[0001] 本发明属于生物催化领域，具体涉及一种自组装生物催化剂及其在合成L‑草铵膦中的应用。

[0002] 草铵膦，即4‑[羟基(甲基)膦酰基]‑D,L‑高丙氨酸(4‑[Hydroxy(methyl)phosphono]‑D,L‑homoalanine，PPT)是一类含磷的氨基酸类除草剂。草铵膦主要有两种手性异构体，分别为D构型和L构型，但是只有L构型具有除草活性，L‑草铵膦具有活性高、吸收好、杀草谱广、低毒、环境兼容性好等特点。

[0003] 草铵膦的合成主要分为生物发酵法(利用微生物分解双丙氨酰磷而产生)和化学合成法两大类：生物发酵法虽然具有反应条件较简单、产物收率相对较高且产物易分离纯化等优点，但其产量小、成本很高；化学合成法主要以甲基二氯化磷或亚磷酸酯为起始原料，通过烷基化、重排、氰胺化、铵化、酸解、纯化等一系列的反应最终生成磷酸酯，然后与某些氨基衍生物发生反应制得草铵膦。用生物方法合成L‑草铵膦，草铵膦最开始源于生物法合成的双丙氨膦，由于双丙氨膦可看成是草铵膦的母体，科研工作者通过生物方法合成草铵膦。以2‑羰基‑4‑(羟基甲基膦酰基)丁酸(PPO)为底物，同时辅酶NAD(P)H以及氨基供体作为辅底物，氨基酸脱氢酶还原胺化合成L‑草铵膦。

[0004] 以谷氨酸脱氢酶(glufosinate dehydrogenase，GfDH)为催化剂，不对称催化2‑羰基‑4‑(羟基甲基氧膦基)‑丁酸(2‑oxo‑4‑[(hydroxy)(‑methyl)phosphinyl]butyric acid，PPO)生成L‑草铵膦，构建了甲酸脱氢酶(LbFDH)胞内辅酶再生体系，转化率为99％，获得的L‑草铵膦e.e.值>99％。

[0005] 甲酸脱氢酶(PseFDH)来源为Pseudomonas sp.101的野生型FDH对NAD+的催化效率+最高，其突变体PseFDH A196G在目前已报道的NAD依赖型FDH中催化效率最高。甲酸价格低+
廉，甲酸脱氢酶能催化甲酸盐生成二氧化碳，易被排出反应体系，无污染；同时将NAD(P) 还原为NAD(P)H，是氧化还原生物合成中辅酶再生体系的关键酶。

[0006] 氧化还原酶大多依赖辅酶NADPH或NADH进行催化反应，是手性化合物合成重要生物催化剂，然而辅酶会随着产物的生成而消耗，同时NAD(P)H的高成本，价格昂贵，阻碍了其大规模生产，这就促使我们找到一种方法使得辅酶的浪费减少。目前常用的方法有化学法和生物法，化学法存在化学工艺复杂，制备成本高，污染严重等问题，酶法制备存在酶纯化成本高，稳定性差，难以放大等问题，为了开发一种高效的辅因子的生产方法，本发明采用了多酶自组装的技术。

[0007] 基于多酶组装技术构建高效催化的超分子复合体系是酶催化领域的研究热点。通过多酶组装可实现底物通道作用，即反应中间产物不经主体溶剂扩散，直接从一个酶的活性位点传递至下一个酶的活性位点，有效防止中间体在扩散或竞争途径中损失，提高酶级联反应转化效率。自组装蛋白是一种缩短多种酶之间距离的技术，适用于需要辅因子的工业生产。然而目前尚未有利用自组装蛋白技术应用于谷氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶双酶共表达的研究。

[0008] 本发明目的是提供一种自组装生物催化剂在L‑草铵膦中的应用，所述生产L‑草铵膦的方法是利用谷氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶自组装蛋白来提高生产NADH的效率，优化辅酶再生体系，为氧化还原反应提供更多的能量。

[0009] 第一方面，本发明提供了一种自组装生物催化剂，包括：相连的谷氨酸脱氢酶与甲酸脱氢酶，所述谷氨酸脱氢酶与甲酸脱氢酶通过SpyCatcher‑SpyTag标签体系相连接，所述谷氨酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述甲酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0010] 进一步地，所述SpyCatcher连接在谷氨酸脱氢酶的N端，所述SpyTag连接在甲酸脱氢酶的C端。

[0011] 进一步地，所述SpyCatcher‑SpyTag标签体系与谷氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶之间通过两倍的柔性连接肽相连接。

[0012] 第二方面，本发明提供了带有SpyCatcher‑SpyTag标签体系以及柔性连接肽的自组装蛋白的编码基因，所述编码基因包括连接有SpyCatcher以及柔性连接肽的谷氨酸脱氢酶的编码基因Ⅰ；所述编码基因还包括连接有SpyTag以及柔性连接肽的甲酸脱氢酶的编码基因Ⅱ；所述连接有SpyCatcher以及柔性连接肽的谷氨酸脱氢酶的编码基因Ⅰ核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述连接有SpyTag以及柔性连接肽的甲酸脱氢酶的编码基因Ⅱ核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

[0013] 第三方面，本发明提供了一种工程菌，所述工程菌包含上述的编码基因。

[0014] 第四方面，本发明提供了所述自组装生物催化剂在合成L‑草铵膦中的应用。

[0015] 第五方面，本发明提供了所述的工程菌的制备方法，包括以下步骤：

[0016] (1)构建第一和第二多克隆位点分别为草铵膦脱氢酶与醇脱氢酶的重组表达载体，转化大肠杆菌，获得初始菌株；

[0017] (2)采用同源重组的方法，将SpyTag基因和两倍柔性连接肽基因连接到甲酸脱氢酶C端基因一端，采用一步克隆法将SpyCatcher基因和两倍柔性连接肽基因克隆到谷氨酸脱氢酶N端基因一端，构建得到重组质粒，转入宿主细胞中，构建自组装工程菌。

[0018] 进一步地，所述重组表达载体以质粒pETDuet为载体；宿主细胞优选大肠杆菌E.coLi BL21(DE3)。

[0019] 第六方面，本发明提供了所述工程菌在合成L‑草铵膦中的应用。

[0020] 进一步地，所述应用的途径为：以带SpyTag标签的甲酸脱氢酶和带SpyCatcher标签的谷氨酸脱氢酶自组装菌株经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以2‑羰基‑4‑[羟基(甲+基)膦酰基]丁酸为底物，加入甲酸铵和NAD，以pH值为7～8的缓冲液为反应介质构成反应体系，在20℃‑60℃、500‑700rpm条件下反应，反应完全，获得L‑草铵膦。

[0021] 进一步地，所述反应体系中，所述催化剂的用量以湿菌体总重量计为5～30g/L，所+述底物的初始浓度为10～500mM，所述NAD添加量为0～0.4mM，所述甲酸铵的添加量为10～
500mM，反应温度为20℃～60℃，反应转速为500～700rpm。

[0022] 进一步地，所述催化剂的用量以湿菌体总重量计为10g/L，所述底物的初始浓度为+200mM，所述NAD添加量为0.1mM，所述甲酸铵的添加量为300mM，反应温度为35℃，反应转速为600rpm。

[0023] 本发明提供的合成L‑草铵膦的方法，以2‑羰基‑4‑[羟基(甲基)膦酰基]丁酸为反应底物，以甲酸铵为辅酶再生体系的底物，此生物催化剂催化辅酶NAD(P)H再生的同时，谷+氨酸脱氢酶将2‑羰基‑4‑[羟基(甲基)膦酰基]丁酸催化为L‑PPT，甲酸脱氢酶将NAD催化为NADH，最终得到的产物为L‑草铵膦和二氧化碳，无需进行分离纯化，减少成本，经济环保，绿色无污染。

[0024] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

[0025] (1)本发明提供的一种自组装生物催化剂能够高效地为氧化还原体系不断提供NADH，保证生物氧化还原过程中的高效辅酶供应，使L‑草铵膦的合成成本降低；

[0026] (2)本发明提供的利用自组装生物催化剂构建辅酶循环体系制备L‑草铵膦的方法中，200mM底物转化率提高、反应速率加快，副产物是CO2，易于排出反应体系，并且绿色无污染；

[0027] (3)本发明的自组装生物催化剂对NAD+的催化效率显著高于野生型，其中谷氨酸脱氢酶的酶活提升2倍，将其用于辅酶再生系统与L‑草铵膦中的应用于L‑草铵膦生产的时间被有效缩短，具有很好的应用前景。附图说明

[0028] 图1为原始菌株与不同自组装菌株的SDS‑PAGE电泳图，其中泳道1：标准蛋白分子量；泳道2：原始菌株的全细胞，其他泳道：自组装菌株的全细胞。

[0029] 图2为原始菌株与自组装菌株中的谷氨酸脱氢酶的酶活比较。

[0030] 图3为原始菌株与自组装菌株中的甲酸脱氢酶的酶活比较。

[0031] 图4为原始菌株与自组装重组菌株制备L‑草铵膦对比的反应进程图。

[0032] 为了使本领域技术人员更好地理解本发明方案，下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。应该指出，以下详细说明都是示例性的，且仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。

[0033] 基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

[0034] 除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本发明实施例中所用的实验材料均为本领域常规的实验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规实验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。

[0035] 上游基因工程操作所用试剂：本发明实施例中使用的一步克隆试剂盒均购自Vazyme，南京诺唯赞生物科技有限公司；质粒提取试剂盒、DNA回收纯化试剂盒购自Axygen杭州有限公司；E.coLi BL21(DE3)、质粒等购自上海生工；DNA marker、FastPfu DNA聚合酶、低分子量标准蛋白、琼脂糖电泳试剂、引物合成与基因测序工作由杭州擎科梓熙生物技术有限公司完成。以上试剂使用方法参考商品说明书。

[0036] 下游催化工艺所用试剂：2‑羰基‑4‑(羟基甲基膦酰基)丁酸(简称PPO)的标准品购自Sigma‑ALdrich公司；NADH购于邦泰生物工程(深圳)有限公司；其他常用试剂购自国药集团化学试剂有限公司。

[0037] 感受态细胞的制备：从‑80℃冰箱中获得甘油管保藏的E.coLi BL21(DE3)菌株，在无抗LB平板上划线，37℃培养10h，获取单菌落；挑取LB平板的单菌落，接种至含10mL的LB培养基的试管中，37℃、180rpm培养8h；从试管中取2mL菌液，接种到100mL的LB培养基中，37℃、180rpm培养OD600至0.4‑0.6；将菌液在冰上预冷，取菌液至灭菌的离心管中，冰上放置10min，4℃、5000rpm离心10min；将上清液倒出，用4℃预冷的0.1moL/L的CaCL2水溶液重悬沉淀细胞，并在冰上放置30min；4℃、5000rpm离心10min，弃上清，用4℃预冷的含15％甘油的0.1moL/L的CaCL2水溶液重悬沉淀细胞，取100μL重悬细胞分装至灭菌的1.5mL离心管中，保藏于‑80℃冰箱，需要时取出。

[0038] 高效液相色谱(HPLC)检测产物L‑PPT浓度，分析方法为：

[0039] (1)色谱柱型号：QS‑C18，5μm，4.6×250mm。流动相：将3.854g乙酸铵溶于900mL超纯水中，用磷酸调pH至5.7，并定容至1000mL，再以乙酸铵溶液：纯甲醇＝10:90的比例加入纯甲醇。荧光检测波长为λex＝340nm，λem＝450nm，流速：1.0mL/min，柱温：40℃。

[0040] (2)衍生化试剂：分别称取0.1g邻苯二甲醛(OPA)和0.12g N‑乙酰‑L‑半胱氨酸(NAC)，加入10mL无水乙醇助溶，再加入0.1mol/L硼酸缓冲液(pH9.8)定容至50mL，溶解后放置4℃冰箱保存。

[0041] (3)衍生化反应：吸取200μL样品溶液加入400μL衍生化试剂，在金属浴中600rpm，35℃振荡反应5min，在加入400μL超纯水混匀，检测。

[0042] 高效液相色谱(HPLC)检测底物PPO的浓度，分析方法为：

[0043] 色谱柱型号：QS‑C18，5μm，4.6×250mm。流动相：将50mM磷酸二氢胺和10mM四丁基溴化铵溶于800mL超纯水中，用磷酸调pH到3.8，并定容至1000mL，与乙腈以体积比88:12混合。检测波长为232nm，流速：0.8mL/min，柱温：40℃，出峰时间为：10.0分钟。

[0044] 本发明中，谷氨酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，甲酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，连接有SpyCatcher以及柔性连接肽的谷氨酸脱氢酶的编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，连接有SpyTag以及柔性连接肽的甲酸脱氢酶的编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

[0045] SEQ ID No.1

[0046] MAKVLCVLYDDPVDGYPKTYARDDLPKIDHYPGGQTLPTPKAIDFTPGQLLGSVSGELGLRKYLESNGHTLVVTSDKDGPDSVFERELVDADVVISQPFWPAYLTPERIAKAKNLKLALTAGIGSDHVDLQSAIDRNVTVAEVTYCNSISVAEHVVMMILSLVRNYLPSHEWARKGGWNIADCVSHAYDLEAMHVGTVGAGRIGLAVLRRLAPFDVHLHYTDRHRLPESVEKELNLTWHATREDMYPVCDVVTLNCPLHPETEHMINDETLKLFKRGAYIVNTARGKLCDRDAVARALESGRLAGYAGDVWFPQPAPKDHPWRTMPYNGMTPHISGTTLTAQARYAAGTREILECFFEGRPIRDEYLIVQGGALAGTGAHSYSKGNATGGSEEAAKFKKAV。

[0047] SEQ ID NO.2

[0048] MAENLNLFTSTQEVVKEALNKLGYDEAMYELLKEPLRLLKVRIPVKMDDGTTQVFTGYRAQHSDAVGPTKGGVRFHPMVSEDEVKALSMWMTLKCGIVDLPYGGGKGGIICDPRQMSMGELERLSRGYVRAISQIVGPTKDIPGPDMFTNAQIMAWMMDEYSRMDEFNSPGFITGKPLVLGGSKGRDRATAEGVTIVIQEAAKKRNIDIKGARVVIQGFGNAGSFLAKFMSDLGAKVIGISDAYGALHDPNGLDIDYLLDRRDSFGTVTTLFENTITNQELLELDCDILVPAAIENQITAENAHNIKATIVVEAANGPTTSEATKILTERGILLVPDVLASAGGATVSYFEWVQNNMGYYWEEEEVQEKLYKKMYDSFEAVYTTATTRNIDMRLAAYMVGVRRTAEASRFRGWV。

[0049] SEQ ID NO.3

[0050] ATGGCAATGGTTGATACACTGAGTGGTCTGAGTAGCGAACAGGGTCAGAGTGGGGATATGACGATTGAAGAAGATAGCGCAACACATATTAAATTTAGTAAACGTGACGAGGATGGTAAAGAACTGGCGGGGGCAACAATGGAACTGCGTGATAGCAGCGGTAAAACCATTAGCACATGGATTAGCGATGGTCAAGTAAAAGACTTCTATCTGTATCCGGGTAAATATACATTTGTGGAAACCGCAGCACCGGACGGCTATGAAGTTGCAACGGCAATTACCTTTACCGTTAATGAACAGGGGCAGGTTACCGTTAATGGGAAAGCAACCAAAGGTGATGCACACATCGGTGGCGGTGGCTCCGGTGGCGGCGGTAGCATGGCAGAAAACCTGAACTTATTTACGAGCACCCAGGAGGTTGTGAAAGAAGCGCTGAACAAACTGGGTTATGATGAGGCAATGTACGAACTGCTGAAAGAACCGCTGCGCCTGCTGAAAGTGCGTATTCCTGTGAAGATGGACGATGGCACCACACAGGTGTTTACGGGTTATCGCGCACAACATTCCGATGCAGTAGGTCCCACCAAAGGTGGCGTGCGTTTTCATCCTATGGTTTCTGAAGACGAAGTTAAAGCACTGAGCATGTGGATGACCCTGAAGTGCGGGATTGTAGATCTGCCTTATGGTGGTGGTAAAGGTGGCATTATTTGTGATCCGCGTCAGATGAGCATGGGGGAATTAGAACGTCTGAGCCGTGGATATGTTCGGGCAATTAGTCAGATTGTTGGGCCGACCAAAGATATACCGGgtCCGGATATGTTTACCAATGCACAAATTATGGCATGGATGATGGATGAGTATAGCCGTATGGATGAATTTAATAGTCCGGGTTTTATAACCGGTAAACCTCTGGTGCTGGGCGGTAGTAAAGGGCGTGATCGGGCGACGGCAGAAGGTGTTACGATTGTTATTCAGGAGGCAGCAAAAAAGAGAAATATCGATATCAAAGGTGCACGCGTTGTTATTCAAGGGTTCGGTAATGCCGGCAGTTTTTTAGCAAAGTTTATGAGTGATCTGGGCGCGAAGGTTATAGGAATAAGTGATGCATACGGGGCCCTGCACGATCCGAATGGTTTAGATATTGATTATCTGCTGGACAGACGTGATAGTTTTGGTACCGTTACCACGCTGTTTGAAAATACAATTACGAATCAGGAGCTGCTGGAACTGGATTGTGATATTCTGGTGCCGGCCGCAATTGAGAATCAGATTACGGCAGAAAATGCACATAATATTAAGGCAACCATAGTTGTGGAAGCAGCGAACGGCCCAACCACCTCTGAAGCAACCAAAATTCTGACCGAACGTGGTATTCTGTTAGTGCCAGACGTTTTAGCAAGCGCAGGTGGGGCAACAGTTAGCTACTTTGAGTGGGTTCAAAATAATATGGGCTATTACTGGGAAGAAGAAGAGGTTCAAGAAAAACTGTACAAAAAAATGTATGATAGCTTTGAAGCAGTATATACAACCGCAACCACGCGCAATATAGATATGCGTCTGGCAGCGTATATGGTGGGAGTGAGAAGAACAGCAGAAGCGAGCCGTTTCCGGGGCTGGGTG。

[0051] SEQ ID NO.4

[0052] ATGGCCAAAGTTCTGTGTGTACTGTATGACGACCCGGTTGATGGTTACCCTAAAACTTACGCACGTGACGATCTGCCGAAAATCGACCACTACCCGGGCGGCCAGACCCTGCCGACGCCGAAAGCGATCGATTTCACTCCGGGCCAACTGCTGGGTTCTGTTTCTGGTGAACTGGGCCTGCGTAAATATCTGGAATCCAACGGCCACACCCTGGTGGTGACCAGCGACAAAGATGGTCCGGACTCCGTGTTCGAACGTGAACTGGTTGATGCTGACGTTGTCATTAGCCAGCCGTTCTGGCCGGCGTATCTGACCCCGGAACGCATCGCCAAAGCTAAAAACCTGAAACTGGCACTGACCGCAGGTATTGGTTCTGACCACGTTGATCTGCAGTCCGCCATCGATCGTAACGTTACCGTTGCCGAAGTAACCTACTGTAACTCTATCTCCGTGGCTGAACATGTGGTTATGATGATCCTGTCTCTGGTTCGCAACTATCTGCCGTCTCATGAATGGGCGCGTAAAGGCGGCTGGAACATCGCTGATTGTGTCAGCCATGCGTATGACCTGGAAGCAATGCATGTGGGCACTGTTGGTGCTGGTCGCATCGGCCTGGCTGTCCTGCGTCGCCTGGCACCATTCGACGTACACCTGCACTACACTGACCGTCACCGTCTGCCAGAAAGCGTGGAGAAAGAACTGAACCTGACCTGGCATGCTACTCGCGAAGACATGTACCCGGTGTGCGACGTTGTTACCCTGAACTGTCCACTGCACCCGGAGACCGAACACATGATTAACGATGAAACCCTGAAGCTGTTCAAACGTGGCGCGTACATCGTAAACACGGCTCGTGGTAAGCTGTGCGATCGTGACGCTGTGGCACGTGCGCTGGAATCTGGTCGCCTGGCCGGTTACGCTGGTGATGTATGGTTTCCACAGCCGGCTCCGAAAGACCACCCGTGGCGCACCATGCCTTACAATGGTATGACCCCGCACATTTCTGGTACCACTCTGACCGCACAGGCGCGTTACGCAGCGGGTACCCGTGAAATTCTGGAGTGCTTCTTTGAAGGTCGCCCGATCCGTGATGAATACCTGATCGTTCAGGGTGGTGCGCTGGCTGGCACTGGTGCTCATTCCTACTCTAAAGGTAACGCGACCGGTGGTTCTGAAGAGGCGGCGAAATTCAAAAAGGCCGTTGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGTGGTGGCTCTGCGCACATCGTTATGGTGGACGCGTACAAACCGACGAAA。

[0053] 实施例1、谷氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶自组装重组菌株的构建

[0054] 首先在NCBI里面搜索得到谷氨酸脱氢酶(LcGluDH)和甲酸脱氢酶(Ps eFDH)的序列，在载体pET‑28a中分别插入两个单酶的序列，由杭州擎科公司合成含LcGluDH单酶的质粒pET28a‑LcGluDH，含PseFDH单酶的质粒pET28a‑PseFDH。

[0055] 以pET28a‑LcGluDH为载体，通过PCR扩增得到含LcGluDH的目的片段；以pETDuet为载体，通过PCR扩增得到第一个多克隆位点打开的线性化片段，将含LcGluDH的目的片段插入到第一个多克隆位点的线性化片段中，得到pE TDuet‑LcGluDH的重组质粒。

[0056] 以pET28a‑PseFDH为载体，通过PCR扩增得到含PseFDH的目的片段；以pETDuet‑LcGluDH为载体，通过PCR扩增得到第二个多克隆位点打开的线性化片段，将含PseFDH的目的片段插入到第二个多克隆位点线性化片段中，得到pETDuet‑LcGluDH‑PseFDH的共表达重组质粒。

[0057] 将pETDuet‑LcGluDH‑PseFDH质粒，导入到大肠杆菌E.coLi BL21(DE3)中，即可得到EcoLi BL21(DE3)/pETDuet‑LcGluDH‑PseFDH，简称(G+F)。

[0058] 从Catcher‑Tag标签库(实验室自主构建，库容量>105)中筛选Catcher‑Ta g标签对，通过谷氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶分别与超过10万个标签对相互作用，发现SpyCatcher‑SpyTag分别与谷氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的结合力最强。因此，采用同源重组的方法，将SpyTag基因和两倍柔性连接肽基因连接到甲酸脱氢酶C端基因一端，采用一步克隆法将SpyCatcher基因和两倍柔性连接肽基因克隆到谷氨酸脱氢酶N端基因一端，构建得到重组质粒pETDuet‑YCG‑FYT，转入宿主E.coLi BL21(DE3)中，构建自组装工程菌E.coLi BL21(DE3)/pETDuet‑YCG‑FYT(简称YCG‑FYT),具体操作如下：

[0059] 引物设计

[0060] 根据SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示氨基酸序列设计引物1、引物2和引物3、引物4，引物5，引物6，引物7、引物8，引物9，引物10。

[0061] 引物1：5’‑GGTGGCGGCGGTAGCATGGCAGAAAACCTGAACTTATTTA CGAGCAC‑3’；

[0062] 引物2：5’‑GCTACCGCCGCCACCGGAGCCACCGCCACCGCTCGAATTC GGAT‑3’；

[0063] 引物3：5’‑GGCGGTGGTGGTTCTTAACCTAGGCTGCTGC‑3’；

[0064] 引物4：5’‑AGAACCACCACCGCCAGAACCACCACCGCCAACGGCCTT TTTGAA‑3’；

[0065] 引物5：5’‑GCGCACATCGTTATGGTGGACGCGTACAAACCGACGAAAT AACCTAGGCTGCTGCCACC‑3’；

[0066] 引物6：5’‑TAACGATGTGCGCAGAGCCACCACCGCCAGAACCACCACC ACCAACGGCCTTTTTGAAT‑3’；

[0067] 引物7：5’‑GGTGGCGGTGGCTCCGGT‑3’；

[0068] 引物8：5’‑GCTCGAATTCGGATCCTGG‑3’；

[0069] 引物9：5’‑GCCAGGATCCGAATTCGAGCATGGCAATGGTTGATACACT GAGT‑3’；

[0070] 引物10：5’‑CCACCGGAGCCACCGCCACCGATGTGTGCATCACCTTTG GTTG‑3’；

[0071] 2、片段扩增

[0072] (1)以原始菌株的质粒pETDuet‑LcGluDH‑PseFDH(简称G+F)为载体，采用引物1和引物2，利用高保真Pfu DNA聚合酶进行扩增，加入DPN I对其进行消化，得到谷氨酸脱氢酶N端连接有两倍柔性连接肽的的共表达载体(pETDuet‑g2G‑F)。按照相同方法，以pETDuet‑g2G‑F为载体，采用引物3和引物4，进行PCR扩增，可以得到谷氨酸脱氢酶N端连接有两倍柔性连接肽、甲酸脱氢酶C端连接有两倍柔性连接肽的的共表达载体(pETDuet‑g2G‑Fg2)。

[0073] (2)以pETDuet‑g2G‑Fg2为载体，使用引物5和引物6，利用高保真Pfu DNA聚合酶进行扩增，加入DPN I对其进行消化，得到甲酸脱氢酶C端带SpyTag标签的共表达载体(pETDuet‑g2G‑FYT)。

[0074] (3)以pETDuet‑g2G‑FYT为载体，使用引物7和引物8，利用高保真Pfu DNA聚合酶进行扩增，得到pETDuet‑g2G‑FYT的线性化片段；以pETDuet‑SpyCatcher为载体，使用引物9和引物10，利用高保真Pfu DNA聚合酶进行扩增，得到含同源臂的SpyCatcher目的片段。

[0075] (4)纯化线性化片段和目的片段。将上述线性化片段和目的片段通过纯化试剂盒进行纯化，将ELuent放进65℃恒温箱中预热，向已放入吸附柱的收集管中加入250uL Buffer BL,12000rpm离心1min，活化硅胶膜；向pcr产物中加入150uL Buffer GL(pcr原液：Buffer GL＝1：3)吸打混匀，将混合液全部加入收集管中，12000rpm离心1min，弃废液；向吸附柱中加入700μL的Buffer W2(已经加入指定体积的无水乙醇)，12000rpm离心1min，弃废液；此步骤做两次；将吸附柱放回空收集管，12000rpm离心2min；取出吸附柱放置于干净的
1.5mL离心管中，20‑25℃静止3min，在吸附柱中间加入已预热的35‑50uLELuent，20‑25℃静置2min，12000rpm离心2min，即可得纯化完成的PCR产物。

[0076] (5)一步克隆。采用NanoDropone微量分光光度计(TermoFisherScientific，USA)进行核酸浓度的测定，根据浓度按照表3的单片段同源重组反应体系进行配置。

[0077] 最适克隆载体使用量＝{0.02*克隆载体碱基对数}ng(0.03pmoL)

[0078] 最适插入片段使用量＝{0.04*插入片段碱基对数}ng(0.06pmoL)

[0079] 表1、反应体系

[0080]

[0081] 将配置好的反应体系使用移液器轻轻吸打混匀，短暂离心后将反应液收集到管底。反应体系放在37℃的PCR仪中，保温30min，然后立即放在冰上冷却，得到含有SpyCatcher目的片段与pETDuet‑g2G‑FYT线性化片段的重组载体。

[0082] 将得到的重组载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)中(42℃，90s)，涂布于含有100μg/mL氨苄霉素抗性的LB平板，37℃下培养12‑16h，随机挑取克隆抽提质粒进行测序鉴定，筛选含有谷氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶基因的自组装菌株EcoLi BL21(DE3)/pETDuet‑YCG‑FYT(YCG‑FYT)。

[0083] 实施例2、谷氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的自组装菌株的诱导表达

[0084] 将实施例1构建的YCG‑FYT接种至含50μg/mL氨苄霉素抗性的LB液体培养基，37℃，200rpm下培养12h，再以体积浓度2％接种量接种至新鲜的含有50μg/mL氨苄霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，180rpm下培养至菌体OD600达0.6～0.8，加入终浓度为12μg/mL的IPTG，28℃下诱导培养12h后，4℃、8000rpm离心15min，弃去上清液，收集沉淀，用pH 7.5、
200mM磷酸钠缓冲液洗涤两次，获得湿菌体。图1A为相对应的蛋白胶图，第1泳道为Maker；第
2泳道为原始菌株的全细胞，第3泳道为自组装菌株的全细胞。

[0085] 实施例3、自组装后的谷氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的酶活力的测定

[0086] 酶活定义：1961年国际酶学会议规定，1个酶活力单位是指在特定条件(35℃)下，在1分钟内转化1微摩尔底物的酶量，或是转化底物中的1微摩尔的有关基团的酶量。相对酶活即以原始菌株作为对照，设为100％。具体操作如下：

[0087] 菌液的配置：称取0.01g实施例1方法制备的10gDCW/L的谷氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶自组装菌体于2mL EP管中(即5g/L的湿菌体)，在向其加入1mL的PB缓冲液，吸打菌体，与液体混匀，即可得到相应的菌液。

[0088] 谷氨酸脱氢酶的酶活测定：取20mM的PPO(使用前反复摇晃),0.1mM的NADH，20mM的(NH4)2SO4，使用氨水将pH调至7.5，最后加PB缓冲液定容到相应体积。

[0089] 甲酸脱氢酶的酶活测定：1mM的NAD+，20mM的甲酸铵，使用氨水将PH调至7.5，最后加PB缓冲液定容到相应体积。按照200uL体系，即100uL菌液和100uL反应液。

[0090] 首先先设置酶标仪的温度为35℃，吸光值为340nm，取100uL的菌液加入到96孔板中，取100uL反应液与菌液迅速混合，开始检测，以时间为横坐标(单位min)、吸光值为纵坐+标测定吸光值。根据NADH标准曲线，计算酶活。NAD和NADH标准曲线：利用PB缓冲液分别配+
置0.05mM、0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.8mM的NAD和NADH溶液，配置1L体系的PB缓冲液，取10.45g的NaH2PO4和18.86g的Na2HPO4，加入1L超纯水，使用氨水和磷酸调pH至7.5。最终结果是谷氨酸脱氢酶的酶活是原始酶活的两倍，甲酸脱氢酶的酶活是原始酶活的60％左右，如图2和3所示。

[0091] 实施例4、谷氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶自组装重组菌制备L‑草铵膦

[0092] 以PPO为底物，以谷氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶自组装重组菌经发酵培养获得的湿菌体为生物催化剂进行反应，生成L‑草铵膦，具体操作如下：

[0093] 先将实施例1方法制备的10gDCW/L的谷氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶自组装重组菌+(EcoLi BL21(DE3)/pETDuet‑YCG‑FYT)湿菌体、300mM甲酸脱氢酶、0.1mM NAD，依次溶解于
1L的200mM、pH 7.5的磷酸钠缓冲液中，然后加入终浓度为200mM的底物PPO(36.2g/L)构成辅酶再生体系1L，35℃、搅拌转速为600rpm下反应6h，反应液取样100uL，采用高效液相色谱检测反应进程。

[0094] 结果如图4所示，菌株YCG‑FYT反应时底物浓度随时间的推移而逐渐降低，2h底物转化率大于87％。

[0095] 实施例5原始菌株与自组装重组菌株对比的蛋白胶图

[0096] 全细胞进行蛋白胶电泳的步骤：将已收集的菌体在分析天平上称取0.1g菌于10mLEP管中，加入10mL的PBS缓冲液充分混匀，从其中取300uL的菌液和100uL的Loading buffer染液(菌液与染液比例为3：1)于1.5mL的EP管中混匀，将此EP管放置于100℃沸水中煮10～15min。

[0097] 组装蛋白胶装置，将撕过膜的蛋白胶插入装置中，加入部分缓冲液，检查装置是否漏液，如若不漏，即可加缓冲液至没过蛋白胶，拔掉梳子，取8uL的EP管中的菌液于孔中，取5uL的mark于孔中进行条带对比，全部加完样后，红色连正极，黑色连负极，120V，80mA，
80min进行蛋白胶电泳。电泳结束后，将蛋白胶取出，进行染色，脱色，最后观察蛋白胶，比对mark对应的条带，并保存照片，其结果如图1A及图1B所示。

[0098] 对比例1、谷氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶共表达原始菌E.coLi BL21(DE3)/pETDu et‑LcGluDH‑PseFDH(G+F)制备L‑草铵膦

[0099] 以PPO为底物，以谷氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶共表达原始菌经发酵培养获得的湿菌体为生物催化剂进行反应，生成L‑草铵膦，具体操作与实施例4相同。

[0100] 结果如图4所示，G+F菌株催化反应的2h底物转化率58％。

[0101] 对比例2、谷氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶融合蛋白的构建

[0102] 原始菌株为含谷氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶双酶共表达基因的菌株(G+F)，首先将含有谷氨酸脱氢酶的目的片段，插入到pET28a载体上，得到含谷氨酸脱氢酶的单酶质粒，即pET28a‑LcGluDH；将含有甲酸脱氢酶的目的片段，插入到pET28a载体上，得到含甲酸脱氢酶的单酶质粒，即pET28a‑PseFDH。将得到的重组质粒导入大肠杆菌中，即可得到两个含单酶的菌株。

[0103] 以已构建成功的pET28a‑LcGluDH为模板，用引物进行pcr扩增得到含LcGluDH的线性化载体，以G+F基因序列为模板，得到含PseFDH的目的片段，通过一步克隆将两个片段连接，进行转化，菌落PCR，得到含LcGluDH在N端、PseFDH在C端融合蛋白基因的重组质粒，即pET28a‑LcGluDH‑PseFDH。

[0104] 以已构建成功的pET28a‑PseFDH为模板，用引物进行pcr扩增得到含PseFDH的线性化载体，以G+F基因序列为模板，得到含LcGluDH的目的片段，通过一步克隆将两个片段连接，进行转化，菌落PCR，得到含PseFDH在N端、LcGluDH在C端融合蛋白基因的重组质粒，即pET28a‑PseFDH‑LcGluDH。

[0105] 将上述得到的重组质粒分别导入大肠杆菌中，即可得到对应的重组菌G‑F、F‑G。

[0106] 对比例3、含不同连接肽的融合蛋白的构建

[0107] 在G‑F基因序列的基础上，将柔性连接肽(GGGGS)基因插入到两个蛋白的编码基因之间，构建得到含一倍柔性连接肽融合蛋白编码基因的重组质粒，将重组质粒导入大肠杆菌中，得到菌株G‑g1‑F；在G‑g1‑F基础上，再插入柔性连接肽基因，构建得到含两倍柔性连接肽融合蛋白基因的重组质粒，将重组质粒导入大肠杆菌中，得到菌株G‑g2‑F；依次类推，可以得到G‑g3‑F，G‑g4‑F；按照相同方法，在F‑G的基础上，可以得到F‑g1‑G、F‑g2‑G、F‑g3‑G、F‑g4‑G菌株；

[0108] 在G‑F基因序列的基础上，将刚性连接肽(EAAAK)基因插入到两个蛋白的编码基因之间，构建得到含一倍刚性连接肽融合蛋白编码基因的重组质粒，将重组质粒导入大肠杆菌中，得到菌株G‑e1‑F；按照相同方法，即可得到G‑e2‑F；依次类推，可以得到G‑e3‑F，G‑e4‑F，按照相同方法，在F‑G的基础上，得到菌株F‑e1‑G、F‑e2‑G、F‑e3‑G、F‑e4‑G。

[0109] 将上述得到的重组质粒分别导入大肠杆菌中，即可得到对应的重组菌。

[0110] 对比例4、含不同连接肽融合蛋白的酶活力测定

[0111] 测定对比例2、3中融合蛋白菌株的相对酶活。

[0112] 谷氨酸脱氢酶的酶活测定：取20mM的PPO(使用前反复摇晃)，0.1mM的NADH，20mM的(NH4)2SO4，使用氨水将pH调至7.5，最后加PB缓冲液定容到相应体积。

[0113] 甲酸脱氢酶的酶活测定：1mM的NAD+，20mM的甲酸铵，使用氨水将pH调至7.5，最后加PB缓冲液定容到相应体积。按照200uL体系，即100uL菌液和100uL反应液。

[0114] 首先设置酶标仪的温度为35℃，吸光值为340nm，取100uL的菌液加入到96孔板中，取100uL反应液与菌液迅速混合，开始检测，以时间为横坐标(单位min)、吸光值为纵坐标测定吸光值。以原始菌株的为最高酶活，设为100％，计算相对酶活。

[0115] 表2原始菌株与对比例2、3中融合蛋白菌株的相对酶活

[0116]

[0117]

[0118] 注：n表示连接肽的倍数，n＝0、1、2、3、4。

[0119] 由表可知，LcGluDH在N端，PseFDH在C端的融合蛋白，LcGluDH有活性，PseFDH的无活性；PseFDH在N端，LcGluDH在C端的融合蛋白，LcGluDH有活性，PseFDH活性很低。使用不同倍柔性连接肽与刚性连接肽的融合蛋白中均为使用三倍连接肽的效果最好，LcGluDH的酶活最高，但是都不如原始菌株中的LcGluDH的酶活。

[0120] 对比例5、不同倍柔性连接肽的YCG‑FYT优化

[0121] SpyCatcher标签通过一倍柔性连接肽连接到LcGluDH的N端、SpyTag标签通过一倍柔性连接肽连接到PseFDH的C端的自组装蛋白，构建此自组装蛋白的编码基因，以G+F基因序列为模板，构建含一倍柔性连接肽的重组质粒，将重组质粒导入大肠杆菌中，得到菌株YCg1G‑Fg1YT；以YCG‑FYT基因序列为模板，将SpyCatcher标签通过三倍柔性连接肽连接到LcGluDH的N端，将SpyTag标签通过两倍连接肽连接到PseFDH的C端，构建含三倍连接肽的重组质粒，将重组质粒导入大肠杆菌中，得到菌株YCg3G‑Fg3YT。进行高效液相色谱检测，方法如实施例4。

[0122] 对比例6、含不同倍柔性连接肽基因的YCG‑FYT制备L‑草铵膦

[0123] 以PPO为底物，以不同倍柔性连接肽的YCG‑FYT经发酵培养获得的湿菌体为生物催化剂进行反应，生成L‑草铵膦，具体操作与实施例4相同。

[0124] 表3对比例5不同倍连接肽的YCG‑FYT制备L‑草铵膦对比的反应进程表

[0125]T/h ppo/mM YCg1G‑Fg1YT YCG‑FYT YCg3G‑Fg3YT
0 200.73 200.04 200.06
1 177.88 80.70 104.18
2 159.35 25.44 53.52
4 138.43 14.94 35.63
2h转化率％ 20.61 87.28 73.25

[0126] 如上表所示，2h的转化率，含有两倍柔性连接肽基因重组质粒的重组菌(YCG‑FYT)最快，含有三倍连接肽基因的重组菌2h转化率次之，含有一倍连接肽基因的重组菌2h转化率最差。

[0127] 对比例7、含SpyCatcher/SpyTag自组装标签的共表达菌株的构建

[0128] SpyCatcher标签通过两倍柔性连接肽连接到LcGluDH的N端、SpyTag标签通过两倍连接肽连接到PseFDH的C端的自组装蛋白，构建此自组装蛋白的编码基因，以G+F基因序列为模板，将构建含(SpyCatcher‑LcGluDH)+(PseFDH‑SpyTag)的重组质粒，将重组质粒导入大肠杆菌中，得到菌株YCG‑FYT；按照相同方法，构建含(SpyCatcher‑LcGluDH)+(SpyTag‑PseFDH)质粒的菌株，简称YCG‑YTF；含(LcGluDH‑SpyCatcher)+(PseFDH‑SpyTag)质粒的菌株，简称GYC‑FYT；含(LcGluDH‑SpyCatcher)+(SpyTag‑PseFDH)质粒的菌株,简称GYC‑YTF；含(SpyTag‑LcGluDH)+(PseFDH‑SpyCatcher)质粒的菌株，简称YTG‑FYC；含(SpyTag‑LcGluDH)+(SpyCatcher‑PseFDH)质粒的菌株，简称YTG‑YCF；含(LcGluDH‑SpyTag)+(PseFDH‑SpyCatcher)质粒的菌株，简称GYT‑FYC；含(LcGluDH‑SpyTag)+(SpyCatcher‑PseFDH)质粒的菌株，简称GYT‑YCF。

[0129] 将上述得到的重组质粒分别导入大肠杆菌中，即可得到对应的重组菌。

[0130] 对比例8、含SnoopCatcher/SnoopTag自组装标签的共表达菌株的构建

[0131] SnoopCatcher标签通过两倍柔性连接肽连接到LcGluDH的N端、将SnoopTag标签通过两倍连接肽连接到PseFDH的C端的自组装蛋白，构建此自组装蛋白的编码基因，以G+F基因序列为模板，构建含(SnoopCatcher‑LcGluDH)+(PseFDH‑SnoopTag)的重组质粒，将重组质粒导入大肠杆菌中，得到菌株NCG‑FNT；按照相同方法，构建含(SnoopCatcher‑LcGluDH)+(SnoopTag‑PseFDH)质粒的菌株，简称NCG‑NTF；含(LcGluDH‑SnoopCatcher)+(PseFDH‑SnoopTag)质粒的菌株，简称GNC‑FNT；含(LcGluDH‑SnoopCatcher)+(SnoopTag‑PseFDH)质粒的菌株,简称GNC‑NTF；含(SnoopTag‑LcGluDH)+(PseFDH‑SnoopCatcher)质粒的菌株，简称NTG‑FNC含(SnoopTag‑LcGluDH)+(SnoopCatcher‑PseFDH)质粒的菌株，简称NTG‑NCF；含(LcGluDH‑SnoopTag)+(PseFDH‑SnoopCatcher)质粒的菌株，简称GNT‑FNC；含(LcGluDH‑SnoopTag)+(SnoopCatcher‑PseFDH)质粒的菌株，简称GNT‑NCF。

[0132] 将上述得到的重组质粒分别导入大肠杆菌中，即可得到对应的重组菌。

[0133] 对比例9、含不同标签及不同组装形式的自组装重组菌所得自组装谷氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的酶活力的测定

[0134] 具体步骤如实施例3所述，测定对比例7和8制备的不同标签及不同组装形式的自组装重组菌所产生自组装谷氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的酶活力。

[0135] 表4对比例7、8不同自组装形式谷氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的酶活示意表

[0136]

[0137]

[0138] 如上表所示，在多种含不同标签及不同组装形式的自组装重组菌中，转入(SpyCatcher‑LcGluDH)+(PseFDH‑SpyTag)重组质粒的重组菌(YCG‑FYT)中的LcGluDH具有最佳的酶活，是原始菌株LcGluDH酶活的两倍，相比于Sn oopCatcher‑SnoopTag标签体系中LcGluDH酶活最高的含(SnoopCatcher‑LcGl uDH)+(PseFDH‑SnoopTag)重组质粒的重组菌(GNC‑FNT)，其LcGluDH酶活仍然有显著的优势。

[0139] 对比例10、含不同标签及不同组装形式的自组装重组菌制备L‑草铵膦

[0140] 以PPO为底物，以谷氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶自组装重组菌经发酵培养获得的湿菌体为生物催化剂进行反应，生成L‑草铵膦，具体操作如下：

[0141] 先将对比例7和8中制备的不同自组装重组菌湿菌体以10g/L的浓度、甲酸铵以+300mM的浓度、NAD以0.1mM的浓度，依次溶解于1L的200mM、pH7.5的磷酸钠缓冲液中，然后加入终浓度为200mM的底物PPO(36.2g/L)，使用氨水调节pH至7.5，构成辅酶再生体系1L，35℃、搅拌转速为600rpm下反应6h，反应液取样100uL，采用高效液相色谱检测反应进程。

[0142] 表5、原始菌株与对比例6、7自组装重组菌株制备L‑草铵膦对比的反应进程表[0143]

[0144] 续表

[0145]

[0146] 由上表可以看出，原始菌株G+F的2h转化率仅为58.01％，只有YCG‑FYT的反应速率快于原始菌株，2h转化率高达87.28％；GYC‑FYT、GNC‑FNT、YCG‑FYT、GNT‑FNC、NCG‑FNT的反应速率慢于原始菌株；而GNC‑NTF、NTG‑FNC、YTG‑FYC、NTG‑NCF、GYC‑YTF、GYT‑FYC、NCG‑NTF、GNT‑NCF、GYT‑YCF几乎不反应。