一种靶向癌胚抗原的单域抗体、构建方法及其应用 |
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| 申请号 | CN202410080679.3 | 申请日 | 2024-01-19 | 公开(公告)号 | CN118005796A | 公开(公告)日 | 2024-05-10 |
| 申请人 | 南京鼓楼医院; | 发明人 | 冯敏; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供一种靶向癌胚 抗原 的单域 抗体 、构建方法及其应用，所述单域抗体的 氨 基酸序列为SEQ ID NO:1～11所示的其中一种。本发明采用健康羊驼作为获取抗体的实验动物，经过免疫后获取羊驼外周血，并判定抗体的效价。将抗体基因 片段 构建至 噬菌体 展示载体上，进行电转收集噬菌体展示库，并利用抗体库能够对特异性抗体进行筛选的特性，对免疫羊驼后得到的抗体进行筛选，获得多个与癌胚抗原结合及可溶表达的抗体。通过细胞筛选，得到亲和 力 较好的可作为靶点的序列用于构建能靶向CEA的纳米抗体，并可应用于 结直肠癌 的临床诊断和 治疗 。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种靶向癌胚抗原的单域抗体，其特征在于：所述单域抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO:1～11所示的其中一种。 |
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| 说明书全文 | 一种靶向癌胚抗原的单域抗体、构建方法及其应用技术领域： [0002] 噬菌体抗体展示技术是基于抗原抗体亲和力，以噬菌体表面为媒介的最常用的展示和筛选的基因工程技术。常用的噬菌体展示技术以M13、T4、T7、Qβ和MS2噬菌体等为载体，从而将编码各种抗体的核酸序列整合到噬菌体的基因组，与编码噬菌体外壳蛋白的基因进行融合。然而，噬菌体展示过程需要经过细菌转化、噬菌体包装，抗体在细胞内的不同结合特性，导致噬菌体展示系统的文库容量和多样性受到限制。根据不同的靶抗体，对噬菌体进行修饰，构建库容量大、灵活性强的展示库，能够解决噬菌体展示系统的库容量和多样性问题。噬菌体抗体展示技术正在成为生物医学领域的重要工具，并在开发用于癌症或传染病诊断的显像剂方面的应用范围不断扩大。综上所述，随着技术的不断发展和完善，噬菌体展示技术的潜在应用价值可能会进一步增加。 [0003] 结直肠癌(CRC)是全球癌症死亡的主要原因，转移是结直肠癌癌症相关死亡的主要原因。转移性结直肠癌的治疗进展甚微。设计靶向和有效的治疗方法仍然是结直肠癌治疗的未满足的主要临床需求。癌胚抗原(CEA)是一种在大多数结直肠肿瘤中过表达的糖蛋白，因此，对于癌胚抗原阳性的肿瘤疾病，可通过靶向癌胚抗原抗体作为检测或治疗药物，可用于产生新的靶向癌胚抗原治疗结直肠癌的治疗策略。目前关于靶向癌胚抗原的抗体药物尚无报道。因此，本发明提供一种靶向癌胚抗原的单域抗体，能够与可用与癌胚抗原特异性结合，可用于结直肠癌等恶性肿瘤的治疗。发明内容： [0004] 本发明的目的是针对现有技术存在的问题，提供一种靶向癌胚抗原的单域抗体、构建方法及其应用，通过噬菌体展示技术筛选出能够与癌胚抗原(CEA)特异性结合的sdAb序列并挑选其中特异性强的序列进行载体构建及真核表达，从而获得亲和力高的抗体。这些对CEA具有高度靶向性的抗体可应用于结直肠癌的临床诊断和治疗。 [0005] 为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案： [0006] (一)本发明提供一种靶向癌胚抗原的单域抗体，所述单域抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO:1～11所示的其中一种。 [0007] 进一步的，所述单域抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO:1～2、SEQ ID NO:4～5、SEQ ID NO:8～9以及SEQ ID NO:11所示的其中一种。 [0008] 进一步的，所述单域抗体为骆驼源的VHH。 [0009] (二)本发明提供以上所述的靶向癌胚抗原的单域抗体的构建方法，包括： [0010] S1、取免疫羊驼外周血，提取外周血淋巴细胞RNA，反转录扩增cDNA； [0011] S2、以cDNA为模板，扩增羊驼抗体VHH基因片段，将VHH基因片段与载体连接，得到重组噬菌体载体； [0012] S3、通过重组噬菌体载体构建单域抗体噬菌体文库； [0013] S4、通过癌胚抗原对所述单域抗体噬菌体文库进行淘选，得到抗CEA的阳性噬菌体。 [0014] 进一步的，所述步骤S1中，羊驼免疫的方法为： [0015] S1.1、初次免疫前采血留作阴性血清； [0016] S1.2、将完全弗氏佐剂与癌胚抗原混合乳化后对羊驼进行注射，进行初次免疫，并检测免疫效价； [0017] S1.3、将不完全弗氏佐剂与癌胚抗原混合乳化后对羊驼进行注射，进行若干次加强免疫，加强免疫间隔为两周，加强免疫后一周检测血清效价。 [0018] 进一步的，所述步骤S2中，构建单域抗体噬菌体文库的方法为： [0019] S2.1、以cDNA为模板，通过巢式PCR扩增方法扩增VHH基因片段； [0020] S2.2、通过限制性内切酶酶切连接方法，将VHH基因片段与M13噬菌体展示载体质粒连接，电转化至感受态细胞中，得到单域抗体噬菌体文库。 [0021] 进一步的，所述S4中，噬菌体文库进行淘选后，对抗CEA的阳性噬菌体进行筛选，得到与癌胚抗原亲和力高的靶向癌胚抗原的单域抗体，筛选方法为：将筛选的阳性克隆通过噬菌体展示方法表达抗体，使用ELISA方法鉴定上述阳性克隆与癌胚抗原的亲和力，筛选与癌胚抗原亲和力高的阳性克隆，并进行序列分析，得到靶向癌胚抗原的单域抗体。 [0022] (三)本发明还提供以上所述的靶向癌胚抗原的单域抗体在制备癌胚抗原检测试剂中的应用。 [0023] (四)本发明还提供以上所述的靶向癌胚抗原的单域抗体在制备癌胚抗原阳性肿瘤如结直肠癌治疗药物中的应用。 [0024] (五)本发明提供一种核酸，编码以上所述的靶向癌胚抗原的单域抗体。 [0025] (六)本发明还提供以上所述的核酸在制备针对癌胚抗原阳性肿瘤的基因治疗药物中的应用。 [0026] 本发明的有益效果： [0027] 本发明基于噬菌体展示技术，采用健康羊驼作为获取抗体的实验动物，经过免疫后获取羊驼外周血，并判定抗体的效价。将抗体基因片段构建至噬菌体展示载体上，进行电转收集噬菌体展示库，并利用抗体库能够对特异性抗体进行筛选的特性，对免疫羊驼后得到的抗体进行筛选，获得多个与癌胚抗原结合及可溶表达的抗体。通过细胞筛选，得到亲和力较好的可作为靶点的序列用于构建能靶向癌胚抗原的纳米抗体，可应用于结直肠癌的临床诊断和治疗。本发明为结直肠肿瘤的临床治疗提供潜在的纳米抗体新药，同时可为结直肠肿瘤的诊断提供相应的检测试剂。附图说明 [0028] 图1为两次采血的羊驼血清效价检测。A为对羊驼进行第三次免疫后采血的全血效价检测；B为对羊驼进行第四次免疫后采血的全血效价检测； [0029] 图2为total RNA琼脂糖凝胶检测； [0030] 图3为文库的Insert rate琼脂糖凝胶电泳检测； [0031] 图4为11个VHH抗体表达上清ELISA鉴定结果； [0032] 图5为11个VHH抗体表达上清亲和力测定结果； [0033] 图6为3个高亲和力VHH抗体的结合曲线； [0034] 图7为7个高亲和力VHH抗体的具体序列。具体实施方式： [0035] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合相关附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。 [0036] 实施例 [0037] 本实施例提供靶向癌胚抗原的单域抗体的构建方法，包括以下步骤： [0038] 1、免疫羊驼 [0039] 本项目使用一只羊驼(未免疫健康羊驼，5周岁)进行免疫，免疫过程包括抗原检测，免疫以及采血等。按照具体的目标蛋白及免疫效果，安排至少4次免疫，并根据需要判断是否追加额外免疫，免疫方法见下述： [0040] (1)初次免疫前采血10ml留作阴性血清，按照ELISA方法测试免疫效价。 [0041] (2)初免(第0天)：将250μl弗氏完全佐剂和250μl 1mg/ml癌胚抗原蛋白的体积进行1:1混合，放在注射乳化器上进行乳化，乳化约1h 20min后，检测乳化结果，形成“油包水”乳化液(或者用震荡混合器乳化)，在羊驼颈部四个点注射0.5ml的乳化液，即一只羊驼注射250μg的蛋白。初免后采血10ml，按照ELISA方法测试免疫效价。 [0042] (3)加强免疫(第14、28、42、56、63天)：将125μl弗氏不完全佐剂和125μl 1mg/ml癌胚抗原蛋白的体积进行1：1混合，放在注射乳化器上进行乳化，乳化约1h 20min后，检测乳化结果，形成“油包水”乳化液，每只羊驼注射0.25ml的乳化液，即每只羊驼注射125μg的蛋白。每次加强免疫后(第35、49、60、67天)，采血10ml，按照ELISA方法测试免疫效价。 [0043] 终免之后，通过ELISA检测抗血清效价，显示血清抗体总效价大于2187k(图1)，提示前期羊驼免疫是成功的。 [0044] 2、重组噬菌体载体的构建 [0045] 收集免疫后羊驼的外周血，利用淋巴细胞分离液(GE Ficoll‑Paque Plus)分离获得羊驼的PBMC，根据TRIzol操作手册，提取总RNA(图2)。并利用oligo(dT)反转录扩增cDNA。以cDNA为模板，通过巢式PCR扩增方法扩增羊驼抗体VHH基因片段，通过限制性内切酶酶切连接方法，将VHH基因片段与M13噬菌体展示载体质粒连接，得到重组噬菌体载体。所述巢式PCR扩增的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:12(CTGCCCAGGCCGCCATGGCC)所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:13(GATTGTGCACCGCGCCGGCCGC)所示。 [0046] PCR扩增体系及条件如下： [0047] [0048] 酶连体系如下： [0049] 试剂 用量VHH(BgLI) 500ng PhV12(SfiI+AP) 1.1μg 10*T4 ligation buffer 5μl T4 ligase 2μl ddH2O up to 50μl [0050] 3、单域抗体噬菌体文库的构建 [0051] 将重组噬菌体载体电转化至感受态细胞(SS320大肠杆菌菌株)中，得到单域抗体噬菌体文库。每个电转使用300ng连接产物，电击转化操作按照标准操作流程处理，使用的液体及固体培养基为2YT培养基(100μg/mL Ampicillin)。 [0052] 电转化完成后，从总菌液中取100μl进行10倍比梯度稀释，并将稀释后的菌液涂布固体培养基平板，通过次日的克隆计数来评估噬菌体抗体文库库容。通过菌液PCR及测序来判定文库质量(VHH插入率及有效插入率)。 [0053] 单域抗体噬菌体文库质量评价：(1)噬菌体文库库容：根据单个感受态(SS320大肠杆菌菌株)电转效率及电转总数量确定噬菌体文库库容，经检测，单域抗体噬菌体文库的库8 容为2.5*10 。(2)VHH插入率：挑选48个单菌落进行菌液PCR鉴定，VHH插入率大于95％(图 3)。(3)VHH有效插入率：随机挑选并测序45个克隆来评价文库的VHH有效插入率(in‑frame rate)，VHH有效插入率大于95％。(3)随机挑选并测序44个克隆来评价文库的多样性，测序结果显示，所测序列多样性为97.6％。 [0054] 4、噬菌体文库的淘选 [0055] 通过癌胚抗原对所述单域抗体噬菌体文库进行淘选，得到抗CEA阳性噬菌体。 [0056] 淘选过程按照标准操作流程操作：将癌胚抗原包被于氨基偶联酶标条，与噬菌体文库振荡结合1h后，用0.1M TEA洗脱结合的噬菌体，在洗脱液中立即加入1M Tris‑HCl中和。在辅助噬菌体的作用下感染细菌，经过抗生素培养，获得第一轮噬菌体文库，完成第一次淘选，将所述第一轮噬菌体文库按照第一次淘选的方法进行第二次和第三次淘选，得到富集的噬菌体文库。每一步噬菌体筛选都会设立相应空白对照，避免假阳性。 [0057] 应用噬菌体ELISA方法鉴定阳性克隆，并以此计算噬菌体文库的阳性克隆产出率。 [0058] 5、抗体的筛选及亲和力鉴定 [0059] 噬菌体文库进行淘选后，对抗CEA阳性噬菌体进行筛选，得到与癌胚抗原亲和力高的靶向癌胚抗原的单域抗体。 [0060] 所述筛选方法为：随机挑选经过淘选后的阳性克隆470个，通过噬菌体展示方法表达抗体，使用ELISA方法鉴定上述阳性克隆与癌胚抗原的亲和力，筛选与癌胚抗原亲和力高的阳性克隆，并进行序列分析，得到靶向癌胚抗原的单域抗体。 [0061] 在经过1轮筛选及表达鉴定后，共获得92个与目标蛋白结合、可溶表达并测序的sdAb序列，对这些序列挑选11个特异性强的进行载体构建及真核表达，编号为：1‑1、6‑2、13‑1、18‑1、20‑1、21‑1、23‑1、32‑1、33‑1、35‑1和53‑1，氨基酸序列依次如SEQ ID NO:1～11所示。ELSIA结果显示，21‑1、1‑1、6‑2、13‑1、18‑1、20‑1、32‑1、33‑1、35‑1和53‑1 10个单克隆sdAb均能特异性与CEA5结合，而不与CEA1、6和8结合，参见图4。 [0062] 亲和力结果显示，共获得1‑1、6‑2、18‑1、20‑1、33‑1、32‑1和53‑2 7个亲和力高的VHH抗体，参见图5和图6，序列分析结果显示，7个具有高亲和力的VHH抗体，序列各不相同(图7)，氨基酸序列对应为SEQ ID NO:1～2、SEQ ID NO:4～5、SEQ ID NO:8～9以及SEQ ID NO:11所示。 [0063] 以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。 |
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