新型抗生素肽哌珀霉素及其制备工艺

(一)技术领域

本发明涉及从木霉发酵产物中分离制备一种新型抗生素肽—哌珀霉素，属于生物技 术领域。

(二)背景技术

化学农药对人类防治病虫草鼠害做出了重要贡献，但随着化学农药的大量施用， “3R”(即抗药性Resistance，再猖獗Resurgence，农药残留Residuce)问题越来越严重， 严重影响农产品的食用安全，成为我国农产品进入国际市场的主要制约因素之一。大量 高毒、高残留、杀伤天敌的化学农药将逐渐被限制使用直至完全禁止生产是一个必然的 趋势。据联合国粮农组织(FAO)统计，世界粮食产量因病虫草鼠害造成的损失每年大 约占总产的20-35％，其中虫害14％，病害10％；棉花因虫害损失16％，因病害损失12％， 年损失额达1200亿美元，相当于中国农业总产值的1/2。因此，利用微生物防治与化学 防治相结合的方法防治植物病虫害是目前较为有效的方法。寻求新的病虫害生物防治措 施，高效防治各种植物病虫害，减少化学农药的用量，降低农产品中化学农药的残留， 是目前急需解决的生产中的难题。相对于以Bt为主的生物杀虫剂在植物虫害防治上的成 功应用，各种植物病害(真菌病、细菌病、病毒病)的防治难度更大，尽管使用大量的 化学杀菌剂，但防治效果并不理想，作物抗病育种取得了一定的效果，但还没有从根本 上解决问题。

对于人、畜禽病害的防治，特别是人、畜禽的细菌性疾病的防治过程中抗生素的大 量使用以及畜禽饲料中用于促生长的亚治疗剂量的抗生素的使用，使得主要病原菌对抗 生素的抗药性大大增强。病原细菌对抗生素的抗药性，已经引起世界范围的关注，将严 重影响细菌性疾病的治疗。因此，开发不易产生抗药性的新型的抗生素药物，已迫在眉 睫。

木霉作为一种植物病害的生防因子一直受到普遍的关注。木霉通过生境竞争、抗生 作用、产生细胞壁降解酶、诱导抗性、促进植物生长等作用来抑制植物病原菌的生长。 木霉产生的抗生素包括木霉素、胶霉素、绿木霉素和抗生素肽—哌珀霉素。哌珀霉素是 一类由非核糖体合成酶(NRPSs)合成的富含α-氨基异丁酸(Aib)、具α-螺旋结构，对 细菌、真菌等有拮抗作用的一类特殊的抗生素肽的总称。哌珀霉素主要来源于土壤真菌， 目前已经有309种哌珀霉素被发现，其中来源于木霉属(Trichoderma spp)的菌株的最 多，达183种。哌珀霉素作为一类特殊的抗生素肽具有广谱的抗微生物活性，对革兰氏 阳性菌和阴性菌、真菌都有很好的抑菌效果。对螺原体、病毒也有一定的作用效果。除 了抗微生物活性外，哌珀霉素对动物细胞表现了多种生物学活性，如促进儿茶酚的分泌、 促进血小板的聚合、免疫抑制作用等。新近的研究表明其对植物的代谢也有影响，是植 物次级代谢和卷须缠绕的潜在的诱导因子。作为真菌源的一类特殊的抗生素肽，哌珀霉 素的研究丰富了人们对抗生素肽的认识。其作用机制独特，不易使病原微生物产生抗药 性，因此极有希望开发成一类新的抗菌药物。但目前用于研究的哌珀霉素几乎都是合成 的，合成成本很高，如何大量的生产高纯度的哌珀霉素成为制约对其深入研究和应用的 难题。

(三)发明内容

本发明针对现有技术的哌珀霉素大量生产的难题，提供了一种新型抗生素肽—哌珀 霉素及其制备工艺。

本发明分离纯化的哌珀霉素是在20个氨基酸的N端是乙酰基，C端是OH，具有如 下序列：

Ac Aib Ala Aib Ala Aib Ala Gln Aib Val Aib Gly Leu Aib Pro Val Aib Aib Gln Gln Phe OH，

Ac Aib Ala Aib Ala Aib Ala Gln Aib Val Aib Gly Leu Aib Pro Val Aib Iva Gln Gln Phe OH， 或Ac Aib Ala Aib Ala Aib Aib Gln Aib Val Aib Gly Leu Aib Pro Val Aib Aib Gln Gln Phe OH。

本发明的哌珀霉素的制备方法如下：

(1)采用高产哌珀霉素的木霉菌株—康宁木霉(Trichoderma koningii SMF2)为生产 菌株，接种三角瓶液体菌种(二级菌种)，以麸皮汁为培养基，液体发酵灌发酵制备生产用 液体菌种；

(2)以玉米秸粉、小麦秸粉和麸皮为主要原料，配以硫酸铵和水，灭菌，接种步骤 (1)所得的生产用液体菌种，转入无菌的固体发酵曲池，通无菌风，厚层通风发酵制备木 霉发酵培养物；

(3)哌珀霉素的制备，将步骤(2)的木霉固体培养物，经过提取、分子筛分离、HPLC 纯化得到哌珀霉素。

下面对本发明的木霉制剂的制备方法的各步骤具体说明如下：

(1)生产用液体菌种的制备

培养基：麸皮9～11份和土豆4～6份，水100份，均为重量份，下同。煮沸，过滤， 加蛋白胨0.41～0.6份、Na2HPO4 0.4～0.5份、KH2PO4 0.03～0.04份、灭菌，冷却，接种康 宁木霉(Trichoderma koningii SMF2)的二级液体菌种，5～10份，通风搅拌，培养24～36 小时，作为生产用液体菌种待用。

(2)厚层通风发酵制备木霉发酵培养物

原料：玉米秸粉和/或小麦秸粉30～40份，麸皮60～70份，硫酸铵1～2份，均为重量 份，润水，原料∶水＝1∶2.8～3.0(重量比)，蒸球高温高压灭菌，冷却，接种步骤(1)的生 产用液体菌种5～7份(重量)，转入无菌固体发酵曲池中，通以无菌风，在25～28℃，空气 相对湿度80～85％下发酵，24～30小时翻曲一次，发酵4～5天，即得到木霉固体培养物。

该木霉固体培养物，哌珀霉素含量达到5～10mg/kg干品。

(3)哌珀霉素的制备

将木霉固体培养物按8L～10L/kg干重的量加入去离子水提取8～10hr左右，得到哌 珀霉素粗提物，经10000rpm，10min离心，旋转蒸发浓缩到原体积的1/4～1/3，得到浓缩 液。将浓缩液过Sephadex G-15分子筛柱(5.0×150cm，medium Pharmacia)，将分离到的 组分用部分收集器分别收集，测定各部分抑菌活性，将有活性的组分部分收集，进一步 用高压液相色谱分离，然后根据保留时间将哌珀霉素分别收集浓缩，得到3种高纯度的 哌珀霉素。

(4)哌珀霉素的鉴定：通过液质连用仪和氨基酸分析得到哌珀霉素的氨基酸序列组 成。

将得到的3个纯哌珀霉素用6N的HCl全水解，用氨基酸自动测序仪测定氨基酸组成， 然后用液质连用仪分析其的分子量和肽段的分布，分析得出三种哌珀霉素的氨基酸序列 分别为：Ac Aib Ala Aib Ala Aib Ala Gln Aib Val Aib Gly Leu Aib Pro Val Aib Aib Gln Gln Phe OH、Ac Aib Ala Aib Ala Aib Ala Gln Aib Val Aib Gly Leu Aib Pro Val Aib Iva Gln Gln Phe OH或Ac Aib Ala Aib Ala Aib Aib Gln Aib Val Aib Gly Leu Aib Pro Val Aib Aib Gln Gln Phe OH。

上述步骤(2)、(3)的抑菌活性测定方法采用琼脂扩散法，指示菌为茄科青枯雷尔 氏菌Ralstonia solanacearum Smith。

上述步骤(3)所用高压液相色谱柱为反相C18柱。

上述步骤(4)氨基酸分析是将肽用6N的HCl在115℃全水解22小时，同时采用氨 基酸自动测序仪进行测定。

本发明的优良效果在于选用高产抗生素哌珀霉素(peptaibols)的木霉菌株，利用液 固两相结合发酵工程技术，在GMP的无菌环境中，发酵生产木霉固体培养物。然后采用 高效的两步分离技术，得到高纯度的哌珀霉素。这三种哌珀霉素，具有广谱的抑菌活性， 对多种植物病原细菌、病原真菌、病毒以及植物根结线虫具有很好的抑制作用，可以对 多种植物病害具有防治作用。哌珀霉素对多种动物和人的病原细菌(包括革兰氏阳性和 阴性细菌)具有很好的抑制作用，并且，该类抗生素的作用机制是在细胞膜上形成离子 通道，因此，在抑菌的过程中不易形成抗药性，对于目前动物和人的多种高抗菌株的预 防和治疗具有重要的意义。

(四)附图说明

图1是实施例1步骤(3)中Sephadex G-15分子筛柱谱图，流速0.6ml/min。

图2是实施例1步骤(3)中高压液相色谱分离谱图，流速1ml/min，溶剂系统：Meoh- 水(82∶18重量比)，测定214nm，分离峰P1、P2和P3是3种高纯度的哌珀霉素。

图3a-3b是3种高纯度的哌珀霉素抑菌活性测定结果照片，出现抑菌圈的为含有活性 组分的部分。

(五)具体实施方式

实施例1：

(1)生产用液体菌种的制备

培养基：麸皮11份、土豆6份，水100份，均为重量份，下同。煮沸，过滤，加蛋 白胨0.6份、Na2HPO4 0.5份、KH2PO4 0.04份、灭菌，冷却，接种康宁木霉(Trichoderma koningii SMF2)的二级液体菌种10份，通风搅拌，培养34小时，做为生产用液体菌种待 用。

(2)厚层通风发酵制备木霉发酵培养物

原料：小麦秸粉35份，麸皮70份，硫酸铵2份，均为重量份，润水，原料∶水＝1∶ 3.0(重量比)，灭菌，冷却，接种步骤(1)的生产用液体菌种7份(重量)，转入无菌固 体发酵曲池中，通以无菌风，在25～28℃，空气相对湿度80～85％下发酵，25小时翻曲一 次，发酵4.5天，即得到木霉固体培养物。

(3)哌珀霉素的制备

将木霉固体培养物按8L～10L/10kg干重的量加入95％乙醇提取5hr左右，得到哌珀 霉素粗提物，经10000rpm，10min离心，旋转蒸发浓缩得到浓缩液。将浓缩液过Sephadex G-15分子筛柱(5.0×150cm，medium Pharmacia)，将分离到的组分用部分收集器分别收集， 测定各部分抑菌活性，将有活性的组分部分收集，进一步用反相C18柱高压液相色谱分 离，然后根据保留时间将哌珀霉素分别收集浓缩，得到3种高纯度的哌珀霉素。

(4)哌珀霉素的鉴定

将得到的3个纯哌珀霉素用6N的HCl全水解，用氨基酸自动测序仪测定氨基酸组成， 然后用液质连用仪分析其的分子量和肽段的分布，分析出三种哌珀霉素的氨基酸序列。

Ac Aib Ala Aib Ala Aib Ala Gln Aib Val Aib Gly Leu Aib Pro Val Aib Aib Gln Gln Phe OH、

Ac Aib Ala Aib Ala Aib Ala Gln Aib Val Aib Gly Leu Aib Pro Val Aib Iva Gln Gln Phe OH、Ac

Aib Ala Aib Ala Aib Aib Gln Aib Val Aib Gly Leu Aib Pro Val Aib Aib Gln Gln Phe OH。

这三种哌珀霉素，具有广谱的抑菌活性，对多种植物病原细菌、病原真菌、病毒以 及植物根结线虫具有很好的抑制作用，可以对多种植物病害具有防治作用。抑菌活性测 定采用琼脂扩散法，牛津杯：内径6±0.1mm，外径7.8±0.1mm，高度10±0.1mm，指示菌 为茄科青枯雷尔氏菌Ralstonia solanacearum Smith.。如图3a-3b所示。出现抑菌圈的为含 有活性组分的部分。

本发明实施例的哌珀霉素的外观为白色，易溶于甲醇。本发明的特点在于选用高产 抗生素哌珀霉素(peptaibols)的木霉菌株，利用液固两相结合发酵工程技术，在GMP 的无菌环境中，发酵生产木霉固体培养物。然后采用高效的两步分离技术，得到高纯度 的哌珀霉素，解决了哌珀霉素高效制备问题，鉴定了三种哌珀霉素，为其理论研究和开 发应用奠定了基础。这三种哌珀霉素，具有广谱的抑菌活性，对多种植物病原细菌、病 原真菌、病毒以及植物根结线虫具有很好的抑制作用，可以对多种植物病害具有防治作 用。哌珀霉素对多种动物和人的病原细菌(包括革兰氏阳性和阴性细菌)具有很好的抑 制作用，并且，该类抗生素的作用机制是在细胞膜上形成离子通道，因此，在抑菌的过 程中不易形成抗药性，对于目前动物和人的多种高抗菌株的预防和治疗具有重要的意义。

                                    序列表

<110>山东大学

<120>新型抗生素肽哌珀霉素及其制备工艺

<140>

<141>

<160>1

<170>Patent In3.1

<210>1

<211>20

<212>PRT

<400>1

Ac Aib Ala Aib Ala Aib Ala Gln Aib Val Aib Gly Leu Aib Pro Val Aib Aib Gln Gln Phe OH

    1               5                  10                  15                  20

<210>2

<211>20

<212>PRT

<400>2

Ac Aib Ala Aib Ala Aib Ala Gln Aib Val Aib Gly Leu Aib Pro Val Aib Iva Gln Gln Phe OH

    1               5                  10                  15                  20

<210>3

<211>20

<212>PRT

<400>3

Ac Aib Ala Aib Ala Aib Aib Gln Aib Val Aib Gly Leu Aib Pro Val Aib Aib Gln Gln Phe OH

    1               5                  10                  15                  20