[0001] 本发明涉及对免疫球蛋白G(IgG)具有结合亲和性的Fc结合性蛋白质。更详细而言，本发明涉及通过使人Fcγ受体IIa的特定位置的氨基酸残基置换为其它氨基酸残基或使之缺失、从而与天然型人Fcγ受体IIa相比对酸的稳定性提高的Fc结合性蛋白质；该蛋白质的制造方法；以及将该蛋白质固定于不溶性载体而得到的抗体吸附剂。

[0002] Fc受体为与免疫球蛋白分子的Fc区结合的受体蛋白质，结合于抗原与免疫球蛋白的免疫复合物而向细胞内进行信号转导(非专利文献1)。特别地，与重要的免疫球蛋白G(IgG)结合的Fcγ受体(FcγR)可以分为FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32a)、FcγRIIb(CD32b)、FcγRIIc(CD32c)、FcγRIIIa(CD16a)和FcγRIIIb(CD16b)之类的亚型(非专利文献1和2)。IgG免疫复合物与FcγR的结合是通过FcγR结合在IgG的Fc区而发生的。各FcγR分子种具有IgG的Fc区识别结构域，识别单一种类或属于相同亚型的IgG。由此而决定在各免疫应答中动员哪种辅助细胞(非专利文献1和2)。

[0003] 在FcγR中，FcγRIIa存在于巨噬细胞、嗜中性粒细胞等细胞的表面，与在人的免疫机制中也较重要的ADCP(抗体依赖性细胞吞噬)活性有关(非专利文献3)。人FcγRIIa的氨基酸序列(序列号1)登记于UniProt(Accsession Number：P12318)等公共数据库。另外，关于人FcγRIIa的结构上的功能结构域、用于贯穿细胞膜的信号肽序列、跨膜区的位置，也同样已经公开。图1示出人FcγRIIa的结构简图。需要说明的是，图1中的氨基酸编号对应于序列号1记载的氨基酸编号。即，序列号1中的第1位的甲硫氨酸至第33位的丝氨酸为止为信号序列(S)，第34位的谷氨酰胺至第217位的甘氨酸为止为胞外区域(EC)，第218位的异亮氨酸至第240位的酪氨酸为止为跨膜区(TM)，第241位的半胱氨酸至第317位的天冬酰胺为止为胞内区域(C)。

[0004] 为了将FcγRIIa用于工业，从使用、保存等观点出发，优选对酸的稳定性高。但是，到目前为止，不存在提高人FcγRIIa对酸的稳定性的尝试。

[0005] 现有技术文献

[0006] 非专利文献

[0007] 非专利文献1:Takai T.，Jpn.J.Clin.Immunol.，28，318‑326，2005

[0008] 非专利文献2:J.Galon et al.，Eur.J.Immunol.，27，1928‑1932，1997[0009] 非专利文献3:J.O.Richards et al.，Mol.Cancer Ther.，7，2517‑2527，2008发明内容

[0010] 发明要解决的问题

[0011] 本发明的课题在于，提供相对于天然型人FcγRIIa而言对酸的稳定性提高了的Fc结合性蛋白质、该蛋白质的制造方法、以及使用了该蛋白质的抗体吸附剂。

[0012] 用于解决问题的方案

[0013] 本发明人们为了解决上述课题进行了深入研究，结果确定了人FcγRIIa中的与提高酸稳定性有关的氨基酸残基，发现使该氨基酸残基置换为其它氨基酸残基或缺失的突变体对酸具有优异的稳定性，从而完成了本发明。

[0014] 即，本申请包括以下的[1]至[13]所述的方式。

[0015] [1]一种Fc结合性蛋白质，其选自以下的(I)～(IV)：

[0016] (I)Fc结合性蛋白质，其至少包含序列号2记载的氨基酸序列中的、第29位的谷氨酰胺至第201位的谷氨酰胺为止的氨基酸残基，其中，在该第29位至第201位为止的氨基酸残基中具有以下的(1)至(12)所示的任一氨基酸置换或缺失中的至少1种以上，

[0017] (1)序列号2的第190位的亮氨酸向丝氨酸的置换

[0018] (2)序列号2的第45位的异亮氨酸向苏氨酸的置换

[0019] (3)序列号2的第69位的谷氨酰胺向亮氨酸的置换

[0020] (4)序列号2的第83位的脯氨酸向亮氨酸的置换

[0021] (5)序列号2的第123位的苏氨酸向脯氨酸的置换

[0022] (6)序列号2的第42位的脯氨酸向谷氨酰胺的置换

[0023] (7)序列号2的第63位的脯氨酸向亮氨酸的置换

[0024] (8)序列号2的第75位的天冬酰胺向丝氨酸的置换

[0025] (9)序列号2的第163位的亮氨酸向组氨酸的置换

[0026] (10)序列号2的第179位的天冬氨酸向缬氨酸的置换

[0027] (11)序列号2的第198位的异亮氨酸向缬氨酸的置换

[0028] (12)序列号2的第62位的丝氨酸的缺失

[0029] (II)Fc结合性蛋白质，其具有抗体结合活性，且至少包含序列号2记载的氨基酸序列中的、第29位的谷氨酰胺至第201位的谷氨酰胺为止的氨基酸残基，其中，在该第29位至第201位为止的氨基酸残基中具有上述(1)至(12)所示的任一氨基酸置换或缺失中的至少1种以上，而且在上述(1)至(12)所示的氨基酸置换或缺失以外进一步具有1个或数个位置处的1个或数个氨基酸残基的置换、缺失、插入和添加中的任意1种以上；

[0030] (III)Fc结合性蛋白质，其具有抗体结合活性，且相对于至少包含序列号2记载的氨基酸序列中的、第29位的谷氨酰胺至第201位的谷氨酰胺为止的氨基酸残基的、其中在该第29位至第201位为止的氨基酸残基中具有所述(1)至(12)所示的任一氨基酸置换或缺失中的至少1种以上的氨基酸序列具有70％以上的同源性、且残留了上述(1)至(12)所示的任一氨基酸置换或缺失。

[0031] (IV)Fc结合性蛋白质，其具有抗体结合活性的，且具有以下氨基酸序列：相对于在序列号2记载的氨基酸序列的第29位的谷氨酰胺至第201位的谷氨酰胺为止的氨基酸残基中具有上述(1)至(12)所示的任意1种以上氨基酸置换或缺失的氨基酸序列整体具有70％以上的同源性、并且残留了上述至少1个氨基酸置换或缺失。

[0032] [2]根据[1]所述的Fc结合性蛋白质，其至少具有以下的(1)所示的氨基酸置换。

[0033] (1)序列号2的第190位的亮氨酸向丝氨酸的置换

[0034] [3]根据[1]或[2]所述的Fc结合性蛋白质，其进一步至少具有以下所示的6处氨基酸置换。

[0035] 序列号2的第68位的异亮氨酸向缬氨酸的置换

[0036] 序列号2的第80位的组氨酸向谷氨酰胺的置换

[0037] 序列号2的第84位的丝氨酸向苏氨酸的置换

[0038] 序列号2的第90位的天冬酰胺向苏氨酸的置换

[0039] 序列号2的第91位的天冬酰胺向丝氨酸的置换

[0040] 序列号2的第125位的组氨酸向精氨酸的置换

[0041] [4]根据[1]或[2]所述的Fc结合性蛋白质，其选自以下的(iv)～(vi)：

[0042] (iv)至少包含序列号5、7、13、17、19、23和25中的任一者记载的氨基酸序列中的、第29位的谷氨酰胺至第201位的谷氨酰胺为止的氨基酸残基的Fc结合性蛋白质；

[0043] (v)至少包含序列号5、7、13、17、19、23和25中的任一者记载的氨基酸序列中的、第29位的谷氨酰胺至第201位的谷氨酰胺为止的氨基酸残基，其中，在该第29位至第201位为止的氨基酸残基中，在上述氨基酸序列所具有的氨基酸置换以外进一步具有1个或数个位置处的1个或数个氨基酸残基的置换、缺失、插入和添加中的任意1种以上、并且具有抗体结合活性的Fc结合性蛋白质；

[0044] (vi)至少包含序列号5、7、13、17、19、23和25中的任一者记载的氨基酸序列中的、第29位的谷氨酰胺至第201位的谷氨酰胺为止的氨基酸残基，其中，相对于该第29位至第201位为止的氨基酸序列具有70％以上的同源性、且残留上述氨基酸序列所具有的氨基酸置换、并且具有抗体结合活性的Fc结合性蛋白质。

[0045] [5]根据[1]～[3]中任一项所述的Fc结合性蛋白质，其选自以下的(vii)～(ix)：

[0046] (vii)至少包含序列号35记载的氨基酸序列中的、第29位的谷氨酰胺至第200位的谷氨酰胺为止的氨基酸残基的Fc结合性蛋白质；

[0047] (viii)至少包含序列号35记载的氨基酸序列中的、第29位的谷氨酰胺至第200位的谷氨酰胺为止的氨基酸残基，其中，在该第29位至第200位为止的氨基酸残基中，在上述氨基酸序列所具有的氨基酸置换和缺失以外进一步具有1个或数个位置处的1个或数个氨基酸残基的置换、缺失、插入和添加中的任意1种以上、并且具有抗体结合活性的Fc结合性蛋白质；

[0048] (ix)至少包含序列号35记载的氨基酸序列中的、第29位的谷氨酰胺至第200位的谷氨酰胺为止的氨基酸残基，其中，相对于该第29位至第200位为止的氨基酸序列具有70％以上的同源性、并且具有抗体结合活性的Fc结合性蛋白质。

[0049] [6]根据[1]～[3]中任一项所述的Fc结合性蛋白质，其选自以下的(x)～(xii)：

[0050] (x)至少包含序列号43记载的氨基酸序列中的、第29位的谷氨酰胺至第196位的谷氨酰胺为止的氨基酸残基的Fc结合性蛋白质；

[0051] (xi)至少包含序列号43记载的氨基酸序列中的、第29位的谷氨酰胺至第196位的谷氨酰胺为止的氨基酸残基，其中，在该第29位至第196位为止的氨基酸残基中，在上述氨基酸序列所具有的氨基酸置换和缺失以外进一步具有1个或数个位置处的1个或数个氨基酸残基的置换、缺失、插入和添加中的任意1种以上、并且具有抗体结合活性的Fc结合性蛋白质；

[0052] (xii)至少包含序列号43记载的氨基酸序列中的、第29位的谷氨酰胺至第196位为止的谷氨酰胺的氨基酸残基，其中，相对于该第29位至第196位为止的氨基酸序列具有70％以上的同源性、且残留上述氨基酸序列所具有的氨基酸置换、并且具有抗体结合活性的Fc结合性蛋白质。

[0053] [7]一种多核苷酸，其编码[1]～[6]中任一项所述的Fc结合性蛋白质。

[0054] [8]一种表达载体，其包含[7]所述的多核苷酸。

[0055] [9]一种能生产Fc结合性蛋白质的转化体，其是用[8]所述的重组载体转化宿主而得到的。

[0056] [10]根据[9]所述的转化体，其中，宿主为大肠杆菌。

[0057] [11]一种Fc结合性蛋白质的制造方法，其包括：通过培养[9]或[10]所述的转化体而生产Fc结合性蛋白质的工序；和、由得到的培养物回收生产的上述Fc结合性蛋白质的工序。

[0058] [12]一种抗体吸附剂，其是将[1]～[6]中任一项所述的Fc结合性蛋白质固定于不溶性载体而得到的。

[0059] [13]一种抗体的分离方法，其包括：向填充有[12]所述的吸附剂的柱中添加包含抗体的溶液，使该抗体吸附于上述吸附剂的工序；和、使用洗脱液洗脱吸附于上述吸附剂的抗体的工序。

[0060] 以下详细说明本发明。

[0061] 本发明的Fc结合性蛋白质为对抗体的Fc区具有结合性的蛋白质，其为如下蛋白质：包含含有由序列号2记载的氨基酸序列构成的、天然型人FcγRIIa的胞外区域的多肽中的、至少第29位的谷氨酰胺至第201位的谷氨酰胺为止的氨基酸残基，其中，在该第29位至第201位为止的氨基酸残基中至少具有特定位置处的氨基酸置换或缺失。需要说明的是，在序列号2中，第1位至第26位为MalE信号肽(UniProt No.P0AEX9的第1位至第26位为止的氨基酸残基所构成的寡肽)的序列，第27位的甲硫氨酸和第28位的甘氨酸为接头序列，第29位至第201位为FcγRIIa的胞外区域(即，序列号1的第34位至第206位为止的区域)，第202位至第203位为甘氨酸接头，第204位至第209位为组氨酸标签。因此，本发明的Fc结合性蛋白质可以包含位于胞外区域的N末端侧的信号肽区域的全部或一部分，也可以包含位于胞外区域的C末端侧的跨膜区和胞外区域的全部或一部分。

[0062] 上述特定位置处的氨基酸置换或缺失具体为Pro42Gln(该表述表示序列号2的第42位(序列号1中为第47位)的脯氨酸被置换为谷氨酰胺，以下同)、Pro63Leu、Asn75Ser、Leu163His、Asp179Val、Leu190Ser、Ile198Val、Ile45Thr、Gln69Leu、Pro83Leu、Thr123Pro和Ser62的缺失中的至少任意1种以上。其中，Leu190Ser为明显提高了对酸的稳定性的氨基酸置换，因此至少包含Leu190Ser的氨基酸置换的Fc结合性蛋白质可以称之为本发明的Fc结合性蛋白质的优选方式。

[0063] 需要说明的是，本发明的Fc结合性蛋白质只要具有上述的特定位置处的氨基酸置换或缺失中的至少1种以上即可，只要具有抗体结合活性则在上述的特定位置的氨基酸置换以外还可以进一步具有氨基酸残基的置换、缺失、插入和添加中的任意1种以上。作为上述方式的具体例，可列举以下的(i)至(v)所示的、具有抗体结合活性的Fc结合性蛋白质。需要说明的是，在使氨基酸残基发生缺失的情况下，从耐热性提高的角度出发，优选以使蛋白质二级结构中的环区域消失的方式使其缺失(Manandez‑Alias and P.Argos，J.Mol.Biol.，206，1989)。

[0064] (i)在上述的特定位置处的氨基酸置换和/或缺失中进一步具有Ile68Val、His80Gln、Ser84Thr、Asn90Thr、Asn91Ser和His125Arg的氨基酸置换的Fc结合性蛋白质[0065] (ii)在上述的特定位置处的氨基酸置换和/或缺失的基础上进一步具有1个或数个位置处的1个或数个氨基酸残基的置换、缺失、插入和添加中的任意1种以上的Fc结合性蛋白质

[0066] (iii)在上述的特定位置处的氨基酸置换和/或缺失以及Ile68Val、His80Gln、Ser84Thr、Asn90Thr、Asn91Ser和His125Arg的氨基酸置换的基础上进一步具有1个或数个位置处的1个或数个氨基酸残基的置换、缺失、插入和添加中的任意1种以上的Fc结合性蛋白质

[0067] (iv)包含相对于具有上述的特定位置处的氨基酸置换和/或缺失的多肽的氨基酸序列具有70％以上的同源性的氨基酸序列、并且残留了上述的定位置处的氨基酸置换和/或缺失的Fc结合性蛋白质

[0068] (v)包含相对于具有上述的特定位置处的氨基酸置换和/或缺失以及Ile68Val、His80Gln、Ser84Thr、Asn90Thr、Asn91Ser和His125Arg的氨基酸置换的多肽的氨基酸序列具有70％以上的同源性的氨基酸序列、并且残留了上述的定位置处的氨基酸置换和/或缺失以及Ile68Val、His80Gln、Ser84Thr、Asn90Thr、Asn91Ser和His125Arg的氨基酸置换的Fc结合性蛋白质

[0069] 上述(i)、(iii)和(v)记载的Ile68Val、His80Gln、Ser84Thr、Asn90Thr、Asn91Ser和His125Arg的氨基酸置换为提高了热稳定性和利用基因重组体的生产率的氨基酸置换(WO2018/056374号)。因此，通过使具有上述的特定位置处的氨基酸置换中的至少1种以上的本发明的Fc结合性蛋白质中进一步具有上述6处氨基酸置换(Ile68Val、His80Gln、Ser84Thr、Asn90Thr、Asn91Ser和His125Arg)，可得到与天然型FcγRIIa相比对酸的稳定性也提高、并且热稳定性和利用基因重组体的生产率也提高的Fc结合性蛋白质。

[0070] 在上述(ii)和(iii)中，“1个或数个”根据在蛋白质的立体结构中的氨基酸残基的位置、氨基酸残基的种类而不同，例如是指1至50个、1至40个、1至30个、1至20个、1至10个中的任一种。另外，在上述(ii)和(iii)记载的“置换、缺失、插入和添加中的任意1种以上”中，也包括基于基因所来源的微生物的个体差异、种属差异等的天然情况下也可发生的的变异(mutant或variant)。

[0071] 上述(iv)和(v)中的氨基酸序列的同源性为70％以上即可，也可以具有其以上的同源性(例如80％以上、85％以上、90％以上或95％以上)。

[0072] 本发明的Fc结合性蛋白质可以进一步具有保守性置换，所述保守性置换是指：在两氨基酸的物理性质和化学性质、或其中一种性质类似的氨基酸之间进行置换。本领域技术人员已知：在保守性置换的情况下，不仅是Fc结合性蛋白质，通常在发生了置换的蛋白质与未发生置换的蛋白质之间，蛋白质的功能得到了维持。作为保守性置换的一例，可列举甘氨酸与丙氨酸之间、天冬氨酸与谷氨酸之间、丝氨酸与脯氨酸之间、或谷氨酸与丙氨酸之间所发生的置换(蛋白质的结构与功能，MEDICAL SCIENCES INTERNATIONAL公司，9，2005)。

[0073] 另外，本发明的Fc结合性蛋白质可以在其N末端侧或C末端侧进一步添加从存在杂质的溶液中进行分离时有用的寡肽。作为上述寡肽，可列举聚组氨酸、聚赖氨酸、聚精氨酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸等。另外，可以在本发明的Fc结合性蛋白质的N末端侧或C末端侧进一步添加在将本发明的Fc结合性蛋白质固定于色谱用支撑体等固相时有用的包含半胱氨酸的寡肽。关于添加于Fc结合性蛋白质的N末端侧或C末端侧的寡肽的长度，只要不损害本发明的Fc结合性蛋白质的IgG结合性、稳定性就没有特别限制。将上述寡肽添加于本发明的Fc结合性蛋白质时，可以制作编码上述寡肽的多核苷酸、之后用本领域技术人员已知的方法通过基因工程手段添加到Fc结合性蛋白质的N末端侧或C末端侧，也可以将化学合成的上述寡肽通过化学手段键合添加于本发明的Fc结合性蛋白质的N末端侧或C末端侧。另外，还可以在本发明的Fc结合性蛋白质的N末端侧添加用于促进在宿主中的高效表达的信号肽。作为宿主为大肠杆菌时的上述信号肽的例子，可例示PelB、DsbA、MalE(UniProt No.P0AEX9记载的氨基酸序列中的第1位至第26位为止的区域)、TorT等这样的使周质分泌蛋白质的信号肽(日本特开2011‑097898号公报)。

[0074] 作为本发明的Fc结合性蛋白质的优选的方式，可列举至少包含由以下的(a)至(i)所示的氨基酸序列构成的多肽的Fc结合性蛋白质。这些Fc结合性蛋白质在对酸的稳定性(耐酸性)提高方面是优选的。

[0075] (a)FcγRIIa‑m7(序列号5记载的氨基酸序列中的、第29位至第201位为止的氨基酸残基)

[0076] 其为下述多肽：为序列号2记载的氨基酸序列中的、第29位的谷氨酰胺至第201位的谷氨酰胺为止的氨基酸残基，其中，在该第29位至第201位为止的氨基酸残基中具有Ile68Val、His80Gln、Ser84Thr、Asn90Thr、Asn91Ser、His125Arg和Leu190Ser的氨基酸置换。

[0077] (b)FcγRIIa‑m1(序列号7记载的氨基酸序列中的、第29位至第201位为止的氨基酸残基)

[0078] 其为下述多肽：为序列号2记载的氨基酸序列中第29位的谷氨酰胺至第201位的谷氨酰胺为止的氨基酸残基，其中，在该第29位至第201位为止的氨基酸残基中具有Leu190Ser的氨基酸置换。

[0079] (c)FcγRIIa‑m8B(序列号13记载的氨基酸序列中的、第29位至第201位为止的氨基酸残基)

[0080] 其为下述多肽：为序列号2记载的氨基酸序列中的、第29位的谷氨酰胺至第201位的谷氨酰胺为止的氨基酸残基，其中，在该第29位至第201位为止的氨基酸残基中具有Ile68Val、Gln69Leu、His80Gln、Ser84Thr、Asn90Thr、Asn91Ser、His125Arg和Leu190Ser的氨基酸置换。

[0081] (d)FcγRIIa‑m8D(序列号17记载的氨基酸序列中的、第29位至第201位为止的氨基酸残基)

[0082] 其为下述多肽：为序列号2记载的氨基酸序列中的、第29位的谷氨酰胺至第201位的谷氨酰胺为止的氨基酸残基，其中，在该第29位至第201位为止的氨基酸残基中具有Ile68Val、His80Gln、Ser84Thr、Asn90Thr、Asn91Ser、Thr123Pro、His125Arg和Leu190Ser的氨基酸置换。

[0083] (e)FcγRIIa‑m10A(序列号19记载的氨基酸序列中的、第29位至第201位为止的氨基酸残基)

[0084] 其为下述多肽：为序列号2记载的氨基酸序列中的、第29位的谷氨酰胺至第201位的谷氨酰胺为止的氨基酸残基，其中，在该第29位至第201位为止的氨基酸残基中具有Ile45Thr、Ile68Val、Gln69Leu、His80Gln、Ser84Thr、Asn90Thr、Asn91Ser、Thr123Pro、His125Arg和Leu190Ser的氨基酸置换。

[0085] (f)FcγRIIa‑m10C(序列号23记载的氨基酸序列中的、第29位至第201位为止的氨基酸残基)

[0086] 其为下述多肽：为序列号2记载的氨基酸序列中的、第29位的谷氨酰胺至第201位的谷氨酰胺为止的氨基酸残基，其中，在该第29位至第201位为止的氨基酸残基中具有Ile68Val、Gln69Leu、His80Gln、Pro83Leu、Ser84Thr、Asn90Thr、Asn91Ser、Thr123Pro、His125Arg和Leu190Ser的氨基酸置换。

[0087] (g)FcγRIIa‑m11(序列号25记载的氨基酸序列中的、第29位至第201位为止的氨基酸残基)

[0088] 其为下述多肽：为序列号2记载的氨基酸序列中的、第29位的谷氨酰胺至第201位为止的谷氨酰胺的氨基酸残基，其中，在该第29位至第201位为止的氨基酸残基中具有Ile45Thr、Ile68Val、Gln69Leu、His80Gln、Pro83Leu、Ser84Thr、Asn90Thr、Asn91Ser、Thr123Pro、His125Arg和Leu190Ser的氨基酸置换。

[0089] (h)FcγRIIa‑m11‑Del1(序列号35记载的氨基酸序列中第29位至第200位为止的氨基酸残基)

[0090] 其为下述多肽：为序列号2记载的氨基酸序列中的、第29位的谷氨酰胺至第200位为止的谷氨酰胺的氨基酸残基，其中，该第29位至第200位为止的氨基酸残基中具有Ile45Thr、Ile68Val、Gln69Leu、His80Gln、Pro83Leu、Ser84Thr、Asn90Thr、Asn91Ser、Thr123Pro、His125Arg和Leu190Ser的氨基酸置换以及Ser62的缺失。

[0091] (i)FcγRIIa‑m11‑Del5(序列号43记载的氨基酸序列中的、第29位至第196位为止的氨基酸残基)

[0092] 其为下述多肽：为序列号2记载的氨基酸序列中的、第29位的谷氨酰胺至第196位的谷氨酰胺为止的氨基酸残基，其中，在该第29位至第196位为止的氨基酸残基中具有Ile45Thr、Ile68Val、Gln69Leu、His80Gln、Pro83Leu、Ser84Thr、Asn90Thr、Asn91Ser、Thr123Pro、His125Arg和Leu190Ser的氨基酸置换以及Arg61至Ser65的缺失。

[0093] 需要说明的是，在序列号5、7、13、17、19、23和25记载的Fc结合性蛋白质中，第1位的甲硫氨酸至第26位的丙氨酸为止为MalE信号肽，第27位的甲硫氨酸和第28位的甘氨酸为接头序列，第29位的谷氨酰胺至第201位的谷氨酰胺为止为能够与抗体的Fc区结合的多肽(FcγRIIa‑m7(序列号5)、FcγRIIa‑m1(序列号7)、FcγRIIa‑m8b(序列号13)、FcγRIIa‑m8d(序列号17)、FcγRIIa‑m10a(序列号19)、FcγRIIa‑m10c(序列号23)或FcγRIIa‑m11(序列号25))的氨基酸序列，第202位和第203位的甘氨酸为接头序列，第204位至第209位为止的组氨酸为标签序列。

[0094] 另外，在序列号35记载的Fc结合性蛋白质中，第1位的甲硫氨酸至第26位的丙氨酸为MalE信号肽，第27位的甲硫氨酸和第28位的甘氨酸为接头序列，第29位的谷氨酰胺至第200位的谷氨酰胺为能够与抗体的Fc区结合的多肽(FcγRIIa‑m11‑Del1)的氨基酸序列，第
201位和第202位的甘氨酸为接头序列，第203位至第208位为止的组氨酸为标签序列。

[0095] 另外，在序列号43记载的Fc结合性蛋白质中的、第1位的甲硫氨酸至第26位的丙氨酸为止为MalE信号肽，第27位的甲硫氨酸和第28位的甘氨酸为接头序列，第29位的谷氨酰胺至第196位的谷氨酰胺为止为能够与抗体的Fc区结合的多肽(FcγRIIa‑m11‑Del5)的氨基酸序列，第197位和第198位的甘氨酸为接头序列，第199位至第204位为止的组氨酸为标签序列。

[0096] 作为编码本发明的Fc结合性蛋白质的多核苷酸(以下也简单表述为本发明的多核苷酸)的制作方法的一例，可例示：

[0097] (1)由本发明的Fc结合性蛋白质的氨基酸序列转换成核苷酸序列，人工合成包含该核苷酸序列的多核苷酸的方法；和

[0098] (2)直接人工制备包含Fc结合性蛋白质的整体或部分序列的多核苷酸、或者使用PCR法之类的DNA扩增方法由Fc结合性蛋白质的cDNA等制备包含Fc结合性蛋白质的整体或部分序列的多核苷酸，将制备的该多核苷酸用适当的方法连接的方法。

[0099] 在上述(1)的方法中，在由氨基酸序列转换成核苷酸序列时，优选考虑所转化的宿主中的密码子使用频度而进行转换。作为一例，在宿主为大肠杆菌(Escherichia coli)时，分别地，在精氨酸(Arg)的情况下，AGA/AGG/CGG/CGA的使用频度低；在异亮氨酸(Ile)的情况下，ATA的使用频度低；在亮氨酸(Leu)的情况下，CTA的使用频度低；在甘氨酸(Gly)的情况下，GGA的使用频度低；在脯氨酸(Pro)的情况下，CCC的使用频度低(为所谓的稀有密码子)，因此按照避开这些密码子的方式进行转换即可。也可以利用公共数据库(例如，上总DNA研究所的网站中的Codon Usage Database等)来分析密码子的使用频度。

[0100] 在向本发明的多核苷酸导入变异的情况下，可以使用易错PCR法。关于易错PCR法的反应条件，只要为可以向编码人FcγRIIa(或Fc结合性蛋白质)的多核苷酸中导入所期望的变异的条件就没有特别限定，例如，使作为底物的4种脱氧核苷酸(dATP/dTTP/dCTP/dGTP)的浓度不均匀，将MnCl2以0.01至10mM(优选为0.1至1mM)的浓度添加到PCR反应液中进行PCR，由此可以向多核苷酸中导入变异。另外，作为易错PCR法以外的变异导入方法，可列举使作为诱变剂的化学试剂接触、作用于包含人FcγRIIa的整体或部分序列的多核苷酸或照射紫外线而向多核苷酸中导入变异来进行制作的方法。在该方法中，作为用作诱变剂的化学试剂，可使用本领域技术人员通常使用的诱变性化学试剂，如羟胺、N‑甲基‑N’‑硝基‑N‑亚硝基胍、亚硝酸、亚硫酸、肼等。

[0101] 使用本发明的多核苷酸来转化宿主的情况下，可以使用本发明的多核苷酸本身，更优选使用在表达载体(例如，在原核细胞、真核细胞的转化中通常使用的噬菌体、黏粒、质粒等)的适当的位置插入有本发明的多核苷酸的表达载体。需要说明的是，该表达载体只要能够在所转化的宿主内稳定地存在并复制则没有特别限制，以大肠杆菌为宿主的情况下，可例示：pET质粒载体、pUC质粒载体、pTrc质粒载体、pCDF质粒载体、pBBR质粒载体。

[0102] 另外，上述适当的位置是指不破坏表达载体的复制功能、所希望的抗生素标记、转导性相关区域的位置。向上述表达载体中插入本发明的多核苷酸时，优选以与表达所需要的启动子之类的功能性多核苷酸连接的状态插入。作为该启动子的例子，在宿主为大肠杆菌的情况下，可列举trp启动子、tac启动子、trc启动子、lac启动子、T7启动子、recA启动子、lpp启动子、进而λ噬菌体的λPL启动子、λPR启动子等。

[0103] 为了使用通过上述方法制备的插入了本发明的多核苷酸的表达载体(以下记作本发明的表达载体)来转化宿主，可以用本领域技术人员通常使用的方法进行。例如，选择属于埃希氏杆菌(Escherichia)属的微生物(大肠杆菌JM109株、大肠杆菌BL21(DE3)株、大肠杆菌W3110株等)作为宿主的情况下，可以通过公知的文献(例如Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory，256，1992)中记载的方法等进行转化。对于用上述的方法转化而得到的转化体，通过用适当的方法筛选，可得到能够表达本发明的Fc结合性蛋白质的转化体(以下记作本发明的转化体)。需要说明的是，作为表达本发明的Fc结合性蛋白质的宿主，没有特别限制，作为一例，可列举动物细胞(CHO(Chinese Hamster Ovary，中华仓鼠卵巢)细胞、HEK细胞、Hela细胞、COS细胞等)、酵母(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、日本裂殖酵母(Schizosaccharomyces japonicus)、八孢裂殖酵母(Schizosaccharomyces octosporus)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)等)、昆虫细胞(Sf9、Sf21等)、大肠杆菌(JM109株、BL21(DE3)株、W3110，等)、枯草芽胞杆菌。需要说明的是，从生产率角度出发优选使用动物细胞、大肠杆菌作为宿主，进一步优选使用大肠杆菌作为宿主。

[0104] 关于由本发明的转化体制备本发明的表达载体，可以由培养本发明的转化体而得到的培养物中使用碱提取法或QIAprep Spin Miniprep kit(QIAGEN公司制)等市售的提取试剂盒进行制备。培养本发明的转化体，由得到的培养物回收本发明的Fc结合性蛋白质，由此可以制造本发明的Fc结合性蛋白质。需要说明的是，本说明书中，培养物除了指所培养的本发明的转化体的细胞本身以外，也包括培养中所使用的培养基。本发明的蛋白质制造方法中所使用的转化体只要用适合于培养对象宿主的培养基进行培养即可，宿主为大肠杆菌的情况下，作为优选的培养基的一例，可列举添加了必要的营养源的LB(Luria‑Bertani)培养基。需要说明的是，为了通过有无导入本发明的载体来选择性地增殖本发明的转化体，优选向培养基中添加对应于该载体所包含的抗药性基因的药剂而进行培养。例如，该载体包含卡那霉素抗性基因的情况下，可以向培养基中添加卡那霉素。另外，培养基中除了碳、氮和无机盐供给源之外，也可以添加适当的营养源，也可以根据期望含有选自由谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、巯基乙酸盐和二硫苏糖醇组成的组的一种以上还原剂。进而，也可以添加甘氨酸之类的促进由上述转化体向培养液分泌蛋白质的试剂，具体而言，宿主为大肠杆菌的情况下，优选对培养基添加2％(w/v)以下的甘氨酸。宿主为大肠杆菌的情况下，培养温度通常为10℃至40℃、优选为20℃至37℃、更优选为25℃左右，根据所表达的蛋白质的特性进行选择即可。宿主为大肠杆菌的情况下，培养基的pH为pH6.8至pH7.4，优选为pH7.0左右。另外，本发明的载体中含有诱导性的启动子的情况下，优选在本发明的Fc结合性蛋白质能够良好表达的条件下实施诱导。作为诱导剂，可例示出IPTG(isopropyl‑β‑D‑thiogalactopyranoside，异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷)。宿主为大肠杆菌的情况下，测定培养液的浊度(600nm处的吸光度)，在达到约0.5至1.0时添加适当量的IPTG，之后继续进行培养，由此能够诱导Fc结合性蛋白质的表达。IPTG的添加浓度可以从0.005至1.0mM的范围适宜选择，优选为0.01至0.5mM的范围。关于与IPTG诱导相关的各种条件，按照该技术领域中已知的条件进行即可。

[0105] 为了从培养本发明的转化体而得到的培养物中回收本发明的Fc结合性蛋白质，可以采用适合于本发明的转化体中的本发明的Fc结合性蛋白质的表达形态的方法，从该培养物中进行分离/纯化，从而回收本发明的Fc结合性蛋白质。例如，在培养上清中表达的情况下，通过离心分离操作分离菌体，从得到的培养上清中纯化本发明的Fc结合性蛋白质即可。另外，在细胞内(包括周质)表达的情况下，通过离心分离操作收集菌体之后，添加酶处理剂、表面活性剂等将菌体破碎而提取本发明的Fc结合性蛋白质，之后进行纯化即可。为了对本发明的Fc结合性蛋白质进行纯化，使用该技术领域中公知的方法即可，作为一例，可列举使用了液相色谱法的分离/纯化。液相色谱法中有离子交换色谱法、疏水性相互作用色谱法、凝胶过滤色谱法、亲和色谱法等，通过组合这些色谱法进行纯化操作，从而可以高纯度地制备本发明的Fc结合性蛋白质。作为测定所得到的本发明的Fc结合性蛋白质对IgG的结合活性的方法，使用例如酶联免疫吸附测定法(Enzyme‑Linked ImmunoSorbent Assay，以下记作ELISA)法、表面等离子共振法等测定对于IgG的结合活性。结合活性的测定中使用的IgG优选为人IgG，可以使用人IgG1、人IgG2、人IgG3、人IgG4中的任一种。

[0106] 通过使本发明的Fc结合性蛋白质与不溶性载体结合，由此可以制造本发明的吸附剂。上述不溶性载体没有特别限定，可例示出：以琼脂糖、海藻酸盐(alginate)、角叉菜胶、几丁质、纤维素、糊精、葡聚糖、淀粉之类的多糖为原料的载体；以聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸酯、聚(甲基丙烯酸2‑羟乙酯)、聚氨酯之类的合成高分子为原料的载体；以二氧化硅等陶瓷为原料的载体。其中，优选以多糖为原料的载体、以合成高分子为原料的载体作为不溶性载体。作为上述优选的载体的一例，可列举：TOYOPEARL(东曹公司制)等导入了羟基的聚甲基丙烯酸酯凝胶、Sepharose(GE Healthcare公司制)等琼脂糖凝胶、Cellu Fine(JNC公司制)等纤维素凝胶。关于不溶性载体的形状，没有特别限定，可以是粒状物或非粒状物、多孔性或非多孔性中的任一者。

[0107] 为了将Fc结合性蛋白质固定于不溶性载体，对不溶性载体赋予N‑羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化酯基、环氧基、羧基、马来酰亚胺基、卤代乙酰基、三氟代乙烷磺酰基(Tresyl)、甲酰基、卤代乙酰胺等活性基团，通过该活性基团使人Fc结合性蛋白质与不溶性载体共价结合而进行固定即可。赋予了活性基团的载体可以直接使用市售的载体，也可以在适当的反应条件下向载体表面导入活性基团而制备。作为赋予了活性基团的市售的载体，可例示出：TOYOPEARL AF‑Epoxy‑650M、TOYOPEARL AF‑Tresyl‑650M(均为东曹公司制)、HiTrap NHS‑activated HP Columns、NHS‑activated Sepharose 4Fast Flow、Epoxy‑activated Sepharose 6B(均为GE Healthcare公司制)、SulfoLink Coupling Resin(Thermo Scientific公司制)。

[0108] 另一方面，作为向载体表面导入活性基团的方法，可例示出：使存在于载体表面的羟基、环氧基、羧基、氨基等与具有2个以上活性部位的化合物中的一个活性部位反应的方法。在该化合物的一例中，作为对载体表面的羟基、氨基导入环氧基的化合物，可例示出：环氧氯丙烷、乙二醇二缩水甘油醚、丁二醇二缩水甘油醚、己二醇二缩水甘油醚。作为在用上述化合物对载体表面导入环氧基之后向载体表面导入羧基的化合物，可例示出：2‑巯基乙酸、3‑巯基丙酸、4‑巯基丁酸、6‑巯基己酸、甘氨酸、3‑氨基丙酸、4‑氨基丁酸、6‑氨基己酸。

[0109] 作为向存在于载体表面的羟基、环氧基、羧基、氨基导入马来酰亚胺基的化合物，可例示出：N‑(ε‑马来酰亚胺己酸)酰肼、N‑(ε‑马来酰亚胺丙酸)酰肼、4‑(4‑N‑马来酰亚胺苯基)乙酰肼、2‑氨基马来酰亚胺、3‑氨基马来酰亚胺、4‑氨基马来酰亚胺、6‑氨基马来酰亚胺、1‑(4‑氨基苯基)马来酰亚胺、1‑(3‑氨基苯基)马来酰亚胺、4‑(马来酰亚胺)苯基异氰酸酯、2‑马来酰亚胺乙酸、3‑马来酰亚胺丙酸、4‑马来酰亚胺丁酸、6‑马来酰亚胺己酸、N‑(α‑马来酰亚胺乙酰氧基)琥珀酰亚胺酯、(马来酰亚胺间苯甲酰基)N‑羟基琥珀酰亚胺酯、琥珀酰亚胺基‑4‑(马来酰亚胺甲基)环己烷‑1‑羰基‑6‑氨基己酸、琥珀酰亚胺基‑4‑(马来酰亚胺甲基)环己烷‑1‑羧酸、(马来酰亚胺对苯甲酰基)N‑羟基琥珀酰亚胺酯、(马来酰亚胺间苯甲酰基)N‑羟基琥珀酰亚胺酯。

[0110] 作为向存在于载体表面的羟基、氨基导入卤代乙酰基的化合物，可例示出：氯代乙酸、溴代乙酸、碘代乙酸、氯代乙酰氯、溴代乙酰氯、溴代乙酰溴、氯代乙酸酐、溴代乙酸酐、碘代乙酸酐、2‑(碘代乙酰胺)乙酸‑N‑羟基琥珀酰亚胺酯、3‑(溴代乙酰胺)丙酸‑N‑羟基琥珀酰亚胺酯、4‑(碘代乙酰基)氨基苯甲酸‑N‑羟基琥珀酰亚胺酯。需要说明的是，还可例示出使存在于载体表面的羟基、氨基与ω‑烯基烷基缩水甘油醚反应之后，用卤化剂将ω‑烯基部位卤化而进行活化的方法。作为ω‑烯基烷基缩水甘油醚，可例示出烯丙基缩水甘油醚、3‑丁烯基缩水甘油醚、4‑戊烯基缩水甘油醚；作为卤化剂，可例示出N‑氯代琥珀酰亚胺、N‑溴代琥珀酰亚胺、N‑碘代琥珀酰亚胺。

[0111] 作为向载体表面导入活性基团的方法的其它例子，有如下方法：对存在于载体表面的羧基使用缩合剂和添加剂而导入活化基团的方法。作为缩合剂，可例示出1‑乙基‑3‑(3‑二甲基氨基丙基)碳二酰亚胺(EDC)、二环己基碳二酰亚胺、羰基二咪唑。另外，作为添加剂，可例示出N‑羟基琥珀酰亚胺(NHS)、4‑硝基苯酚、1‑羟基苯并三唑。

[0112] 作为将本发明的Fc结合性蛋白质固定于不溶性载体时使用的缓冲液，可列举：乙酸缓冲液、磷酸缓冲液、MES(2‑吗啉乙磺酸)缓冲液、HEPES(4‑(2‑羟基乙基)‑1‑哌嗪乙烷磺酸)缓冲液、Tris缓冲液、硼酸缓冲液。关于固定时的反应温度，在考虑到活性基团的反应性、本发明的Fc结合性蛋白质的稳定性的基础上在5℃至50℃的温度范围内适当设定即可，优选为10℃至35℃的范围。

[0113] 为了使用将本发明的Fc结合性蛋白质固定于不溶性载体而得到的本发明的吸附剂纯化抗体，例如，可以利用泵等送液手段向填充有本发明的吸附剂的柱中添加包含抗体的缓冲液，从而使抗体特异性地吸附于本发明的吸附剂，之后向柱中添加适当的洗脱液而洗脱抗体。需要说明的是，能够用本发明的吸附剂纯化的抗体只要为至少包含与Fc结合性蛋白质具有亲和性的抗体的Fc区的抗体即可。作为一例，可列举通常用作在抗体药物中所使用的抗体的嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、它们的氨基酸置换体。另外，双特异性抗体(Bi‑specific antibody)、抗体的Fc区与其它蛋白质的融合抗体、抗体的Fc区与药物的复合物(ADC)等人工进行了结构修饰的抗体也可以用本发明的吸附剂来纯化。另外，若在向柱中添加包含抗体的缓冲液之前使用适当的缓冲液对柱进行平衡，则可以以更高纯度纯化抗体，因此是优选的。作为缓冲液，可例示磷酸缓冲液等以无机盐为成分的缓冲液，缓冲液的pH为pH3.0至10.0，优选为pH5.0至8.0。

[0114] 为了洗脱吸附于本发明的吸附剂的抗体，弱化抗体与配体(本发明的Fc结合性蛋白质)的相互作用即可，具体而言，可例示出由缓冲液带来的pH变化、抗衡肽(counter peptide)、温度变化、盐浓度变化。作为用于洗脱吸附于本发明的吸附剂的抗体的洗脱液的具体例，可列举：比使抗体吸附于本发明的吸附剂时使用的溶液靠近酸性侧的缓冲液。作为缓冲液的种类，可例示出在酸性侧具有缓冲能力的柠檬酸缓冲液、甘氨酸盐酸缓冲液、乙酸缓冲液。缓冲液的pH在不破坏抗体所具有的功能的范围内设定即可，优选为pH2.5至6.0，更优选为pH3.0至5.0，进一步优选为pH3.3至4.0。

[0115] 发明的效果

[0116] 本发明的Fc结合性蛋白质为使天然型人FcγRIIa的胞外区域中的特定位置处的氨基酸残基置换为其它氨基酸残基或缺失的蛋白质。本发明的Fc结合性蛋白质与天然型人FcγRIIa相比对酸的稳定性提高。因此，本发明的Fc结合性蛋白质作为用于分离抗体(免疫球蛋白)的吸附剂的配体有用。附图说明

[0117] 图1为人FcγRIIa的概要图。图中的数字表示序列号1记载的氨基酸序列的位置。图中的S表示信号序列，EC表示胞外区域，TM表示跨膜区，C表示胞内区域。

[0118] 图2为示出评价Fc结合性蛋白质的耐酸性的结果的图，所述Fc结合性蛋白质是相对于由序列号3记载的氨基酸序列构成的Fc结合性蛋白质(对照)进行了1处或2处氨基酸置换而得的。

[0119] 实施例

[0120] 以下为了进一步详细说明本发明而示出实施例，但是本发明不受这些实施例限定。

[0121] 实施例1向Fc结合性蛋白质中导入变异和文库的制作

[0122] 在表达由序列号3记载的氨基酸序列构成的Fc结合性蛋白质的表达载体pET‑Am6中，对于编码上述Fc结合性蛋白质的多核苷酸部分(序列号4)，利用易错PCR实施随机变异导入。需要说明的是，由序列号3记载的序列构成的Fc结合性蛋白质是在由序列号2记载的序列构成的、包含天然型人FcγRIIa的胞外区域的Fc结合性蛋白质中导入了以下所示的6处氨基酸置换的Fc结合性蛋白质。

[0123] 序列号2的第68位(序列号1中为第73位)的异亮氨酸向缬氨酸的置换

[0124] 序列号2的第80位(序列号1中为第85位)的组氨酸向谷氨酰胺的置换

[0125] 序列号2的第84位(序列号1中为第89位)的丝氨酸向苏氨酸的置换

[0126] 序列号2的第90位(序列号1中为第95位)的天冬酰胺向苏氨酸的置换

[0127] 序列号2的第91位(序列号1中为第96位)的天冬酰胺向丝氨酸的置换

[0128] 序列号2的第125位(序列号1中为第130位)的组氨酸向精氨酸的置换

[0129] (1)使用上述的pET‑Am6作为模板DNA，进行易错PCR。易错PCR如下进行：使用序列号8和9记载的引物，在制备表1所示的组成的反应液后，将该反应液在95℃下热处理2分钟，将95℃下30秒的第1步骤、60℃下30秒的第2步骤、72℃下90秒的第3步骤作为一个循环，使反应进行35个循环，最后在72℃下进行7分钟热处理。

[0130] [表1]

[0131] 表1

[0132] 组成 体积模板DNA(10ng/μL) 1μL
10mM MnCl2 4μL
10mM dATP 2μL
10mM dGTP 2μL
10mN dCTP 12μL
10mM dTTP 8μL
引物(序列号8、10pmol/μL) 4μL
引物(序列号9、10pmol/μL) 4μL
10×Ex Taq缓冲液 10μL
25mM MgCl2 12μL
GoTaq聚合酶(Promega Corporation制) 1μL
H2O 定容至100μL

[0133] (2)对(1)中得到的PCR产物进行纯化后，用限制性内切酶NcoI和HindIII消化，连接于预先用相同的限制性内切酶消化后的表达载体pETMalE(日本特开2011‑206046号公报)。

[0134] (3)连接反应结束后，将反应液通过热休克法导入大肠杆菌BL21(DE3)株，用包含50μg/mL的卡那霉素的LB平板培养基培养(37℃下18小时)后，将平板上所形成的菌落作为随机突变体文库。

[0135] 实施例2耐酸性Fc结合性蛋白质的筛选

[0136] (1)将实施例1中制作的随机变异体文库(转化体)接种于包含50μg/mL的卡那霉素的2YT液体培养基(蛋白胨16g/L、酵母提取物10g/L、氯化钠5g/L)200μL中，使用96孔深孔板在30℃下振荡培养一晚。

[0137] (2)培养后，将5μL的培养液转移到500μL的含有0.05mM的IPTG(异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷)、0.3％(w/v)的甘氨酸和50μg/mL的卡那霉素的2YT液体培养基中，使用96孔深孔板进一步在20℃下振荡培养一晚。

[0138] (3)培养后，将通过离心操作而得到的包含各Fc结合性蛋白质的培养上清20μL与0.1M的甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.0)80μL混合，在25℃下静置24小时。

[0139] (4)分别通过下述所示的ELISA法测定进行了(3)的酸处理时的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性和未进行(3)的酸处理时的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性，将进行了酸处理时的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性除以未进行酸处理时的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性，从而算出残留活性。

[0140] (4‑1)将作为人抗体的γ球蛋白制剂(化学及血清疗法研究所制)以1μg/孔固定于96孔微孔板的孔(4℃下18小时)，固定结束后，用含有2％(w/v)的SKIM MILK(BD公司制)和
150mM的氯化钠的20mM的Tris盐酸缓冲液(pH7.4)封闭。

[0141] (4‑2)用洗涤缓冲液(包含0.05％[w/v]的Tween 20、150mM的NaCl的20mM Tris‑HCl缓冲液(pH7.4))洗涤后，添加包含待评价抗体结合活性的Fc结合性蛋白质的溶液，使Fc结合性蛋白质与所固定的γ球蛋白反应(30℃下1小时)。

[0142] (4‑3)反应结束后，用上述洗涤缓冲液进行洗涤，以100μL/孔添加稀释成100ng/mL的Anti‑6His抗体(Bethyl Laboratories公司制)。

[0143] (4‑4)在30℃下反应1小时，用上述洗涤缓冲液洗涤，之后以50μL/孔添加TMB Peroxidase Substrate(KPL公司制)。通过以50μL/孔添加1M的磷酸而终止显色，用酶标仪(Tecan公司制)测定450nm的吸光度。

[0144] (5)用(4)的方法评价约700株的转化体，在其中选择表达与由序列号3记载的氨基酸序列构成的Fc结合性蛋白质相比酸稳定性提高的Fc结合性蛋白质的转化体。培养上述选择的转化体，使用QIAprep Spin Miniprep kit(QIAGEN公司制)制备表达载体。

[0145] (6)将插入到所得到的表达载体中的编码Fc结合性蛋白质的多核苷酸区域的序列供于基于链终止子法(chain terminator method)的使用Big Dye Terminator Cycle Sequencing FS read Reaction kit(PE Applied Biosystems公司制)的循环测序反应，利用全自动DNA测序仪ABI Prism 3700DNA analyzer(PE Applied Biosystems公司制)分析碱基序列，确定氨基酸的变异位置。需要说明的是，在进行该分析时，使用由序列号8或9记载的序列构成的寡核苷酸中的任一者作为测序用引物。

[0146] 将(5)中选择的转化体所表达的Fc结合性蛋白质的、相对于由序列号3记载的氨基酸序列构成的Fc结合性蛋白质(对照)的氨基酸置换位置和酸处理后的残留活性(％)汇总并示于图2。可知：导入了Pro42Gln(该表述表示序列号2的第42位(序列号1中为第47位)的脯氨酸被置换为谷氨酰胺，以下同)、Pro63Leu、Asn75Ser、Leu163His、Asp179Val、Leu190Ser、Ile198Val、Ile45Thr、Gln69Leu、Pro83Leu或Thr123Pro的氨基酸置换的Fc结合性蛋白质与对照相比，酸稳定性提高。因此可知，通过在人FcγRIIa的胞外区域中具有上述11处氨基酸置换中的至少任意1种以上，酸稳定性(耐酸性)提高。其中，Leu190Ser的残留活性最高，因此可知：在人FcγRIIa的胞外区域中至少具有Leu190Ser的氨基酸置换的Fc结合性蛋白质的酸稳定性(耐酸性)尤其会提高。

[0147] 分别将本实施例中取得的、酸稳定性提高的Fc结合性蛋白质中的具有Leu190Ser的氨基酸置换的Fc结合性蛋白质的氨基酸序列示于序列号5，将编码上述蛋白质的多核苷酸的序列示于序列号6。需要说明的是，在序列号5中，第1位的甲硫氨酸(Met)至第26位的丙氨酸(Ala)为止为MalE信号肽，第27位的甲硫氨酸(Met)和第28位的甘氨酸(Gly)为接头序列，第29位的谷氨酰胺(Gln)至第201位的(Gln)为止为能够与Fc区结合的多肽(FcγRIIa‑m7)，第202位和203位的甘氨酸(Gly)为接头序列，第204位至第209位的组氨酸(His)为标签序列。另外，FcγRIIa‑m7为如下多肽：为具有序列号2记载的氨基酸序列中的、第29位的谷氨酰胺至第201位的谷氨酰胺为止的氨基酸残基，其中，在该第29位至第201位为止的氨基酸残基中具有Ile68Val、His80Gln、Ser84Thr、Asn90Thr、Asn91Ser、His125Arg和Leu190Ser的氨基酸置换。

[0148] 实施例3进一步导入氨基酸置换(其1)

[0149] 通过将实施例2中了解到的与提高Fc结合性蛋白质的酸稳定性有关的氨基酸置换进一步导入FcγRIIa‑m7中，从而谋求酸稳定性的进一步提高。氨基酸置换的导入(累积)主要使用PCR来进行，制作了以下的(a)至(d)所示的4种多肽。

[0150] (a)相对于FcγRIIa‑m7进一步导入了Ile45Thr的氨基酸置换的多肽(命名为FcγRIIa‑m8A)

[0151] (b)相对于FcγRIIa‑m7进一步导入了Gln69Leu的氨基酸置换的多肽(命名为FcγRIIa‑m8B)

[0152] (c)相对于FcγRIIa‑m7进一步导入了Pro83Leu的氨基酸置换的多肽(命名为FcγRIIa‑m8C)

[0153] (d)相对于FcγRIIa‑m7进一步导入了Thr123Pro的氨基酸置换的多肽(命名为FcγRIIa‑m8D)

[0154] 以下详细说明各Fc结合性蛋白质的制作方法。

[0155] (a)FcγRIIa‑m8A

[0156] 从实施例2中了解到的与提高酸稳定性有关的氨基酸置换中选择Ile45Thr，制作使其在FcγRIIa‑m7中累积的FcγRIIa‑m8A。具体而言，相对于编码实施例2中得到的FcγRIIa‑m7的多核苷酸，进行产生Ile45Thr的变异导入，从而制作FcγRIIa‑m8A。

[0157] (a‑1)以编码包含实施例2中取得的FcγRIIa‑m7的Fc结合性蛋白质的多核苷酸(序列号6)为模板，将由序列号8和序列号27记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物，进行PCR。PCR如下进行：在制备表2所示的组成的反应液后，将该反应液在98℃下热处理5分钟，将98℃下10秒的第1步骤、55℃下5秒的第2步骤、72℃下1分钟的第3步骤作为一个循环，使反应进行30个循环，最后在72℃下进行5分钟热处理。将扩增的PCR产物供于琼脂糖凝胶电泳，使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN制)从该凝胶中进行纯化。将纯化得到的PCR产物命名为m8A‑F。

[0158] [表2]

[0159] 表2

[0160] 组成 体积模板DNA 2μL
2.5mM dNTPs 2μL
10μM正向引物 1μL
10μM反向引物 1μL
5×PrimeSTAR缓冲液(Takara Bio Inc.制) 4μL
2.5U/mL PrimeSTAR HS(Takara Bio Inc.制) 0.5μL
H2O 定容至20μL

[0161] (a‑2)以与(a‑1)相同的多核苷酸为模板，将由序列号26和序列号9记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物，除此以外通过与(a‑1)相同的方法进行PCR和PCR产物的纯化。将纯化得到的PCR产物命名为m8A‑S。

[0162] (a‑3)将(a‑1)和(a‑2)中得到的2种PCR产物(m8A‑F、m8A‑S)混合，制备表3所示的组成的反应液。将该反应液在98℃下热处理5分钟后，将98℃下10秒的第1步骤、55℃下5秒的第2步骤、72℃下1分钟的第3步骤作为一个循环，使反应进行5个循环，由此进行PCR，得到将m8A‑F和m8A‑R连接而成的PCR产物m8A‑FL。

[0163] [表3]

[0164] 表3

[0165] 组成 体积PCR产物 1μL
2.5mM dNTPs 2μL
5×PrimeSTAR缓冲液(Takara Bio Inc.制) 4μL
2.5U/mL PrimeSTAR HS(Takara Bio Inc.制) 0.5μL
H2O 定容至20μL

[0166] (a‑4)以(a‑3)中得到的PCR产物m8A‑FL为模板，将由序列号8和序列号9记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物，进行PCR。PCR中，在制备表4所示的组成的反应液后，将该反应液在98℃下热处理5分钟，将98℃下10秒的第1步骤、55℃下5秒的第2步骤、72℃下1分钟的第3步骤作为一个循环，使反应进行30个循环。由此制作编码FcγRIIa‑m8A的多核苷酸。

[0167] [表4]

[0168] 表4

[0169] 组成 体积PCR产物 2μL
2.5mM dNTPs 4μL
10μM正向引物 2μL
10μM反向引物 2μL
5×PrimeSTAR缓冲液(Takara Bio Inc.制) 10μL
2.5U/mL PrimeSTAR HS(Takara Bio Inc.制) 1μL
H2O 定容至50μL

[0170] (a‑5)对(a‑4)中得到的多核苷酸进行纯化后，用限制性内切酶NcoI和HindIII消化，连接于预先用限制性内切酶NcoI和HindIII消化的表达载体pETMalE(日本特开2011‑206046号公报)，使用其转化大肠杆菌BL21(DE3)株。

[0171] (a‑6)将得到的转化体用添加了50μg/mL的卡那霉素的LB培养基培养。从回收的菌体(转化体)中提取质粒，从而得到包含编码FcγRIIa‑m8A的多核苷酸的质粒pET‑m8A，所述FcγRIIa‑m8A是对FcγRIIa‑m7进一步进行了一处氨基酸置换的多肽。

[0172] (a‑7)通过与实施例2的(6)相同的方法进行pET‑m8的核苷酸序列的分析。

[0173] 将添加了信号序列和聚组氨酸标签的FcγRIIa‑m8A的氨基酸序列示于序列号11，将编码上述FcγRIIa‑m8A的多核苷酸的序列示于序列号10。需要说明的是，在序列号11中，第1位的甲硫氨酸(Met)至第26位的丙氨酸(Ala)为止为MalE信号肽，第27位的甲硫氨酸(Met)至第28位的甘氨酸(Gly)为止为接头序列，第29位的谷氨酰胺(Gln)至第201位的谷氨酰胺(Gln)为止为FcγRIIa‑m8A的氨基酸序列(相当于序列号1的第34位至第206位为止的区域)，第202位和203位的甘氨酸(Gly)为接头序列，第204位至第209位的组氨酸(His)为标签序列。

[0174] (b)FcγRIIa‑m8B

[0175] 从实施例2中了解到的与提高酸稳定性有关的氨基酸置换中选择Gln69Leu，制作使其在FcγRIIa‑m7中累积的FcγRIIa‑m8B。具体而言，相对于编码实施例2中得到的FcγRIIa‑m7的多核苷酸，进行产生Gln69Leu的变异导入，从而制作FcγRIIa‑m8B。

[0176] (b‑1)以编码包含实施例2中取得的FcγRIIa‑m7的Fc结合性蛋白质的多核苷酸(序列号6)为模板，将由序列号8和序列号29记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物，除此以外通过与(a‑1)相同的方法进行PCR和PCR产物的纯化。将纯化得到的PCR产物命名为m8B‑F。

[0177] (b‑2)以与(b‑1)相同的多核苷酸为模板，将由序列号28和序列号9记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物，除此以外通过与(a‑1)相同的方法进行PCR和PCR产物的纯化。将纯化得到的PCR产物命名为m8B‑S。

[0178] (b‑3)将(b‑1)中得到的m8B‑F和(b‑2)中得到的m8B‑S作为PCR产物，除此以外通过与(a‑3)相同的方法进行PCR，得到将m8B‑F和m8B‑S连接而成的PCR产物m8B‑FL。

[0179] (b‑4)以(b‑3)中得到的PCR产物m8B‑FL为模板，将由序列号8和序列号9记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物，除此以外通过与(a‑4)相同的方法进行PCR。由此制作编码FcγRIIa‑m8B的多核苷酸。

[0180] (b‑5)对(b‑4)中得到的多核苷酸进行纯化后，用限制性内切酶NcoI和HindIII消化，连接于预先用限制性内切酶NcoI和HindIII消化的表达载体pETMalE(日本特开2011‑206046号公报)，使用其转化大肠杆菌BL21(DE3)株。

[0181] (b‑6)将得到的转化体用添加了50μg/mL的卡那霉素的LB培养基培养。从回收的菌体(转化体)中提取质粒，从而得到包含编码FcγRIIa‑m8B的多核苷酸的质粒pET‑FcγRIIa‑m8B，所述FcγRIIa‑m8B是对FcγRIIa‑m7进一步进行了一处氨基酸置换的多肽。

[0182] (b‑7)通过与实施例2的(6)相同的方法进行pET‑FcγRIIa‑m8B的核苷酸序列的分析。

[0183] 将添加了信号序列和聚组氨酸标签的FcγRIIa‑m8B的氨基酸序列示于序列号13，将编码上述FcγRIIa‑m8B的多核苷酸的序列示于序列号12。需要说明的是，在序列号13中，第1位的甲硫氨酸(Met)至第26位的丙氨酸(Ala)为止为MalE信号肽，第27位的甲硫氨酸(Met)至第28位的甘氨酸(Gly)为止为接头序列，第29位的谷氨酰胺(Gln)至第201位的谷氨酰胺(Gln)为止为FcγRIIa‑m8B的氨基酸序列(相当于序列号1的第34位至第206位为止的区域)，第202位和第203位的甘氨酸(Gly)为接头序列，第204位至第209位的组氨酸(His)为标签序列。

[0184] (c)FcγRIIa‑m8C

[0185] 从实施例2中了解到的与提高酸稳定性有关的氨基酸置换中选择Pro83Leu，制作使其在FcγRIIa‑m7中累积的FcγRIIa‑m8C。具体而言，相对于编码实施例2中得到的FcγRIIa‑m7的多核苷酸，进行产生Pro83Leu的变异导入，从而制作FcγRIIa‑m8C。

[0186] (c‑1)以编码包含实施例2中取得的FcγRIIa‑m7的Fc结合性蛋白质的多核苷酸(序列号6)为模板，将由序列号8和序列号31记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物，除此以外通过与(a‑1)相同的方法进行PCR和PCR产物的纯化。将纯化得到的PCR产物命名为m8C‑F。

[0187] (c‑2)以与(c‑1)相同的多核苷酸为模板，将由序列号30和序列号9记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物，除此以外通过与(a‑1)相同的方法进行PCR和PCR产物的纯化。将纯化得到的PCR产物命名为m8C‑S。

[0188] (c‑3)将(c‑1)中得到的m8C‑F和(c‑2)中得到的m8C‑S作为PCR产物，除此以外通过与(a‑3)相同的方法进行PCR，得到将m8C‑F和m8C‑S连接而成的PCR产物m8C‑FL。

[0189] (c‑4)以(c‑3)中得到的PCR产物m8C‑FL为模板，将由序列号8和序列号9记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物，除此以外通过与(a‑4)相同的方法进行PCR。由此制作编码FcγRIIa‑m8C的多核苷酸。

[0190] (c‑5)对(c‑4)中得到的多核苷酸进行纯化后，用限制性内切酶NcoI和HindIII消化，连接于预先用限制性内切酶NcoI和HindIII消化的表达载体pETMalE(日本特开2011‑206046号公报)，使用其转化大肠杆菌BL21(DE3)株。

[0191] (c‑6)将得到的转化体用添加了50μg/mL的卡那霉素的LB培养基培养。从回收的菌体(转化体)中提取质粒，从而得到包含编码FcγRIIa‑m8C的多核苷酸的质粒pET‑FcγRIIa‑m8C，所述FcγRIIa‑m8C是对FcγRIIa‑m7进一步进行了一处氨基酸置换的多肽。

[0192] (c‑7)通过与实施例2的(6)相同的方法进行pET‑FcγRIIa‑m8C的核苷酸序列的分析。

[0193] 将添加了信号序列和聚组氨酸标签的FcγRIIa‑m8C的氨基酸序列示于序列号15，将编码上述FcγRIIa‑m8C的多核苷酸的序列示于序列号14。需要说明的是，在序列号15中，第1位的甲硫氨酸(Met)至第26位的丙氨酸(Ala)为止为MalE信号肽，第27位的甲硫氨酸(Met)至第28位的甘氨酸(Gly)为止为接头序列，第29位的谷氨酰胺(Gln)至第201位的谷氨酰胺(Gln)为止为FcγRIIa‑m8C的氨基酸序列(相当于序列号1的第34位至第206位为止的区域)，第202位和第203位的甘氨酸(Gly)为接头序列，第204位至第209位的组氨酸(His)为标签序列。

[0194] (d)FcγRIIa‑m8D

[0195] 从实施例2中了解到的与提高酸稳定性有关的氨基酸置换中选择Thr123Pro，制作使其在FcγRIIa‑m7中累积的FcγRIIa‑m8D。具体而言，相对于编码实施例2中得到的FcγRIIa‑m7的多核苷酸，进行产生Thr123Pro的变异导入，从而制作FcγRIIa‑m8D。

[0196] (d‑1)以编码包含实施例2中取得的FcγRIIa‑m7的Fc结合性蛋白质的多核苷酸(序列号6)为模板，将由序列号8和序列号33记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物，除此以外通过与(a‑1)相同的方法进行PCR和PCR产物的纯化。将纯化得到的PCR产物命名为m8D‑F。

[0197] (d‑2)以与(d‑1)相同的多核苷酸为模板，将由序列号32和序列号9记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物，除此以外通过与(a‑1)相同的方法进行PCR和PCR产物的纯化。将纯化得到的PCR产物命名为m8D‑S。

[0198] (d‑3)将(d‑1)中得到的m8C‑F和(d‑2)中得到的m8C‑S作为PCR产物，除此以外通过与(a‑3)相同的方法进行PCR，得到将m8D‑F和m8D‑S连接而成的PCR产物m8D‑FL。

[0199] (d‑4)以(d‑3)中得到的PCR产物m8D‑FL为模板，将由序列号8和序列号9记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物，除此以外通过与(a‑4)相同的方法进行PCR。由此制作编码FcγRIIa‑m8D的多核苷酸。

[0200] (d‑5)对(d‑4)中得到的多核苷酸进行纯化后，用限制性内切酶NcoI和HindIII消化，连接于预先用限制性内切酶NcoI和HindIII消化的表达载体pETMalE(日本特开2011‑206046号公报)，使用其转化大肠杆菌BL21(DE3)株。

[0201] (d‑6)将得到的转化体用添加了50μg/mL的卡那霉素的LB培养基培养。从回收的菌体(转化体)中提取质粒，从而得到包含编码FcγRIIa‑m8D的多核苷酸的质粒pET‑FcγRIIa‑m8D，所述FcγRIIa‑m8D是对FcγRIIa‑m7进一步进行了一处氨基酸置换的多肽。

[0202] (d‑7)通过与实施例2的(6)相同的方法进行pET‑FcγRIIa‑m8D的核苷酸序列的分析。

[0203] 将添加了信号序列和聚组氨酸标签的FcγRIIa‑m8D的氨基酸序列示于序列号17，将编码上述FcγRIIa‑m8D的多核苷酸的序列示于序列号16。需要说明的是，在序列号17中，第1位的甲硫氨酸(Met)至第26位的丙氨酸(Ala)为止为MalE信号肽，第27位的甲硫氨酸(Met)至第28位的甘氨酸(Gly)为止为接头序列，第29位的谷氨酰胺(Gln)至第201位的谷氨酰胺(Gln)为止为FcγRIIa‑m8D的氨基酸序列(相当于序列号1的第34位至第206位的区域)，第202位和203位的甘氨酸(Gly)为接头序列，第204位至第209位的组氨酸(His)为标签序列。

[0204] 实施例4Fc结合性蛋白质的酸稳定性评价(其1)

[0205] (1)将表达FcγRIIa‑m6、以及实施例3中制作的FcγRIIa‑m8A、FcγRIIa‑m8B、FcγRIIa‑m8C和FcγRIIa‑m8D的转化体分别接种于包含50μg/mL的卡那霉素的3mL的2YT液体培养基(蛋白胨16g/L、酵母提取物10g/L、氯化钠5g/L)，在37℃下需氧振荡培养一晚而进行预培养。

[0206] (2)向添加有50μg/mL的卡那霉素的20mL的2YT液体培养基中接种预培养液200μL，在37℃下进行需氧振荡培养。

[0207] (3)培养开始1.5小时后，将培养温度变更为20℃并进行30分钟振荡培养。然后，以终浓度成为0.01mM的方式添加IPTG，接着在20℃下进行一晚的需氧振荡培养。

[0208] (4)培养结束后，通过离心分离收集菌体，使用BugBuster Protein extraction kit(宝生物制)制备蛋白质提取液。

[0209] (5)通过实施例2的(4)记载的ELISA法测定(4)中制备的蛋白质提取液中的FcγRIIa‑m6、FcγRIIa‑m8A、FcγRIIa‑m8B、FcγRIIa‑m8C和FcγRIIa‑m8D的抗体结合活性。此时，使用经纯化、定量的FcγRIIa‑m6制作标准曲线，进行蛋白质浓度测定。

[0210] (6)以各Fc结合性蛋白质的浓度为10μg/mL的方式用纯水稀释后，将上述稀释而得的溶液50μL和20mM甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.0)溶液50μL混合，在30℃下静置24小时而进行酸处理。然后，加入4倍量的1M Tris盐酸缓冲液(pH7.0)进行中和，通过实施例2的(4)记载的ELISA法测定Fc结合性蛋白质的抗体结合活性。

[0211] (7)将进行了酸处理时的抗体结合活性除以未进行酸处理时的抗体结合活性，从而计算残留活性、评价酸稳定性。

[0212] 将结果示于表5。在实施例3中制作的Fc结合性蛋白质中，FcγRIIa‑m8B和FcγRIIa‑m8D与FcγRIIa‑m6相比，残留活性高，因此可确认与FcγRIIa‑m6相比，酸稳定性提高。

[0213] [表5]

[0214] 表5

[0215]实施例 名称 序列号 残留活性[％]
实施例3(a) FcγRIIa‑m8A 11 55.7
实施例3(b) FcγRIIa‑m8B 13 73.5
实施例3(c) FcγRIIa‑m8C 15 25.2
实施例3(d) FcγRIIa‑m8D 17 73.8
  FcγRIIa‑m6 3 56.9

[0216] 实施例5进一步导入氨基酸置换(其2)

[0217] 通过将实施例2中了解到的与提高Fc结合性蛋白质的酸稳定性有关的氨基酸置换进一步导入FcγRIIa‑m8D中，从而谋求酸稳定性的进一步提高。氨基酸置换的导入(累积)主要使用PCR来进行，制作了以下的(a)至(c)所示的3种多肽。

[0218] (a)相对于FcγRIIa‑m8D进一步导入了Ile45Thr和Gln69Leu的氨基酸置换的多肽(命名为FcγRIIa‑m10A)

[0219] (b)相对于FcγRIIa‑m8D进一步导入了Ile45Thr和Pro83Leu的氨基酸置换的多肽(命名为FcγRIIa‑m10B)

[0220] (c)相对于FcγRIIa‑m8D进一步导入了Gln69Leu和Pro83Leu的氨基酸置换的多肽(命名为FcγRIIa‑m10C)

[0221] 以下详细说明各Fc结合性蛋白质的制作方法。

[0222] (a)FcγRIIa‑m10A

[0223] 从实施例2中了解到的与提高酸稳定性有关的氨基酸置换中选择Ile45Thr和Gln69Leu，制作使其在FcγRIIa‑m8D中累积的FcγRIIa‑m10A。具体而言，相对于编码实施例3的(d)中得到的FcγRIIa‑m8D的多核苷酸，进行产生Ile45Thr和Gln69Leu的变异导入，从而制作FcγRIIa‑m10A。

[0224] (a‑1)以编码包含实施例3的(d)中取得的FcγRIIa‑m8D的Fc结合性蛋白质的多核苷酸(序列号16)为模板，将由序列号8和序列号27记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物，除此以外通过与实施例3的(a‑1)相同的方法进行PCR和PCR产物的纯化。将纯化得到的PCR产物命名为m10A‑F。

[0225] (a‑2)以与(a‑1)相同的多核苷酸为模板，将由序列号26和序列号29记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物，除此以外通过与实施例3的(a‑1)相同的方法进行PCR和PCR产物的纯化。将纯化得到的PCR产物命名为m10A‑S。

[0226] (a‑3)以与(a‑1)相同的多核苷酸为模板，将由序列号28和序列号9记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物，除此以外通过与实施例3的(a‑1)相同的方法进行PCR和PCR产物的纯化。将纯化得到的PCR产物命名为m10A‑T。

[0227] (a‑4)将(a‑1)中得到的m10A‑F、(a‑2)中得到的m10A‑S和(a‑3)中得到的m10A‑T作为PCR产物，除此以外通过与实施例3的(a‑3)相同的方法进行PCR，得到将m10A‑F、m10A‑S和m10A‑T连接而成的PCR产物m10A‑FL。

[0228] (a‑5)以(a‑4)中得到的PCR产物m10A‑FL为模板，将由序列号8和序列号9记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物，除此以外通过与实施例3的(a‑4)相同的方法进行PCR。由此制作编码FcγRIIa‑m10A的多核苷酸。

[0229] (a‑6)对(a‑5)中得到的多核苷酸进行纯化后，用限制性内切酶NcoI和HindIII消化，连接于预先用限制性内切酶NcoI和HindIII消化的表达载体pETMalE(日本特开2011‑206046号公报)，使用其转化大肠杆菌BL21(DE3)株。

[0230] (a‑7)将得到的转化体用添加了50μg/mL的卡那霉素的LB培养基培养。从回收的菌体(转化体)中提取质粒，从而得到包含编码FcγRIIa‑m10A的多核苷酸的质粒pET‑FcγRIIa‑m10A，所述FcγRIIa‑m10A是对FcγRIIa‑m7进一步进行了三处氨基酸置换的多肽。

[0231] (a‑8)通过与实施例2的(6)相同的方法进行pET‑FcγRIIa‑m10A的核苷酸序列的分析。

[0232] 将添加了信号序列和聚组氨酸标签的FcγRIIa‑m10A的氨基酸序列示于序列号19，将编码上述FcγRIIa‑m10A的多核苷酸的序列示于序列号18。需要说明的是，在序列号
19中，第1位的甲硫氨酸(Met)至第26位的丙氨酸(Ala)为止为MalE信号肽，第27位的甲硫氨酸(Met)至第28位的甘氨酸(Gly)为止为接头序列，第29位的谷氨酰胺(Gln)至第201位的谷氨酰胺(Gln)为止为FcγRIIa‑m10A的氨基酸序列(相对于序列号1的第34位至第206位为止的区域)，第202位和203位的甘氨酸(Gly)为接头序列，第204位至第209位的组氨酸(His)为标签序列。

[0233] (b)FcγRIIa‑m10B

[0234] 从实施例2中了解到的与提高酸稳定性有关的氨基酸置换中选择Ile45Thr和Pro83Leu，制作使其在FcγRIIa‑m8D中累积的FcγRIIa‑m10B。具体而言，相对于编码实施例3的(d)中得到的FcγRIIa‑m8D的多核苷酸，进行产生Ile45Thr和Pro83Leu的变异导入，从而制作FcγRIIa‑m10B。

[0235] (b‑1)以编码包含实施例3的(d)中取得的FcγRIIa‑m8D的Fc结合性蛋白质的多核苷酸(序列号16)为模板，将由序列号8和序列号27记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物，除此以外通过与实施例3的(a‑1)相同的方法进行PCR和PCR产物的纯化。将纯化得到的PCR产物命名为m10B‑F。

[0236] (b‑2)以与(b‑1)相同的多核苷酸为模板，将由序列号26和序列号31记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物，除此以外通过与实施例3的(a‑1)相同的方法进行PCR和PCR产物的纯化。将纯化得到的PCR产物命名为m10B‑S。

[0237] (b‑3)以与(b‑2)相同的多核苷酸为模板，将由序列号30和序列号9记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物，除此以外通过与实施例3的(a‑1)相同的方法进行PCR和PCR产物的纯化。将纯化得到的PCR产物命名为m10B‑T。

[0238] (b‑4)将(b‑1)中得到的m10B‑F、(b‑2)中得到的m10B‑S和(b‑3)中得到的m10B‑T作为PCR产物，除此以外通过与实施例3的(a‑3)相同的方法进行PCR，得到将m10B‑F、m10B‑S和m10B‑T连接而成的PCR产物m10B‑FL。

[0239] (b‑5)以(b‑4)中得到的PCR产物m10B‑FL为模板，将由序列号8和序列号9记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物，除此以外通过与实施例3的(a‑4)相同的方法进行PCR。由此制作编码FcγRIIa‑m10B的多核苷酸。

[0240] (b‑6)对(b‑5)中得到的多核苷酸进行纯化后，用限制性内切酶NcoI和HindIII消化，连接于预先用限制性内切酶NcoI和HindIII消化的表达载体pETMalE(日本特开2011‑206046号公报)，使用其转化大肠杆菌BL21(DE3)株。

[0241] (b‑7)将得到的转化体用添加了50μg/mL的卡那霉素的LB培养基培养。从回收的菌体(转化体)中提取质粒，从而得到包含编码FcγRIIa‑m10B的多核苷酸的质粒pET‑FcγRIIa‑m10B，所述FcγRIIa‑m10B是对FcγRIIa‑m7进一步进行了三处氨基酸置换的多肽。

[0242] (b‑8)通过与实施例2的(6)相同的方法进行pET‑FcγRIIa‑m10B的核苷酸序列的分析。

[0243] 将添加了信号序列和聚组氨酸标签的FcγRIIa‑m10B的氨基酸序列示于序列号21，将编码上述FcγRIIa‑m10B的多核苷酸的序列示于序列号20。需要说明的是，在序列号
21中，第1位的甲硫氨酸(Met)至第26位的丙氨酸(Ala)为止为MalE信号肽，第27位的甲硫氨酸(Met)至第28位的甘氨酸(Gly)为止为接头序列，第29位的谷氨酰胺(Gln)至第201位的谷氨酰胺(Gln)为止为FcγRIIa‑m10B的氨基酸序列(相当于序列号1的第34位至第206位为止的区域)，第202位和203位的甘氨酸(Gly)为接头序列，第204位至第209位的组氨酸(His)为标签序列。

[0244] (c)FcγRIIa‑m10C

[0245] 从实施例2中了解到的与提高酸稳定性有关的氨基酸置换中选择Gln69Leu和Pro83Leu，制作使其在FcγRIIa‑m8D中累积的FcγRIIa‑m10C。具体而言，相对于编码实施例3的(d)中得到的FcγRIIa‑m8D的多核苷酸，进行产生Gln69Leu和Pro83Leu的变异导入，从而制作FcγRIIa‑m10C。

[0246] (c‑1)以编码包含实施例3的(d)中取得的FcγRIIa‑m8D的Fc结合性蛋白质的多核苷酸(序列号16)为模板，将由序列号8和序列号29记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物，除此以外通过与实施例3的(a‑1)相同的方法进行PCR和PCR产物的纯化。将纯化得到的PCR产物命名为m10C‑F。

[0247] (c‑2)以与(c‑1)相同的多核苷酸为模板，将由序列号28和序列号31记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物，除此以外通过与实施例3的(a‑1)相同的方法进行PCR和PCR产物的纯化。将纯化得到的PCR产物命名为m10C‑S。

[0248] (c‑3)以与(c‑1)相同的多核苷酸为模板，将由序列号30和序列号9记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物，除此以外通过与实施例3的(a‑1)相同的方法进行PCR和PCR产物的纯化。将纯化得到的PCR产物命名为m10C‑T。

[0249] (c‑4)将(c‑1)中得到的m10C‑F、(c‑2)中得到的m10C‑S和(c‑3)中得到的m10C‑T作为PCR产物，除此以外通过与实施例3的(a‑3)相同的方法进行PCR，得到将m10C‑F与m10C‑S和m10C‑T连接而成的PCR产物m10C‑FL。

[0250] (c‑5)以(c‑4)中得到的PCR产物m10C‑FL为模板，将由序列号8和序列号9记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物，除此以外通过与实施例3的(a‑4)相同的方法进行PCR。由此制作编码FcγRIIa‑m10C的多核苷酸。

[0251] (c‑6)对(c‑5)中得到的多核苷酸进行纯化后，用限制性内切酶NcoI和HindIII消化，连接于预先用限制性内切酶NcoI和HindIII消化的表达载体pETMalE(日本特开2011‑206046号公报)，使用其转化大肠杆菌BL21(DE3)株。

[0252] (c‑7)将得到的转化体用添加了50μg/mL的卡那霉素的LB培养基培养。从回收的菌体(转化体)中提取质粒，从而得到包含编码FcγRIIa‑m10C的多核苷酸的质粒pET‑FcγRIIa‑m10C，所述FcγRIIa‑m10C是对FcγRIIa‑m7进一步进行了三处氨基酸置换的多肽。

[0253] (c‑8)通过与实施例2的(6)相同的方法进行pET‑FcγRIIa‑m10C的核苷酸序列的分析。

[0254] 将添加了信号序列和聚组氨酸标签的FcγRIIa‑m10C的氨基酸序列示于序列号23，将编码上述FcγRIIa‑m10C的多核苷酸的序列示于序列号22。需要说明的是，在序列号
23中，第1位的甲硫氨酸(Met)至第26位的丙氨酸(Ala)为止为MalE信号肽，第27位的甲硫氨酸(Met)至第28位的甘氨酸(Gly)为止为接头序列，第29位的谷氨酰胺(Gln)至第201位的谷氨酰胺(Gln)为止为FcγRIIa‑m10C的氨基酸序列(相当于序列号1的第34位至第206位的区域)，第202位和203位的甘氨酸(Gly)为接头序列，第204位至第209位的组氨酸(His)为标签序列。

[0255] 实施例6进一步导入氨基酸置换(其3)

[0256] 从实施例2中了解到的与提高Fc结合性蛋白质的酸稳定性有关的氨基酸置换中选择Ile45Thr、Gln69Leu和Pro83Leu并进一步导入到FcγRIIa‑m8D中，从而谋求酸稳定性的进一步提高。具体而言，对编码实施例5的(a)中得到的FcγRIIa‑m10A的多核苷酸进行产生Pro83Leu的变异导入，从而制作(命名为FcγRIIa‑m11)。以下对FcγRIIa‑m11的制作方法进行详细说明。

[0257] (1)以编码包含实施例5的(a)中取得的FcγRIIa‑m10A的Fc结合性蛋白质的多核苷酸(序列号18)为模板，将由序列号8和序列号31记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物，除此以外通过与实施例3的(a‑1)相同的方法进行PCR和PCR产物的纯化。将纯化得到的PCR产物命名为m11‑F。

[0258] (2)以与(1)相同的多核苷酸为模板，将由序列号30和序列号9记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物，除此以外通过与实施例3的(a‑1)相同的方法进行PCR和PCR产物的纯化。将纯化得到的PCR产物命名为m11‑S。

[0259] (3)以(1)中得到的m11‑F和(2)中得到的m11‑S作为PCR产物，除此以外通过与实施例3的(a‑3)相同的方法进行PCR，得到将m11‑F和m11‑S连接而成的PCR产物m11‑FL。

[0260] (4)以(3)中得到的PCR产物m11‑FL为模板，将由序列号8和序列号9记载的序列构成的寡核苷酸作为PCR引物，除此以外通过与实施例3的(a‑4)相同的方法进行PCR。由此制作编码FcγRIIa‑m11的多核苷酸。

[0261] (5)对(4)中得到的多核苷酸进行纯化后，用限制性内切酶NcoI和HindIII消化，连接于预先用限制性内切酶NcoI和HindIII消化的表达载体pETMalE(日本特开2011‑206046号公报)，使用其转化大肠杆菌BL21(DE3)株。

[0262] (6)将得到的转化体用添加了50μg/mL的卡那霉素的LB培养基培养。从回收的菌体(转化体)中提取质粒，从而得到包含编码FcγRIIa‑m11的多核苷酸的质粒pET‑FcγRIIa‑m11，所述FcγRIIa‑m11是对FcγRIIa‑m7进一步进行了四处氨基酸置换的多肽。

[0263] (7)通过与实施例2的(6)相同的方法进行pET‑FcγRIIa‑m11的核苷酸序列的分析。

[0264] 将添加了信号序列和聚组氨酸标签的FcγRIIa‑m11的氨基酸序列示于序列号25，将编码上述FcγRIIa‑m11的多核苷酸的序列示于序列号24。需要说明的是，在序列号25中，第1位的甲硫氨酸(Met)至第26位的丙氨酸(Ala)为止为MalE信号肽，第27位的甲硫氨酸(Met)至第28位的甘氨酸(Gly)为止为接头序列，第29位的谷氨酰胺(Gln)至第201位的谷氨酰胺(Gln)为止为FcγRIIa‑m11的氨基酸序列(相当于序列号1的第34位至第206位为止的区域)，第202位和203位的甘氨酸(Gly)为接头序列，第204位至第209位的组氨酸(His)为标签序列。

[0265] 实施例7 Fc结合性蛋白质的酸稳定性评价(其2)

[0266] (1)通过与实施例4的(1)至(4)相同的方法培养表达FcγRIIa‑m6、实施例5中制作的FcγRIIa‑m10A、FcγRIIa‑m10B和FcγRIIa‑m10C、以及实施例6中制作的FcγIIa‑m11的转化体，进行提取，从而制备这些蛋白质。

[0267] (2)通过实施例2的(4)记载的ELISA法测定(1)中制备的蛋白质提取液中的FcγRIIa‑m6、3种FcγRIIa‑m10、和FcγRIIa‑m11的抗体结合活性。此时，使用经纯化、定量的FcγRIIa‑m6制作标准曲线，进行蛋白质浓度测定。

[0268] (3)以各Fc结合性蛋白质的浓度成为10μg/mL的方式用纯水稀释后，将上述稀释而得的溶液50μL与20mM甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.0)溶液50μL进行混合，在30℃下静置24小时而进行酸处理。然后，加入4倍量的1M Tris盐酸缓冲液(pH7.0)进行中和，通过实施例2的(4)记载的ELISA法测定Fc结合性蛋白质的抗体结合活性。

[0269] (4)将进行了酸处理时的抗体结合活性除以未进行酸处理时的抗体结合活性，由此计算残留活性、评价酸稳定性。

[0270] 将结果示于表6。FcγRIIa‑m10A、FcγRIIa‑m10C和FcγRIIa‑m11与FcγRIIa‑m6相比，残留活性高，因此可确认与FcγRIIa‑m6相比酸稳定性提高。其中，FcγRIIa‑m11的残留活性高达95.3％，可以说是酸稳定性尤其提高的Fc结合性蛋白质。

[0271] [表6]

[0272] 表6

[0273] 实施例 名称 序列号 残留活性[％]实施例5(a) FcγRIIa‑m10A 19 77.3
实施例5(b) FcγRIIa‑m10B 21 46.9
实施例5(c) FcγRIIa‑m10C 23 72.9
实施例6 FcγRIIa‑m11 25 95.3
  FcγRIIa‑m6 3 56.9

[0274] 实施例8处于环区域的氨基酸残基的缺失

[0275] 为了进一步提高酸稳定性，基于收录于公知数据库的FcγRIIa的晶体结构数据(PDB ID：1FCG)的见解，使位于FcγRIIa的环区域的氨基酸残基缺失。具体而言，通过下述方法制作下述(a)至(j)所示的、使实施例6中得到的FcγRIIa‑m11中的环区域(序列号25的第58位的谷氨酰胺至第67位的丝氨酸为止的区域)的一部分或全部氨基酸残基缺失的Fc结合性蛋白质。

[0276] (a)使FcγRIIa‑m11中第62位的丝氨酸缺失的Fc结合性蛋白质(命名为FcγRIIa‑m11‑Del1)

[0277] (b)使FcγRIIa‑m11中第62位的丝氨酸和第64位的谷氨酸缺失的Fc结合性蛋白质(命名为FcγRIIa‑m11‑Del2)

[0278] (c)使FcγRIIa‑m11中第62位的丝氨酸至第64位的谷氨酸为止的氨基酸残基缺失的Fc结合性蛋白质(命名为FcγRIIa‑m11‑Del3)

[0279] (d)使FcγRIIa‑m11中第61位的精氨酸至第64位的谷氨酸为止的氨基酸残基缺失的Fc结合性蛋白质(命名为FcγRIIa‑m11‑Del4)

[0280] (e)使FcγRIIa‑m11中第61位的精氨酸至第65位的丝氨酸为止的氨基酸残基缺失的Fc结合性蛋白质(命名为FcγRIIa‑m11‑Del5)

[0281] (f)使FcγRIIa‑m11中第60位的丙氨酸至第65位的丝氨酸为止的氨基酸残基缺失的Fc结合性蛋白质(命名为FcγRIIa‑m11‑Del6)

[0282] (g)使FcγRIIa‑m11中第59位的甘氨酸至第65位的丝氨酸为止的氨基酸残基缺失的Fc结合性蛋白质(命名为FcγRIIa‑m11‑Del7)

[0283] (h)使FcγRIIa‑m11中第59位的甘氨酸至第66位的天冬氨酸为止的氨基酸残基缺失的Fc结合性蛋白质(命名为FcγRIIa‑m11‑Del8)

[0284] (i)使FcγRIIa‑m11中第59位的甘氨酸至第67位的丝氨酸为止的氨基酸残基缺失的Fc结合性蛋白质(命名为FcγRIIa‑m11‑Del9)

[0285] (j)使FcγRIIa‑m11中第58位的谷氨酰胺至第67位的丝氨酸为止的氨基酸残基缺失的Fc结合性蛋白质(命名为FcγRIIa‑m11‑Del10)

[0286] (1)通过人工基因合成而制作(委托FASMAC公司)包含上述10种Fc结合性蛋白质缺失体的多核苷酸((a)FcγRIIa‑m11‑Del1：序列号34、(b)FcγRIIa‑m11‑Del2：序列号36、(c)FcγRIIa‑m11‑Del3：序列号38、(d)FcγRIIa‑m11‑Del4：序列号40、(e)FcγRIIa‑m11‑Del5：序列号42、(f)FcγRIIa‑m11‑Del6：序列号44、(g)FcγRIIa‑m11‑Del7：序列号46、(h)FcγRIIa‑m11‑Del8：序列号48、(i)FcγRIIa‑m11‑Del9：序列号50、(j)FcγRIIa‑m11‑Del10：序列号52)。

[0287] (2)将(1)中制作的多核苷酸连接到用限制性内切酶NcoI和HindIII消化而得的表达载体pETMalE(日本特开2011‑206046号公报)中，使用其转化大肠杆菌BL21(DE3)株。

[0288] (3)用与实施例4的(1)至(4)相同的方法培养将得到的转化体，进行提取，由此制备这些蛋白质。

[0289] 分别地，将添加了信号序列和聚组氨酸标签的(a)FcγRIIa‑m11‑Del1的氨基酸序列示于序列号35，将添加了信号序列和聚组氨酸标签的(b)FcγRIIa‑m11‑Del2的氨基酸序列示于序列号37，将添加了信号序列和聚组氨酸标签的(c)FcγRIIa‑m11‑Del3的氨基酸序列示于序列号39，将添加了信号序列和聚组氨酸标签的(d)FcγRIIa‑m11‑Del4的氨基酸序列示于序列号41，将添加了信号序列和聚组氨酸标签的(e)FcγRIIa‑m11‑Del5的氨基酸序列示于序列号43，将添加了信号序列和聚组氨酸标签的(f)FcγRIIa‑m11‑Del6的氨基酸序列示于序列号45，将添加了信号序列和聚组氨酸标签的(g)FcγRIIa‑m11‑Del7的氨基酸序列示于序列号47，将添加了信号序列和聚组氨酸标签的(h)FcγRIIa‑m11‑Del8的氨基酸序列示于序列号49，将添加了信号序列和聚组氨酸标签的(i)FcγRIIa‑m11‑Del9的氨基酸序列示于序列号51，将添加了信号序列和聚组氨酸标签的(j)FcγRIIa‑m11‑Del10的氨基酸序列示于序列号53。需要说明的是，在这些序列中，第1位的甲硫氨酸(Met)至第26位的丙氨酸(Ala)为止为MalE信号肽，第27位的甲硫氨酸(Met)至第28位的甘氨酸(Gly)为止为接头序列，C末端侧的6个组氨酸(His)残基为标签序列，C末端起第7位和第8位的甘氨酸(Gly)为接头序列，其它区域为能够与Fc区结合的多肽(FcγRIIa‑m11‑Del1、FcγRIIa‑m11‑Del2、FcγRIIa‑m11‑Del3、FcγRIIa‑m11‑Del4、FcγRIIa‑m11‑Del5、FcγRIIa‑m11‑Del6、FcγRIIa‑m11‑Del7、FcγRIIa‑m11‑Del8、FcγRIIa‑m11‑Del9或FcγRIIa‑m11‑Del10)。

[0290] 实施例9Fc结合性蛋白质的酸稳定性评价(其3)

[0291] (1)通过与实施例4的(1)至(4)相同的方法培养表达实施例6中制作的FcγRIIa‑m11的转化体，进行提取，由此制备蛋白质。

[0292] (2)通过实施例2的(4)记载的ELISA法测定(1)和实施例8中制备的蛋白质提取液中的抗体结合活性。此时，使用经纯化、定量的FcγRIIa‑m6制作标准曲线，进行蛋白质浓度测定。需要说明的是，FcγRIIa‑m11‑Del8、FcγRIIa‑m11‑Del9和FcγRIIa‑m11‑Del10的蛋白质表达量不充分，因此未能进行蛋白质浓度测定。

[0293] (3)以各Fc结合性蛋白质的浓度为10μg/mL的方式用纯水稀释后，将上述稀释而得的溶液50μL和20mM甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.0)溶液50μL混合，在30℃下静置72小时而进行酸处理。然后，加入4倍量的1M Tris盐酸缓冲液(pH7.0)进行中和，通过实施例2的(4)记载的ELISA法测定Fc结合性蛋白质的抗体结合活性。

[0294] (4)将进行了酸处理时的抗体结合活性除以未进行酸处理时的抗体结合活性，由此计算残留活性、评价酸稳定性。

[0295] 将结果示于表7。FcγRIIa‑m11‑Del1和FcγRIIa‑m11‑Del5与FcγRIIa‑m11相比72小时处理后的残留活性高，因此可确认与FcγRIIa‑m11相比长期的酸稳定性提高。

[0296] [表7]

[0297] 表7

[0298]

[0299] 详细地、另外参照特定的实施方式说明了本发明，但是可以在不脱离本发明的本质和范围的条件下加以各种变更、改进，这对于本领域技术人员人员而言是显而易见的。

[0300] 需要说明的是，将2018年2月22日提出的日本专利申请2018‑029994号、2018年8月20日提出的日本专利申请2018‑154007号、2019年1月11日提出的日本专利申请2019‑
003038号的说明书、序列表、权利要求书、附图和摘要的全部内容引用于此，作为本发明的说明书的公开而并入。