014] 在本发明的再一实施例中,上述药物组合物的有效成分可以包含90%以上与上述软骨祖细胞同质的(homogenous)细胞。
[0015] 在本发明的另一实施例中,上述软骨祖细胞可以由干细胞分化诱导而来。
[0016] 在本发明的还一实施例中,上述干细胞可以为间充质干细胞(mesenchymal stem cell)。
[0017] 在本发明的又一实施例中,上述分化诱导可以通过电刺激来实现。
[0018] 在本发明的又一实施例中,上述电刺激可以具有大于0Hz且小于等于20Hz的频率、‑20V以上且20V以下的振幅以及大于0%且小于等于80%的占空比。
[0019] 在本发明的又一实施例中,与间充质干细胞相比,上述软骨祖细胞的选自由COL1及COL5组成的组中的一种以上基因或由该基因编码的蛋白质的表达平可以减少,与间充质干细胞相比,上述软骨祖细胞的COL6基因或由该基因编码的蛋白质的表达水平可以增加。
[0020] 在本发明的又一实施例中,与间充质干细胞相比,上述软骨祖细胞的选自由GJB2、GJC1、PECAM1、CLDN2、CLDN7、CLDN10及CLDN19组成的组中的一种以上基因或由该基因编码的蛋白质的表达水平可以增加。
[0021] 在本发明的又一实施例中,上述药物组合物可以为易于直接植入软骨部位的给药剂型形式。
[0022] 在本发明的又一实施例中,上述软骨祖细胞的聚集体可以聚集为球体(spheroid)形态。
[0023] 在本发明的又一实施例中,上述球体的直径可以为0.5mm至1.5mm。
[0024] 并且,本发明提供用于治疗或预防软骨相关疾病的药物组合物的制备方法,包括向干细胞施加电刺激来制备软骨祖细胞或其聚集体的步骤,上述软骨祖细胞具有如下特征:(a)不表达Col2;(b)上述软骨祖细胞被选自由阿尔新蓝、番红O及甲苯胺蓝组成的组中的一种以上基质染色。
[0025] 并且,本发明提供治疗或预防软骨相关疾病的方法,包括向有需要的个体给药软骨祖细胞或其聚集体的步骤,上述软骨祖细胞具有如下特征:(a)不表达Col2;(b)上述软骨祖细胞被选自由阿尔新蓝、番红O及甲苯胺蓝组成的组中的一种以上基质染色。
[0026] 并且,本发明提供软骨祖细胞或其聚集体在制备用于治疗或预防软骨相关疾病的药剂中的用途,上述软骨祖细胞具有如下特征:(a)不表达Col2;(b)上述软骨祖细胞被选自由阿尔新蓝、番红O及甲苯胺蓝组成的组中的一种以上基质染色。
[0027] 发明的效果
[0028] 本发明的用于治疗软骨相关疾病的组合物可以在不导入来源于外部的生长因子等的情况下仅通过向干细胞聚集体施加电刺激的方式来制备,可以不使用昂贵的生长因子来制备,从而具有划时代地降低医疗费用的优点。并且,与现有的为了治疗软骨相关疾病而制备的细胞相比,本发明的用于治疗软骨相关疾病的组合物不表达作为成熟软骨细胞的标记物的Col2,具有免疫相关副作用比成熟的细胞低的优点。
[0029] 但本发明的效果不限定于上述效果,而应解释为包括能够通过本发明的详细说明或发明要求保护范围中记载的发明的构成推导的所有效果。附图说明
[0030] 图1涉及向细胞施加电刺激的内容,图1a示出电刺激条件及向细胞施加电刺激的大略模式,图1b为使用相差显微镜观察施加电刺激的细胞的结果,图1c观察使用阿尔新蓝及番红O染色的细胞的结果,图1d为通过活/死存活细胞毒性试剂盒(Live/Dead viability cytotoxicity kit)确认细胞存活能力的结果,图1e示出单个微团的细胞数量,图1f为确认细胞的膜抗原水平的结果。
[0031] 图2为确认基于电刺激的细胞的振荡的结果,图2a为通过Fluo‑4染色确认钙移2+
动的结果,图2b为随着时间流逝确认细胞内Ca 浓度变化的结果,图2c为确认细胞的异硫氰酸荧光素(FITC)强度的结果。
[0032] 图3为确认基于电刺激的基因表达变化的结果,图3a为用于分析单一细胞核糖核酸测序(RNA‑seq)的工作流程简图,图3b将2D(培养的脂肪来源干细胞(ADSC))、未施加6小时的电刺激的细胞微团、施加电刺激6小时的细胞微团、施加电刺激72小时的细胞微团的基因表达谱分类合并后示出的结果,图3c为示出4个样品中差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)的表达的热图的结果(右侧示出上调的前十位标记物)。
[0033] 图4为确认基于电刺激的软骨形成标记物的基因表达的结果,图4a至图4c为示出有关4个样品中明显上调的前20位基因的基因本体富集分析的结果,图4d至图4f为利用NCBI的高通量基因表达(GEO,gene expression omnibus)比较关节软骨(左侧)及发育中的软骨细胞(中间,BM‑MSCs的软骨分化,右侧)的基因表达谱的结果,图4g为利用作为软骨祖细胞(或成软骨细胞)的GO0060591的基因本体数据来确认有关软骨细胞发育的基因的表达水平的结果。
[0034] 图5为确认基于电刺激的细胞存活能力及细胞核型变化的结果,图5a为将施加电刺激3天的聚集的细胞微团及片段化的细胞移到96孔培养板后,使用CCK‑8存活能力分析试剂盒确认细胞的存活能力的结果,图5b为按照施加电刺激的细胞样品组别确认作为有关细胞凋亡的基因的SHARPIN的信使核糖核酸(mRNA)的表达水平的结果,图5c为在微团的单一细胞水平中通过吖啶橙/碘化丙啶(AO/PI,acridine Orange/Propidium Iodide)染色确认细胞凋亡程度的结果,图5d示出作为与干细胞能力相关的基因的MKI67、HMMR及TOP2A等基因的表达热图,图5e为在施加电刺激的微团的细胞中确认正常核型的结果。
[0035] 图6为确认细胞的胶原蛋白表达水平随着施加电刺激的变化的结果,图6a示出包括微细胞计数中的变化在内的细胞的所有胶原蛋白的表达水平的变化,图6b为在其中确认示出相当的变化的COL1A1、COL1A2、COL3A1、COL5A2、COL6A1及COL6A3的表达变化的结果,图6c为通过逆转录聚合酶链式反应(RT‑PCR)确认COL1A1的表达水平的结果,图6d为通过蛋白印迹法确认COL1A1的表达水平的结果。
[0036] 图7为确认I型胶原蛋白表达随着施加电刺激的基因表达调节,图7a为确认与转化生长因子β(TGFβ)的信号传导相关的RBFOX2、NFIC、YBX1及ID3等转录因子基因的表达的结果,图7b为确认与COL1A1的启动子/增强子结合的转录因子的表达水平的结果,图7c为示出转化生长因子β超级家族及受体的表达水平的热图,图7d及图7e为在施加电刺激的细胞中利用基因本体数据网站来确认GO0007043(细胞‑细胞接合组)及GO0051495(细胞骨架组织的阳性调节)的组织形成相关基因的表达水平的变化的结果。
[0037] 图8为将施加电刺激的球体埋植到实验动物兔的后腿股骨软骨后确认治疗效果的结果,图8a示出实验的整个进行过程,图8b及图8c为埋植16周后摘出股骨并利用微型计算机断层扫描(CT)通过影像拍摄来确认软骨再生的结果,图8d至图8g为制备组织病理切片后通过代表性的软骨染色方法确认组织学再生的结果,图8h至图8l通过打分来评估施加电刺激的球体对5只兔的软骨缺损的再生的结果,图8m为通过确认实验动物的体重来确认未发生由制备缺陷产生的炎症反应或动物的健康未受影响的结果。

具体实施方式

[0038] 本发明人致力于开发即使不添加生长因子也能够治疗软骨相关疾病的治疗剂,结果,确认到在向干细胞施加电刺激时,在不表达作为成熟的软骨细胞的标记物的COL2的情况下也可以分化为具有软骨细胞特征的软骨祖细胞,从而完成本发明。
[0039] 于是,提供包含具有如下特征的软骨祖细胞或其聚集体作为有效成分的用于治疗或预防软骨相关疾病的药物组合物:(a)不表达Col2;(b)上述软骨祖细胞被选自由阿尔新蓝、番红O及甲苯胺蓝组成的组中的一种以上基质染色。
[0040] 在本发明中,II型胶原蛋白(Col2,Collagen 2)作为形成关节软骨及透明软骨的基础的胶原蛋白,占软骨全部蛋白质的50%,在关节软骨的胶原蛋白中的占85~90%。由于具有上述特征而被用作成熟的软骨细胞的典型标记物,但本发明的软骨祖细胞完全不表达上述Col2,因此可以确认不是成熟的软骨细胞。
[0041] 在本发明中,上述软骨祖细胞通过向干细胞施加电刺激来制备,优选地,通过向间充质干细胞施加电刺激来制备,不表达间充质干细胞的作为与干细胞能力相关的因子的MKI67、TOP2A及HMMR等增殖标记物,因此与间充质干细胞不同。上述软骨祖细胞能够进行作为软骨细胞特征的阿尔新蓝、番红O等的基质染色,因此表现出与软骨细胞相似的特性。然而,由于完全不表达作为成熟软骨细胞的典型标记物的COL2,因此,表示处于向成熟的软骨细胞分化的前阶段的细胞。即使没有添加生长因子或离心分离等外部因素也自然地聚集为球体形态,因此可以用作易于进行用于治疗的植入等的剂型。
[0042] 在本发明中,术语“球体(Spheroid)”是指旋转椭圆体形态的细胞聚集体,为了生成球体,通常利用96孔培养板(96‑well)中的培养、悬滴(hanging drop)方法等。为了作为本发明用途的软骨相关疾病的治疗,需要埋植细胞或其聚集体的步骤,球体形态适合这样的埋植过程。为了将用于埋植的细胞聚集体制备为上述球体形态,可以利用离心分离等方法,但本发明的细胞聚集体确认到即使没有额外的上述步骤,仅施加用于分化诱导为软骨祖细胞的电刺激,就形成易于植入的球体形态。
[0043] 上述软骨相关疾病可以选自由骨关节炎、关节炎、半月板异常、类风湿关节炎、半月板软骨损伤、三角纤维软骨复合体损伤、外伤性软骨损伤、退行性关节炎组成的组中,但不限定于此。
[0044] 本发明中使用的术语“预防”是指通过给药本发明的药物组合物来抑制由软骨相关疾病引起的症状或延迟发病的所有行为。
[0045] 本发明中使用的术语“治疗”是指通过给药本发明的药物组合物来使软骨相关疾病的症状好转或变更为痊愈的所有行为。
[0046] 上述药物组合物的有效成分可以包含90%以上,优选地,可以包含91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上与上述软骨祖细胞同质的细胞。并且,可以从干细胞分化而来,优选地,干细胞可以为间充质干细胞。
[0047] 本发明的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)为能够分化为软骨细胞、骨细胞、脂肪细胞及肌细胞的细胞,可以在试管内在特定的培养条件下分化诱导为软骨、骨、肌肉、韧带及脂肪组织等。间充质干细胞易于从骨髓中提取,因此,已进行许多有关将其用作多种疑难疾病的细胞治疗剂的可能性的研究。由于软骨的再生力不足,因此,一旦损伤后很难治疗。退行性关节炎因关节的退行性变化而发生,无法完全停止,因此,现在依赖药物疗法或物理治疗等。但是,目前处于未开发出确实治疗关节炎的药物的状态,而类固醇制剂及润滑剂的长期使用会引起促进软骨变性的结果。近来,虽然开发出软骨细胞移植术,但仍存在软骨组织的受限、软骨细胞在试管培养中的去分化、细胞增殖随着骨龄的限制等问题。因此,再生能力丰富的间充质干细胞可以应用为在生物恢复被破坏的软骨再生中有效的细胞治疗剂。利用细胞治疗剂的软骨再生不仅可以应用在肌肉骨骼系统疾病中,还可以应用在消化系统及泌尿系统等疾病中。即,可以通过使软骨组织在局部再生来在反流性食管炎及尿道反流等疾病的治疗中应用。
[0048] 本发明的分化诱导可以通过电刺激来实现,上述电刺激的频率可以大于0Hz且小于等于20Hz,优选地,可以大于3Hz且小于等于15Hz或大于5Hz且小于等于12Hz,但不限定于此。上述电刺激的电压可以为‑20V以上且20V以下,优选地,可以为‑15V以上且15V以下,更优选地,可以为‑10V以上且10V以下。
[0049] 与间充质干细胞相比,本发明的软骨祖细胞的选自由COL1及COL5组成的组中的一种以上基因或由该基因编码的蛋白质的表达水平可以减少,与间充质干细胞相比,本发明的软骨祖细胞的COL6基因或由该基因编码的蛋白质的表达水平可以增加,与间充质干细胞相比,本发明的软骨祖细胞的选自由GJB2、GJC1、PECAM1、CLDN2、CLDN7、CLDN10及CLDN19组成的组中的一种以上基因或由该基因编码的蛋白质的表达水平可以增加。
[0050] 本发明人通过具体的实施例确认到本发明的施加电刺激的细胞可以分化为软骨祖细胞,可以利用其来治疗软骨相关疾病。
[0051] 本发明的一实施例中,本发明人确认到在向狗的间充质干细胞施加特定条件的电刺激时引起细胞的聚集。确认细胞聚集体时确认到即使不追加外因性因子也引起向软骨祖细胞的分化,确认到进行阿尔新蓝及番红O染色时可以基质染色,从而确认其具有软骨细胞的特性(参照实施例2‑1)。在这样制备的细胞的情况下,确认到与未施加电刺激的细胞相比,分化过程中发生的钙振荡增加,通过上述电刺激发生细胞的聚集,确认到通过此来引起充质干细胞向软骨祖细胞的分化(参照实施例2‑2)。
[0052] 在本发明的再一实施例中,在向间充质干细胞施加特定条件的电刺激的情况下,即使施加电刺激也未确认到存活能力有显著差异(参照实施例3‑2),施加电刺激的细胞不表达作为与干细胞能力相关的因子的MKI67、TOP2A及HMMR等标记物,因此与间充质干细胞不同(参照实施例3‑3),而且完全不表达用作成熟软骨细胞的典型标记物的Col2,从而具体确认到与成熟的软骨细胞的不同(参照实施例3‑4)。
[0053] 在本发明的另一实施例中,在兔的软骨部位诱导缺损后,将如上所述的通过施加电刺激来制备的软骨祖细胞植入兔的软骨结合部位时,确认到能够以有效的水平使有缺陷的部位再生(参照实施例5)。
[0054] 通过上述结果,本发明人确认到在施加特定条件的电刺激的情况下,即使不加入昂贵的生长因子也能够将间充质干细胞分化诱导为与间充质干细胞及软骨细胞都不相同的软骨祖细胞。本发明的软骨祖细胞具有完全不表达作为成熟的软骨细胞的标记物的Col2的优点,作为未成熟细胞,预计在作为移植成熟细胞时主要发生的问题的免疫相关问题方面更为游刃有余。
[0055] 另一方面,本发明中的“药物组合物”是指以疾病的预防或治疗为目的来制备的组合物,可以通过各种通常的方法配制为多种形态来使用。例如,可以配制为散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬混剂、乳剂、糖浆剂等口服剂型,也可以配制为外用剂、栓剂及灭菌注射溶液的形态来使用。
[0056] 本发明的药物组合物还可以包含药学上可接受的载体。上述药学上可接受的载体为配制时通常使用的载体,包括生理盐水、灭菌水、林格氏液、缓冲生理盐水、环糊精、葡萄糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇、脂质体等,但不限定于此,还可以根据需要包含抗化剂、缓冲液等其他通常的添加剂。并且,还可以加入稀释剂、分散剂、表面活性剂、结合剂、润滑剂等来配制为水溶液、悬混液、乳浊液等注射用剂型以及丸药、胶囊、颗粒或片剂等。适当的药学上可接受的载体以及与配制相关的内容可以使用Remington's Pharmaceutical Sciences(19th edition,1995)中公开的方法根据各成分来优选地配制。本发明的药物组合物的剂型不受特别限制,可以配制为注射剂、吸入剂、皮肤外用剂或口服摄取剂等,可以为易于植入的剂型形态,优选地,可以为球体形态,上述球体的直径可以为0.5mm至1.5mm,优选地,可以为0.8mm至1.2mm,更优选地,可以为1.0mm,但不限定于此。
[0057] 本发明的药物组合物可以根据目标方法来口服给药或胃肠外给药(例如,静脉内、皮下、腹腔内或局部给药),给药量根据患者的状态及体重、疾病的严重程度、药物形态、给药途径及时间的不同而不同,可以通过相关从业者适当地选择。
[0058] 本发明的药物组合物以药学上有效的量来给药。在本发明中,“药学上有效的量”是指以能够适用于治疗的合理的收益/风险比例来治疗疾病的充分的量,有效剂量水平可以根据包括患者的疾病的种类、疾病的严重程度、药物的活性、对药物的敏感度、给药时间、给药途径、及代谢比例、治疗期间、同时使用的药物在内的因素及其他医学领域中广为人知的因素来确定。
[0059] 本发明的药物组合物能够以单独的治疗剂来给药或者与其他治疗剂联合来给药,可以与现有的治疗剂依次或同时给药,可以单次或多次给药。重点在于,在考虑所有上述因素后以无副作用的最小的量来获得最大效果,这可以通过相关从业者轻松确定。
[0060] 并且,本发明提供软骨相关疾病的预防或治疗方法,包括向个体给药上述药物组合物的步骤。
[0061] 本发明中使用的术语“给药”是指以任意适当的方法向个体提供规定的本发明的组合物。
[0062] 本发明中使用的术语“个体”是指需要疾病的治疗的对象,更具体地,是指人类或非人类的灵长类、小鼠(mouse)、狗、猫、哺乳动物
[0063] 并且,本发明提供上述药物组合物的软骨相关疾病的预防或治疗用途
[0064] 并且,本发明提供用于治疗或预防软骨相关疾病的药物组合物的制备方法,包括向干细胞施加电刺激来制备软骨祖细胞或其聚集体的步骤,上述软骨祖细胞具有如下特征:(a)不表达Col2;(b)上述软骨祖细胞被选自由阿尔新蓝、番红O及甲苯胺蓝组成的组中的一种以上基质染色。
[0065] 以下,通过优选实施例来帮助本发明的理解。但下述实施例仅为更易于理解本发明而提供,本发明的内容不限定于下述实施例。
[0066] [实施例]
[0067] 实施例1.实验材料及实验方法
[0068] 1‑1.一次细胞培养
[0069] 从3只4个月的雌性比格犬的腹部脂肪组织中获得3批(batches)量的狗(Canine)脂肪源性干细胞(Adipose derived stem cell,以下称ADSC)。在传代(passage)0中保管细2 5
胞并评估向脂肪细胞、软骨细胞及成骨细胞的分化能力。将细胞涂在75‑cm的烧瓶(5×10细胞/烧瓶(cells/flask),碧迪(BD)Falcon公司)后在包含10%的胎牛血清(FBS)(GIBCO公司)及1X的抗生素‑抗真菌剂(antibiotic‑antimycotic)(GIBCO公司)的低葡萄糖的杜氏改良伊戈尔培养基(DMEM,Dulbecco`modified Eagle medium,GIBCO公司)中培养。
[0070] 1‑2.微团(Micromass)培养及电刺激
[0071] 分离传代3至传代5的狗ADSC后,在包含1x抗生素‑抗真菌剂以及1x的GlutaMax(GIBCO公司)的作为无血清培养基的无血清高级杜氏改良伊戈尔培养基/F12培养基7
(serum‑free advanced DMEM/F12 medium)(GIBCO公司)中以高密度(2.5×10 细胞
2
(cells)/ml)悬浮。为了生成微团,将10μl的细胞悬浮液放入35‑mm 的培养皿(dish,Corning公司)后在37℃的温度及5%CO2条件的恒温箱(N‑Biotek公司,韩国)中以能够附着的方式培养。培养1小时后,加入无血清高级杜氏改良伊戈尔培养基/F12培养基(GIBCO公司)。将细胞放入能够给细胞慢性刺激的多通道刺激器(multi‑channel stimulator)中。对狗一次ADSC的微团以2.0Hz频率、10V/cm及10ms条件的电刺激(Electrical stimulation,以下称ES)以及无电刺激的条件来培养。施加电刺激3天后,通过相差显微镜(phase‑contrast microscope)(Eclipse Ti2,尼康公司(Nikon),日本(Japan))观察聚集的细胞的形成。
[0072] 1‑3.准备单一细胞及核糖核酸(RNA)测序
[0073] 单一细胞制备在室温下利用MACS组织分离试剂盒(MACS tissue dissociation kit,美天旎生物科技公司(Miltenyi Biotech))及温和MACS分离器(gentleMACS dissociator,美天旎生物科技公司)来进行。将细胞悬浮液移到细胞过滤器后使用完全培养基(complete medium)洗涤。进行用于分析细胞存活率的存活/凋亡分析(Live/Dead assay,利用分子探针(Molecular Probe),示出90%以下的细胞存活率的组即终止)。核糖核酸测序通过宏基因(Macrogen,韩国(Korea))的核糖核酸测序(RNA‑seq)分析服务来进行。
[0074] 为了制备单一细胞文库,根据生产公司的说明书使用能够捕获约500细胞的Next GEM Single Cell 3'文库(Library)&Single Cell3'V3.1凝胶柱(Gel beads)将细胞在10×Genomics平台中处理。可以在单一细胞的液滴(single‑cell droplets)中经过逆转录、纯化及聚合酶链式反应(PCR)过程从核糖核酸制备独特的条形码编码的互补脱氧核糖核酸(cDNA)文库。文库使用读取1(read 1,细胞条形码及固有分子标识符[UMI])、8bp索引读取(index read,样品条形码)及91bp读取2(read 2,核糖核酸读取)以及读取长度为28bp的HiSeqX(因美纳公司(Illumina))来测序。
[0075] 为了生成用于数据分析的FASTQ文件,使用Cell RangerV3.1.0(10X Genomics公司)。为此,将数据与狗(canine)的参照基因组(CanFam3.1 release 100)对齐后,使用UMI及细胞条形码测定基因的表达,确定细胞簇后,进行差异基因表达分析。为了标准化为多个数据集,使用Seurat 3.1.3带来最终的合计数据集。线粒体的比例>0.2的细胞集团为了筛除包含低UMI含量的细胞而进行过滤。统一流形逼近和投影(UMAP,Uniform Manifold Approximation and Projection)分析基于统计学上具有显著性的主要成分来进行。所有簇与其余细胞的特异性标记物的比较利用最小细胞百分比(minimum percentage of cells)的最小分数(minimum fraction)来确定,进行Wilcox秩和检验来仅报告具有显著性的结果。
[0076] 1‑4.利用线上数据库的基因组分析
[0077] 为了评估狗ADSC的软骨分化,利用NCBI的高通量基因表达来分析转录组(transcriptome)变化。为此,使用GSE32398(与生长板软骨相比,人类的关节软骨中变化的前250个基因)、GSE51812(发育17周的人类关节软骨细胞中变化的前239个基因按照周别与软骨细胞进行比较)发生6胚芽)及GSE19664(软骨形成期间人类骨髓源性干细胞(BMSC,Bone marrow‑derived stem cell)随时间变化的前128个基因)转录组。为了分析重要的探针列表,使用基因本体注释(GO annotation,Gene Ontology annotation)和PANTHER分类系统(PANTHER classification system)。
[0078] 1‑5.测定钙振荡(Oscillation)
[0079] 将狗一次ADSC以2~2.5×107cells/ml的密度悬浮后,将10μl细胞悬浮液滴放入2
CellBIND表面的35‑mm培养板(Corning公司)。每个狗ADSC的微团以施加电刺激与否(刺激条件:在2.0Hz的频率下以10V/cm刺激10ms)加以区别来培养。施加电刺激14小时后,将没有丙磺舒(probenecid)的Fluo‑4试剂(分子探针)根据生产企业的说明书以1∶1的比例上样到培养基30分钟。钙振荡为在不培养10分钟的情况下在488nm中暴露1秒钟来刺激后,记录1(fps)。荧光强度的延时分析(Time‑lapse)利用NIS‑Elements高级研究成像软件(Advanced Research Imaging software)(Eclipse Ti2,尼康公司,日本)来分析。
[0080] 1‑6.测定总糖胺聚糖(glycosaminoglycan)
[0081] 为了测定糖胺聚糖(glycosaminoglycan,以下称GAG),使用磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤细胞后使用多聚甲(paraformaldehyde,Biosesang公司)固定20分钟并在4℃的温度下保管直至染色。使用阿尔新蓝(IHC world公司)溶液在室温下培养细胞30分钟或者使用番红O(IHC world公司)溶液在室温下培养细胞1小时后,使用蒸馏水洗涤多次。利用数码通用串行总线(USB)照相机拍摄GAG的积累(My first lab公司,美国(USA))。
[0082] 1‑7.流式细胞分析(Flow Cytometry)
[0083] 在4℃的温度下向上述实施例1‑3中准备的单一细胞分别处理Alexa488抗狗(anti‑dog)CD44(MCA1041A488,Bio‑Rad公司)、PE抗狗CD90(12‑5900‑42,BD公司)、PerCP‑Cy5.5抗狗CD29(303024,生物传奇公司(BioLegend))、Alexa488抗狗(anti‑dog)CD45(MCA1042F,Bio‑Rad公司)、Alexa647抗狗CD73(Bs‑4834R‑A647,Bioss公司)、FITC抗狗CD54(GTX76274,GeneTex公司)、APC抗狗CD49d(304308,生物传奇公司)、PE抗狗CD34(559369,BD公司)、PE抗人/狗(anti‑hu/dog)HLA‑DR(361606,生物传奇公司)或APC抗狗CD80(104714,BD)20分钟来染色。流式细胞分析利用作为韩国延世大学临床研究机构的BD LSRII分析服务来进行。
[0084] 1‑8.实时定量聚合酶链式反应(RT qPCR)分析
[0085] 从根据生产企业的说明书使用温和MACS分离器(GentleMACS dissociator)(美天旎生物技术公司)及Direct‑zol核糖核酸质粒提取试剂盒(RNA MiniPrep)(泽莫研究公司(Zymo Research))在多种条件下培养3天的狗ADSC中分离总核糖核酸。利用生物分光光度计(biospectrometer,本德公司(Eppendorf))测定核糖核酸浓度,逆转转录反应使用TOPscript互补脱氧核糖核酸合成试剂盒(Enzynomics公司)以0.3‑0.5μg的总核糖核酸来进行。有关GAPDH及COL1A1的实时聚合酶链式反应(PCR)使用包含10ng互补脱氧核糖核酸/管的SYBR 2x Mix(Bio‑Rad公司)与CFX连接实时聚合酶链式反应(Real‑Time PCR)检测系统(Bio‑Rad公司)来进行。具体地,将样品在95℃的温度下保持15分钟后进行包括在95℃的温度下变性10秒钟的步骤、在60℃的温度下扩散30秒钟以及退火步骤在内的扩增循环40次。
[0086] COL1A1的表达水平以GAPDH的表达水平来标准化,相对的基因表达水平使用2‑△△CT方法来计算。引物序列使用Primer‑BLAST按照如下方式自我确定:狗GAPDH正向内各引物5'‑GGTGATGCTGGTGCTGAGTA,反向引物5'‑GGCATTGCTGACAATTCTGA;狗COL1A1正向引物5'‑CCGCTTCACCTACAGTGTCA,反向引物5'‑CAGACAGGGCCAATATCCAT(Bioneer公司,韩国)。
[0087] 1‑9.蛋白印迹分析
[0088] 使用冷的磷酸盐缓冲溶液(ice‑cold PBS)洗涤细胞3次后,在含有磷酸酶抑制剂混合物(phosphatase inhibitor cocktails,genDEPOT公司)的RIPA细胞裂解缓冲液(RIPA cell lysis buffer,genDEPOT公司)中收获。蛋白质浓度使用BCA蛋白质分析试剂盒(Pierce公司)来确定。在十二烷基磺酸钠‑聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS‑PAGE)凝胶中分离蛋白质样品后,使用标准流程以聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(ATTO公司)进行电泳(electrotransferred)。使用溶在0.05%的TBST中的5%的脱脂奶粉阻断膜后,在4℃的摇床(rocking platform)中与一抗一同培养12小时。使用TBST缓冲液洗涤膜15分钟共3次,在包含接合有辣根过氧化物酶(HRP)的二抗(HRP‑conjugated secondary antibody,GeneTex公司)的TBST中与1%的脱脂牛奶一同培养1小时。使用TBST缓冲液洗涤杂交的膜后,使用增强的化学发光检测试剂盒(enhanced chemiluminescence detection kit,Merk公司)及LAS500成像系统(LAS500 Imaging system,GE healthcare公司)来可视化
[0089] 1‑10.核型分析(Karyotyping)
[0090] 为了采样,使用具有70μm大小气孔的尼龙筛将通过ES诱导的细胞聚集物破坏为均匀的单一细胞悬浮液。将细胞悬浮液收集到15ml的试管后,以450×g的条件离心分离5分钟。吸引(aspiration)培养基后,在新的培养基中使颗粒悬浮后使用GenDix Karyotyping服务的G‑banding染色及染色体成像分析系统(chromosome imaging analyzer system)来分析核型。
[0091] 1‑11.统计分析
[0092] 所有数据以平均数±标准差来表示(n=单独样品数量)。所有统计分析使用MS Excel软件(Microsoft 365)来进行,<0.05的P值表示示出显著差异。
[0093] 实施例2.通过向干细胞施加电刺激来制备软骨祖细胞
[0094] 2‑1.通过施加电刺激的ADSC的软骨化
[0095] 以ES(10V/cm,10ms,2Hz频率)刺激狗ADSC(间充质干细胞)后,确认通过刺激聚集的细胞。在不追加血清及外因性因子的情况下进行狗ADSC微团的培养(图1a)。施加ES并经过3天后,通过相差显微镜确认随着施加ES与否的聚集体的软骨基质相关分子的免疫组织化学染色结果。结果,如图1b所示,与不施加ES的细胞相比,在施加ES的细胞中确认到片形态(sheet like)的细胞聚集以及更大的聚集。并且,在通过ES刺激的细胞中进行细胞阿尔新蓝及番红O染色后观察时,如图1c所示,可以确认到蛋白聚糖的沉积。
[0096] 为了确认ES给细胞的凋亡带来的影响,进行使用存活/死亡(Live/Dead)试剂的存活力评估。结果,如图1d所示,可以确认ES的施加与否未给细胞存活力带来显著差异,如图5
1e所示,确认到聚集体包含约10个细胞。为了确认随着施加ES的细胞膜蛋白变化,进行使用对表面分子的抗体的流式细胞分析。比较在单层生长的ADSC与膜蛋白的表达时,如图1f所示,可以确认CD44、CD90、CD29、CD73、CD54、CD34、CD49d、CD45、HLA‑DR及CD80示出相似的表达。
[0097] 本发明人可以通过上述内容确认ES诱导狗ADSC的非常稠密的软骨形成前聚集(prechondrogenic condensation)。
[0098] 2‑2.在软骨化过程中确认钙振荡
[0099] 根据以往的报告,通过ES的软骨形成重新生成在软骨发育过程中被观察到的自发的细胞内钙振荡。本发明人在施加ES时,监测是否在本发明的狗ADSC微团中也发生与之相似的钙振荡。使用Fluo‑4 Direct的该荧光测定如图2a所示,与未施加ES的对照组相比,在接受ES的细胞团块中,确认到以更为规律的频率在高振幅中变动。更具体地,如图2b及图2c2+
所示,电刺激的细胞聚集体示出典型的钙振荡的Ca 变动模式。这样的结果示出,即使在没有外因性因子的ES施加条件下,也在微团聚集过程中诱导ADSC细胞内软骨形成前聚集。
[0100] 实施例3.确认通过电刺激制备的软骨祖细胞的特性
[0101] 3‑1.确认转录谱
[0102] 从电刺激的细胞的团块中分离单一细胞。在10X Genomics Chromium平台准备单一细胞核糖核酸测序文库,数据使用作为用于数据分析的工具包的标准Seurat。用于确认细胞的转录谱的整体实验如图3a所示。具体地,分析通过使用Loupe Cell Browser标准化的数据集来筛选变化性高的基因,将12个簇细分为4个数据集(图3b)。并且,如图3c所示,发现2D ADSC在表达型和功能上与施加ES的细胞微团在转录组部分中具有相当的差异。
[0103] 使用公开资源基因本体注释和PANTHER数据库分析工具来探索4个数据集的基因表达模式。在施加6小时的ES的ADSC微团中确认到与质子离子传输(proton  ion transport)、酸代谢(ornithine metabolism)、生物发生(biogenesis)及钙离子进出(calcium ion import/release)相关的基因上调(图4a)。在未施加ES的细胞微团中确认到与软骨凝结(cartilage condensation)、钙离子跨膜转运(calcium ion transmembrane transport)、骨骼肌组织发育(skeletal muscle tissue development)、NF‑κB通路(NF‑κB pathway)及免疫细胞的化学趋化性(chemotaxis of immune cells)相关的基因上调(图4b)。施加72小时的ES的细胞微团确认到与前列腺素合成(prostaglandin synthesis)、多细胞有机体发育(multicellular organism development)、精氨酸分解代谢(arginine catabolism)及细胞凋亡负调节(negative regulation of apoptosis)相关的基因上调(图4c)。
[0104] 为了理解如上所述的基因表达模式的作用,进行与可公开利用的软骨祖细胞分化(prechondrocyte differentiation)基因表达数据细胞的比较。结果,如图4d至图4f所示,施加72小时的ES的细胞微团确认到从软骨形成聚集(embryonic  chondrogenic condesation)到关节软骨细胞分化(articular chondrocyte differentiation)的过程中上调的相当数量的基因诱导软骨形成前变化(prechondrogenic changes)。当进行用来识别有关骨软骨祖细胞(osteochondral progenitor cells)的分化的核心因子的研究时,确认到骨软骨祖细胞中RUNX2与SOX9之间的平衡在软骨细胞与成骨细胞的分化中起到必需的作用。有关施加ES的微团的现有数据显示RUNX2及其抑制因子NKX3.2的水平特异性地变更为对软骨祖细胞典型的量(图4e)。
[0105] 本发明人通过上述结果确认通过ES触发的狗ADSC的聚集诱导了与软骨祖细胞发育阶段相似的表现型。
[0106] 3‑2.确认存活能力
[0107] 由ES引起的生理性应激可以给多种细胞过程带来影响并引起多种生理及病理结果,使用CCK‑8细胞存活试剂盒(Viability kit)确认施加ES刺激3天的ADSC的细胞存活能力。结果,如图5a所示,可以确认施加ES不给狗ADSC微团的存活力带来影响。进行基因本体(GO)数据库分析时,如图5b所示,确认到暴露在电刺激下不给作为与细胞凋亡相关的基因的SHARPIN的表达带来影响。对通过裂解制备的ADSC悬浮液进行碘化丙啶(PI,propidium iodide)染色。结果,如图5c所示,确认到碘化丙啶染色的细胞的数量与施加ES与否无关。
[0108] 3‑3.确认是否向软骨祖细胞分化
[0109] 与正在生长中的普通细胞相比,成体干细胞表达MKI67、TOP2A及HMMR等代表性的增殖标记物。如图5d所示,确认到上述增殖标记物与是否施加ES无关地,在聚集的细胞中不表达。在上述施加ES的细胞中观察核型的结果,如图5e所示,确认到不发生核型的变化。
[0110] 本发明人通过上述结果确认,在细胞聚集的情况下,进行向不再是干细胞的成熟的细胞类型的分化。
[0111] 3‑4.确认胶原蛋白生成水平变化
[0112] 软骨细胞的主要功能为合成胶原蛋白2型、4型、6型、10型、11型、12型及14型等细胞外基质,因此,为了确认本发明的施加ES的细胞的分化与否,确认胶原蛋白生成水平。结果,如图6a所示,确认到与施加ES与否无关地,狗ADSC的微团中COL3A1、COL4A1、COL4A2、COL4A5、COL5A3、COL6A1、COL6A3、COL6A5、COL8A1、COL13A1、COL14A1、COL15A1、COL16A1、COL21A1、COL23A1、COL24A1、COL24A1及COL27A1的表达增加。其中,确认到COL3A1、COL5A2及COL6A1/3的表达在ADSC微团中强力且均匀地增加。与不施加ES的情况相比,确认到施加ES的细胞的COL6A3及COL16A1在微团中被整体抑制。
[0113] 然而,已知为与间充质干细胞的软骨形成一同表达的成熟的软骨细胞的标记物的Col2,如图6b所示,确认到无论是否施加ES,都不表达。虽然通过现有的公开通过向间充质干细胞施加电刺激来将干细胞分化为软骨细胞的方法的预申请的专利(KR 10‑2015‑0047361)中的比较例确认到用作成熟的软骨细胞的标记物的Col2的表达在添加生长因子的间充质干细胞及施加电刺激的间充质干细胞中都以显著水平增加,但是本发明的施加电刺激的细胞聚集体与之不同,确认到完全不表达Col2。
[0114] 另一方面,为了确认ES对胶原蛋白I型的效果,进行实时定量聚合酶链式反应(RT‑qPCR,Real‑time quantitative PCR)。结果,如图6c所示,与不施加ES的细胞相比,在施加ES的细胞中确认到COL1A1的表达大幅增加。通过蛋白印迹法确认COL1A1的表达时,如图6d所示,也确认到其表达大幅增加。
[0115] 3‑5.确认胶原蛋白调节相关因子随施加电刺激的变化
[0116] 选择胶原蛋白I型来分析表达水平随电刺激的变化机制。为了分析机制,利用了统合多种资源的增强子的GeneHancer中提供的公开资源数据库。在施加ES的细胞中确认到已知与COL1A1的表达相关的转录因子NR4A1、RBFOX2、NFIC、ID3、HDGF、BMI1、YBX1、SMARCE1、HLTF及SMC3的水平随时间有相当幅度的减少(图7a)。与之相反,在施加ES后的72小时内,在细胞微团中确认到TCF12、POLR2A、ATF4、ARID4B、SMARCA5、GTF2F1、LARP7、HDAC2及YY1等转录因子增加(图7b)。
[0117] 上述因子与转化生长因子β信号传导相关,因此给COL1A1的表达水平带来变化。尽管与COL1A1相关的转录因子的表达增加,但COL1A1的表达显著减少。通过上述结果确认,除上述转录因子以外,还有其他因素给COL1A1的表达带来影响。
[0118] 实施例4.确认本发明软骨祖细胞的组织形成能力
[0119] 为了在细胞骨架中确认ES的作用,确认具体调节包括细胞‑细胞接合(cell‑cell junction)在内的细胞骨架组织(cytoskeleton organization)的基因的表达。结果如图7d及7e所示,确认到报告为软骨细胞外基质(cartilage extracellular matrix)的功能所必需的连接蛋白(Connexins(GJB2/GJC1))、细胞接合蛋白(PECAM1)及紧密连接蛋白(claudins(CLDN2/CLDN7/CLDN10/CLDN19))的表达上调。
[0120] 这样的结果符合上述实施例2‑1的GAG染色结果。在向细胞微团施加ES的情况下,诱导相当高的与作为构成聚蛋白多糖(aggrecan)的两种GAG的硫酸软骨素(chondroitin sulfate)及硫酸角质素(keratan sulfate)的生物合成相关的基因的表达。这样的数据表示电刺激可以直接诱导向软骨祖细胞的分化,表示可以通过刺激软骨基质及软骨祖细胞的可塑性(plasticity)来恢复透明软骨。
[0121] 实施例5.确认本发明软骨祖细胞的生物体内治疗效果
[0122] 为了在生物体内确认随着施加电刺激的软骨祖细胞聚集体向软骨组织的分化及组织植活的软骨的组织学再生及恢复,在4kg以上的骨成熟完毕的实验用新西兰白兔(NZW rabbit)的股骨软骨生成4mm直径(兔的平均软骨厚度为0.3mm)的小的软骨缺损部位并埋植8个电刺激聚集体后,涂敷纤维蛋白胶来固定聚集体。图8a示出本实验的整个进行过程。埋植的电刺激聚集体为狗的脂肪源性间充质干细胞,考虑到异种间移植,一天一次静脉给药(10mg/kg)作为免疫抑制剂的环孢素,若2周内出现不适用或非正常的健康状态,则马上终止。埋植后经过16周时,通过解剖摘出股骨软骨后,在通过具有微米单位的分辨率的显微计算机断层扫描拍摄来获得的股骨软骨的缺损及再生的图像中进行评估。结果如图8b及图8c所示,确认到埋植施加电刺激的聚集体的缺损部位在4个月以后,埋植的部位恢复为评估为软骨层的范围。
[0123] 为了确认上述结果,进行软骨基质染色。结果如图8c至图8g所示,在埋植施加电刺激的聚集体的情况下,在作为软骨组织染色的阿尔新蓝、三色染色、番红O的组织染色切片中,在与缺损相比的埋植的聚集体的组织学评估中可以确认分化为与正常软骨组织的特性相似的软骨细胞以及软骨基质的恢复。并且,确认到在生物体内示出长期的植活、与周围正常软骨的连接以及与下部的骨组织之间的顺滑的组织接合性。这样的结果符合上述确认的组织病理染色结果。
[0124] 在对其打分的图表中,在5只兔中确认到平均的显著再生及恢复,结果如图8h至8m所示。这样的数据示出在实验动物的软骨缺损部位或埋植的聚集体部位中未观察到炎症,通过实验动物的体重变化及肉眼观察来实施健康监测时,确认未观察到异常症状,在评估埋植的聚集体的效力方面,不用考虑为追加的影响。
[0125] 上述陈述的本发明的说明仅为例示,本发明所属技术领域的普通技术人员可以理解的是,在不变更本发明的技术思想及必要特征的情况下,可以轻易变形为其他具体的形态。因此,应该理解的是,上述实施例无论从哪个方面来讲,都是例示性而非限制性。
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