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一种长效胰岛素及其体外细胞生产加工方法
申请号	CN202111091704.0	申请日	2021-09-17	公开(公告)号	CN113801242B	公开(公告)日	2024-05-17
申请人	南通大学;			发明人	刘建喜;
摘要	本发明提供一种长效胰岛素及其体外细胞生产加工方法，涉及生物医学技术领域，其中长效胰岛素的体外细胞生产加工方法包含以下步骤：S1：准备胰岛素原前体；S2：使用2A肽及接头取代C肽；S3：使用取代C肽的2A肽将胰岛素原中的β链和α链酶切分开；S4：在β链的羧基端融入人促绒毛膜性腺激素 CTP糖基化多肽。通过上述体外细胞生产加工方法制备的长效胰岛素，使用2A肽，可以在设计的多肽位点完整的将胰岛素α与β链切断，使α和β链形成稳定的具有生物学活性异源二聚体。并且，在β链的羧基端融入了人促绒毛膜性腺激素CTP糖基化多肽，可以显著增加胰岛素的半衰期，极大地减少了服药次数与药量。
权利要求	1.一种长效胰岛素的体外细胞生产加工方法，其特征在于：包含以下步骤： S1：准备胰岛素原前体；所述胰岛素原前体通过体外细胞生产表达获得，并在体外细胞生产中将β链和α链设计在同一阅读框，以实现将β链和α链按相同比例表达的目的，S2：使用2A肽及接头取代C肽；在β链与α链折叠交联完成后，使用2A肽切断取代的C肽，达到将β链和α链分开的目的； S3：使用2A肽将β链和α链酶切分开； S4：在β链的羧基端融入促绒毛膜性腺激素糖基化多肽，所述促绒毛膜性腺激素为马或斑马的绒毛膜促性腺激素β亚基的羧基端。
说明书全文	一种长效胰岛素及其体外细胞生产加工方法技术领域 [0001] 本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种长效胰岛素及其体外细胞生产加工方法。背景技术 [0002] 糖尿病是一种常见的分泌代谢疾病，是一组由遗传和环境因素相互作用而引起的临床综合征。当胰岛素分泌绝对或相对不足时，为维持血糖平衡，有必要注射胰岛素。使用正常的胰岛素，因其体内的半衰期非常短暂，每日需要多次注射或者使用胰岛素泵持续注射。为避免多次给药，已有多款长效胰岛素上市。 [0003] 具体原理包括以下几个方面。1）在功能蛋白或多肽中融入抗体Fc，利用Fc受体将功能靶蛋白带入内涵体，在内涵体内的酸性环境条件下，使功能蛋白或多肽缓慢降解。2）提高功能蛋白或多肽在血液或者体内的非活性储量，依靠在血液或者体内缓慢释放活性功能蛋白或多肽，补充降解部分功能蛋白或多肽药学活性。 [0004] 具体到几种长效胰岛素，例如，重组甘精胰岛素注射液，地特胰岛素注射液和诺和平笔芯等。这类长效胰岛素主要是通过基因重组的技术生产，具体是通过缓释达到“长效”目的，其实缓释后，其半衰期与正常的胰岛素没有显著区别。另外的缺点还包括，其“长效”时间不够长，并且起效时间长。发明内容 [0005] 本发明的目的是为了解决现有技术中起效速度慢，体内半衰期短的缺点。 [0006] 为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案： [0007] 一种长效胰岛素的体外细胞生产加工方法，包含以下步骤： [0008] S1：准备胰岛素原前体； [0009] S2：使用2A肽及接头取代C肽； [0010] S3：使用2A肽将β链和α链酶切分开； [0011] S4：在β链的羧基端融入促绒毛膜性腺激素糖基化多肽。 [0012] 优选的，所述S2中，在β链与α链折叠交联完成后，使用2A肽切断取代的C肽，达到将β链和α链分开的目的。 [0013] 优选的，在体外细胞生产过程中将β链和α链设计在同一阅读框，以实现将β链和α链按相同比例表达的目的。 [0014] 优选的，所述促绒毛膜性腺激素糖基化多肽为人的促绒毛膜性腺激素β亚基的羧基端。 [0015] 优选的，所述促绒毛膜性腺激素为马或斑马的绒毛膜促性腺激素β亚基的羧基端。 [0016] 本申请还提供了一种长效胰岛素，使用上述所述长效胰岛素的体外细胞生产加工方法加工得到。 [0017] 优选的，包含以下序列：信号肽、β链、人促绒毛膜性腺激素 β亚基的羧基端、His标签、2A肽酶及α链。 [0018] 优选的，包含以下序列：信号肽、β链、马的促绒毛膜性腺激素 β亚基的羧基端、His标签、2A肽酶及α链。 [0019] 优选的，包含以下序列：信号肽、β链、驴的促绒毛膜性腺激素 β亚基的羧基端、His标签、2A肽酶及α链。 [0020] 上述所述的一种长效胰岛素，其使用2A肽，可以在设计的多肽位点完整的将胰岛素α和者β链切断，使α和β链形成稳定的具有生物学活性异源二聚体。并且在β链的羧基端融入人的促绒毛膜性腺激素CTP, 糖基化多肽，可以显著增加胰岛素的半衰期，极大地减少服药次数与药量。附图说明 [0021] 图1（结构一）为本发明提出一种胰岛素（含有组蛋白）的结构图； [0022] 图2（结构二）为本发明提出一种胰岛素（含有组蛋白和2A肽标签）的结构图； [0023] 图3（结构三）为一种长效胰岛素（含人的促绒毛膜性腺激素β亚基CTP、有组蛋白和2A肽标签）的结构图； [0024] 图4（结构四）为一种长效胰岛素（含马或者斑马的促绒毛膜性腺激素β亚基CTP、有组蛋白和2A肽标签）的结构图； [0025] 图5为不同结构表达的胰岛素活性示意图； [0026] 图6为一种长效胰岛素（含人的促绒毛膜性腺激素β亚基CTP、有组蛋白和2A肽标签）的活性示意图； [0027] 图7为一种长效胰岛素（含人的促绒毛膜性腺激素β亚基CTP、有组蛋白和2A肽标签）在血液中相对浓度与时间的折线图。具体实施方式 [0028] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，以下结合具体实施例，对本发明作进一步地详细说明。 [0029] 部分英文释义： [0030] CTP：蛋白质氨基酸序列羧基端 [0031] 在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开说明书的具体实施例的限制。 [0032] 一种长效胰岛素的体外细胞生产加工方法，包含以下步骤： [0033] S1：材料准备：请参照图1和2，体外细胞生产表达胰岛素原前体； [0034] S2：将β链和α链分开的目的在一实施方式中，将C肽切除，具体的，在β链与α链折叠交联完成后，使用2A肽酶切短C肽，体外由一个阅读框来表达胰岛素原时，C肽的切断是在体外细胞中完成的。 [0035] 在另一实施方式中，在体外将β链和α链设计在同一的阅读框来达到将β链和α链按相同比例表达的目的。 [0036] S3：请参阅图2，使用2A肽与合理长度的接头取代C肽，可以在工程细胞内完成胰岛素原的酶切加工。 [0037] S4：在β链的羧基端融入绒毛膜促性腺激素β亚基CTP糖基化多肽，在一实施方式中，所述CTP糖基化多肽为人的促绒毛膜性腺激素β亚基高度糖基化多肽。在另一实施方式中，也可使用马或斑马的绒毛膜促性腺激素β亚基。在其他实施方式中，也可以使用驴的促绒毛膜性腺激素 β亚基。 [0038] 马和斑马的绒毛膜促性腺激素β亚基上可被糖基化的氨基酸是人的绒毛膜促性腺激素β亚基上可被糖基化的氨基酸的两倍。使用人绒毛膜促性腺激素β亚基β亚基的羧基端是与人同源的，可以减少免疫反应。 [0039] 本申请还提供了一种长效胰岛素，使用上述所述长效胰岛素的制备方法制备，请参阅图3，包括信号肽、β链、人绒毛膜促性腺激素β亚基、His标签、2A肽酶及α链。在另一实施方式中，请参阅图4，包括信号肽、β链、马或斑马绒毛膜促性腺激素β亚基、His标签、2A肽酶及α链。在其他实施方式中，所述长效胰岛素还可以包括信号肽、β链、驴绒毛膜促性腺激素β亚基、His标签、2A肽酶及α链。 [0040] 验证实验： [0041] 1 蛋白表达纯化 [0042] HEK 293 细胞转染胰岛素表达质粒，培养48小时候，取培养上清，加入2M咪唑溶液使终浓度为20mM。0.45μm的滤膜简单过滤去杂质。取1ml镍琼脂糖凝胶镍NTA琼脂糖凝胶装柱，平衡，上样，洗脱分部收集。ELISA His标签抗体确定目标蛋白收集液，用生理盐水超滤换液去咪唑。进一步用ELISA His标签抗体确定目标蛋白浓度备用。 [0043] 2 体外胰岛素活性实验 [0044] 利用胰岛素诱导胰岛素受体激活pERK信号通路，进而激活SRE转录荧光素酶报告基因来预测胰岛素活性。HEK293 细胞表达内源性胰岛素受体。稳定转染SRE得到HEK293 /SRE稳定株。请参阅图5，结果显示结构一因不含有2A肽，所以生产的胰岛素是没有活性的。结构二，三和四则可以生成具有和胰岛素标准品相当活性的胰岛素。 [0045] 3 小鼠体内给药 [0046] 小鼠约30克每只，每组6只，分别皮下注射约300μl 稀释好的胰岛素，终浓度约为30pmol/克。每组注射的胰岛素分别为标准品、结构一、结构二、结构三、结构四的胰岛素。 [0047] 4 血液采集与血糖的测定 [0048] 注射前设为0小时，注射后间隔 2、4、 6、 24、 48、72、96、 120 h 尾静脉采血40 μl。 [0049] 应用索莱宝血糖含量检测试剂盒根据其说明书完成。如图6所示，结构三胰岛素给药后，药物起效快，血糖浓度很快降低；并且，维持血糖降低的时间长度可达到96小时。 [0050] 5 血液采集与体内血液中胰岛素浓度半衰期的测定 [0051] 利用组蛋白双抗夹心法，在96孔板中预包被了组蛋白的单克隆抗体A，将标准品，以及样品加入到96孔板中孵育结合，经过洗涤，再加入 HRP‑偶联的组蛋白多克隆抗体B进行孵育，在加入TMB底物，HRP与底物反应产生有色产物。吸光值越高，对应样品中胰岛素含量越多。如图7所示，注射结构三胰岛素后，胰岛素在体内的半衰期超过了36小时，远超过正常的胰岛素的半衰期。 [0052] 本申请所提供的一种长效胰岛素，其使用2A肽，可以在设计的多肽位点完整的将胰岛素α和者β链切断，使α和β链形成稳定的具有生物学活性异源二聚体。并且在β链的羧基端融入绒毛膜促性腺激素β亚基CTG糖基化多肽，可以显著增加胰岛素的半衰期，极大地减少服药次数与药量。 [0053] 以上所述仅为本发明的实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的权利要求范围。

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