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用于细胞的选择性分离或用于细胞培养的经聚合物被覆的基体

申请号 CN201880046103.8 申请日 2018-07-09 公开(公告)号 CN110914309B 公开(公告)日 2023-10-24
申请人 国立大学法人富山大学; 日产化学株式会社; 发明人 北野博巳; 中路正; 臼井友辉; 西野泰斗; 岸冈高广;
摘要 本 发明 提供在表面的至少一部分被覆有包含下述式(1a)及式(1b)表示的结构单元的 聚合物 (P1)的带配体的基体及其原材料、以及其制造方法。式中,R1、R2、X、Y、L、Q1、Q2、Q3、m1、m2及n如 权利要求 书及 说明书 中记载。#imgabs0#
权利要求

1.带配体的基体,其在表面的至少一部分被覆有包含下述式(1a)及式(1b)表示的结构单元的聚合物(P3),
1 2
式中,R 及R 各自独立地表示原子数1至5的直链烷基,X表示氢原子或碳原子数1至5‑ ‑ 1 2
的直链烷基,Y表示羧酸根阴离子(‑COO基)或磺酸根阴离子(‑SO3基),L表示配体,Q及Q各自独立地表示酯键、酰胺键、碳原子数1至10的直链或支链亚烷基或可经取代的亚苯基、或
3
者由它们的组合构成的二价基团,Q 表示包含1,2,3‑三唑环骨架的二价有机基团,m1及m2各自独立地表示1至200的整数,n各自独立地表示1至10的整数。
2.如权利要求1所述的带配体的基体,其中,所述配体选自由肽、抗体蛋白质、及低分子化合物组成的组。
3.如权利要求2所述的带配体的基体,其中,所述肽包含Gln‑Gln‑Gly‑Trp‑Phe的序列。
4.如权利要求1~3中任一项所述的基体,其用于细胞分离。
5.如权利要求1~3中任一项所述的基体,其用于细胞培养。
6.基体,其在表面的至少一部分被覆有包含下述式(1a)及式(1c)表示的结构单元的聚合物(P5),
1 2 1 2
式中,R 、R、X、Y、Q、Q 、m1、m2、及n与权利要求1相同,Z表示包含碳‑碳三键或叠氮基的基团。
7.如权利要求1~6中任一项所述的基体,其中,所述基体为皿、基板、多孔质膜、粒子或过滤器
8.组合物,其包含含有下述式(1a)及式(1c)表示的结构单元的聚合物(P5)、及溶剂
1 2 1 2
式中,R、R、X、Y、Z、Q、Q、m1、m2、及n与权利要求6相同。
9.带配体的基体的制造方法,其包括使含有碳‑碳三键或叠氮基的配体与权利要求6所述的基体接触的工序。
10.带配体的基体的制造方法,其包括下述工序:将权利要求8所述的组合物涂布于基体、制造聚合物(P5)被覆基体的工序;以及,接着使含有碳‑碳三键或叠氮基的配体与所述被覆基体接触的工序。
11.方法,使含有叠氮基或碳‑碳三键的配体与表面的至少一部分经包含下述式(1a)及式(1c)表示的结构单元的聚合物(P5)被覆的基体接触,从而对基体赋予细胞粘附性,
1 2 1 2
式中,R 、R、X、Y、Q、Q 、m1、m2、及n与权利要求1相同,Z表示包含碳‑碳三键或叠氮基的基团。
12.如权利要求4所述的基体,其从包含至少两种以上的细胞的细胞混合液中选择性地分离至少一种细胞。
13.细胞分离方法,其使用权利要求1~3中任一项所述的基体。
14.如权利要求5所述的基体,其从包含至少两种以上的细胞的细胞混合液选择性地培养至少一种细胞。
15.细胞培养方法,其使用权利要求1~3中任一项所述的基体。
16.如权利要求1所述的带配体的基体,其中,聚合物(P3)还包含下述式(1d)表示的结构单元,
3
式中,R 各自独立地表示碳原子数1至5的直链烷基,X表示氢原子或碳原子数1至5的直
4
链烷基,Q表示酯键、磷酸二酯键、酰胺键、碳原子数1至10的直链或支链亚烷基或可经取代的亚苯基、或者由它们的组合构成的二价基团,m3表示1至200的整数。
17.如权利要求6所述的基体,其中,聚合物(P5)还包含下述式(1d)表示的结构单元,
3
式中,R 各自独立地表示碳原子数1至5的直链烷基,X表示氢原子或碳原子数1至5的直
4
链烷基,Q表示酯键、磷酸二酯键、酰胺键、碳原子数1至10的直链或支链亚烷基或可经取代的亚苯基、或者由它们的组合构成的二价基团,m3表示1至200的整数。
18.如权利要求8所述的组合物,其中,聚合物(P5)还包含下述式(1d)表示的结构单元,
3
式中,R 各自独立地表示碳原子数1至5的饱和直链烷基,X表示氢原子或碳原子数1至5
4
的直链烷基,Q 表示酯键、磷酸二酯键、酰胺键、碳原子数1至10的直链或支链亚烷基或可经取代的亚苯基、或者由它们的组合构成的二价基团,m3表示1至200的整数。

说明书全文

用于细胞的选择性分离或用于细胞培养的经聚合物被覆的

基体

技术领域

[0001] 本发明涉及经包含显示细胞非粘附性的结构单元和显示细胞粘附性的结构单元的聚合物被覆的基体及其原材料、以及其制造方法。尤其涉及上述显示细胞粘附性的结构单元包含针对特定细胞作为配体发挥作用的肽、抗体蛋白质或低分子化合物的、用于细胞的选择性分离或用于细胞培养的经聚合物被覆的基体及其制造方法。

背景技术

[0002] 目前已报道了各种细胞分离方法、分离材料,其利用针对特定细胞作为配体发挥作用的肽、抗体、蛋白质或低分子化合物等,使细胞选择性地粘附,从而利用其细胞选择性。例如,报道了将淋巴毒素固定于96孔板、塑料珠等而成的载体、和使用其而使具有淋巴毒素的受体的细胞选择性地吸附于载体的方法(例如,参见专利文献1)。
[0003] 另外,报道了细胞的分离方法,其特征在于包括下述工序:通过使单克隆抗体或多克隆抗体等与含有羧基的分子量10000以下的化合物以共价键键合而得到修饰抗体的工序,所述单克隆抗体或多克隆抗体等具有与在分离的细胞表面表达的抗原的结合性;使含有目标细胞的细胞悬浮液等与修饰抗体反应而使修饰抗体与目标细胞结合的工序;通过将得到的结合有修饰抗体的细胞液与在表面含有基或亚氨基的非溶性载体进行处理来
使目标细胞与载体结合,从而除去其他细胞等的工序;和利用适当的方法仅使目标细胞从上述载体解离的工序(例如,参见专利文献2)。在所述分离方法中,作为用于将结合有修饰抗体的细胞回收的、在表面含有氨基或亚氨基的非水溶性载体,具体而言,使用了使聚乙二醇二丙烯酸酯和聚乙烯亚胺含浸于无纺布、并通过电子射线照射使其接枝而得到的载体。
[0004] 此外,报道了:细胞选择过滤器,其特征在于,将肽或蛋白质固定于由平均纤维直径为1μm以上且100μm以下的纤维形成的无纺布而成,所述无纺布至少具有芳香族环及/或聚烯链,并在该芳香族环及/或聚烯烃链中在羰基的α位碳及/或位于β位的碳上键合有至少两个以上的卤素或类卤素取代基,所述肽或蛋白质具有下述氨基酸序列,所述氨基酸序列可形成构成细胞中特有的重链或轻链的可变区域的氨基酸序列中的互补性决定区域(例如,参见专利文献3);等等。
[0005] 现有技术文献
[0006] 专利文献
[0007] 专利文献1:日本特开平6‑32800号公报
[0008] 专利文献2:日本特开平7‑113799号公报
[0009] 专利文献3:日本特开平8‑201384号公报

发明内容

[0010] 发明要解决的课题
[0011] 然而,上述现有技术存在下述问题:配体向基体(珠、板、过滤器等)的固定化不充分;或者因细胞对担载有配体的化合物(聚合物)、基材自身的非特异性粘附而损害配体的细胞选择性。
[0012] 用于解决课题的手段
[0013] 目前为止,本申请发明人针对与基体的粘接性优异、并且具有抑制细胞等生物材料附着的能的涂覆材料反复进行了研究。而且,在现有见解的基础上发现,经包含显示细胞非粘附性的结构单元及显示细胞粘附性的结构单元的聚合物被覆的基体不会因细胞对聚合物、基材自身的非特异性粘附而损害细胞选择性,能发挥优异的细胞选择性培养能力及分离能力,从而完成了本发明。
[0014] 即,本发明如下所述。
[0015] [1]带配体的基体,其在表面的至少一部分被覆有包含下述式(1a)及式(1b)表示的结构单元的聚合物(P3)。
[0016] [化学式1]
[0017]
[0018] [式中,R1及R2各自独立地表示碳原子数1至5的直链烷基,X表示氢原子或碳原子数‑ ‑ 11至5的直链烷基,Y表示羧酸根阴离子(‑COO基)或磺酸根阴离子(‑SO3基),L表示配体,Q
2
及Q各自独立地表示酯键、磷酸二酯键、酰胺键、碳原子数1至10的直链或支链亚烷基或可
3
经取代的亚苯基、或者由它们的组合构成的二价基团,Q 表示包含1,2,3‑三唑环骨架的二价有机基团,m1及m2各自独立地表示1至200的整数,n各自独立地表示1至10的整数。]
[0019] [2]带配体的基体,其表面的至少一部分经包含显示细胞非粘附性的结构单元和含有配体的结构单元的聚合物(P2)被覆。
[0020] [3]如上述[1]或[2]所述的带配体的基体,其中,上述配体选自由肽、抗体、蛋白质、及低分子化合物组成的组。
[0021] [4]如上述[3]所述的带配体的基体,其中,上述肽包含Gln‑Gln‑Gly‑Trp‑Phe的序列。
[0022] [5]基体,其表面的至少一部分经包含显示细胞非粘附性的结构单元和显示细胞粘附性的结构单元的聚合物(P1)被覆。
[0023] [6]如上述[1]~[5]中任一项所述的基体,其用于细胞分离。
[0024] [7]如上述[1]~[5]中任一项所述的基体,其用于细胞培养。
[0025] [8]基体,其表面的至少一部分经包含显示细胞非粘附性的结构单元和含有碳‑碳三键或叠氮基的结构单元的聚合物(P4)被覆。
[0026] [9]基体,其在表面的至少一部分被覆有包含下述式(1a)及式(1c)表示的结构单元的聚合物(P5)。
[0027] [化学式2]
[0028]
[0029] (式中,R1、R2、X、Y、Q1、Q2、m1、m2、及n与上述[1]相同,Z表示包含碳‑碳三键或叠氮基的基团。)
[0030] [10]如上述[1]~[9]中任一项所述的基体,其中,上述基体为皿、基板、多孔质膜、粒子或过滤器。
[0031] [11]组合物,其包含含有下述式(1a)及式(1c)表示的结构单元的聚合物(P5)、及溶剂
[0032] [化学式3]
[0033]
[0034] (式中,R1、R2、X、Y、Z、Q1、Q2、m1、m2、及n与上述[9]相同。)
[0035] [12]带配体的基体的制造方法,其包括使含有碳‑碳三键或叠氮基的配体与上述[8]或[9]所述的基体接触的工序。
[0036] [13]带配体的基体的制造方法,其包括下述工序:将上述[11]所述的组合物涂布于基体、制造聚合物(P5)被覆基体的工序;以及,接着使含有碳‑碳三键或叠氮基的配体与上述被覆基体接触的工序。
[0037] [14]方法,使含有叠氮基或碳‑碳三键的配体与表面的至少一部分经包含显示细胞非粘附性的结构单元和含有碳‑碳三键或叠氮基的结构单元的聚合物(P4)被覆的基体接触,从而对基体赋予细胞粘附性。
[0038] [15]如上述[6]所述的基体,其从包含至少两种以上的细胞的细胞混合液中选择性地分离至少一种细胞。
[0039] [16]细胞分离方法,其使用上述[1]~[5]中任一项所述的基体。
[0040] [17]如上述[7]所述的基体,其从包含至少两种以上的细胞的细胞混合液选择性地培养至少一种细胞。
[0041] [18]细胞培养方法,其使用上述[1]~[5]中任一项所述的基体。
[0042] [19]如上述[1]所述的带配体的基体,其中,聚合物(P3)还包含下述式(1d)表示的结构单元。
[0043] [化学式4]
[0044]
[0045] (式中,R3各自独立地表示碳原子数1至5的直链烷基,X表示氢原子或碳原子数1至4
5的直链烷基,Q表示酯键、磷酸二酯键、酰胺键、碳原子数1至10的直链或支链亚烷基或可经取代的亚苯基、或者由它们的组合构成的二价基团,m3表示1至200的整数。)
[0046] [20]如上述[9]所述的基体,其中,聚合物(P5)还包含下述式(1d)表示的结构单元。
[0047] [化学式5]
[0048]
[0049] (式中,R3各自独立地表示碳原子数1至5的直链烷基,X表示氢原子或碳原子数1至4
5的直链烷基,Q表示酯键、磷酸二酯键、酰胺键、碳原子数1至10的直链或支链亚烷基或可经取代的亚苯基、或者由它们的组合构成的二价基团,m3表示1至200的整数。)
[0050] [21]如上述[11]所述的组合物,其中,聚合物(P5)还包含下述式(1d)表示的结构单元。
[0051] [化学式6]
[0052]
[0053] (式中,R3各自独立地表示碳原子数1至5的饱和直链烷基,X表示氢原子或碳原子4
数1至5的直链烷基,Q表示酯键、磷酸二酯键、酰胺键、碳原子数1至10的直链或支链亚烷基或可经取代的亚苯基、或者由它们的组合构成的二价基团,m3表示1至200的整数。)
[0054] 发明的效果
[0055] 本发明的经包含显示细胞非粘附性的结构单元和显示细胞粘附性的结构单元的聚合物被覆的基体不会因细胞对聚合物、基体自身的非特异性粘附而损害细胞选择性,能发挥优异的细胞选择性培养能力及分离能力。特别地,就经上述显示细胞粘附性的结构单元包含针对特定细胞作为配体发挥作用的肽、抗体、蛋白质或低分子化合物的聚合物被覆的基体而言,通过具有显示细胞非粘附性的结构单元,从而聚合物与基体的粘接性优异,并且除了配体部分以外使聚合物、基体自身为细胞非粘附性,因此不会损害配体的细胞选择性,能够发挥优异的细胞选择性培养能力及细胞分离能力。
附图说明
[0056] [图1]示出合成例1中制作的肽1~3的利用圆偏光二色性(CD)光谱法得到的CD光谱。实线为肽1,虚线为肽2,长虚线为肽3。
[0057] [图2]示出实施例4的细胞选择性评价所附的、实施例1的被覆有未担载肽的聚合物的玻璃基板的光学显微镜照片。(A)为使用了人骨髓间充质系干细胞(hMSC)的结果;(B)为使用了来自人胚胎干细胞的神经祖细胞(hNPC)的结果;(C)为使用了来自人胎儿肾脏的细胞(HEK293细胞)的结果;及(D)为使用了来自小鼠的成纤维细胞(3T3细胞)的结果。
[0058] [图3]示出实施例4的细胞选择性评价所附的、实施例2的被覆有担载了肽的聚合物的玻璃基板的光学显微镜照片。(A)为使用了人骨髓间充质系干细胞(hMSC)的结果;(B)为使用了来自人胚胎干细胞的神经祖细胞(hNPC)的结果;(C)为使用了来自人胎儿肾脏的细胞(HEK293细胞)的结果;及(D)为使用了来自小鼠的成纤维细胞(3T3细胞)的结果。
[0059] [图4]示出了实施例4的细胞(3T3细胞)选择性评价所附的、实施例2的被覆有担载了肽的聚合物的玻璃基板的流式细胞术的结果。
[0060] [图5]示出了实施例5的细胞(hMSC)捕获速度的评价所附的、被覆有担载了肽的聚合物的玻璃基板表面(实施例2)及被覆有未担载肽的聚合物的玻璃基板表面(实施例1)的光学显微镜照片。从上排的左起,为在被覆有担载了肽的聚合物的玻璃基板表面(实施例2)接种细胞并培养5分钟、15分钟及30分钟后的光学显微镜照片,从下排的左起,为在被覆有未担载肽的聚合物的玻璃基板表面(实施例1)接种细胞并培养5分钟、15分钟及30分钟后的光学显微镜照片。
[0061] [图6]示出实施例5的细胞(hMSC)捕获速度的评价所附的、(A)对在被覆有担载了肽的聚合物的玻璃基板(实施例2)的表面粘附的细胞数进行计数的结果、和(B)被覆有担载了肽的聚合物的玻璃基板(实施例2)的流式细胞术的结果。
[0062] [图7]示出实施例5的从hMSC及HEK293细胞的细胞混合物捕获hMSC的速度的评价所附的、(A)对在被覆有担载了肽的聚合物的玻璃基板(实施例2)的表面粘附的细胞数进行计数的结果、和(B)被覆有担载了肽的聚合物的玻璃基板(实施例2)的流式细胞术的结果。
[0063] [图8]为实施例8中利用(A)水(液滴)接触测定及(B)气泡接触角测定对实施例6中得到的经未担载肽的聚合物修饰的表面、和实施例7中得到的经担载了肽1的聚合物修饰的表面的润湿性进行评价、并示出其结果的坐标图。需要说明的是,前者的结果以黑色长条示出,后者的结果以灰色长条示出。
[0064] [图9]为实施例9中利用全反射红外光谱测定对实施例6中得到的经未担载肽的聚合物(CMB:PGMA:MPTMS的组成比=70:20:10)修饰的玻璃表面、和实施例7中得到的经担载了肽1的聚合物(CMB:PGMA:MPTMS的组成比=70:20:10)修饰的玻璃表面进行评价而得到的光谱。需要说明的是,前者的光谱以实线示出,后者的光谱以虚线示出。
[0065] [图10]为实施例10中利用椭圆偏振测定对实施例6中得到的经未担载肽的聚合物修饰的表面、和实施例7中得到的经担载了肽1的聚合物修饰的表面的膜厚进行评价、并示出其结果的坐标图。需要说明的是,前者的结果以黑色长条表示,后者的结果以灰色长条表示。
[0066] [图11]为实施例11中利用微量BCA法对肽1在实施例7中得到的经各种担载了肽的聚合物修饰的表面上的担载量进行定量、并示出其结果的坐标图。
[0067] [图12]是为了评价蛋白质是否对玻璃基板、实施例6中得到的经未担载肽的聚合物修饰的表面、及实施例7中得到的经担载了肽1的聚合物修饰的表面进行非特异吸附,在实施例12中利用微量BCA测定对血清蛋白质的吸附量进行定量,并示出其结果的坐标图。需要说明的是,玻璃基板的结果以白色长条示出,经未担载肽的聚合物修饰的表面的结果以黑色长条示出,此外,经担载了肽1的聚合物修饰的表面的结果以灰色长条示出。
[0068] [图13]为实施例13中在经各种未担载肽的聚合物修饰的表面及经各种担载了肽1(CD44BP)的聚合物修饰的表面上接种NIH3T3细胞后的相位差显微镜照片。
[0069] [图14]为实施例13中在经各种未担载肽的聚合物修饰的表面及经各种担载了肽1(CD44BP)的聚合物修饰的表面上接种HEK293细胞后的相位差显微镜照片。
[0070] [图15]为实施例13中在经各种未担载肽的聚合物修饰的表面及经各种担载了肽1(CD44BP)的聚合物修饰的表面上接种MSC后的相位差显微镜照片。
[0071] [图16]为示出实施例13中对经各种未担载肽的聚合物修饰的表面(‑)及经各种担载了肽1的聚合物修饰的表面(+)上所捕获的各种细胞数(n=3)进行定量的结果的坐标图。需要说明的是,NIH3T3细胞的结果以淡灰色长条示出,HEK293细胞的结果以深灰色长条示出,人MSC的结果以黑色长条示出。

具体实施方式

[0072] 《术语的说明》
[0073] 只要没有其他特别说明,本发明中使用的术语具有以下的定义。
[0074] 本发明中,“卤原子”是指氟原子、氯原子、溴原子或碘原子。
[0075] 本发明中,“烷基”是指非环式或环式的饱和脂肪族烃的一价基团。作为“碳原子数1至5的直链或支链烷基”,例如可举出甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、1‑甲基丁基、2‑甲基丁基、3‑甲基丁基、1,1‑二甲基丙基、1,2‑二甲基丙基、
2,2‑二甲基丙基或1‑乙基丙基。其中,“碳原子数1至5的直链烷基”为甲基、乙基、正丙基、正丁基或正戊基。
[0076] 本发明中,“炔基”是指直链或支链的含有至少一个碳‑碳三键的不饱和脂肪族烃的一价基团。作为“碳原子数2至5的炔基”,例如可举出乙炔基、炔丙基、3‑丁炔基或4‑戊炔基。
[0077] 本发明中,“酯键”是指‑C(=O)‑O‑或‑O‑C(=O)‑,“磷酸二酯键”是指‑O‑P(=O)(‑‑O)‑O‑,“酰胺键”是指‑NHC(=O)‑或‑C(=O)NH‑,“醚键”是指‑O‑,“氨基键”是指‑NH‑,“羰基键”是指‑C(=O)‑基,“硫醚键”是指‑S‑。
[0078] 本发明中,“可经取代的亚苯基”是指“亚苯基”或“经取代的亚苯基”。作为“亚苯基”,可举出1,4‑亚苯基、1,3‑亚苯基或1,2‑亚苯基,其中,优选1,4‑亚苯基。“经取代的亚苯基”可举出经选自卤素原子、碳原子数1至5的直链或支链烷基等中的至少一个取代基取代的1,4‑亚苯基、1,3‑亚苯基或1,2‑亚苯基。
[0079] 本发明中,“亚烷基”是指直链或支链的饱和脂肪族烃的二价基团。作为“碳原子数1至10的直链或支链亚烷基”的例子,可举出亚甲基、亚乙基、1,2‑亚丙基(propylene group)、1,3‑亚丙基(trimethylene group)、1,4‑亚丁基、1‑甲基‑1,2‑亚丙基、2‑甲基‑1,
2‑亚丙基、二甲基亚乙基、乙基亚乙基、1,5‑亚戊基、1‑甲基‑1,4‑亚丁基、2‑甲基‑1,4‑亚丁基、1,1‑二甲基‑1,3‑亚丙基、1,2‑二甲基‑1,3‑亚丙基、2,2‑二甲基‑1,3‑亚丙基、1‑乙基‑
1,3‑亚丙基、1,6‑亚己基、1,8‑亚辛基及1,10‑亚癸基等,这些中,优选亚乙基、1,2‑亚丙基、
1,8‑亚辛基及1,10‑亚癸基,更优选例如亚乙基、1,2‑亚丙基、1,3‑亚丙基、1,4‑亚丁基等碳原子数1~5的直链或支链亚烷基,尤其优选亚乙基或1,2‑亚丙基。
[0080] 本发明中,(甲基)丙烯酸酯化合物是指丙烯酸酯化合物和甲基丙烯酸酯化合物两者。例如(甲基)丙烯酸是指丙烯酸和甲基丙烯酸。
[0081] 本发明中,作为细胞,例如,可举出成纤维细胞、骨髓细胞、Β淋巴细胞、Τ淋巴细胞、嗜中性粒细胞、红细胞、血小板、巨噬细胞、单核细胞、骨细胞、骨髓细胞、周皮细胞、树突状细胞、角质化细胞、脂肪细胞、间充质细胞、上皮细胞、表皮细胞、内皮细胞、血管内皮细胞、肝实质细胞、软骨细胞、卵丘细胞、神经细胞、神经胶质细胞、神经元、少突胶质细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞、心脏细胞、食道细胞、肌肉细胞(例如,平滑肌细胞或骨骼肌细胞)、胰岛β细胞、黑素细胞、定向造血干细胞、单核细胞、胚胎干细胞(ES细胞)、胚胎肿瘤细胞、胚胎生殖干细胞、诱导多能干细胞(iPS细胞)、神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、肝干细胞、胰干细胞、肌干细胞、生殖干细胞、肠干细胞、癌干细胞、毛囊干细胞、巨核细胞、CD34阳性的源自脊髓的巨核细胞及各种细胞株(例如,HCT116、Huh7、HEK293(人源胚胎肾细胞)、HeLa(人宫颈癌细胞株)、HepG2(人肝癌细胞株)、UT7/TPO(人白血病细胞株)、CHO(中国仓鼠卵巢细胞株)、MDCK、MDBK、BHK、C‑33A、HT‑29、AE‑1、3D9、Ns0/1、Jurkat、NIH3T3、PC12、S2、Sf9、Sf21、High Five、Vero)等,这些之中,优选间充质系干细胞。
[0082] 所谓细胞粘附性,通常是指:促进细胞粘附的蛋白质(例如,纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白等)吸附于任意基材,该吸附蛋白质与细胞膜上的整合素受体相互作用所产生的粘附;存在于细胞膜上的受体之一的粘蛋白彼此相互作用而在细胞间产生的粘附。然而,本发明中的细胞粘附性与通常的细胞粘附性稍许不同,是指通过预先将与特异性表达的细胞膜上的受体相互作用的配体固定于基材、并使其与特定的细胞的膜上存在的受体相互作用来捕获细胞。
[0083] 另一方面,所谓细胞非粘附性,是指细胞对基材无响应·相互作用,本发明中也同样。通常的话,这样的基材表面大多也不吸附蛋白质。其原因在于,就大部分的细胞粘附而言,在细胞‑基材间的粘附中,为介由吸附于基材上的蛋白质的整合素依赖粘附。因此,就细胞非粘附性的基材构筑而言,可以说必须向基材表面赋予不响应于生物材料的功能。
[0084] 《本发明的说明》
[0085] 本发明涉及表面的至少一部分经包含显示细胞非粘附性的结构单元和显示细胞粘附性的结构单元的聚合物(P1)被覆的基体。基体只要是在至少一部分的表面具备至少
1500nm以下、优选10~1300nm、更优选10~1100nm、进一步优选10~1000nm、尤其优选10~
500nm的膜厚的涂覆膜的基体则没有特别限制,优选在该基体的总表面积的10%以上具备涂覆膜,更优选为20%以上,进一步优选为30%以上,尤其优选为40%以上,最优选为50%以上。例如,为平板状基体的情况下,优选在一个表面的总表面积的10%以上具备涂覆膜,更优选为30%以上,进一步优选为50%以上,最优选为80%以上。
[0086] 本发明的实施方式中,作为能够衍生出聚合物所包含的显示细胞非粘附性的结构单元的单体的例子,可举出烯键式不饱和单体。作为烯键式不饱和单体的例子,可举出选自由(甲基)丙烯酸及其酯;乙酸乙烯酯;乙烯基吡咯烷;乙烯;乙烯醇;以及它们的亲水性的官能性衍生物组成的组中的一种或两种以上的烯键式不饱和单体。
[0087] 作为亲水性的官能性衍生物的亲水性官能性基团的例子,可举出磷酸、膦酸及它们的酯结构;甜菜结构;酰胺结构;亚烷基二醇残基;氨基;以及亚磺酰基等。
[0088] 此处,磷酸及其酯结构是指下述式表示的基团,
[0089] [化学式7]
[0090]
[0091] [此处,R11、R12及R13彼此独立地为氢原子或有机基团(例如,碳原子数1至5的直链或支链烷基等)],
[0092] 膦酸及其酯结构是指下述式表示的基团,
[0093] [化学式8]
[0094]
[0095] [此处,R14及R15彼此独立地为氢原子或有机基团(例如,碳原子数1至5的直链或支链烷基等)]。
[0096] 作为具有这样结构的烯键式不饱和单体的例子,可举出(甲基)丙烯酸(酸式磷酰基)乙酯(acid phosphoxy ethyl(meth)acrylate)、乙烯基膦酸等。
[0097] 甜菜碱结构是指具有季铵型的阳离子结构和酸性的阴离子结构的两性中心的化合物的一价或二价基团,例如,可举出磷酰胆碱基:
[0098] [化学式9]
[0099] 。
[0100] 作为具有这样结构的烯键式不饱和单体的例子,可举出2‑甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱(MPC)等。
[0101] 酰胺结构是指下述式表示的基团,
[0102] [化学式10]
[0103]
[0104] [此处,R16、R17及R18彼此独立地为氢原子或有机基团(例如,甲基、羟甲基或羟乙基等)]。
[0105] 作为具有这样结构的烯键式不饱和单体的例子,可举出(甲基)丙烯酰胺、N‑(羟甲基)(甲基)丙烯酰胺等。此外,具有这样结构的单体公开于例如日本特开2010‑169604号公报等中。
[0106] 亚烷基二醇残基是指亚烷基二醇(HO‑Alk‑OH;此处,Alk为碳原子数1至10的直链或支链亚烷基)的一侧末端或两末端的羟基与其他化合物进行缩合反应后残留的亚烷基氧基(‑Alk‑O‑),也包括重复亚烷基氧基单元而成的聚(亚烷基氧基)基团。作为具有这样结构的烯键式不饱和单体的例子,可举出(甲基)丙烯酸2‑羟基乙酯、甲氧基聚乙二醇(甲基)丙烯酸酯等。此外,具有这样结构的单体公开于例如日本特开2008‑533489号公报等中。
[0107] 氨基是指式‑NH2、‑NHR19或‑NR20R21[此处,R19、R20及R21彼此独立地为有机基团(例如,碳原子数1至5的直链或支链烷基等)]表示的基团。本说明书中的氨基包括季铵化或氯化的氨基。作为具有这样结构的烯键式不饱和单体的例子,可举出(甲基)丙烯酸二甲基氨基乙酯、(甲基)丙烯酸2‑(叔丁基氨基)乙酯、甲基丙烯酰基胆碱氯化物(methacroylcholine chloride)等。
[0108] 亚磺酰基是指下述式表示的基团,
[0109] [化学式11]
[0110]
[0111] [此处,R22为有机基团(例如,碳原子数1至10的有机基团,优选为具有1个以上羟基的碳原子数1至10的烷基等)]。
[0112] 作为具有这样的结构的聚合物,可举出日本特开2014‑48278号公报等公开的共聚物。
[0113] 本发明的实施方式中,作为显示细胞非粘附性的结构单元,优选下述式(1a)表示的结构单元。
[0114] [化学式12]
[0115]
[0116] 式中,R1及R2各自独立地表示碳原子数1至5的直链烷基,X表示氢原子或碳原子数1‑ ‑ 1至5的直链烷基,Y表示羧酸根阴离子(‑COO 基)或磺酸根阴离子(‑SO3基),Q 表示酯键、磷酸二酯键、酰胺键、碳原子数1至10的直链或支链亚烷基或可经取代的亚苯基、或者由它们的组合构成的二价基团,m1表示1至200的整数,n表示1至10的整数。
[0117] 其中,优选为R1及R2各自独立地表示甲基或乙基,X表示氢原子或甲基,Y表示羧酸‑ ‑ 1根阴离子(‑COO 基)或磺酸根阴离子(‑SO3基),Q 表示酯键、酰胺键、碳原子数1至10的直链或支链亚烷基、或者由它们的组合构成的二价基团,m1表示1至200的整数,n表示1至10的整
1 2
数的上述式(1a)表示的结构单元;更优选为R及R 表示甲基,X表示氢原子或甲基,Y表示羧‑ 1 1 1
酸根阴离子(‑COO 基),Q 表示‑C(=O)‑O‑、‑Alk ‑或‑C(=O)‑O‑Alk‑,m1表示1至200的整
1
数,n表示1至10的整数的上述式(1a)表示的结构单元。需要说明的是,Alk为碳原子数1至
10的直链或支链亚烷基,优选为碳原子数1至5的直链或支链亚烷基,更优选为亚甲基、亚乙基或1,2‑亚丙基。
[0118] 作为可衍生出上述式(1a)表示的结构单元的单体,例如,可举出N‑甲基丙烯酰氧基乙基‑N,N‑二甲基铵‑α,N‑甲基羧基甜菜碱等。
[0119] 本发明的实施方式中,聚合物中包含的显示细胞粘附性的结构单元优选为含有配体的结构单元。即,将基体的表面的至少一部分被覆的聚合物优选为包含显示细胞非粘附性的结构单元和含有配体的结构单元的聚合物(P2)。
[0120] 本发明的实施方式中,显示细胞粘附性的结构单元更优选为下述式(1b)表示的结构单元。因此,将基体的表面的至少一部分被覆的聚合物优选为包含上述式(1a)表示的结构单元、和下述式(1b)表示的结构单元的聚合物(P3)。
[0121] [化学式13]
[0122]
[0123] 式中,X表示氢原子或碳原子数1至5的直链烷基,L表示配体,Q2表示酯键、磷酸二酯键、酰胺键、碳原子数1至10的直链或支链亚烷基或可经取代的亚苯基、或者由它们的组3
合构成的二价基团,Q表示包含1,2,3‑三唑环骨架的二价有机基团,m2表示1至200的整数,n表示1至10的整数。
[0124] 其中,优选为X表示氢原子或甲基,L表示配体,Q2表示酯键或酰胺键,Q3表示包含下述式(2a)或(2b)所示的结构的二价基团,m2表示1至200的整数,n表示1至10的整数的上述式(1b)表示的结构单元。
[0125] [化学式14]
[0126]
[0127] 特别地,更优选为X表示氢原子或甲基,L表示配体,Q2表示酯键或酰胺键,Q3表示下述式(2a‑1)、(2a‑2)、(2b‑1)或(2b‑2)的上述式(1b)表示的结构单元,
[0128] [化学式15]
[0129]
[0130] (式中,S1及S2表示通过叠氮‑炔环加成反应衍生的二价基团)。
[0131] 本发明的实施方式中,作为上述式(1b)表示的结构单元,更优选下述式(1b‑1)至(1b‑4)表示的结构单元。
[0132] [化学式16]
[0133]
[0134] 式中,X表示氢原子或碳原子数1至5的直链烷基,L表示配体,Q2表示酯键、磷酸二酯键、酰胺键、碳原子数1至10的直链或支链亚烷基或可经取代的亚苯基、或者由它们的组1 2
合构成的二价基团,S 及S各自独立地表示单键、酯键、酰胺键、醚键、氨基键、羰基键、硫醚键、碳原子数1至5的直链或支链亚烷基、或者由它们的组合构成的二价基团,m2表示1至200的整数,n表示1至10的整数。
[0135] 其中,更优选为X表示氢原子或甲基,L表示配体,Q2表示酯键或酰胺键,S1及S2各自独立地表示单键、酯键或碳原子数1至5的直链或支链亚烷基,m2表示1至200的整数,n表示1至10的整数的上述式(1b‑1)至(1b‑4)表示的结构单元;进一步优选为上述式(1b‑1)或(1b‑2)表示的结构单元;尤其优选为上述式(1b‑1)表示的结构单元。
[0136] 本发明的实施方式中,配体选自由肽、抗体、蛋白质、及低分子化合物组成的组。例如,可举出肽激素(例如,胰岛素)、神经肽等肽;IgG、IgA、IgM等各种抗体;纤维蛋白原、血清白蛋白(BSA)、卵白白蛋白、人白蛋白、各种球蛋白、血清γ‑球蛋白、β‑脂蛋白质、溶菌酶、纤连蛋白、胃蛋白酶、组蛋白、胶原蛋白、各种凝集素等蛋白质;糖(例如,葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖)、核苷、核苷酸等低分子化合物。
[0137] 本发明的实施方式中,配体优选为肽,
[0138] 更优选为包含Gln‑Gln‑Gly‑Trp‑Phe‑Pro(序列号1)或Phe‑Asp‑Ala‑Ile‑Ala‑Glu‑Ile‑Gly‑Asn‑Gln‑Leu‑Tyr‑Leu‑Phe‑Lys‑Asp‑Gly‑Lys‑Tyr‑Trp(序列2)的序列的肽。
[0139] 即,本发明的实施方式中,将基体的表面的至少一部分被覆的聚合物(P3)为含有下述式(1a)及式(1b)表示的结构单元的聚合物,
[0140] [化学式17]
[0141]
[0142] (式中,R1、R2、X、Y、L、Q1、Q2、Q3、m1、m2及n如上所述),
[0143] 尤其优选为含有下述式(1a)及式(1b‑1)表示的结构单元的聚合物,
[0144] [化学式18]
[0145]
[0146] (式中,R1、R2、X、Y、L、Q1、Q2、S1、S2、m1、m2及n如上所述)。
[0147] 本申请的聚合物(P3)可以还含有下述式(1d)表示的结构单元。含有该结构单元的聚合物可期待对尤其是表面具有羟基的基体(例如,玻璃基板)赋予密合性。
[0148] [化学式19]
[0149]
[0150] 式中,R3各自独立地表示碳原子数1至5的直链烷基,X表示氢原子或碳原子数1至54
的直链烷基,Q 表示酯键、磷酸二酯键、酰胺键、碳原子数1至10的直链或支链亚烷基或可经取代的亚苯基、或者由它们的组合构成的二价基团,m3表示1至200的整数。
[0151] 本发明的实施方式中,作为上述式(1d)表示的结构单元,优选下述式(1d‑1)表示的结构单元。
[0152] [化学式20]
[0153]
[0154] 式中,R3、X及m3如上述式(1d)中的定义。
[0155] 作为可衍生出上述式(1d)表示的结构单元的单体,例如,可举出对苯乙烯基三甲氧基烷等含有亚苯基的单体、3‑(甲基)丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷、4‑(甲基)丙烯酰氧基丙基三乙氧基硅烷、3‑(甲基)丙烯酰氧基丙基三异丙氧基硅烷等包含由酯键和碳原子数1至10的直链或支链亚烷基构成的二价基团的单体。
[0156] 本发明的实施方式中,聚合物(P1)至(P3)可以在不损害本发明目的的范围内,除包含显示细胞非粘附性的结构单元(例如,上述式(1a)表示的结构单元)和显示细胞粘附性的结构单元(例如,上述式(1b)表示的结构单元)外,还包含例如上述式(1d)表示的结构单元这样的任意结构单元。聚合物(P1)至(P3)的分子量为数千至数百万左右即可,优选为5,000至5,000,000。更优选为5,000至2,000,000,进一步优选为5,000至1,000,000。另外,聚合物(P1)至(P3)中的各结构单元的排列没有特别限制,聚合物(P1)至(P3)可以为无规、嵌段、交替及/或接枝共聚物中的任意。就聚合物(P1)至(P3)中的显示细胞非粘附性的结构单元的比例、尤其是聚合物(P3)中的式(1a)表示的结构单元的比例而言,以全部结构单元为基准,为3摩尔%至80摩尔%。需要说明的是,聚合物(P3)可以含有两种以上的式(1a)表示的结构单元。
[0157] 就聚合物(P1)至(P3)中的显示细胞粘附性的结构单元的比例、尤其是聚合物(P3)中的式(1b)表示的结构单元的比例而言,以全部结构单元为基准,为3摩尔%至80摩尔%。需要说明的是,聚合物(P3)可以含有两种以上的式(1b)表示的结构单元。
[0158] 作为可衍生出聚合物(P1)至(P3)中可包含的任意结构单元(除上述式(1d)表示的结构单元外)的单体,可举出(甲基)丙烯酸、(甲基)丙烯酸酯化合物、(甲基)丙烯酰胺化合物、乙烯基化合物、苯乙烯化合物、来酰亚胺化合物、马来酸酐、(甲基)丙烯腈等,具体而言,可举出丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸异丙酯、丙烯酸叔丁酯、丙烯酸异丁酯、丙烯酸正己酯、丙烯酸环己酯、丙烯酸苄酯、丙烯酸苯酯、丙烯酸烯丙酯等丙烯酸酯化合物、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸异丙酯、甲基丙烯酸叔丁酯、丙烯酸异丁酯、甲基丙烯酸正己酯、甲基丙烯酸环己酯、甲基丙烯酸苄酯、甲基丙烯酸苯酯、甲基丙烯酸烯丙酯等甲基丙烯酸酯化合物、N‑甲基丙烯酰胺、N‑乙基丙烯酰胺、N‑苄基丙烯酰胺、N‑苯基丙烯酰胺等丙烯酰胺化合物、甲基丙烯酰胺、N‑甲基甲基丙烯酰胺、N‑乙基甲基丙烯酰胺、N‑苄基甲基丙烯酰胺、N‑苯基甲基丙烯酰胺等甲基丙烯酰胺化合物、乙基乙烯基醚、苄基乙烯基醚、乙酸乙烯酯等乙烯基化合物、苯乙烯、甲氧基苯乙烯等苯乙烯化合物、马来酰亚胺、N‑甲基马来酰亚胺、N‑苯基马来酰亚胺、N‑环己基马来酰亚胺等马来酰亚胺化合物。
[0159] 本发明的实施方式中,表面的至少一部分经上述聚合物(P1)至(P3)被覆的基体能够用于细胞分离及培养。
[0160] 另外,本发明的基体能够作为能从包含至少两种以上的细胞的细胞混合液中选择性地分离至少一种细胞的基体使用。
[0161] 细胞混合液只要是包含至少两种以上的细胞的液体则没有特别限定,例如可举出血液、分化诱导后的细胞群、未分化维持培养的干细胞中包含的进行了无序分化的细胞的混合液、hMSC的HEK293细胞的混合液等。
[0162] 优选能够从不同的三种细胞中选择性地分离一种或两种细胞,进一步优选能够从不同的两种细胞中选择性地分离一种细胞。
[0163] 例如,能够将想要从混合液中分离的细胞按优选的顺序以接种量的90质量%以上、70质量%以上、50质量%以上、30质量%以上、10质量%以上的比例分离。
[0164] 本发明的实施方式中,表面的至少一部分经上述聚合物(P1)至(P3)被覆的基体可以通过将上述聚合物(P1)至(P3)涂布于基体来制备。将上述聚合物(P1)至(P3)涂布于基体的手段没有特别限制,可适当采用已知的手段。另外,“涂布”也包括下述方法:将基体浸渍于聚合物或含有聚合物的溶液中;或者将聚合物或含有聚合物的溶液流入基体,并静置规定的时间;等等。浸渍或静置的时间、温度可根据基体的材质、聚合物的种类进行适当选择,例如,于10~35℃、优选环境温度(例如25℃)实施30秒至24小时、优选1分钟至3小时。由此,基体的表面的至少一部分(优选整个表面)经上述聚合物(P1)至(P3)被覆。
[0165] 本发明的其他实施方式中,聚合物(P2)及(P3)的含有配体的结构单元通常可通过下述方式导入聚合物中:准备包含含有特定的反应性基团的结构单元的聚合物,使该聚合物中的特定的反应性基团与含有能够与该反应性基团反应的基团的配体反应。这样的反应对于本领域技术人员是已知的,没有特别限定,典型而言为点击反应。其中,优选利用了叠氮‑炔环加成反应的点击反应。另外,这样的反应也可以在被覆于基体上的聚合物上进行。
[0166] 本发明的其他实施方式中,通过利用了叠氮‑炔环加成反应的点击反应,含有配体的结构单元可借助下述两种方式导入聚合物中:(i)使含有碳‑碳三键的结构单元与含有叠氮基的配体接触;或(ii)使含有叠氮基的结构单元与含有碳‑碳三键的配体接触。
[0167] 因此,本发明还涉及表面的至少一部分经包含显示细胞非粘附性的结构单元和含有碳‑碳三键或叠氮基的结构单元的聚合物(P4)被覆的基体。
[0168] 本发明的实施方式中,作为包含碳‑碳三键或叠氮基的结构单元,优选下述式(1c)表示的结构单元。因此,将基体的表面的至少一部分被覆的聚合物可以为包含上述式(1a)表示的结构单元和下述式(1c)表示的结构单元的聚合物(P5)。
[0169] [化学式21]
[0170]
[0171] 式中,X表示氢原子或碳原子数1至5的直链烷基,Z表示包含碳‑碳三键或叠氮基的2
基团,Q表示酯键、磷酸二酯键、酰胺键、碳原子数1至10的直链或支链亚烷基或可经取代的亚苯基、或者由它们的组合构成的二价基团,m2表示1至200的整数,n表示1至10的整数。
[0172] Z中的“包含碳‑碳三键的基团”是指例如包含乙炔或下述式表示的二苯并环辛炔等碳‑碳三键骨架的基团。
[0173] [化学式22]
[0174]
[0175] 作为这样的基团,例如,可举出式‑Sa1‑Ra1基(式中,Sa1为单键、酯键、酰胺键、醚键、氨基键、羰基键、硫醚键、碳原子数1至5的直链或支链亚烷基、或者由它们的组合构成的二a1价基团,R 为碳原子数2至5的炔基或二苯并环辛炔)。
[0176] Z中的“包含叠氮基的基团”是指包含叠氮基(‑N3)的基团。作为这样的基团,例如,a2 a2可举出式‑S ‑N3基(式中,S 为单键、酯键、酰胺键、醚键、氨基键、羰基键、硫醚键、碳原子数
1至5的直链或支链亚烷基、或者由它们的组合构成的二价基团)。
[0177] 其中,优选X表示氢原子或甲基,Z表示上述式‑Sa2‑N3基(此处,Sa2表示碳原子数1至2
5的直链或支链亚烷基),Q表示酯键或酰胺键,m2表示1至200的整数,n表示1至10的整数的上述式(1c)表示的结构单元。作为可衍生出这样的上述式(1c)表示的结构单元的单体,例如,可举出甲基丙烯酸3‑叠氮基丙酯等。
[0178] 另外,优选X表示氢原子或甲基,Z表示上述式‑Sa1‑Ra1基(此处,Sa1表示碳原子数1a1 2至5的直链或支链亚烷基,R 表示碳原子数2至5的炔基),Q 表示酯键或酰胺键,m2表示1至
200的整数,n表示1至10的整数的上述式(1c)表示的结构单元。作为可衍生出这样的上述式(1c)表示的结构单元的单体,例如,可举出甲基丙烯酸炔丙基酯等。
[0179] 与本申请的聚合物(P3)同样地,本申请的聚合物(P5)可以还含有下述式(1d)表示的结构单元。
[0180] [化学式23]
[0181]
[0182] 式中,R3、X、Q4及m3如上所述。式(1d)表示的结构单元的优选方式、可衍生出式(1d)表示的结构单元的单体的例子也与上述聚合物(P3)的情况同样。
[0183] 本发明的实施方式中,例如聚合物(P5)只要为包含上述式(1a)表示的结构单元、上述式(1c)表示的结构单元、和根据情况的任意结构单元(例如,上述式(1d)表示的结构单元)的聚合物,则没有特别限制。聚合物(P5)中,可衍生出除上述式(1d)表示的结构单元外的任意结构单元的单体的例子与上述聚合物(P3)的情况同样。聚合物(P5)优选为将衍生出上述式(1a)表示的结构单元的单体、衍生出上述式(1c)表示的结构单元的单体、和根据情况的任意单体进行自由基聚合而得到的物质。
[0184] 就聚合物(P5)中的式(1a)表示的结构单元的比例而言,以全部结构单元为基准,为3摩尔%至80摩尔%。需要说明的是,聚合物(P5)可以包含两种以上的式(1a)表示的结构单元。
[0185] 聚合物(P5)中的式(1c)表示的结构单元的比例为3摩尔%至80摩尔%。需要说明的是,聚合物(P5)可以包含两种以上的式(1c)表示的结构单元。
[0186] 作为聚合反应中的溶剂,可举出水、有机溶剂或将它们组合而得到的混合溶剂。溶剂可根据供于聚合反应的单体、聚合引发剂及目标聚合物的种类、性质进行适当选择,作为例子,可举出:水;丙酮、甲基乙基酮、甲基异丁基酮、甲基异戊基酮、甲基戊基酮、环己酮等酮类;甲醇、乙醇、异丙醇、乙二醇单甲基醚、乙二醇单乙基醚、丙二醇单甲基醚、丙二醇单乙基醚等醇类;乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸异丙酯、乙酸丁酯、丙酸甲酯、乳酸甲酯、乳酸乙酯等酯类;四氢呋喃、1,4‑二氧杂环己烷、乙二醇二甲基醚等醚类;己烷、庚烷、辛烷、环己烷等脂肪族烃类;甲苯、二甲苯等芳香族烃类;乙腈、丙腈、苯甲腈等腈类;N,N‑二甲基甲酰胺、N,N‑二甲基乙酰胺、N‑甲基‑2‑吡咯烷酮等酰胺类。
[0187] 为了高效地进行聚合反应,优选使用聚合引发剂。作为聚合引发剂的例子,可使用2,2’‑偶氮双(异丁腈)、2,2’‑偶氮双(2‑甲基丁腈)、2,2’‑偶氮双(2,4‑二甲基戊腈)(和光纯药工业(株)制;VA‑065,10小时半衰期温度:51℃)、4,4’‑偶氮双(4‑氰基戊酸)、2,2’‑偶氮双(4‑甲氧基‑2,4‑二甲基戊腈)、1,1’‑偶氮双(环己烷‑1‑甲腈)、1‑[(1‑氰基‑1‑甲基乙基)偶氮]甲酰胺、2,2’‑偶氮双[2‑(2‑咪唑啉‑2‑基)丙烷]、2,2’‑偶氮双(2‑甲基丙脒)二盐酸盐、2,2’‑偶氮双[2‑甲基‑N‑(2‑羟乙基)丙酰胺](和光纯药工业(株)制,VA‑086,10小时半衰期温度:86℃)、过氧化苯甲酰(BPO)、2,2’‑偶氮双[N‑(2‑羧基乙基)‑2‑甲基丙脒]n‑水合物(和光纯药工业(株)制;VA‑057,10小时半衰期温度:57℃)、4,4’‑偶氮双(4‑氰基戊酸)(和光纯药工业(株)制;V‑501)、2,2’‑偶氮双[2‑(2‑咪唑啉‑2‑基)丙烷]二盐酸盐(和光纯药工业(株)制;VA‑044,10小时半衰期温度:44℃)、2,2’‑偶氮双[2‑(2‑咪唑啉‑2‑基)丙烷]二硫酸盐二水合物(和光纯药工业(株)制;VA‑046B,10小时半衰期温度:46℃)、2,2’‑偶氮双[2‑(2‑咪唑啉‑2‑基)丙烷](和光纯药工业(株)制;VA‑061,10小时半衰期温度:61℃)、2,
2’‑偶氮双(2‑甲脒基丙烷)二盐酸盐(和光纯药工业(株)制;V‑50,10小时半衰期温度:56℃)、过二硫酸或叔丁基过氧化氢等。
[0188] 在考虑在水中的溶解性、离子平衡及与单体的相互作用的情况下,优选选自2,2’‑偶氮双[2‑甲基‑N‑(2‑羟乙基)丙酰胺]、2,2’‑偶氮双[N‑(2‑羧基乙基)‑2‑甲基丙脒]n‑水合物、4,4’‑偶氮双(4‑氰基戊酸)、2,2’‑偶氮双[2‑(2‑咪唑啉‑2‑基)丙烷]二盐酸盐、2,2’‑偶氮双[2‑(2‑咪唑啉‑2‑基)丙烷]二硫酸盐二水合物、2,2’‑偶氮双[2‑(2‑咪唑啉‑2‑基)丙烷]、2,2’‑偶氮双(2‑甲脒基丙烷)二盐酸盐及过二硫酸。
[0189] 在考虑在有机溶剂中的溶解性、离子平衡及与单体的相互作用的情况下,优选使用2,2’‑偶氮双(2,4‑二甲基戊腈)或2,2’‑偶氮双(异丁腈)。
[0190] 作为聚合引发剂的添加量,相对于聚合中使用的单体的总质量而言,为0.05质量%~10质量%。
[0191] 就反应条件而言,为了提高单体及聚合物的溶解性,可进行加热,例如,用油浴等将反应容器加热至50℃至200℃,进行1小时至48小时搅拌,更优选加热至80℃至150℃进行5小时至30小时搅拌,由此进行聚合反应,得到本发明的共聚物。反应气氛优选为氮气氛。
[0192] 作为反应步骤,可以在将全部反应物质均投入室温的反应溶剂中后加热至上述温度而使其聚合,也可以向已预先加热的溶剂中每次少量地滴加反应物质的混合物的全部或一部分。
[0193] 聚合物(P5)的分子量为数千至数百万左右即可,优选为5,000至5,000,000。更优选为5,000至2,000,000,进一步优选为5,000至1,000,000。另外,可以为无规共聚物、嵌段共聚物、接枝共聚物中的任意,用于制造该共聚物的共聚反应其本身没有特别限制,可以使用利用了自由基聚合、离子聚合、光聚合、乳液聚合的聚合等已知的在溶液中进行合成的方法。它们根据目标用途可以单独使用本发明涉及的聚合物(P5)中的任一者,也可以将多种聚合物(P5)混合并且改变其比率而使用。
[0194] 用于在基体的表面的至少一部分形成基于聚合物(P5)的被覆的组合物可以通过下述方式制备:用适当的溶剂,将包含上述式(1a)及式(1c)表示的结构单元、和根据情况包含的上述式(1d)表示的结构单元的聚合物(P5)根据情况稀释成规定的浓度。即,本发明提供包含聚合物(P5)及溶剂的组合物。
[0195] 作为这样的溶剂,可举出水、有机溶剂或将它们组合而得到的混合溶剂。溶剂可根据聚合物(P5)的种类、性质进行适当选择,作为例子,可举出:水;丙酮、甲基乙基酮、甲基异丁基酮、甲基异戊基酮、甲基戊基酮、环己酮等酮类;甲醇、乙醇、异丙醇、乙二醇单甲基醚、乙二醇单乙基醚、丙二醇单甲基醚、丙二醇单乙基醚等醇类;乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸异丙酯、乙酸丁酯、丙酸甲酯、乳酸甲酯、乳酸乙酯等酯类;四氢呋喃、1,4‑二氧杂环己烷、乙二醇二甲基醚等醚类;己烷、庚烷、辛烷、环己烷等脂肪族烃类;甲苯、二甲苯等芳香族烃类;乙腈、丙腈、苯甲腈等腈类;N,N‑二甲基甲酰胺、N,N‑二甲基乙酰胺、N‑甲基‑2‑吡咯烷酮等酰胺类,可以单独使用或者使用作为它们的组合的混合溶剂。
[0196] 组合物可以从含聚合物(P5)的清漆制备。含聚合物(P5)的清漆例如可利用包括下述工序的制造方法来制备:在溶剂中,将衍生出上述式(1a)表示的结构单元的单体、衍生出上述式(1c)表示的结构单元的单体、和根据情况包含的任意单体以单体的总浓度为0.01质量%至20质量%的方式使其反应(聚合)。聚合物(P5)优选为进行自由基聚合而得到的物质。
[0197] 作为组合物中的固态成分的浓度,为了均匀地形成被覆,优选为0.01至50质量%。
[0198] 此外,就组合物而言,除了添加有上述聚合物(P5)和溶剂外,也可以根据需要在不损害得到的被覆性能的范围内添加其他物质。作为其他物质,可举出防腐剂表面活性剂、提高与基体的密合性的底漆、杀霉菌剂及糖类等。
[0199] 本发明的实施方式中,表面的至少一部分经上述聚合物(P4)或(P5)被覆的基体可以通过将上述聚合物(P4)或(P5)涂布于基体来制备。将上述聚合物(P4)或(P5)涂布于基体的手段没有特别限制,可以适当采用已知的手段。另外,“涂布”也包括下述方法:将基体浸渍于聚合物或含有聚合物的溶液中;或者将聚合物或含有聚合物的溶液流入基体,并静置规定的时间;等等。浸渍或静置的时间、温度可根据基体的材质、聚合物的种类进行适当选择,例如,于10~35℃、优选环境温度(例如25℃)实施30秒至24小时、优选1分钟至3小时。由此,基体的表面的至少一部分(优选整个表面)经上述聚合物(P4)或(P5)被覆。
[0200] 本发明的实施方式中,基体典型地可以为皿、基板、多孔质膜、粒子或过滤器。基体尤其可以为实验设备类、分析设备类或医疗设备类中细胞的分离及/或培养所使用的皿、基板、多孔质膜、粒子或过滤器。
[0201] 另外,作为基体的材质,可举出玻璃、金属、含金属的化合物或含准金属的化合物、活性炭树脂。金属可举出典型金属:(碱金属:Li、Na、K、Rb、Cs;碱土金属:Ca、Sr、Ba、Ra)、镁族元素:Be、Mg、Zn、Cd、Hg;族元素:Al、Ga、In;稀土类元素:Y、La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu;族元素:Ti、Zr、Sn、Hf、Pb、Th;族元素:Fe、Co、Ni;族元素:V、Nb、Ta、铬族元素:Cr、Mo、W、U;锰族元素:Mn、Re;贵金属:Cu、Ag、Au;铂族元素:Ru、Rh、Pd、Os、Ir、Pt等。对于含金属的化合物或含准金属的化合物,例如可举出基本成分为金属氧化物、经高温时的热处理进行烧结而成的烧结体即陶瓷、硅这样的半导体;金属氧化物或准金属氧化物(硅氧化物、氧化铝等);金属碳化物或准金属碳化物;金属氮化物或准金属氮化物(氮化硅等);金属化物或准金属硼化物等无机化合物的成型体等无机固体材料;铝;镍合金;不锈(SUS304、SUS316、SUS316L等)。
[0202] 关于作为基体材质的树脂,天然树脂或其衍生物、或合成树脂均可,作为天然树脂或其衍生物,可优选使用纤维素、三乙酸纤维素(CTA)、硝基纤维素(NC)、固定了硫酸葡聚糖的纤维素等,作为合成树脂,可优选使用聚丙烯腈(PAN)、聚酯系聚合物合金(PEPA)、聚苯乙烯(PS)、聚砜(PSF)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨酯(PU)、乙烯‑乙烯醇(EVAL)、聚乙烯(PE)、聚酯、聚丙烯(PP)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚醚砜(PES)、聚碳酸酯(PC)、聚氯乙烯(PVC)、聚四氟乙烯(PTFE)、超高分子量聚乙烯(UHPE)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、丙烯腈‑丁二烯‑苯乙烯树脂(ABS)、Teflon(注册商标)、尼龙、聚甲基戊烯(PMP)或各种离子交换树脂等。
[0203] 基体中,带涂覆膜的表面的材质可以为一种也可以为两种以上的组合。这些材质中,优选为玻璃、硅、氧化硅、聚苯乙烯(PS)、聚丙烯(PP)、Teflon(注册商标)、环烯烃聚合物(COP)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)中的一种或不锈钢(SUS304、SUS316、SUS316L等)、或选自它们中的组合。本发明涉及的聚合物在低温干燥条件下也能够进行被覆,因此也能够应用于耐热性低的树脂等。
[0204] 上述基体在直接用水或适当的介质清洗后、或施以等离子体处理等表面处理后使用。
[0205] 本发明还提供带配体的基体的制造方法,其包括下述工序:使含有碳‑碳三键或叠氮基的配体与表面的至少一部分经上述聚合物(P4)或(P5)被覆的基体接触的工序。上述方法也可以包括下述工序:将包含上述聚合物(P5)的组合物涂布于所期望的基体上,制造聚合物(P5)被覆基体的工序;以及,以与聚合物(P5)所包含的Z中的碳‑碳三键或叠氮基反应的方式,使含有叠氮基或碳‑碳三键的配体与该聚合物(P5)被覆基体接触的工序。
[0206] 本发明的实施方式中,通过利用了叠氮‑炔环加成反应的点击反应,配体可借助下述两种方式导入聚合物(P4)或(P5)中:(i)使含有碳‑碳三键的结构单元与含有叠氮基的配体接触;或(ii)使含有叠氮基的结构单元与含有碳‑碳三键的配体接触。需要说明的是,点击反应也可以在被覆于基体上的聚合物上进行。
[0207] 作为上述实施方式,优选(i)。
[0208] 就含有碳‑碳三键或叠氮基的配体而言,作为点击化学试剂,可以从Funakoshi(株)、Sigma‑Aldrich等试剂供应商获得,或者本领域技术人员按照已知的方法由能够自试剂供应商获得的试剂进行制备。聚合物(P4)或(P5)中,(i)存在含有碳‑碳三键的结构单元的情况下,选择含有叠氮基的配体,(ii)存在含有叠氮基的结构单元的情况下,选择含有碳‑碳三键的配体。即,结构单元和配体的一者中存在碳‑碳三键,另一者中存在叠氮基,因此,通过使两者接触,从而容易形成下述式(2a)或(2b)表示的结构,能够将配体导入聚合物中。
[0209] [化学式24]
[0210] 。
[0211] 作为本发明的实施方式,优选(i)。
[0212] 作为点击反应中可使用的溶剂,没有特别限定,例如,可举出苯、甲苯、二甲苯等芳香族烃类;乙酸乙酯、乙酸丁酯等酯类;丙酮、甲基乙基酮等酮类;N,N‑二甲基甲酰胺、N,N‑二甲基乙酰胺、N‑甲基‑2‑吡咯烷酮等酰胺类;乙腈、丙腈等腈类;四氢呋喃、二氧杂环己烷等醚类;甲醇、乙醇等碳原子数1~4醇类;二甲基亚砜、水等。
[0213] 点击反应可以在催化剂的存在下或未存在下实施。作为点击反应中可使用的铜催化剂,可举出溴化铜(I)、碘化铜(I)、乙酸铜(II)、硫酸铜(II)或其水合物等。作为还原剂,代表性地,可举出抗坏血酸或其盐等。
[0214] 此外,根据需要,点击反应可以在含氮的配体的存在下实施。通过含氮的配体,能够提高基于铜催化剂的环加成的效率。作为这样的含氮的配体,可举出三[(1‑苄基‑1H‑1,2,3‑三唑‑4‑基)甲基]胺、三(2‑苯并咪唑基甲基)胺等。
[0215] 需要说明的是,根据点击化学试剂的种类,也可以不添加铜催化剂及还原剂。例如,就上述式(2b)表示的含有碳‑碳三键的环辛炔衍生物而言,因环的应力而使得活化能量低,即使无催化剂也能够容易地与叠氮反应。
[0216] 就利用上述方法得到的带配体的基体而言,在点击反应结束后,优选在使用水或适当的介质清洗后,可作为带配体的基体使用。
[0217] 实施例
[0218] 以下,举出实施例,更具体地说明本发明,但本发明并不限定于下述的实施例。
[0219] 合成例1具有两性离子及点击反应部位的聚合物的合成
[0220] 使CMB(N‑甲基丙烯酰氧基乙基‑N,N‑二甲基铵‑α‑N‑甲基羧基甜菜碱,大阪有机化学工业(株)制)3.0g、PGMA(甲基丙烯酸炔丙基酯)4.0g、及2,2’‑偶氮双[N‑(2‑羧基乙基)‑2‑甲基丙脒]水合物(VA‑057,和光纯药工业(株)制)0.07g溶解于乳酸乙酯28.4g中,然后,在氮气氛下,于80℃加热搅拌一整夜。然后,向反应液中加入乙醇使聚合物沉淀,进行回收,并在减压下将聚合物干燥,由此得到具有下述式(1)表示的结构的聚合物。得到的聚合物的重均分子量以标准聚环氧乙烷、聚乙二醇换算计为8000。
[0221] [化学式25]
[0222]
[0223] 合成例2具有两性离子、点击反应部位、及硅烷偶联基团的聚合物的合成
[0224] 合成了三元共聚物即聚(CMB‑PGMA‑MPTMS),其使用了可利用化学键对玻璃、金属表面进行修饰的甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(MPTMS)。目前已知晓,MPTMS的组成比为10摩尔%时,被覆率最好,并且能够抑制由CMB引起的蛋白质、细胞的吸附及粘附(J.Biomed.Mater.Res.A,2016,104A,2029‑2036.),因此将MPTMS组成比设为10摩尔%,合成了CMB与PGMA的组成比为80:10、70:20、60:30的三元共聚物。使合计45mmol的CMB和PGMA、
0.5mmol的MPTMS、0.17mmol的AIBN溶解于乙醇/二甲基甲酰胺(3:1)混合溶剂中,在氮气氛下,于70℃反应4小时,然后,补充添加0.034mmol的AIBN,进一步使其反应4小时,由此得到具有下述式(2)表示的结构的聚合物。
[0225] [化学式26]
[0226]
[0227] 合成例3肽的制作
[0228] 利用Fmoc固相法合成表1记载的肽。以Fmoc‑Gly‑Alko‑PEG树脂(N‑α‑(9‑芴基甲氧基羰基)‑甘氨酸对甲氧基苄醇聚乙二醇树脂(N‑α‑(9‑Fluorenylmethoxycarbonyl)‑glycine p‑methoxybenzyl alcohol polyethyleneglycol resin),渡边化学工业(株)制)为载体,将肽链延长。将从N末端开始计数为第7‑9位残基的Gly作为柔性接头导入。在C末端导入叠氮高丙氨酸(AHA),使得最终能够利用点击反应向高分子链导入肽。另外,肽2及3为变更了柔性接头的长度的肽。对在树脂上延长的肽链进行脱树脂、脱保护,得到粗肽,然后利用反相高效液相色谱法进行纯化,得到的纯化肽通过MALDI TOF‑MS确认了分子量并进行了鉴定。
[0229] [表1]
[0230]
[0231] ※AHA:叠氮高丙氨酸
[0232] 利用圆偏光二色性(CD)光谱法,评价表1所示的各种寡肽的二级结构。将光谱示于图1(实线:肽1,虚线:肽2,长虚线:肽3)。就肽1而言,作为接头,导入3个Gly残基。已知导入了接头的肽及其接头越长,则肽越为无规结构,可知仅作为与CD44结合的活性部位的Gln‑Gln‑Gly‑Trp‑Phe‑Pro(序列号1)的序列中,具有β股结构。
[0233] 实施例1聚合物对玻璃基板表面的被覆
[0234] 将合成例1中合成的聚合物溶解于乳酸乙酯中,制作10%溶液。接着,通过旋涂在4×4cm的玻璃基板上以1115rpm/60s的速度进行涂布,在加热至100℃的加热板上加热1分钟,由此将聚合物被覆于玻璃基板。聚合物的膜厚为500nm。
[0235] 实施例2肽的担载
[0236] 使40mg合成例3中合成的肽1悬浮于纯水16g中,将1mg/ml硫化铜水溶液0.43g、1mg/ml抗坏血酸钠水溶液2.7g混合,制成肽反应溶液。将该肽反应溶液滴于实施例1中制作的玻璃基板的整个面上,在该状态下于室温静置12小时,然后用纯水清洗基板,进行空气吹扫,由此制成担载了肽的玻璃基板。
[0237] 比较例1肽对被覆有聚合物的玻璃基板的涂布
[0238] 使40mg合成例3中合成的肽1悬浮于纯水16g中,制成肽悬浮液。将该溶液滴于实施例1中制作的玻璃基板的整个面上,在该状态下于室温静置12小时,然后用纯水清洗基板,进行空气吹扫,由此制成未担载肽的玻璃基板。
[0239] 实施例3确认肽的担载的试验
[0240] 关于实施例2及比较例1中制作的基板,为了确认肽的担载,利用MicroBCA法实施了分析。本试验使用Thermo Fisher Scientific Inc.制BCA蛋白质分析试剂盒(BCA Protein Assay Reagent Kit)来实施,将各试剂混合后,使实施例2及比较例1中制作的基板各自浸渍于试剂混合液中,于60℃保持1小时,回收溶液后,对溶液在562nm处的透过率进行评价。结果,使用实施例2中制作的基板时,透过率为32%,确认了由肽键带来的吸收。另一方面,使用比较例1中制作的基板时,透过率为80%。由该结果确认了,实施例2中制作的基板为被覆有担载了肽的聚合物的玻璃基板(肽通过点击反应而被担载),比较例1中制作的基板为被覆有未担载肽的聚合物的玻璃基板。
[0241] 实施例4细胞选择性评价
[0242] 对人骨髓间充质系干细胞(hMSC)在被覆有担载了肽(实施例2)/未担载肽(实施例1)的聚合物的玻璃基板表面上的捕获进行调查。另外,使用来自人胚胎干细胞的神经祖细胞(hNPC)及来自人胎儿肾脏的细胞(HEK293细胞)、来自小鼠的成纤维细胞(3T3细胞)评价细胞选择性。使被覆有担载了肽/未担载肽的聚合物的玻璃基板浸渍于70%乙醇溶液中,通过在超净工作台内使其干燥从而实施灭菌处理,然后,利用以下的表2所示的与各细胞对应的培养液,对接种细胞后6小时的细胞粘附状态进行观察。将实施例1的结果示于图2(光学显微镜观察),将实施例2的结果示于图3(光学显微镜观察)和图4(流式细胞术)。
[0243] [表2]
[0244]
[0245] 实施例5细胞捕获速度及捕获的细胞数以及捕获细胞的纯度评价
[0246] 对细胞在被覆有担载了肽的聚合物的玻璃基板表面(实施例2)及被覆有未担载肽的聚合物的玻璃基板表面(实施例1)上的捕获所需的时间及捕获的细胞数、以及捕获细胞
4 2
是否为hMSC进行评价。首先,以3.0×10个细胞/cm的量仅接种hMSC,培养5、15、30分钟后,用培养液进行清洗,对粘附的细胞数进行计数。将结果示于图5(光学显微镜观察)、图6(A)(经细胞计数而得到的数目)。另外,利用流式细胞术对捕获细胞的表达型进行调查。将结果示于图6(B)。
[0247] 接着,将hMSC与HEK293细胞混合(各自为1.5×104个细胞/cm2),接种后,培养与上述同样的规定时间,利用培养液进行清洗,然后回收粘附的细胞,进行细胞计数及基于流式细胞术的表达型的调查。将结果分别示于图7(A)及(B)。
[0248] 如图2所示,根据实施例4的评价,就实施例1中制作的被覆有聚合物的玻璃基板(被覆有未担载肽的聚合物的玻璃基板)而言,在hMSCs、hNPCs、HEK293细胞、3T3细胞全部细胞种类中,完全未观察到粘附。由此确认了,作为基础聚合物的合成例1中合成的聚合物显示细胞非粘附性。
[0249] 如图3所示,根据实施例4的评价,使用实施例2中制作的被覆有担载了肽的聚合物的玻璃基板的情况下,hMSCs中,观察到细胞的粘附及伸展(图3(A)),hNPC(图3(B))及HEK293细胞(图3(C))中,完全未观察到细胞的粘附。关于3T3细胞,虽较弱但观察到了粘附。
利用流式细胞术评价了表面抗原表达,结果获得了若干CD34‑PE抗体与表面结合的结果(图
4),由此暗示可能与肽发生相互作用。由此明确了,通过使用本材料,能够选择性地捕获在表面表达CD34的细胞。
[0250] 如图5所示,根据实施例5的评价,在被覆有担载了肽的聚合物的玻璃基板表面(实施例2),观察到细胞粘附数经时地增加的倾向。另一方面,在被覆有未担载肽的聚合物的玻璃基板表面(实施例1),完全未观察到细胞粘附。对担载了肽的表面的hMSC捕获数进行评价的结果(图6(A))显示,能够捕获接种细胞中约4成的细胞。另外,由利用流式细胞术对捕获细胞的表面抗原的表达进行评价的结果(图6(B))可知,为CD34阳性,并且为CD44阳性(hMSC的表面标记蛋白质)。
[0251] 此外,由将hMSC与等量的HEK293细胞混合、进行细胞捕获实验的结果(图7(A))可2
知,培养30分钟后,约10000个细胞/cm的细胞被捕获,由对该细胞的表面抗原进行评价的结果(图7(B))可知,几乎全部的细胞为CD34/44双阳性细胞、即hMSC。由这些结果明确了,被覆有担载了肽的聚合物的玻璃基板表面能够从hMSC与HEK293细胞的混合液中选择性地仅
捕获hMSC。
[0252] 实施例6聚(CMB‑PGMA‑MPTMS)三元共聚物对玻璃基材的修饰
[0253] 通过进行强酸处理(食人鱼溶液、浓硫酸等)、氧等离子体处理、或UV/O3处理来清洗玻璃基板,然后,使其浸渍于将合成例2中合成的聚(CMB‑PGMA‑MPTMS)以成为1w/v%的方式溶解于乙醇而得到的溶液。用乙醇对从溶液中取出的玻璃基板进行清洗,并利用N2气使其干燥。通过上述方式,得到修饰有聚(CMB‑PGMA‑MPTMS)的玻璃基板。
[0254] 实施例7肽的担载
[0255] 利用与实施例2同样的方法,使肽1担载于修饰基材的聚合物。
[0256] 实施例8经担载了肽的聚合物修饰的玻璃基板表面的润湿性
[0257] 利用水(液滴)接触角测定及气泡接触角测定,评价实施例6及7中得到的经未担载肽及担载了肽的聚合物修饰的表面的润湿性。将结果分别示于图8(A)及(B)。在经未担载肽的聚合物修饰的表面,伴随PGMA组成的增加(CMB组成的减少),观察到液滴接触角的增加及气泡接触角的减少,因此可知表面亲水性降低(图8(A)及(B)中以黑色示出的长条)。认为这是由PGMA的炔取代基的疏水性引起的。另一方面,在经担载了肽的聚合物修饰的表面,与未担载肽的情况相比,观察到液滴接触角的减少及气泡接触角的增加(图8(A)及(B)中以灰色示出的长条)。可认为这是由肽1的亲水性引起的,通过担载肽而使得表面的亲水性提高。
[0258] 实施例9利用全反射红外光谱测定对肽1向经聚合物修饰的表面的担载进行评价
[0259] 利用全反射红外光谱测定,对实施例6及7中得到的经未担载肽及担载了肽的聚合物修饰的表面进行调查。本测定中,代表性地对CMB:PGMA:MPTMS的组成比为70:20:10的聚‑1合物进行评价。将结果示于图9。在肽1的来自酰胺键的酰胺II区域(1700~1760cm )中,相对于经未担载肽的聚合物修饰的表面的红外吸收(图9:实线),经担载了肽的聚合物修饰的表面的红外吸收(图9:虚线)大幅增加。根据该结果,认为通过在修饰于基材上的聚合物的炔烃侧链与肽1的叠氮基之间进行点击反应,肽1被修饰于聚合物链上。
[0260] 实施例10经担载了肽1的聚合物修饰的表面的膜厚评价
[0261] 利用椭圆偏振测定,对实施例6及7中得到的经未担载肽及担载了肽的聚合物修饰的表面的干燥状态的膜厚进行评价。将结果示于图10。经未担载肽的聚合物修饰的表面的膜厚为4~6nm(图10中以黑色示出的长条),可知就任意组成的聚合物而言均形成了薄膜。另一方面,与未担载肽1的表面相比,经担载了肽1的聚合物修饰的表面的膜厚增加1~
2.5nm(图10中以灰色示出的长条)。考虑到就CMB:PGMA:MPTMS=90:00:10的经聚合物修饰的表面而言在肽反应前后膜厚完全未变化,认为上述膜厚增加是由担载肽1而引起的。
[0262] 实施例11肽1的担载量的定量
[0263] 利用微量BCA法,对实施例7中得到的肽1在经各种担载了肽的聚合物修饰的表面上的担载量进行定量(n=3)。将结果示于图11。观察到下述倾向:肽1的担载量依赖于PGMA组成比的增加、即炔烃侧链的导入量而增加。另外,就其担载量而言,可知根据炔烃侧链的
2
导入量,可以使肽1的担载量从每1cm 2.5pmol变化为3.65pmol。
[0264] 根据上述实施例的液滴/气泡接触角测定、全反射红外光谱测定、椭圆偏振测定及肽1担载量测定的各评价可知,能够使肽1担载于修饰于基材上的聚合物。另外发现,也可通过PGMA的组成比而使肽1的组成比变化。
[0265] 实施例12血清蛋白质对经担载了肽1的聚合物修饰的表面的非特异吸附评价
[0266] 为了对蛋白质向实施例7中得到的经担载了肽1的聚合物修饰的表面有无非特异吸附进行评价,利用微量BCA测定,对血清蛋白质的吸附量进行定量(n=3)。将结果示于图
2
12。作为对照实验,评价了向玻璃基板上的吸附,结果观察到每1cm 约200ng的蛋白质吸附(图12中,以白色示出的长条)。与此相对,实施例6中得到的经未担载肽的聚合物修饰的表
2
面为30~50ng/cm ,可知蛋白质吸附被大幅抑制(图12中,以黑色示出的长条)。另外可知,在经担载了肽1的聚合物修饰的表面,与经未担载肽的聚合物修饰的表面同样地,大幅抑制血清蛋白质的非特异吸附(图12中,以灰色示出的长条)。由该结果暗示了:通过肽1的担载,不会阻碍抑制CMB的蛋白质非特异吸附的能力,并且血清蛋白质不会与担载的肽1发生非特异性相互作用,伴随于此,不会阻碍肽1的特异性相互作用。
[0267] 由该结果可预期(1)能够抑制细胞的非特异性粘附、(2)能够介由肽1而仅捕获特定的细胞这两点,能够实现细胞的选择捕获及选择培养。
[0268] 实施例13细胞在经担载了肽1的聚合物修饰的表面上的选择捕获
[0269] 为了评价细胞在经各种未担载肽及担载了肽的聚合物修饰的表面上的选择捕获,4 2
将NIH3T3细胞、HEK293细胞、人MSC这三种细胞接种(各自为3.0×10个细胞/cm)于实施例6及7中制作的各种基板表面上,培养12小时后,用显微镜观察细胞的捕获数及细胞的伸展度。将结果示于图13~16。图13~15示出接种了各细胞种类时的各种修饰表面的相位差显微镜图像,另外,图16为示出对经未担载肽的聚合物修饰的表面(‑)及经担载了肽1的聚合物修饰的表面(+)上所捕获的细胞数(n=3)进行定量的结果的坐标图。需要说明的是,
NIH3T3细胞的结果以淡灰色长条示出,HEK293细胞的结果以深灰色长条示出,人MSC的结果以黑色长条示出。由这些结果可知,在经未担载肽的聚合物修饰的表面,细胞完全未被捕获·粘附,另外,在经担载了肽1的聚合物修饰的表面,NIH3T3细胞及HEK293细胞未被捕获,仅人MSC被捕获。认为在人MSC的膜表面存在CD44抗原,通过将与该CD44特异性相互作用的肽1(CD44结合肽,CD44BP)担载于聚合物修饰表面,从而能够选择性地仅捕获、粘附人MSC。
[0270] 另外,可知随着PGMA组成比的增加、即炔烃侧链的增加,细胞捕获数增加。认为这是由起因于炔烃侧链增加的肽1担载量的增加所带来的,可以说是与实施例11中示出的结果相关联的结果。此外,关于人MSC的捕获细胞数相对于向玻璃基板的粘附数而言大幅减少,可认为其原因在于,将即使进行少许分化而使CD44抗原的表达量减少的细胞排除在外而仅捕获CD44抗原高度表达的人MSC,能够构筑高细胞选择性的基材表面。
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