[0001] 本发明涉及某些选择靶蛋白的表位的新方法，该方法用于但不限于抗体(例如功能性抗体)产生。因此，本发明在一些方面中涉及用于产生抗体的方法。此类方法典型地包括鉴别抗原表位和培育针对该抗原表位的抗体。本发明还涉及抗原表位和结合此类抗原表
位的抗体。

[0002] 由于用例如若干种单克隆抗体(mAb)疗法(包括阿达木单抗(Humira)、贝伐单抗(Avastin)、赫赛汀(Herceptin))所见的临床成功，和例如靶向PCSK9的新型胆固醇下降mAb治疗(阿利库单抗(Alirocumab)和依伏库单抗(Evolocumab))的希望，抗体治疗的发展非常
迅速。然而，目前市场上的所有抗体以及所有在晚期临床发展中的抗体通常是针对细胞外
靶标，并且这些抗体通常是使用聚焦于亲和力或结合强度的筛选平台进行发现和开发。细
胞内作用的抗体的开发和针对“困难靶标(即其中传统抗体发现方法失败的靶标)”的抗体
的开发是一项艰巨的挑战，需要新的技术进步来发现和开发有效的抗体。对于细胞内作用
的抗体，还需要用于将抗体内化至正确的靶器官中的细胞的新工具。此外，目前的抗体发现和开发平台通常缺乏(例如在医学症状中)可以预测具体抗体在给定生物系统中的工作的
功能相关性、药理学相关性和作用机制相关性。

[0003] 今天，针对开发和发现成功抗体治疗的策略不限于完整大小的单克隆抗体。由于蛋白质工程的进步，在过去二十年中已经衍生出多种多样的工程化的抗体片段，这些片段
包括Fab片段、ScFv片段、双抗体、四抗体，用蛋白质轭合物功能化的抗体片段、连同与两种抗原结合的双特异性片段。当尝试开发具有高特异性和亲和力、深层组织渗透性、高稳定性和低毒性的抗体和抗体衍生生物制剂时，这些新构建体提供了远远更大的工具箱。然而，抗体疗法的主要障碍之一仍然存在，并且该障碍是其对细胞外靶标的一般限制。抗体太大、太极性而不能通过细胞膜进入。此外，抗体通常在细胞溶质的还原环境中是不稳定的。已经开发了若干种技术来接近细胞内靶标，这些技术包括使用不同的转运载体(例如转染试剂和
蛋白质转导结构域(PTD))跨细胞膜运输抗体，连同包括直接在靶细胞内表达抗体(所谓的
胞内抗体)。尽管对抗体的应用不如小分子和遗传物质广泛，但是电穿孔技术也还是得到了应用。可以通过融合胞内抗体的遗传序列和细胞内运输信号来构建胞内抗体以靶向不同的
细胞区室。对于有效递送载体的需要仍然是胞内抗体疗法中的关键步骤，因为仍然需要将
编码胞内抗体的遗传物质递送至靶细胞。

[0004] 通过杂交瘤技术生产单克隆抗体首先在1975年开发出来。简言之，给哺乳动物注射感兴趣的抗原，这触发了哺乳动物的免疫应答。然后从动物脾取出脾细胞，并且稍后与永生骨髓瘤细胞进行融合。将细胞稀释至单个细胞并分离至多孔板中。由于一个细胞产生每
个分离的群落，所以在单个孔中产生的抗体将是单克隆的。下一步是筛选所有不同的孔，以获得与抗原结合的最佳候选物。

[0005] 与完整大小的抗体相比，具有更小抗体片段的巨大优点是它们可以在不同的表达系统(例如，大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞)中生产，并且不再局限于用杂交瘤技术生产。
这使得能够以更低的成本进行大规模生产，并且实现遗传调节抗体特性的许多可能性。抗
体片段可以显示在丝状噬菌体的表面上，即所谓的噬菌体展示，丝状噬菌体可用于产生大
的抗体文库，针对所需抗原对这些抗体文库进行筛选。筛选程序评估与抗原结合的抗体候
选物。由于第一周期中的非特异性结合，筛选程序经常在若干个周期内重复。可以改变筛选周期期间的条件，以便在某些环境中找到最适合的候选物，例如可以通过使用恶劣环境来
选择更稳定的抗体。选择具有非常高亲和力的抗体的另一种方法是用非常低浓度的抗原进
行筛选，使得只保留那些能够在这种条件下结合的抗体。几家公司已经开发了他们自己的
筛选技术，并且这几家公司通常具有大的抗体文库，例如再生元公司(Regeneron 
(regeneron.com))或Alligator生物技术公司(Alligator  bioscience
(alligatorscience.se))。

[0006] 在一个方面，本发明提供产生针对蛋白质的抗体的方法，所述方法包括：

[0007] (i)通过以下方式鉴别所述蛋白质中的抗原表位：通过使该蛋白质与至少一种蛋白酶接触以形成至少一种消化、解构或截短版本的该蛋白质和至少一种表面暴露的肽来将
该蛋白质暴露于限制性或约束的蛋白质水解，该表面暴露的肽通过所述蛋白酶的作用从该
蛋白质上切割掉，并且基于所述表面暴露的肽产生抗原表位；和

[0008] (ii)培育针对该抗原表位的抗体。

[0009] 在另一个方面，本发明提供产生针对蛋白质的抗体的方法，所述方法包括：

[0010] (i)通过使该蛋白质与至少一种蛋白酶接触以形成至少一种消化、解构或截短版本的该蛋白质和至少一种表面暴露的肽来将该蛋白质暴露于限制性或约束的蛋白质水解，
该表面暴露的肽通过所述蛋白酶的作用从该蛋白质上切割掉；和

[0011] (ii)通过鉴别该至少一种表面暴露的肽中的表面暴露的表位来鉴别抗原表位，该表面暴露的肽存在于该蛋白质的区域中，导致当该肽在限制性或约束的蛋白质水解期间从
该蛋白质上切割掉或除去时，该蛋白质的生物功能的缺乏或显著改变；或

[0012] 基于该蛋白质的生物功能的生物信息学和/或已知数据来选择该蛋白质内的至少一个靶区域，并通过鉴别该至少一种表面暴露的肽中的表面暴露表位来鉴别抗原表位，该
表面暴露的肽存在于所述至少一个靶区域中；和

[0013] (iii)培育针对该抗原表位的抗体。

[0014] 在另一个方面，本发明提供鉴别抗原表位的方法，所述方法包括：

[0015] (i)通过使蛋白质与至少一种蛋白酶接触以形成至少一种消化、解构或截短版本的该蛋白质和至少一种表面暴露的肽来将该蛋白质暴露于限制性或约束的蛋白质水解，该
表面暴露的肽通过所述蛋白酶的作用从该蛋白质上切割掉；和

[0016] (ii)通过鉴别该至少一种表面暴露的肽中的表面暴露的表位来鉴别抗原表位，该表面暴露的肽存在于该蛋白质的区域中，导致当该肽在限制性或约束的蛋白质水解期间从
该蛋白质上切割掉或除去时，该蛋白质的生物功能的缺乏或显著改变；或

[0017] 基于该蛋白质的生物功能的生物信息学和/或已知数据来选择该蛋白质内的至少一个靶区域，并通过鉴别该至少一种表面暴露的肽中的表面暴露表位来鉴别抗原表位，该
表面暴露的肽存在于所述至少一个靶区域中。

[0018] 本发明涉及检测和鉴别蛋白质中氨基酸序列的方法，其中所述氨基酸序列具有良好的暴露性并在功能上相关的，至少这些氨基酸序列是被很好地暴露的。因此，我们称之为“热点”的这些氨基酸序列可以用作引导抗体靶向、发现和开发的抗原表位。此外，这些氨基酸序列可以基于蛋白水解消化后的它们的出现、和基于来自已知的生物信息学数据或来自
功能/药理学测试的功能相关性来进行排序。因此，从蛋白水解消化产生的若干个氨基酸序列的列表中，可以挑选最适合的氨基酸序列(基于功能和结构参数)用于抗原表位发现和开
发。在限制性条件下进行蛋白水解消化，即蛋白酶或若干种蛋白酶的活性非常低，使得一次只有一个或几个表面暴露的肽从靶蛋白上切割掉。因此，蛋白酶用作针对结合靶蛋白的抗
体的成药性探针。

[0019] 在一个实施例中，这些抗体是药理学活性的。在另一个实施例中，这些抗体是药理学活性的并且被开发用于治疗用途。更确切地，此类方法包括用于揭示靶蛋白的热点表位的蛋白质组学工具。

[0020] 在本发明的一个方面，蛋白质通过蛋白酶作用被消化、解构和/或截短，并且所有良好暴露的氨基酸序列用于抗原表位产生，并且尝试对基于所述抗原表位开发的抗体进行
效力、功效、药理学分析和其他测试(按照制药工业中使用的抗体发现的惯例)。

[0021] 在本发明的一个方面，蛋白质通过蛋白酶作用被消化、解构和/或截短，并且并行地通过在消化的、解构的和/或截短的蛋白质上进行功能测定来探测蛋白质，以描绘蛋白质的功能重要区域。相关蛋白质在此有时表示靶蛋白。

[0022] 在一个实施例中，并行地通过功能测定来进行靶蛋白的消化、解构和/或截短，以描绘靶蛋白的功能重要区域以引导针对抗体产生的表位选择。

[0023] 在一个实施例中，消化、解构和/或截短，以及消化的、解构的和/或截短的蛋白质和天然靶蛋白的功能测定，与其他关于蛋白质功能的生物信息学事实和其他已知的事实相结合，以描绘靶蛋白的功能重要区域以引导针对抗体产生的表位选择。

[0024] 在一个实施例中，可以使用单个蛋白酶来消化、解构和/或截短靶蛋白。在另一个实施例中，可以使用多种蛋白酶来按顺序一次一个地或并行地消化、解构和/或截短靶蛋
白。此类蛋白酶的示例为、但不限于：Arg‑C蛋白酶、Asp‑N肽链内切酶、梭菌蛋白酶、谷氨酰肽链内切酶、Lys‑C、Lys‑N、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、蛋白酶K和嗜热菌蛋白酶。易于被若干种蛋白酶消化的区域应该位于蛋白质的暴露区域中，并且仅被单个蛋白酶消化的区域可能
位于更隐藏的区域中。可替代地，蛋白酶具有独特的切割特异性或/和物理化学特性或/和
结构特征，使得其可以鉴别其他蛋白酶不能鉴别的在靶蛋白上的表面暴露的肽。因此，优选使用多种蛋白酶，并且每种不同的蛋白酶可以产生关于表面暴露的肽作为抗原表位的适合
性的互补或独特的信息。

[0025] 这些实施例使得能够实现用于快速和精确地开发可用于药理学研究的药理学活性抗体的新方法/技术，例如，这些实施例可以用作(例如在细胞测定或体外测定中)用于检测生物化合物的工具。更重要的是，所述抗体可用于治疗人和动物的医学症状。这些实施例可以应用于所有蛋白质，包括可溶性蛋白质或膜结合蛋白质、细胞外的蛋白质或细胞内的
蛋白质。此外可以利用这些实施例来产生对蛋白质功能的新的基本理解。

[0026] 本发明还提供通过本发明的方法产生的抗体。

[0027] 本发明还提供通过本发明的方法鉴别的抗原表位。

[0028] 本发明还提供针对本发明的抗原表位的抗体。

[0029] 本发明的其他特征和优点从以下详细说明将是清楚的。附图说明

[0030] 通过参考以下结合附图的描述，可以最好地理解实施例及其进一步的目的和优点，其中：

[0031] 图1

[0032] 在室温下，在5μg/ml胰蛋白酶的限制性蛋白水解后，从TRPV1检测到的肽，n＝6。A：在TRPV1的3D模型中显示的检测到的肽的位置。在0.5分钟(品红色)、5分钟(橙色)和15分钟(蓝色)后检测到的肽。B：在TRPV1的示意图中显示的检测到的肽的位置。在0.5分钟(品红
色)、5分钟(橙色)和15分钟(蓝色)后检测到的肽。C：在5μg/ml胰蛋白酶的限制性蛋白水解后，从TRPV1检测到的消化的肽的条形图，显示在哪个时间点对它们进行了确认。

[0033] 图2

[0034] 暴露于5μg/ml、20μg/ml或40μg/ml胰蛋白酶(Tr)5min后从TRPV1消化的肽，以及除去这些肽后电流响应的变化。A‑C：来自TRPV1的消化的肽的位置，显示在流动细胞(青色)内消化的肽，以及在流动细胞内消化并随后完全消化过夜的肽(黄色)。D：TRPV1的内面向外记录的代表性轨迹(用1μM辣椒素(Cap)激活、然后进行5分钟暴露于缓冲液抑或胰蛋白酶并且另外用辣椒素激活时)。从上到下分别为：暴露于缓冲液5min、暴露于5μg/ml胰蛋白酶5min、暴露于20μg/ml胰蛋白酶5min、和暴露于40μg/ml胰蛋白酶5min。轨迹已经以100Hz进行数字滤波，仅供图形显示目的。

[0035] 图3

[0036] TRPV1功能的电生理膜片钳记录显示用辣椒素进行第二次激活的电流轨迹时间间隔，计算为以(在用缓冲液n＝11抑或抗体n＝6处理后)用辣椒素进行第一次激活的间隔的
百分比。数据呈现为平均值±SEM。

[0037] 图4

[0038] OTV1，肽aa96‑117的抗原决定簇(红色)的位置，在hTRPV1的表面模型中可视化。A：TRPV1的侧视图，其中每个单体以交替的蓝色和紫色着色。B：TRPV1的顶视图，其中每个单体以交替的蓝色和紫色着色。

[0039] 图5

[0040] OTV2，肽aa785‑799的抗原决定簇(红色)的位置，在hTRPV1的表面模型中可视化。A：TRPV1的侧视图，其中由于观察目的而省略了两种单体。B：TRPV1的底视图，其中每个单体以交替的蓝色和紫色着色。

[0041] 图6

[0042] 在有TRPV1表达(A)和无TRPV1表达(B)的固定细胞中，OTV1(左)的位置和OTV2(右)的位置。使用山羊抗兔Alexa 488第二抗体来可视化OTV1和OTV2。在每个图像下方给出沿着横穿细胞的线段(黑色)的强度值。OTV1和OTV2使用不同的激光设置，不应进行抗体之间的
比较。

[0043] 图7

[0044] 用抗体处理后TRPV1功能的电生理膜片钳记录。A：用辣椒素进行第二次激活的电流轨迹时间间隔，计算为以(在用缓冲液(n＝11)抑或OTV1(n＝6)处理后)用辣椒素进行第
一次激活的间隔的百分比。B：在钙调素(CaM)和OTV2存在下，用辣椒素进行第二次激活的电流轨迹时间间隔，计算为以(在仅用钙调素(n＝11)、抑或钙调素和OTV2处理后)用辣椒素进行第一次激活的间隔的百分比。使用OTV2进行的处理可以分为：在尖端超声处理(n＝4)15
分钟内进行测量，和在尖端超声处理(n＝7)30分钟内进行测量。数据呈现为平均值±SEM。

[0045] 图8

[0046] A：在无钙PBS中，在用OTV1电穿孔后，TRPV1介导的YO‑PRO摄取。顶部：OTV1(n＝11)2+
和对照(n＝11)的荧光强度。底部：OTV1和对照的相应荧光强度率。B：在50μM的Ca 存在下，在用OTV2电穿孔后，TRPV1介导的YO‑PRO摄取。顶部：OTV2(n＝9)和对照(n＝7)的荧光强度。
底部：OTV2(绿色)和对照(红色)的相应荧光强度率。数据呈现为平均值±SEM。

[0047] 图9

[0048] 通过电穿孔，用荧光验证抗体的内化。将细胞电穿孔、固定、透化、并用山羊抗兔Alexa 488第二抗体进行孵育。荧光强度用共焦显微镜测量。在经受OTV1抑或OTV2的电穿孔细胞和非电穿孔细胞、连同只经受第二抗体的细胞之间进行强度比较。在OTV1和OTV2之间使用了不同的激光设置，并且不应进行强度值的比较。数据呈现为平均值±SEM。

[0049] 图10

[0050] 在用胰蛋白酶限制性蛋白水解后，从TRPV1检测到的肽。在TRPV1的3D模型中显示的检测到的肽的位置。实验细节在实施例3中给出。首先消化的肽显示为黑色。后面消化的肽显示为灰色。

[0051] 图11

[0052] 在用Asp‑N限制性蛋白水解后，从TRPV1检测到的肽。在TRPV1的3D模型中显示的检测到的肽的位置。实验细节在实施例3中给出。首先消化的肽显示为黑色。后面消化的肽显示为灰色。

[0053] 图12

[0054] 在用胰凝乳蛋白酶限制性蛋白水解后，从TRPV1检测到的肽。在TRPV1的3D模型中显示的检测到的肽的位置。实验细节在实施例3中给出。首先消化的肽显示为黑色。后面消化的肽显示为灰色。

[0055] 图13

[0056] 在用胃蛋白酶限制性蛋白水解后，从TRPV1检测到的肽。在TRPV1的3D模型中显示的检测到的肽的位置。实验细节在实施例3中给出。首先消化的肽显示为黑色。后面消化的肽显示为灰色。

[0057] 图14

[0058] 在用蛋白酶K限制性蛋白水解后，从TRPV1检测到的肽。在TRPV1的3D模型中显示的检测到的肽的位置。实验细节在实施例3中给出。首先消化的肽显示为黑色。后面消化的肽显示为灰色。

[0059] 图15

[0060] 这个图显示(d)适合研究缺少的切割位点，针对含有缺少的切割位点的7‑8个氨基酸长序列生产抗体，使用移码方法(使用嵌套的表位组)以覆盖合适的区域(例如切割位点
周围的‑20至+20个氨基酸)。为了寻找最佳的结合位点将抗体进行筛选。

[0061] 现在将关于本文提供的描述和方法，更详细地描述本发明的前述和其他方面。应当理解，本发明可以按不同的形式实施，并且本发明不应被解释为限于本文所阐述的实施
例。相反，提供这些实施例是为了使得本披露将是全面和完整的，并且将对本领域技术人员充分传达本发明的范围。

[0062] 除非另外定义，在此所使用的全部技术术语和科学术语具有与本发明所属领域之内的普通技术人员通常所理解的相同的意思。在本说明书中，除非上下文另外明确规定，否则单数形式也包括复数。虽然类似或等同于在此所述的那些的方法和材料可以用于本发明
的实践或测试，但以下描述了适合的方法和材料。在此提及的所有出版物、专利申请、专利以及其他参考文献通过引用结合。本文引用的参考文献不被承认是要求保护的发明的现有
技术。在有矛盾的情况下，将以本说明书(包括定义)为准。此外，这些材料、方法、以及实例仅是说明性的，并且不旨在进行限制。

[0063] 用于本发明的描述中的术语仅用于描述具体实施例的目的，而不旨在限制本发明。如在本发明的实施例的描述中所使用的，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“该”旨在同样包括复数形式，除非上下文另外明确指明。并且，如在此使用的，“和/或”涵盖相关列出项目中的一个或多个的任何和所有可能的组合。此外，如在此使用的术语“约”当指代可测量的值如化合物的量、剂量、时间、温度等时意在涵盖指定量的20％、10％、5％、1％、0.5％、或甚至0.1％的变化。当采用范围(例如从x到y的范围)时，是指可测量的值是从约x到约y的范围、或者其中的任何范围，例如约x1到约y1等。应进一步理解，术语“包括”和/或“包含”当用于本说明书中时指示所陈述的特征、整数、步骤、操作、元件、和/或部件的存在，但并不排除一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、元件、部件、和/或它们的群组的存在或添加。除非另外限定，否则在本说明书中使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有如本发明
所属领域的普通技术人员之一通常理解的相同含义。

[0064] 在一个方面，本发明提供产生针对蛋白质的抗体的方法，所述方法包括：

[0065] (i)通过以下方式鉴别所述蛋白质中的抗原表位：通过使该蛋白质与至少一种蛋白酶接触以形成至少一种消化、解构或截短版本的该蛋白质和至少一种表面暴露的肽来将
该蛋白质暴露于限制性或约束的蛋白质水解，该表面暴露的肽通过所述蛋白酶的作用从该
蛋白质上切割掉，并且基于所述表面暴露的肽产生抗原表位；和

[0066] (ii)培育针对该抗原表位的抗体。

[0067] 在另一个方面，本发明提供产生针对蛋白质的抗体的方法，所述方法包括：

[0068] (i)通过使该蛋白质与至少一种蛋白酶接触以形成至少一种消化、解构或截短版本的该蛋白质和至少一种表面暴露的肽来将该蛋白质暴露于限制性或约束的蛋白质水解，
该表面暴露的肽通过所述蛋白酶的作用从该蛋白质上切割掉；和

[0069] (ii)通过鉴别该至少一种表面暴露的肽中的表面暴露的表位来鉴别抗原表位，该表面暴露的肽存在于该蛋白质的区域中，导致当该肽在限制性或约束的蛋白质水解期间从
该蛋白质上切割掉或除去时，该蛋白质的生物功能的缺乏或显著改变；或

[0070] 基于该蛋白质的生物功能的生物信息学和/或已知数据来选择该蛋白质内的至少一个靶区域，并通过鉴别该至少一种表面暴露的肽中的表面暴露表位来鉴别抗原表位，该
表面暴露的肽存在于所述至少一个靶区域中；和

[0071] (iii)培育针对该抗原表位的抗体。

[0072] 可替代地观察到，本发明提供产生针对蛋白质的抗体的方法，所述方法包括：

[0073] (i)通过使蛋白质与至少一种蛋白酶接触以形成至少一种消化、解构或截短版本的蛋白质和至少一种表面暴露的肽来将蛋白质暴露于限制性或约束的蛋白质水解，该表面
暴露的肽通过所述蛋白酶的作用从蛋白质上切割掉；和

[0074] (ii)通过鉴别被切割掉的表面暴露的肽来鉴别抗原表位，该表面暴露的肽具有对所述蛋白质有或预测有功能重要性的氨基酸序列，并且基于所述表面暴露的肽产生抗原表
位；和

[0075] (iii)培育针对所述抗原表位的抗体。

[0076] 在另一个方面，本发明提供产生针对蛋白质的抗体的方法，所述方法包括：

[0077] (i)通过以下方式鉴别所述蛋白质中的表面暴露的肽：通过使该蛋白质与至少一种蛋白酶接触以形成至少一种消化、解构或截短版本的该蛋白质和至少一种肽来将该蛋白
质暴露于限制性或约束的蛋白质水解，该肽通过所述蛋白酶的作用从该蛋白质上切割掉；
和

[0078] (ii)基于所述至少一种表面暴露的肽构建线性抗原表位或构象抗原表位；和

[0079] (iii)培育针对该抗原表位的抗体。

[0080] 在另一个方面，本发明提供产生针对蛋白质的抗体的方法，所述方法包括：

[0081] (i)通过以下方式鉴别所述蛋白质中的表面暴露的肽：通过使该蛋白质与至少一种蛋白酶接触以形成至少一种消化、解构或截短版本的该蛋白质和至少一种表面暴露的肽
来将该蛋白质暴露于限制性或约束的蛋白质水解，该表面暴露的肽通过所述蛋白酶的作用
从该蛋白质上切割掉；和

[0082] (ii)当表面暴露的肽在限制性或约束的蛋白质水解期间从该蛋白质上切割掉或除去，导致所述蛋白质的生物功能的缺乏或显著改变时，对该表面暴露的肽进行鉴别；或

[0083] 在以下情况下选择至少一种鉴别的表面暴露的肽：(i)基于所述表面暴露的肽与该蛋白质的生物功能的生物信息学和/或已知数据的相关性；和

[0084] (iii)基于所述至少一种表面暴露的肽构建线性抗原表位或构象抗原表位；和

[0085] (iv)培育针对该抗原表位的抗体。

[0086] 在另一个方面，本发明提供产生针对蛋白质的抗体的方法，所述方法包括：

[0087] (i)通过以下方式鉴别所述蛋白质中的抗原表位：通过使该蛋白质与至少一种蛋白酶接触以形成至少一种消化、解构或截短版本的该蛋白质和至少一种表面暴露的肽来将
该蛋白质暴露于限制性或约束的蛋白质水解，该表面暴露的肽通过所述蛋白酶的作用从该
蛋白质上切割掉；和

[0088] (ii)培育针对该抗原表位的抗体。

[0089] 在另一方面，根据本发明的产生抗体的方法可以可替代地视为用于生产特异性结合蛋白质的抗体的方法。产生本文所述抗体的方法的示例性和优选实施例细节上作必要的
修改将同样适用于用于生产特异性结合蛋白质的抗体的方法。

[0090] 在另一个方面，本发明提供鉴别抗原表位的方法，所述方法包括：

[0091] (i)通过使蛋白质与至少一种蛋白酶接触以形成至少一种消化、解构或截短版本的该蛋白质和至少一种表面暴露的肽来将该蛋白质暴露于限制性或约束的蛋白质水解，该
表面暴露的肽通过所述蛋白酶的作用从该蛋白质上切割掉；和

[0092] (ii)通过鉴别该至少一种表面暴露的肽中的表面暴露的表位来鉴别抗原表位，该表面暴露的肽存在于该蛋白质的区域中，导致当该肽在限制性或约束的蛋白质水解期间从
该蛋白质上切割掉或除去时，该蛋白质的生物功能的缺乏或显著改变；或

[0093] 基于该蛋白质的生物功能的生物信息学和/或已知数据来选择该蛋白质内的至少一个靶区域，并通过鉴别该至少一种表面暴露的肽中的表面暴露表位来鉴别抗原表位，该
表面暴露的肽存在于所述至少一个靶区域中。

[0094] 任选地，这种方法进一步包括培育针对所述抗原表位的抗体的步骤。

[0095] 可替代地观察到，本发明提供鉴别抗原表位的方法，所述方法包括：

[0096] (i)通过使蛋白质与至少一种蛋白酶接触以形成至少一种消化、解构或截短版本的该蛋白质和至少一种表面暴露的肽来将该蛋白质暴露于限制性或约束的蛋白质水解，该
表面暴露的肽通过所述蛋白酶的作用从该蛋白质上切割掉；和

[0097] (ii)通过鉴别被切割掉的表面暴露的肽来鉴别抗原表位，该表面暴露的肽具有对所述蛋白质有或预测有功能重要性的氨基酸序列，并且基于所述表面暴露的肽产生抗原表
位。

[0098] 任选地，这种方法进一步包括培育针对所述抗原表位的抗体的步骤。

[0099] 关于蛋白质内表面暴露的功能活性表位的详细知识可以帮助开发有效的抗体，并帮助通过降低抗体候选物的量而减少对精细筛选程序的需要。评估蛋白质表面形态的可能
方法是通过进行限制性和受控的蛋白水解来约束蛋白酶的活性，以消化蛋白质中最灵活的
和表面暴露的部分。这个想法是减缓蛋白酶活性的动力学，使得肽被一次一个的切割掉或
肽被一次至多几个地切割掉。然后可以基于蛋白酶攻击后的出现顺序对切割掉的肽进行排
序。首先从蛋白质上切割掉的肽很好地被蛋白质暴露，并且可以容易地被蛋白酶所接近。我们给这些肽定位高等级，并且我们假设由蛋白酶容易切割掉的肽也容易被抗体识别。我们
给这些后面切割掉的肽定为低等级，并且使两者之间的所有肽基于蛋白酶攻击后随时间的
出现从高到低得分。因此，该方法是基于氨基酸序列的，并且因为我们知道我们特别知道抗体将结合到所述靶蛋白处的序列。在第二步骤中，因为我们知道蛋白质中靶向的特定氨基
酸序列，我们可以从截短的蛋白质的公布的数据或其他已知的生物信息学数据或从其药理
学研究中调查所述氨基酸序列的功能意义。如果氨基酸序列与具有功能重要性的已知氨基
酸序列(例如结合位点，调节位点，结构重要位点，通道区等)一致或接触或重叠，则所述肽被给予高分，并且被判断为用于抗原表位和随后的抗体开发的良好候选物。确切地，这可以通过使用例如低温、低浓度和/或短消化时间来控制蛋白酶的活性来实现。当对具有已知结构的蛋白进行限制性蛋白水解时，主要有三种结构决定簇已经被认为对蛋白水解活性发生
处具有影响。这些包括灵活性、表面暴露和局部相互作用的数量。为了使肽链进入蛋白酶内的活性位点，需要灵活性和蛋白质局部展开的能力。表面暴露使得切割位点更可能发生蛋
白水解，因为事实是表面上的区域倾向于更容易展开连同施加更少的位阻。就氢键和二硫
桥而言，局部相互作用的量也很重要。更较少的局部相互作用有利于蛋白水解这些结构决
定簇中的所有三种通常在蛋白质内相关。因此，鉴于蛋白质链可以在局部展开，限制性的蛋白水解将主要切割表面暴露的区域。已被用作用来确定具有未知详细结构的蛋白质中的表
面暴露区域的方法。

[0100] 基于脂质的蛋白质固定(LPI)技术使得能够对膜蛋白质进行灵活的化学过程。通过从细胞中衍生蛋白脂质体并将其固定在流动细胞内，产生膜蛋白质的固定相，该固定相
可以经受若干轮溶液和不同类型的化学调节(例如通过酶)。已经开发了用于蛋白质组学表
征的顺序胰蛋白酶消化方案，其中通过使用串联质谱(LC‑MS/MS)的液相色谱法分析由蛋白脂质体的逐步酶消化产生的肽[1‑3]。

[0101] 在本发明方法的一些实施例中，蛋白质是存在于蛋白脂质体(例如衍生自细胞(例如人类细胞)的蛋白脂质体)中(例如，在蛋白脂质体的脂质双层中)的蛋白质(例如膜蛋白
质)。因此，在一些实施例中，对蛋白脂质体进行限制性的蛋白水解。蛋白脂质体是包含蛋白质的脂质囊泡。蛋白质脂质体可以从纯化的膜蛋白质和脂质中重构，或者可以直接从细胞
膜衍生(例如通过起泡)，或通过细胞的裂解。优选地，蛋白脂质体衍生自(制备自)裂解的细胞的细胞膜。蛋白脂质体可以从感兴趣的任何细胞类型获得。方便的细胞类型是中国仓鼠
卵巢(CHO)细胞。

[0102] 制备蛋白脂质体的方法是本领域已知的，并且可以使用这些中的任何一种(例如，Jansson等人，Anal.Chem.[分析化学]，2012,84:5582‑5588中描述的方法)。在本文的实例中描述了用于制备蛋白脂质体的示例性的和优选的方法。典型地，优选具有直径约50nm至
约150nm的蛋白脂质体。

[0103] 优选使用衍生自(制备自)裂解的细胞的细胞膜的蛋白脂质体，因为以这种方式(例如使用实例中提到的方法)制备的蛋白脂质体可以在蛋白脂质体外部上存在膜蛋白质
的细胞内部分(或结构域)，因此可用于蛋白水解切割蛋白质的一些部分(以及因此的抗原
表位鉴别)，否则这些蛋白质的一些部分不可接近蛋白酶。

[0104] 在一个方面，我们已经通过利用LPI微流体平台[1,4]开发出靶向抗体技术来产生潜在的表位候选物。这是一种机制，而不是基于筛选的方法。简言之，LPI技术使得能够在膜蛋白质上进行灵活的化学过程(例如限制性的蛋白水解)。通过从细胞中衍生蛋白脂质体并
将其固定在流动细胞内，产生膜蛋白质的固定相。已经开发了用于蛋白质组学表征的顺序
消化方案，其中通过LC‑MS/MS分析由蛋白脂质体的逐步酶消化产生的肽。由LPI流动细胞内的动力学控制的消化产生的此类肽阐明靶蛋白内的暴露的和可接近的区域，这些区域是具
有可接近抗体结合潜力的区域。这些潜在表位与已知的功能数据进一步相关，以便找到将
产生具有优异结合特征和生物功效两者的抗体的表位。最后，所选择的表位/肽可以用于免疫宿主动物以产生抗体。应当提及，进行限制性蛋白水解消化的其他方法和技术是本领域
已知的，并且可以用于例如可溶性蛋白质。

[0105] 在本发明的一些实施例中，蛋白质(例如膜蛋白质)在限制性或约束的蛋白质水解之前(例如在固体支持物上)被固定以产生蛋白质的固定相。因此，在一些实施例中，蛋白质是表面结合的。

[0106] 在一些实施例中，蛋白质(例如膜蛋白质)存在于蛋白脂质体(例如衍生自细胞的蛋白脂质体)中(或之上)，并且所述蛋白质脂质体在限制性或约束的蛋白质水解之前(例如
在固体支持物上)被固定以产生蛋白质的固定相。

[0107] 在本发明的方法的一些实施例中，蛋白质是存在于衍生自细胞的蛋白脂质体中的膜蛋白质，其中所述蛋白脂质体固定在流动细胞中以产生膜蛋白质的固定相。适合的流动
细胞在本领域中是已知的，例如，Jansson等人(Anal.Chem.[分析化学]2012,84:5582‑
5588)描述的流动细胞。

[0108] 在一些实施例中，蛋白质(例如膜蛋白质)存在于蛋白脂质体(例如衍生自细胞的蛋白脂质体)中(或之上)，并且所述蛋白脂质体处于悬浮液中(例如悬浮在溶液中)。

[0109] 在一些实施例中，所述蛋白质是在包含(或存在于)蛋白质的脂质囊泡中，该囊胞是表面结合的或在悬浮液中(例如悬浮于溶液中)。

[0110] 在一些实施例中，所述蛋白质可以是任何适当实体的一部分或存在于任何适当实体上，使得所述蛋白质的功能或天然构象被保留，例如，所述蛋白质是脂质双层或膜的一部分或在支架或颗粒上。

[0111] 在一些实施例中，所述蛋白质是在颗粒，例如纳米颗粒，或表面结合的或悬浮液中(例如悬浮在溶液中)的任何其他胶体颗粒中(或存在于其上)。

[0112] 在一些实施例中，所述蛋白质是在支架或其他化学实体(例如笼状化合物)中(或存在于其上)，该支架或其他化学实体是表面结合的或在悬浮液中(例如悬浮在溶液中)。

[0113] 在一些实施例中，所述蛋白质是在完整细胞(生物细胞，例如人类细胞)中(或存在于其上)，该细胞是表面结合的或在悬浮液中(例如悬浮在溶液中)。

[0114] 在蛋白脂质体中的蛋白质的上下文中的，包含蛋白质的囊泡或完整细胞包括：延伸至(并因此暴露于)蛋白脂质体、包含蛋白质的脂质囊泡或细胞的外部的蛋白质。

[0115] 在一些实施例中，所述蛋白质在溶液中。该溶液可以是纯化的蛋白质的溶液，或者可以包含蛋白质的混合物。

[0116] 在一些实施例中，细胞(例如CHO细胞)例如经由可调节的(例如四环素可调节的)表达系统来过表达蛋白质。在一些实施例中，使用从这种细胞衍生的蛋白脂质体。

[0117] 我们检查了由瞬态受体电位香草素1(TRPV1)离子通道的限制性蛋白水解产生的肽，目的是找到用于开发生物活性抗体的潜在表位，这些抗体具有调节这一离子通道的功
能的能力。使TRPV1经受两种不同的蛋白酶的限制性蛋白水解，并且消化的肽与功能数据相关。使用这一信息，我们已经开发了两种多克隆抗体OTV1和OTV2，作用于人类TRPV1
(hTRPV1)离子通道的细胞内侧。两种抗体均具有药理学活性，并且基于两种抗体的易于消
化(或表面暴露(限制性蛋白水解后的高等级的肽))连同功能重要性，选择这两种抗体的靶
向表位区域。当用激动剂辣椒素刺激时，OTV1显示对蛋白质的强抑制作用。OTV2干扰TRPV1
2+
的钙调素/Ca 依赖性脱敏，这是通过TRPV1引起的钙流入触发的过程。使用内面向外膜片钳研究了OTV1和OTV2两者的功效，其中TRPV1的细胞内侧可以暴露于抗体溶液中，并且在抗体在活细胞内电穿孔之后使用TRPV1介导的荧光摄取测定。

[0118] 先前已经描述了使用LPI流动细胞与开放体积的微流体流动细胞组合用于快速溶液交换(适合于膜片钳实验)的方法。这样做的好处就是细胞膜可以转入内部，并且离子通
道的细胞内区域可以被直接询问。在这种方法中，人员可以使用限制性和受控的蛋白水解
获得相关的结构和功能数据。TRPV1是一种阳离子通道，并且在伤害性初级感觉神经元中表达。详细的晶体结构不能用于全长蛋白质，但N‑末端的锚蛋白重复结构域(ARD)已经成功地用于大鼠TRPV1结晶。在TRPV1上进行限制性蛋白水解时，在短时间内消化的肽已经与已知
的功能活性区域进行了比较。三分之一的检测到的肽包含已经被提出在功能重要的残基。

[0119] 通过将包含TRPV1的蛋白脂质体固定在流动细胞内，并且进一步将其暴露于限制性的胰蛋白酶蛋白水解，进行如现场调查(survey of the field)中描述的TRPV1表面形态
的筛选[1,4]。通过在室温下使用不同的消化时间来控制胰蛋白酶的活性。使用累积孵育时间的顺序方案，并用LC‑MS/MS检测消化的肽。随着时间的推移检测到越来越多的肽，突出了可接近和容易消化的蛋白质的区域连同更刚性的区域。这在图1中示出。在LPI流动细胞中
TRPV1的限制性蛋白水解之后切割掉肽时，用LC‑MS/MS观察到的若干个区域与钙调素、ATP和PIP2的已知相互作用位点相关。

[0120] 我们还测试了通过胰蛋白酶消化，除去不同结构区段后，TRPV1的功能性[4]。使用内面向外膜片钳记录和流动细胞消化测试TRPV1离子通道的活性，然后进行蛋白质组学分析评估化学截短的结构效应。我们已经使用内面向外膜片钳记录构型，允许TRPV1的细胞内部分暴露于胰蛋白酶，并确定电流响应随着胰蛋白酶浓度的增加而降低(图2)。

[0121] 我们证明离子通道TRPV1可以在相同的实验条件下在两个不同的微流体流动细胞中暴露于限制性和受控的胰蛋白酶蛋白水解。在一个实例中，针对药理学研究进行了膜片
钳记录，获得了关于开放体积微流体装置中的通道功能动力学的信息。这种设计允许膜片
钳移液管和细胞膜片可以进入过熔通道。在另一个实例中，使用封闭体积的当量流动细胞
来消化掉来自离子通道的肽而不引起样品的稀释。用LC‑MS/MS鉴别切割掉的肽。然后比较来自两个实验的数据，并且可以评估结构‑功能关系。使用这种方法对策，我们已经鉴别了TRPV1的高度灵活的区域连同影响功能通道特性的关键区域(在其激动剂辣椒素激活期
间)。

[0122] 这种类型的方法也可以用于其他蛋白质(即非TRPV1蛋白质)。

[0123] hTRPV1的氨基酸序列如下所示(SEQ ID NO:1)。

[0124] MKKWSSTDLGAAADPLQKDTCPDPLDGDPNSRPPPAKPQLSTAKSRTRLFGKGDSEEAFPVDCPHEEGELDSCPTITVSPVITIQRPGDGPTGARLLSQDSVAASTEKTLRLYDRRSIFEAVAQNNCQDLESLLLFLQKSKKHLTD
NEFKDPETGKTCLLKAMLNLHDGQNTTIPLLLEIARQTDSLKELVNASYTDSYYKGQTALHIAIERRNMALVTLLVE
NGADVQAAAHGDFFKKTKGRPGFYFGELPLSLAACTNQLGIVKFLLQNSWQTADISARDSVGNTVLHALVEVADNTA
DNTKFVTSMYNEILMLGAKLHPTLKLEELTNKKGMTPLALAAGTGKIGVLAYILQREIQEPECRHLSRKFTEWAYGP
VHSSLYDLSCIDTCEKNSVLEVIAYSSSETPNRHDMLLVEPLNRLLQDKWDRFVKRIFYFNFLVYCLYMIIFTMAAY
YRPVDGLPPFKMEKTGDYFRVTGEILSVLGGVYFFFRGIQYFLQRRPSMKTLFVDSYSEMLFFLQSLFMLATVVLYF
SHLKEYVASMVFSLALGWTNMLYYTRGFQQMGIYAVMIEKMILRDLCRFMFVYIVFLFGFSTAVVTLIEDGKNDSLP
SESTSHRWRGPACRPPDSSYNSLYSTCLELFKFTIGMGDLEFTENYDFKAVFIILLLAYVILTYILLLNMLIALMGE
TVNKIAQESKNIWKLQRAITILDTEKSFLKCMRKAFRSGKLLQVGYTPDGKDDYRWCFRVDEVNWTTWNTNVGIINE
DPGNCEGVKRTLSFSLRSSRVSGRHWKNFALVPLLREASARDRQSAQPEEVYLRQFSGSLKPEDAEVFKSPAASGEK

[0125] 因此，对于存在于其天然脂质环境中的靶膜蛋白质，本发明使得能够针对新颖抗体，进行特异性表位的功能研究或推定结合位点的评估。

[0126] 根据本发明，抗原表位典型地基于表面暴露的肽，该表面暴露的肽在限制性或约束的蛋白质水解期间已经从蛋白质上切割掉。可替代地观察到，典型地表面暴露的肽用于
产生抗原表位。

[0127] 在这方面，抗原表位可以包括表面暴露的肽的氨基酸序列或与其基本同源的序列。抗原表位可以由表面暴露的肽的氨基酸序列或与其基本同源的序列组成。抗原表位可
以与表面暴露的肽的氨基酸序列或与其基本同源的序列重叠。

[0128] 与表面暴露的肽“基本同源”的氨基酸序列包括：与给定的表面暴露的肽的氨基酸序列相比，具有1、2或3个(优选1或2个，更优选1个)氨基酸取代的序列，或包含具有1、2或3个(优选1或2个，更优选1个)氨基酸取代的序列的序列。

[0129] 与表面暴露的肽“基本同源”的氨基酸序列包括：包括表面暴露的肽的至少5个或至少6个连续氨基酸(或由其组成)的序列(或包括表面暴露的肽的至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少15个、至少20个或至少25个连续氨基酸(或由其组成)的序列)。六个氨基酸是被抗体识别或结合的肽/蛋白质序列的典型长度。

[0130] 与表面暴露的肽“基本同源”的氨基酸序列包括：与给定的表面暴露的肽序列具有至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少98％序列一致性的序列，或包括与给定的表面暴露的肽序列具有至少25％、至少30％、至少35％、至少
40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少98％序列一致性的序列的序列。至少70％、至少
75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的序列一致性是优选的。

[0131] 抗原表位可以包括：表面暴露的肽的延长版本(或由其组成)，或者与表面暴露的肽基本同源的氨基酸序列的延长版本(或由其组成)。例如，一个或多个另外的氨基酸(例如至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个或至少9个、至少10个、至少15个或至少20个氨基酸)可以存在于表面暴露的肽序列(或与其基本同源的序列)的一端
或两端。在一些实施例中，最多2个、最多3个、最多4个、最多5个、最多6个、最多7个、最多8个、最多9个、最多10个、最多15个或最多20个氨基酸可能存在于表面暴露的肽序列(或与其基本上同源的序列)的一端或两端。

[0132] 抗原表位可以包括表面暴露的肽的截短版本(或由其组成)，或者与表面暴露的肽基本同源的氨基酸序列的截短版本(或由其组成)。例如，一个或多个氨基酸(例如至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个或9个、至少10个氨基酸)可以不存在于表面暴露的肽序列(或与其基本同源的序列)的一端或两端。在一些实施例中，最多2
个、最多3个、最多4个、最多5个、最多6个、最多7个、最多8个、最多9个、最多10个、最多15个或最多20个氨基酸可能存在于表面暴露的肽序列(或与其基本上同源的序列)的一端或两
端。

[0133] 抗原表位可以是环肽，例如与一种或若干种表面暴露的肽基本同源的环肽，其中该表面暴露的肽在空间中定位为彼此靠近。

[0134] 抗原表位的长度可以是至少5个、或至少6个或至少7个氨基酸，例如长度是6至10、6至12、6至15、6至20、6至25、6至30、6至40、6至50、6至60或6至75个氨基酸。抗原表位的长度可以是，例如，最多7个、最多8个、最多9个、最多10个、最多15个、最多20个、最多25个、最多
30个、最多35个或最多40个氨基酸。抗原表位的长度可以是，例如5至30、6至30、7至30、5至
25、6至25或7至25个氨基酸。抗原表位的长度可以是，例如5至7或5至8或5至9(例如7至9个氨基酸)。为避免疑问，更长的蛋白质或多肽，例如，长度大于100个氨基酸的那些，不认为是本发明中涉及的表位。

[0135] 可以通过任何方便的方法来评估同源性(例如序列一致性)。然而，为了确定序列之间的同源性的程度(例如一致性)，进行序列的多重比对的计算机程序是有用的，例如
Clustal W(Thompson，Higgins，Gibson，Nucleic Acids Res.[核酸研究]，22:4673‑4680,
1994)。如果需要，Clustal W算法可以与BLOSUM 62评分矩阵(Henikoff和Henikoff，
Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]，89:10915‑10919,1992)一起使用，并且间隙开放罚分为10和间隙延伸罚分为0.1，使得在两个序列之间获得最高阶匹配，其中序列之一的总长度的至少50％参与比对。可以用于比对序列的其他方法是Needleman和Wunsch
的比对方(Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.[分子生物杂志]，48:443,1970)，该方法由
Smith和Waterman进行了修改(Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.[应用数学进展]，2:482,
1981)，使得在两个序列之间获得最高阶匹配，并且在两个序列之间确定相同氨基酸的数
量。计算两个氨基酸序列之间的百分比一致性的其他方法通常是本领域公认的，并且包括
例如Carillo和Lipton(Carillo和Lipton，SIAM J.Applied Math.[SIAM应用数学杂志]，
48:1073,1988)所描述的那些，以及Computational Molecular Biology[计算分子生物
学]，Lesk编辑，牛津大学出版社(Oxford University Press)，纽约，1988，Biocomputing:
Informatics and Genomics Projects[生物计算：信息学和基因组学项目]所描述的那些。

[0136] 一般来说，计算机程序将用于这种计算。比较和比对序列对的程序，如ALIGN(Myers和Miller，CABIOS[计算机在生物学中的应用]，4:11‑17,1988)、FASTA(Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]，85:2444‑2448,1988；Pearson，Methods in Enzymology[酶学方法]，183:63‑98,1990)和间隙BLAST(Altschul等人，
Nucleic Acids Res.[核酸研究]，25:3389‑3402,1997)、BLASTP、BLASTN或GCG(Devereux，Haeberli，Smithies，Nucleic Acids Res.[核酸研究]，12:387,1984)也可用于此目的。此外，欧洲生物信息学研究所(European Bioinformatics institute)的Dali服务器(Dali 
server)提供基于结构的蛋白质序列比对(Holm，Trends in Biochemical Sciences[生物
化学趋势]，20:478‑480,1995；Holm，J.Mol.Biol.[分子生物杂志]，233:123‑38,1993；
Holm，Nucleic Acid Res.[核酸研究]，26:316‑9,1998)。

[0137] 根据本发明的抗原表位可以是线性表位或构象表位。

[0138] 在一些实施例中，根据本发明的抗原表位可以是环化表位。

[0139] 用于制备用于免疫的线性抗原表位的常用技术是Fmoc SPPS(固相肽合成)。在SPPS中，小的多孔珠可以用功能性接头进行处理，其上可以使用重复的洗涤‑偶联‑洗涤循环来构建肽链。然后使用化学切割将合成的肽从珠中释放出来。为了合成环肽，通常的方法是利用环化，该环化是通过形成二硫桥(其中桥由两个半胱氨酸形成桥)或通过形成“头对
尾(head‑to‑tail)”桥(其中桥由典型的肽键组成)进行的。环肽可以在固体支持物上形成。
通常使用整个蛋白质或蛋白质的更大部分来培育针对构象表位的抗体。

[0140] 限制性或约束的蛋白水解包括不完成的蛋白质的蛋白水解消化。因此，经由限制性或约束的蛋白质水解，给定的蛋白质可能仅部分消化(或部分解构或部分截短)。限制性
或约束的蛋白水解可以被认为是部分蛋白水解。如果给定的蛋白质对于给定的蛋白酶具有
某一数量的潜在的切割点(即可通过给定的蛋白酶识别用于切割的位点)，则在限制性或约
束的蛋白质水解下，蛋白酶只能在这些切割位点的一个子集上进行切割。

[0141] 限制性或约束的蛋白质水解还包括在限制条件下进行的蛋白水解，由此使蛋白酶活性的动力学减慢到以下程度：一次一个或一次至多几个肽从蛋白质上切割掉。在一些实
施例中，至少一种蛋白酶的动力学活性被减慢，使得所述表面暴露的肽一次一个或一次至
多一次几个被切割掉，例如，一次至多8(1、2、3、4、5、6、7或8)个肽被切割掉(例如样品中至多8个肽或8个独特的肽被切割掉，例如如本文别处所述)，或一次至多7(1、2、3、4、5、6或7)个肽被切割掉(例如样品中至多7个肽或7个独特的肽被切割掉，例如如本文别处所述)(例
如，至多7个肽或样品中至多7个独特的肽，例如本文别处所述)，或一次至多5(1、2、3、4或5)个肽被切割掉(例如样品中至多5个肽或5个独特的肽被切割掉，例如如本文别处所述)。在
一些此类实施例中，蛋白水解反应可以完成，使得蛋白质耗尽可被给定蛋白酶切割掉的肽。

[0142] 如在本文的其他地方描述的，典型地，限制性或约束的蛋白质水解仅导致蛋白质的最灵活的和/或表面暴露的部分被蛋白酶切割掉。

[0143] 在本发明的一些实施例中，所述至少一种蛋白酶在以下条件下使用：导致通过所述蛋白酶的作用，至多8个表面暴露的肽(例如1、2、3、4、5、6、7或8个表面暴露的肽)从蛋白质上切割掉(例如样品中至多8个肽或至多8个独特的肽被切割掉，例如如本文别处所述)。

[0144] 在一个优选的实施例中，所述至少一种蛋白酶在以下条件下使用：导致通过所述蛋白酶的作用，至多7个表面暴露的肽(例如1、2、3、4、5、6或7个表面暴露的肽)或至多5个表面暴露的肽(例如1、2、3、4或5个表面暴露的肽)从蛋白质上切割掉(例如样品中至多7个或至多5个肽、或至多7个或至多5个独特的肽被切割掉，例如如本文别处所述)。

[0145] 典型地，可以通过降低蛋白酶活性来实现根据本发明的限制性或约束的蛋白质水解，例如通过将蛋白酶活性的动力学减慢到到以下程度：一次一个或一次至多几个肽从蛋
白质上切割掉。在一些实施例中，所述至少一种蛋白酶的动力学活性被减慢，使得所述表面暴露的肽一次一个或一次至多几个被切割掉，例如，一次至多8(1、2、3、4、5、6、7或8)个肽被切割掉、或一次至多7(1、2、3、4、5、6或7)个肽被切割掉、或一次至多5(1、2、3、4或5)个肽被切割掉，例如，如上所述。

[0146] 任何适合的条件可用于限制性或约束的蛋白质水解，以便仅导致蛋白质中最灵活的和/或表面暴露的蛋白质部分被蛋白酶切割掉，例如导致至多8个表面暴露的肽、或至多7个表面暴露的肽、或至多5个表面暴露的肽被蛋白酶切割掉。可以通过改变消化反应的温度和/或蛋白酶的浓度和/或消化反应的持续时间和/或缓冲条件来确定导致限制性或约束的
蛋白质水解的条件。在具体条件下从肽切割掉的肽的数目可以由本领域技术人员确定(例
如通过质谱法或蛋白质化学或生物化学)。为限制性或约束的蛋白水解建立适当的条件的
适合方式也在本文其他地方描述。可以为不同的蛋白质、或不同的蛋白酶、或所使用的蛋白质和蛋白酶的具体组合建立适当的限制性或约束的蛋白质水解条件。用于限制性或约束的
蛋白质水解的特别优选的条件在本文的实例中描述。典型地，用于限制性或约束的蛋白质
水解的条件不会改变(或不显著改变)蛋白质的天然构型(天然形式)。蛋白质的辅酶因子可
能是但不一定存在于限制性或约束的蛋白水解过程中。

[0147] 用于限制性或约束的蛋白质水解的适当条件可以取决于蛋白酶和/或蛋白质而不同，但是通常是对于所讨论的蛋白酶是次优的条件，例如使得蛋白酶活性的动力学显著减
慢或降低的条件。

[0148] 通常使用赋予(或提供)蛋白酶的低蛋白水解活性(例如更低或显著低于最优蛋白水解活性)的条件。这些条件包括但不限于使用低浓度的蛋白酶、和/或对所讨论的蛋白酶
来说次优的工作温度、和/或对所讨论的蛋白酶来说非标准或次优缓冲液、和/或蛋白酶与
蛋白质的短接触(孵育)时间。

[0149] 在一些实施例中，在室温(例如约20℃或17℃‑23℃或20‑25℃)下进行限制性或约束的蛋白质水解(例如在最优工作温度(例如37℃或更高)下使用胰蛋白酶或例如使用蛋白酶)。

[0150] 在一些实施例中，限制性或约束性蛋白水解在高于或低于，或显著高于或低于，(优选低于)使用的蛋白酶的最优工作温度至少2℃、至少5℃、至少10℃、或至少20℃的温度下进行。在一些实施例中，限制性或约束性蛋白水解是在高于或低于(优选低于)使用的蛋
白酶的最优工作温度2℃至5℃、2℃至10℃、2℃至20℃、2℃至30℃、5℃至10℃、5℃至20℃、
5℃至30℃、10℃至20℃、10℃至30℃、20℃至30℃的温度下进行。

[0151] 在一些实施例中，高达5μg/ml蛋白酶(例如胰蛋白酶)的浓度用于限制性或约束性蛋白水解。在一些实施例中，浓度高达0.5μg/ml、高达1μg/ml、高达2μg/ml、高达5μg/ml、高达10μg/ml或高达20μg/ml的蛋白酶用于限制性或约束性蛋白水解。优选地，5μg/ml或更低的蛋白酶浓度用于限制性或约束性蛋白水解(例如高达1μg/ml、高达2μg/ml、高达3μg/ml、高达4μg/ml或高达5μg/ml)。在一些实施例中，允许限制性蛋白水解反应进行高达或少于5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、一小时或五小时，通常优选更短的孵育时间。例如，在一些实施例中，允许限制性蛋白水解反应进行至多或少于5分钟、10分钟、15分钟、30分钟。在一些优选的实施例中，限制性或约束性蛋白水解反应是允许进行5分钟或更短(例如4分钟或更
短、3分钟或更短、2分钟或更短或1分钟或更短)的反应。典型地，如果使用高(或更高)浓度的蛋白酶，则使用短(或更短)的孵育时间。纯粹作为举例，如果使用20μg/ml(或更高)浓度的蛋白酶，则可以使用5分钟(或更短)的孵育时间。在一些此类实施例中，限制性蛋白水解在室温下进行。因此，在一些实施例中，在室温下以高达5μg/ml蛋白酶(例如约5μg/ml蛋白酶)的浓度进行至多约5分钟(例如约5分钟)的限制性蛋白水解。

[0152] 在一些实施例中，限制性或约束性蛋白水解是蛋白水解(蛋白水解反应)，其导致(或实现)蛋白质中潜在地被所用的蛋白酶可切割(可消化)的位点(键)的15％或更少、或
10％或更少、或5％或更少(例如1％、2％、3％、4％或5％)切割。可替代地观察到，在一些实施例中，限制性蛋白水解实现15％或更少、或10％或更少、或5％或更少(例如1％、2％、3％、
4％或5％)的蛋白水解。基于蛋白质序列和所用的蛋白酶的底物特异性的知识，本领域技术人员可以容易地鉴别给定蛋白质中可能潜在地被所用蛋白酶切割的位点(例如通过使用计
算机，诸如肽切割器(Peptidecutter)(Expasy，SIB  Swiss Institute  of 
Bioinformatics)。典型地，蛋白质的线性氨基酸序列中所有潜在位点的切割将代表
“100％”值(尽管“100％”值可替代地设定为蛋白质中潜在位点的总数，如果切割后，将释放(或产生)具有所用仪器容易检测的长度的肽，例如所用的MS仪器)。可替代地，可以将
“100％”值设定为蛋白质中潜在地可切割的位点的数量，所述位点已知(或预测为，例如通过使用蛋白质建模工具)在蛋白质的可接近蛋白酶的区域中(例如蛋白质的细胞外部分或
结构域，或例如不是细胞膜内蛋白质的部分或区域或结构域，或不是蛋白质的富含半胱氨
酸的部分或不是蛋白质的翻译后修饰部分，或不是β折叠)。实际上被蛋白酶切割的位点的数量(和位置)也可以由技术人员容易地确定(例如使用质谱法)，因此可以容易地确定实际
切割的潜在可切割位点的百分比。

[0153] 在一些实施例中，限制性或约束性蛋白水解可以被认为是蛋白水解步骤，其在本文所述的一种或多种条件下与限制性或约束性蛋白水解相关地进行。

[0154] 在一些实施例中，可以使用甲酸或氨水停止蛋白水解消化反应。例如，可以使用甲酸停止胰蛋白酶、Asp‑N、蛋白酶K和胰凝乳蛋白酶，并且可以使用氨水停止胃蛋白酶。

[0155] 在本发明的一些实施例中，基于与所述至少一种蛋白酶接触后的出现顺序对切割掉的表面暴露的肽进行排序，其中首先(或早期)被切割掉并且在第一(或早期)取样点检测
到的表面暴露的肽被定为高等级，并且之后被切割掉并且在随后取样点检测到的表面暴露
的肽被定为低等级。快速脱离靶蛋白的、也具有功能意义的高等级肽，典型地可以用于表位开发、免疫和随后的抗体产生。

[0156] 在本发明的一些实施例中，如在本文所述的低(更不苛刻的)蛋白水解活性条件下(例如蛋白酶的浓度(更)低、孵育的温度(更)低和/或孵育的时间(更)短，通常容易消化的
肽)切割掉的表面暴露的肽被定为高等级，并且如在本文所述的高(更苛刻的)蛋白水解活
性条件下(例如蛋白酶的浓度(更)高、孵育的温度(更)高和/或孵育的温度(更)长，通常不
容易消化的肽)切割掉的表面暴露的肽被定为低等级。

[0157] 在一些实施例中，可以在限制性或约束的蛋白质水解反应期间(例如，顺序地))取蛋白水解消化物质的多个样品(或来自蛋白水解消化反应的洗脱液)，和/或多个样品(例如
多个限制性或约束的蛋白质水解反应)可以分开处理(或运行)(例如并行地处理或运行)。

[0158] 在一些实施例中，在蛋白质的限制性或约束的蛋白质水解期间，以时间间隔(例如1分钟、2.5分钟或5分钟间隔)获取(或获得)蛋白水解消化物质的多个样品(或来自蛋白水
解消化反应的洗脱液)。在一些此类实施例中，蛋白酶和/或(典型地是“和”)蛋白酶浓度
(和/或可能影响蛋白水解的其他条件，如本文其他地方所述)对于每个样品(或在每个样品
中)可能是恒定的，其中样品基于与蛋白酶接触(或一起孵育)的时间(或持续时间)变化。在一些此类实施例中，可以顺序获得样品(顺序消化)。

[0159] 在一些实施例中，对多个样品(例如多个限制性或约束的消化反应)进行分开处理(或运行)，其中对于蛋白质的限制性或约束的蛋白质水解，每个样品具有不同的蛋白水解
条件或蛋白水解活性，例如，如本文其他地方所讨论，例如，可以用于不同的样品的不同的蛋白酶和/或不同的蛋白酶浓度和/或不同的温度和/或不同的孵育的时间。在一些此类实
施例中，对于每种样品(或在每种样品中)，与蛋白酶接触(或一起孵育)的时间(或持续时
间)是典型地(或优选地)恒定。在一些此类实施例中，样品可以并行地处理(或运行)。

[0160] 在本发明方法的一些实施例中，通过所述蛋白酶的作用从所述蛋白质上切割掉的表面暴露的肽的数目由蛋白酶的恒定浓度的时间控制，并且随着时间的推移获取若干个样
品，或通过所述蛋白酶的作用从蛋白质上切割掉的表面暴露的肽的数目由恒定时间的蛋白
酶的浓度控制，并且可以在若干种不同浓度的蛋白酶下获取(或运行)若干个样品，或通过
所述蛋白酶的作用从蛋白质上切割掉的表面暴露的肽的数目由所述蛋白酶的时间和浓度
二者控制。

[0161] 每个样品(或优选的样品)可以优选地包含已经从蛋白质上切割掉的一个或几个肽(例如多达8个肽或多达8个独特的肽)。因此，可以在每个样品中检测到已经从蛋白质上
切割掉的一个或几个肽(例如多达8个肽或多达8个独特的肽)。独特的肽是不存在于先前样
品中的肽，或不存在于具有更弱(或更不苛刻)的蛋白水解条件的样品中的肽(例如与存在
于先前样品中的肽或存在于具有更弱蛋白水解条件的样品中的肽明显不同(distinct)或
不同(different)的肽)。因此，包含多达8个独特的肽的样品可包含大于8种不同的肽，但是这些肽中的一种或多种可能已经在先前的样品或具有更弱蛋白水解条件的样品中检测到
(并且因此这些肽中的一种或多种肽可以是非独特的肽)。

[0162] 理想地，并且优选地，每个样品将仅包含单个切割掉的肽。例如，可以在第一样品(或取样点)中检测到单个切割掉的肽，并且可以在一个或多个随后样品(或取样点)中检测到单个切割掉的肽。在其他实例中，可以在第一和/或随后样品(取样点)中检测多个切割掉的肽(例如多达8个肽或多达8个独特的肽)。可以通过使用短的取样间隔、不同的蛋白酶浓
度、不同的缓冲液组成、不同的温度、不同的盐浓度、或蛋白酶抑制剂(或其组合)来建立每个样品产生一个或几个切割掉的肽(例如多达8个肽或多达8个独特的肽)的条件。可以基于
其中出现切割掉的肽的样品(取样点)对这些切割掉的肽进行排序。例如，导致在每个取样
点仅检测到一个肽的条件下，获取的第一样品中的肽被定为最高等级、获取的第二样品中
的肽被定为等级2等。使用在每个取样点仅检测到单个切割掉肽的条件，对单个肽进行排序是可能的。使用在每个取样点检测到多个切割掉肽的条件，对肽的组的排序是可能的。

[0163] 在一些实施例中，更高等级的表面暴露的肽(切割掉的肽)是优选的。在一些实施例中，根据本发明的表面暴露的肽(例如高等级肽)是在(或存在于)所获取的第一样品中检
测的切割掉的肽。在一些实施例中，就在蛋白质的限制性或约束的蛋白质水解过程中获取
的一个或多个样品的其出现顺序而言，根据本发明的表面暴露的肽(例如高等级肽)是被切
割掉的肽，这一切割掉的肽是前8位的肽(例如前8位的独特的肽)之一，或存在于包含前8位的肽(例如前7位或前5的肽)(例如前8位、前7位或前5位的独特的肽)之一样品中。此类肽可以在(或存在于)所获取的第一样品中检测到或可存在于一个或多个随后获取的样品中。

[0164] 典型地，首先(或早期)从蛋白质上切割掉的肽(例如，在如上所述的获取的第一样品(第一取样点)中的肽，或是基于在如上所述的限制性或约束的蛋白质水解期间的出现顺
序，排前8的肽(例如前8等级的独特的肽)的肽)是那些被很好地暴露(例如表面暴露)并且
因此被蛋白酶容易地接近的肽。这种第一(或早期)消化的肽被定为高等级(例如，第一出现的肽被定为等级1，第二出现的被定为等级2等)。典型地，之后从蛋白质上切割掉的肽(例如在比早期肽更晚的取样点)是那些暴露不太好并且因此蛋白酶不容易接近的肽。此类之后
消化的肽被定为更低的等级。在本发明中，典型地优选具有高等级的肽。

[0165] 在一些实施例中，具有在蛋白质表面最多暴露的氨基酸序列的切割掉的肽(表面暴露的肽)优选用于抗原表位开发。

[0166] 在一些实施例中，可以基于肽对蛋白质有或预测有功能重要性来对这些肽(切割掉的肽)进行排序。典型地，具有对蛋白质有或预测有功能重要性的氨基酸序列的那些肽比具有对蛋白质无或预测无功能重要性的氨基酸序列的那些肽具有更高的等级。在一些实施
例中，优选更高等级的肽。

[0167] 在一些实施例中，具有对蛋白质有或预测有功能重要性(例如具有高等级的功能重要性)的氨基酸序列、并且另外具有基于表面暴露的高等级的肽(例如，如上所述的在获
取的第一样品(第一取样点)的肽或基于如上所述在限制性或约束的蛋白质水解期间的出
现顺序，排前8的肽(例如前8等级的独特的肽))的那些肽优选用于抗原表位开发(或另一种
方式是抗原表位所基于的优选的肽)。

[0168] 在一些实施例中，具有对蛋白质有或预测有功能重要性(例如具有高等级的功能重要性)的氨基酸序列、但是另外不具有基于表面暴露的高等级的肽(例如不是如上所述的
在获取的第一样品(第一取样点)的肽或基于如上所述在限制性或约束的蛋白质水解期间
的出现顺序，排前8的肽(例如前8等级的独特的肽))的那些肽可以用于抗原表位开发。

[0169] 在一些实施例中，具有对蛋白质无或预测无功能重要性(例如具有低等级的功能重要性)的氨基酸序列、但是具有基于表面暴露的高等级的肽(例如如上所述的在获取的第
一样品(第一取样点)的肽或基于如上所述在限制性或约束的蛋白质水解期间的出现顺序，
排前8的肽(例如前8等级的独特的肽))的那些肽可以用于抗原表位开发。

[0170] 在一些实施例中，抗原表位是基于首先(或早期)从所述蛋白质上切割掉的表面暴露的肽(例如，如上所述获取的第一样品(第一取样点)中的肽或基于如上所述在限制性或
约束的蛋白质水解期间的出现顺序，排前8的肽(例如前8等级的独特的肽))的肽，而不管切割掉的肽的氨基酸序列的功能重要性或预测的功能重要性。

[0171] 在一些实施例中，抗原表位是基于表面暴露的肽，该表面暴露的肽是基于在另外具有对蛋白质有或预测有功能重要性的氨基酸序列的那些肽的限制性或约束的蛋白质水
解期间的出现顺序，排前8的肽(例如前8等级的独特的肽)。这些肽不一定(但可以)与仅基
于出现顺序的绝对前8个肽的集合相同(如上所述)。

[0172] 在一些实施例中，鉴别或选择蛋白质上的感兴趣区域(该区域是或被预测为对于蛋白质具有功能重要性)，并且抗原表位是基于表面暴露的肽(该表面暴露的肽是基于在另
外具有从所述感兴趣区域切割掉的氨基酸序列的那些肽的限制性或约束的蛋白质水解期
间的出现顺序，排前8的肽(例如前8等级的独特的肽))。这些肽不一定(但可以)与仅基于出现顺序的绝对前8个肽的集合相同(如上所述)。

[0173] 在一些实施例中，针对抗体产生的抗原表位是基于在限制性蛋白水解期间通过蛋白酶的作用，首先(或早期)从所述蛋白质上切割掉并因此具有高等级的肽(表面暴露的肽)
(例如，如上所述获取的第一样品(第一取样点)中的肽或基于如上所述在限制性或约束的
蛋白质水解期间的出现顺序，排前8的肽(例如前8等级的独特的肽))的肽的氨基酸序列。

[0174] 因此，在一些实施例中，本发明的方法包括挑选具有高等级的表面暴露的肽(如上所述获取的第一样品(第一取样点)中的肽或基于如上所述在限制性或约束的蛋白质水解
期间的出现顺序，排前8的肽(例如前8等级的独特的肽)的肽)，用于抗原表位开发并培养针对所述抗原表位的抗体(所述表位基于所述表面暴露的肽(或从其开发))。

[0175] 在一些实施例中，本发明的方法包括挑选具有高等级的表面暴露的肽(如上所述获取的第一样品(第一取样点)中的肽或基于如上所述在限制性或约束的蛋白质水解期间
的出现顺序，排前8的肽(例如前8等级的独特的肽)的肽)，来基于所述表面暴露的肽构建抗原表位并培育针对所述抗原表位的抗体。

[0176] 在一些实施例中，本发明的方法包括挑选具有高等级的表面暴露的肽(如上所述获取的第一样品(第一取样点)中的肽或基于如上所述在限制性或约束的蛋白质水解期间
的出现顺序，排前8的肽(例如前8等级的独特的肽)的肽)并且将其与蛋白质的定义的生物
学特性(或生物功能)相关，来基于所述表面暴露的肽构建抗原表位并培育针对所述抗原表
位的抗体。典型地，优选具有与蛋白质的定义的生物学特性(或功能)相关的氨基酸序列的
肽。

[0177] 可以采用被用于鉴别切割掉的肽(表面暴露的肽)的任何手段。在一些实施例中，使用质谱鉴别切割掉的肽。在一些实施例中，将液相色谱与质谱组合使用。优选地，用LC‑MS/MS(液相色谱‑串联质谱)鉴别切割掉的肽(表面暴露的肽)。示例性和优选的质谱方法在实施例中描述。串联质谱可以由MASCOT(英国伦敦的矩阵科学(Matrix Science，London，
UK))针对适当的数据库进行检索，例如，如实例中所述。

[0178] 本文所述的消化、解构或截短的蛋白质是已经通过蛋白酶在沿其长度上的一个或多个位点处被切割掉的蛋白质。此类蛋白水解切割导致一个或多个肽(表面暴露的肽)从蛋
白质上切割掉(即从蛋白质释放出来)。因此，表面暴露的肽是已经通过蛋白酶的作用从蛋
白质上切割掉的肽。典型地，在全长蛋白质(即未切割掉的蛋白质)的背景下，术语“表面暴露”反映了这样的事实，对应于切割掉(释放的)肽序列的蛋白质的部分是良好的暴露并且
可接近蛋白酶。

[0179] 本发明提供用于治疗性抗体发现的新方法和针对人类TRPV1蛋白的新的药理学活性抗体。

[0180] 本发明涉及在良好暴露的蛋白上检测表位的方法，并且因此本发明可以用作抗体靶向的指导。

[0181] 本发明的一些方法包括通过鉴别被切割掉的表面暴露的肽来鉴别抗原表位的步骤，这一切割掉的肽具有对所述蛋白质有或预测有功能重要性(例如生物重要性)的氨基酸
序列，并且基于这种表面暴露的肽产生抗原表位。在一些实施例中，针对这种抗原表位培育抗体。

[0182] 可以通过任何适合的手段鉴别从所述蛋白质上切割掉的表面暴露的肽是否具有氨基酸序列，该氨基酸序列对所述蛋白质有或预测有功能重要性，并且本领域技术人员将
会很容易地能够做到这一点。

[0183] 例如，在一些实施例中，在功能测定中测试在限制性或约束的蛋白质水解期间被消化、解构或截短的蛋白质，以评估其功能或功能活性(例如生物功能)是否已被改变。这可以通过比较消化的、解构的或截短的蛋白质的功能活性的水平与尚未进行限制性或约束的
蛋白质水解的蛋白质的功能活性的水平(没有经受限制性或约束的蛋白水解的蛋白质的功
能活性的水平可以视为对照水平)来完成。如果蛋白质的生物功能在限制性或约束的蛋白
质水解之后(或期间)被改变，这表明一个或多个被切割掉的肽(表面暴露的肽)已从与蛋白
质功能相关的蛋白质(例如具有生物重要性的蛋白质)的区域中被切割掉了。因此，切割掉
的表面暴露的肽可以与功能数据相关以评估表面暴露的肽对蛋白质的功能重要性。例如，
在平行实验中，可以鉴别一个或多个被切割掉的肽(例如，可以鉴别一个或多个被切割掉的肽的序列)，如本文其他地方所述(例如通过LC‑MS/MS)。如果从蛋白质上切割肽(表面暴露的肽)导致蛋白质的功能活性的改变，则这表明表面暴露的肽在本发明中可以特别用于抗
原表位产生。可替代地观察到，基于此类表面暴露的肽的抗原表位可能是特别有用的并且
优选用于抗体产生。

[0184] 在一个实施例中，蛋白质是TRPV1，并且确定切割掉的肽对TRPV1的功能重要性的测定是如本文别处所述的内面向外膜片钳测定法。

[0185] 对于功能或功能活性，“改变的”或“改变”可以是任何可测量的改变，优选显著改变、更优选统计学上显著的改变“改变的”功能或功能“改变”可以是功能的增加或减少。功能的示例性改变是≥2％、≥3％、≥5％、≥10％、≥25％、≥50％、≥75％、≥100％、≥200％、≥300％、≥400％、≥500％、≥600％、≥700％、≥800％、≥900％、≥1000％、≥
2000％、≥5000％，或≥10,000％的改变。典型地，与功能或功能活性的适当对照水平相比评估改变，例如与尚未进行限制性或约束的蛋白质水解的等价蛋白质的功能或功能活性相
比较评估改变。

[0186] 在一些实施例中，抗原表位基于表面暴露的肽的氨基酸序列，当该表面暴露的肽从蛋白质上切割掉时导致蛋白质的功能或功能活性的改变。

[0187] 在一些实施例中，表面暴露的肽序列是否具有功能重要性(例如生物重要性)是通过生物信息学手段和/或通过使用已知关于蛋白质的功能重要区域的其他信息(例如在学
术文献中)预测或确定的。因此，切割掉的表面暴露的肽可以与已知关于蛋白质的功能重要区域的数据相关，以预测或确定切割掉的肽对蛋白质的功能重要性。如果表面暴露的肽的
氨基酸序列已知具有(或预测具有)功能重要性，则这表明该表面暴露的肽在本发明中可以
特别用于抗原表位产生。可替代地观察到，基于此类表面暴露的肽的抗原表位可能是特别
有用的并且优选用于抗体产生。

[0188] 因此，在一些实施例中，抗原表位基于已知(或预测为)在功能上重要的表面暴露的肽的氨基酸序列，例如，基于生物信息学分析和/或基于关于蛋白质的功能重要区域已知的(例如在学术文献中的)其他信息。

[0189] 在一些实施例中，抗原表位是TRPV1的抗原表位，其基于与TRPV1的钙调素结合序列或TRPV1的辣椒素结合位点相关(或与之对应)的表面暴露的肽的氨基酸序列。

[0190] 在一些实施例中，除了通过生物信息学手段和/或通过使用已知关于蛋白质的功能重要区域的其他信息(例如在学术文献中)来预测或确定表面暴露的肽的功能重要性之
外，还进行功能测定来确定表面暴露的肽的功能重要性。

[0191] “生物信息学手段”、“生物信息学分析”、“生物信息学数据”和“生物信息学信息”包括但不限于数据库检索(例如BLAST检索)、结构建模、或结构生物学以及由此获得的数据/信息。

[0192] 功能(例如生物功能)可以包括所讨论的蛋白质的任何生物或生理相关功能。功能(例如生物功能)包括但不限于：蛋白质与靶标(例如配体或受体)或其他结合配偶体(例如
辅因子)结合的能力、信号传导活性、蛋白质的酶活性和离子通道活性，转运活性，释放(例如胰岛素释放)和摄取机制等。因此，蛋白质的功能相关或功能重要的区域包括但不限于：
赋予蛋白质结合靶标(例如配体或受体)或其他结合配偶体(例如辅因子)的能力的区域、赋
予信号传导活性的区域、具有蛋白质的酶活性的区域、赋予离子通道活性的区域、赋予转运活性的区域、以及赋予分子(例如胰岛素)的释放和摄取的区域。

[0193] 在一个实施例中，本发明的方法进一步包括：经由电脑产生一组推定肽(或全部推定肽)的步骤，这些推定肽可以通过一种或多种蛋白酶(例如通过使用计算机程序，该程序
可以基于所述一种或多种蛋白酶的已知一个或多个识别序列，鉴别该蛋白质中的切割点)
从蛋白质上切割掉，并任选地过滤所述经由电脑产生的推定肽的集合以除去先前已经描述
的肽(例如，在序列数据库(例如BLAST检索)中或在其他文献中)，从而获得推定肽的过滤列表，将推定肽的所述过滤列表与通过蛋白质的限制性或约束的蛋白质水解鉴别的肽的列表
进行比较，鉴别通过蛋白质的限制性或约束的蛋白质水解鉴别的所述过滤列表和所述肽的
列表二者共有的肽，基于两个列表共有的肽鉴别(或构建)抗原表位，以及任选地培育针对
所述抗原表位的抗体。

[0194] 在另一个方面，本发明提供鉴别抗原表位的方法，所述方法包括：

[0195] (i)通过使第一蛋白质与至少一种蛋白酶接触以形成至少一种消化、解构或截短版本的该第一蛋白质和至少一种表面暴露的肽来将该第一蛋白质暴露于限制性或约束的
蛋白质水解，该表面暴露的肽通过所述蛋白酶的作用从该第一蛋白质上切割掉；

[0196] (ii)鉴别第二蛋白质的区域(或部分区域或区域部分)的氨基酸序列，该氨基酸序列与从第一蛋白质上切割掉的表面暴露的肽的氨基酸序列相同或基本同源；和

[0197] (iii)基于所述第二蛋白质的所述区域(或部分区域或区域部分)的氨基酸序列产生抗原表位，该氨基酸序列与从第一蛋白质上切割掉的表面暴露的肽的氨基酸序列相同或
基本同源；并且任选地

[0198] (iv)培育针对该抗原表位的抗体。

[0199] 基本同源的序列的示例性类型在本文其他地方讨论。基于对不同蛋白质(第一蛋白质)进行的限制性或约束的蛋白质水解，此类方法可以促进针对蛋白质(第二蛋白质)的
抗原表位产生。当第一和第二蛋白质在相同的蛋白质家族中或以其他方式相关时(例如可
以使用在TRPV1上进行的限制性或约束的蛋白质水解的数据鉴别TRPV2抗原表位时)，这可
能是特别有用的。可以使用任何适合的手段(例如计算机程序)和技术人员熟悉的手段来确
定(或鉴别)第二蛋白质上的基本同源的蛋白质。纯粹作为举例，由EMBL‑EBI提供的EMBOSS Needle程序是一个适合的计算机程序。EMBOSS针读取两个输入序列并写入其最优全局序列
比对，使用Needleman‑Wunsch比对算法进行计算，以找到沿其整个长度的两个序列的最优比对(包括间隙)。

[0200] 在本发明的一些实施例中，抗原表位不是基于表面暴露的肽，该表面暴露的肽具有与另一种或多种蛋白质保守的氨基酸序列(例如，进化上保守的序列或与表面暴露的肽
的氨基酸序列相同或基本同源的序列)。这可以最小化针对此类抗原表位培育的抗体的交
叉反应性(或非特异性结合)。换句话说，在一些实施例中可以使用基于独特氨基酸序列(或其他蛋白质中未发现的序列)的抗原表位

[0201] 本发明涉及在功能上相关的蛋白上检测表位的方法，并且因此本发明可以用作抗体靶向的指导。更确切地，此类方法包括用于揭示靶蛋白的热点表位的蛋白质组学工具。潜在地可以用作抗体的生产中的抗原的这些表位在本文中被表示为抗原表位。

[0202] 在本发明的一个方面，蛋白质通过蛋白酶作用被消化、解构和/或截短，并且并行地通过在消化的、解构的和/或截短的蛋白质上进行一个或多个功能测定来探测蛋白质，以描绘蛋白质的一个或多个功能重要区域。

[0203] 在一个实施例中，可以并行地通过一个或多个功能测定来进行蛋白质的消化、解构和/或截短，以描绘蛋白质的功能重要区域以引导针对抗体产生的表位选择。

[0204] 在一个实施例中，可以使用单个蛋白酶来消化、解构和/或截短蛋白质。在另一个实施例中，可以使用多种蛋白酶来按顺序一次一个地或并行地消化、解构和/或截短靶蛋
白。此类蛋白酶的示例为、但不限于：Arg‑C蛋白酶、Asp‑N肽链内切酶、梭菌蛋白酶、谷氨酰肽链内切酶、Lys‑C、Lys‑N、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、蛋白酶K和嗜热菌蛋白酶。易于被若干种蛋白酶消化的区域应该位于蛋白质的暴露区域中，并且仅被单个蛋白酶消化的区域可能
位于更隐藏的区域中。可替代地，蛋白酶具有独特的切割特异性或/和物理化学特性或/和
结构特征，使得其可以鉴别其他蛋白酶不能鉴别的在靶蛋白上的表面暴露的肽。因此，优选使用多种蛋白酶，并且每种不同的蛋白酶可以产生关于表面暴露的肽作为抗原表位的适合
性的互补或独特的信息。

[0205] 多种蛋白酶的顺序使用意味着不同的蛋白酶与蛋白质一个接一个地孵育，即一个蛋白酶被孵育，随后又在之后的时间点孵育另一个蛋白酶，以及在稍后的一个或多个时间
点任选地孵育一个或多个其他不同的蛋白酶。

[0206] 单个蛋白酶的顺序使用意味着将相同的蛋白酶(例如相同浓度的蛋白酶)与蛋白质一起孵育若干次(例如，在若干个不同的(顺序)时间点)，或者意味着从蛋白水解消化反
应中随时间取出若干个样品，并且随着时间的推移检测和跟踪在反应中产生的新的或独特
的肽的出现。

[0207] 并行地使用意味着进行多个单独的单蛋白酶消化反应，每个反应使用不同的蛋白酶、或者使用相同的蛋白酶但不同的蛋白水解条件(例如，如本文别处描述的，不同的蛋白酶浓度和/或温度和/或时间点)。

[0208] 可以使用多种蛋白酶来鉴别重叠的、互补的或独特的表面暴露的肽。在这种情况下，“重叠”是指经由用一种蛋白酶的限制性或约束的蛋白质水解鉴别的表面暴露的肽具有以下氨基酸序列：与经由用一种或多种其他(即不同的)蛋白酶的限制性或约束的蛋白水解
鉴别的表面暴露的肽的氨基酸序列(部分或完全)重叠。在这种情况下，“互补”是指经由用一种蛋白酶的限制性或约束的蛋白质水解鉴别的表面暴露的肽具有以下氨基酸序列：在整
个蛋白质序列的背景中(即在限制性或约束的蛋白质水解之前的整个蛋白质序列),位于与
经由用一种或多种其他(即不同的)蛋白酶的限制性或约束的蛋白质水解鉴别的表面暴露
的肽的氨基酸序列紧邻或接近(或甚至部分重叠)。“独特的”表面暴露的肽是仅在用一个或几个(少数)测试的蛋白酶的限制性或约束的蛋白水解之后才被鉴别的表面暴露的肽。

[0209] 不希望被理论束缚，被多于一种蛋白酶切割掉的蛋白质的区域可能在蛋白质的良好暴露(例如表面暴露)区域中，并且因此来自被多于一种蛋白酶切割掉的蛋白质的区域的
表面暴露的肽可以代表特别有用的表面暴露的肽，抗原表位是基于这些表面暴露的肽的。

[0210] 使用多种蛋白酶包括但不限于使用2、3、4、5种蛋白酶。

[0211] 在本发明方法的一些实施例中，蛋白酶选自下组，该组由以下各项组成：胰蛋白酶、Arg‑C蛋白酶、Asp‑N肽链内切酶、梭菌蛋白酶、谷氨酰肽链内切酶、Lys‑C、Lys‑N、胰凝乳蛋白酶、蛋白酶K、嗜热菌蛋白酶、胃蛋白酶、半胱天冬酶1、半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶4、半胱天冬酶5、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、半胱天冬酶10、肠激酶、因子Xa、粒酶B、中性粒细胞弹性蛋白酶、脯氨酸‑肽链内切酶、葡萄球菌肽酶I、和凝血酶。

[0212] 在一些优选的实施例中，蛋白酶选自下组，该组由以下各项组成：胰蛋白酶、Asp‑N肽链内切酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K。在优选的实施例中，蛋白酶是胰蛋白酶。

[0213] 在本发明的又另一方面，在时间上间隔地以恒定或不同浓度的一种或若干种蛋白酶的单个或多个激发中，单一地一起使用若干种蛋白酶的混合物。因此，在一些实施例中，使用多种蛋白酶的单一混合物(cocktail)(混合物(mixture))。

[0214] 如果使用多种蛋白酶，则可以为每个单独的蛋白酶产生排序列表。

[0215] 这种方法将对得到对蛋白质功能的新的基本了解、以及可以用于治疗人和/或动物的医学症状的药理学活性抗体的快速和精确开发的新方法/技术。该方法可以推广到所
有蛋白质，可溶性蛋白质或膜结合蛋白质、细胞外的蛋白质或细胞内的蛋白质。

[0216] 通过所提出的方法产生的表位的列表优选地针对生物信息学数据和一个或多个功能测定进行分类。该方法优选地使用来自两个实验的输入数据和生物信息学信息。在一
个实施例中，重点将在膜和膜相关蛋白质上。此类蛋白质是例示但不限于人类伤害感受器
TRPV1、TRP超家族中的其他离子通道、连同一些兴奋性氨基酸受体(包括NMDA受体和G‑蛋白质)。这些蛋白质(例如离子通道)具有这样的优点：可以使用例如膜片钳，以详细的方式直接研究它们。其他类型的感兴趣的蛋白质与致癌蛋白质(包括致癌小GTP酶KRAS、NRAS和
HRAS)有关。KRAS是若干种转移性恶性肿瘤(包括胰腺癌、结肠癌和肺癌)中的关键蛋白质。
例如，GTP酶活性可以通过以下研究：GTP的放射性同位素标记，随后测量GTP水解至GDP后的游离32P，或降低测定(pull‑down assays)，随后进行蛋白质印迹。而其他有趣的蛋白质类别是涉及癌症疗法中的免疫调节的免疫调节蛋白，例如PD1、PDL1、CD40(仅作为几个实例)。

[0217] 根据本发明的“蛋白质”可以是任何蛋白质。

[0218] 在本发明的一些实施例中，蛋白质是膜结合蛋白质，可溶性(例如循环)蛋白质、细胞外蛋白质或细胞内蛋白质。

[0219] 在一些实施例中，蛋白质是膜蛋白质或膜相关蛋白质。

[0220] 在一些实施例中，蛋白质是离子通道，例如TRP超家族中的离子通道(例如TRPV1或TRPV2)。在优选的实施例中，蛋白质是TRPV1。

[0221] 在一些实施例中，蛋白质是兴奋性氨基酸受体。在一些此类实施例中，蛋白质是NMDA受体或G‑蛋白质。

[0222] 在一些实施例中，蛋白质是致癌蛋白质。在一些此类实施例中，蛋白质是选自下组的致癌小GTP酶，该组由以下各项组成：KRAS、NRAS和HRAS。

[0223] 在一些实施例中，蛋白质是免疫调节蛋白。在一些此类实施例中，蛋白质选自下组，该组由以下各项组成：PD1、PDL1、CD40、OX40、VISTA、LAG‑3、TIM‑3、GITR和CD20。

[0224] 在一些实施例中，蛋白质是包括在本文表9、10、11或12中任一个中的蛋白质。因此，在一些实施例中，蛋白质该组由以下各项组成(或包括)甘露糖基‑寡糖1,2‑α‑甘露糖苷酶IA(Mannosyl‑oligosaccharide 1,2‑alpha‑mannosidase IA)、脂肪醛脱氢酶(Fatty aldehyde dehydrogenase)、CD81抗原、嗅感受蛋白1B1(Olfactory receptor 1B1)、氯化物通道CLIC样蛋白质1(Chloride channel CLIC‑like protein 1)、可能的G蛋白偶联受体83(Probable G‑protein coupled receptor 83)、PRA1家族蛋白3(PRA1family protein 3)、甘油‑3‑磷酸酰基转移酶4(Glycerol‑3‑phosphate acyltransferase 4)、POTE锚蛋白结构域家族成员F(POTE ankyrin domain family member F)、NADH‑细胞色素b5还原酶3(NADH‑cytochrome b5reductase 3)、激肽原‑1(Kininogen‑1)、Rho相关的GTP结合蛋白RhoC(Rho‑related GTP‑binding protein RhoC)、钠/氢通道6(Sodium/hydrogen exchanger 6)、淀粉样蛋白2(Amyloid‑like protein 2)、膜相关孕酮受体成分1(Membrane‑associated 
progesterone receptor component 1)、磷脂酶D4(Phospholipase D4)、基质金属蛋白酶‑
14(Matrix metalloproteinase‑14)、Atlastin‑3、蛋白YIF1A(Protein YIF1A)、囊泡相关膜蛋白1(Vesicle‑associated membrane protein 1)、氯化物通道CLIC样蛋白1(Chloride channel CLIC‑like protein 1)、高尔基体蛋白亚家族B成员1(Golgin subfamily B 
member 1)、脱氢酶/还原酶SDR家族成员7B(Dehydrogenase/reductase SDR family 
member 7B)、阴离子交换转运蛋白(Anion exchange transporter)、跨膜蛋白192
(Transmembrane protein 192)、含有跨膜和泛素样结构域的蛋白1(Transmembrane and 
ubiquitin‑like domain‑containing  protein  1)、多聚嘧啶串结合蛋白1
(Polypyrimidine tract‑binding protein 1)、RNA结合蛋白Musashi同系物2(RNA‑
binding protein Musashi homolog 2)、死亡结构域相关蛋白6(Death domain‑
associated protein 6)、推定泛素缀合酶E2N样(Putative ubiquitin‑conjugating 
enzyme E2N‑like)、泛素缀合酶E2N(Ubiquitin‑conjugating enzyme E2N)、α‑中心体肌动蛋白(Alpha‑centractin)、AP‑2复合物亚基β(AP‑2complex subunit beta)、mRNA脱帽酶1A(mRNA‑decapping enzyme 1A)、钙腔蛋白(Calumenin)和RNA结合蛋白14(RNA‑binding 
protein 14)。

[0225] 在一些实施例中，蛋白质不是尿激酶纤溶酶原激活物受体(u‑PAR)、转谷氨酰胺酶3(TGase3)、脑膜炎奈瑟氏球菌蛋白质或大麻素受体(例如CB1)。

[0226] 在一些实施例中，蛋白质是真核蛋白质。例如，在一些实施例中，蛋白质是哺乳动物蛋白质，优选人蛋白质。

[0227] 在一些实施例中，蛋白质是人类蛋白质组的任何蛋白质。换句话说，人类蛋白质是优选的。

[0228] 使用这些靶标的单个蛋白酶或多蛋白酶限制消化方案，将导致发现针对热点表位的新抗体。不同的蛋白酶会产生不同的切割掉的肽。在一个实施例中，膜蛋白质被解构，并且这种逐件截短的作用被探测以影响蛋白质功能。仅用某些蛋白酶观察到的稀少斑点也将
被鉴别。然后，然后将针对策划(curated)的生物信息学数据以及也来自截短的蛋白质的功能测定来分析鉴别数据，以识别所讨论的蛋白质的功能重要区域。

[0229] 实施例的一个方面涉及鉴别蛋白质中的抗原表位的方法。该方法包括通过使蛋白质与至少一种蛋白酶接触以形成至少一种消化、解构或截短版本的蛋白质和至少一种表面
暴露的肽来将蛋白质暴露于限制性或约束的蛋白质水解。在另一个实施例中，该方法还包
括在测试、检查或验证蛋白质的至少一种生物功能的功能测定中探测至少一种消化的、解
构的或截短的版本的蛋白质。该方法进一步包括鉴别蛋白质中的抗原表位，将其鉴别为在
至少一种表面暴露的肽中的，并且存在于参与如基于功能测定确定的发挥蛋白质的生物学
功能的蛋白质的区域中的一种表面暴露的肽。

[0230] 在一个实施例中，将蛋白质暴露于限制性或约束的蛋白质水解包括在以下条件使蛋白质与至少一种蛋白酶接触：i)至少一种蛋白酶的选择的温度或温度范围、ii)至少一种蛋白酶的选择的浓度或浓度范围(相对于蛋白质的浓度)、和/或iii)在选择的持续时间期
间。这转而使得至少一种蛋白酶能够切割蛋白质的表面暴露区域，而不是蛋白质的非灵活
的和/或内部的区域。

[0231] 通过使蛋白质与至少一种蛋白酶接触将蛋白质暴露于限制性或约束的蛋白质水解，这意味着蛋白质暴露于温和的蛋白水解。因此，特别是蛋白质的一个或多个表面暴露的和灵活的肽部分将通过至少一种蛋白酶的作用从氨基酸序列上切割掉。典型地，在蛋白水
解中使用的温度、浓度和/或持续时间取决于具体的一种或多种蛋白酶和当前的蛋白质。因此，在一个实施例中，首先测试一组候选蛋白水解条件以选择或鉴别用于消化的适合的温
度、蛋白酶的浓度和/或持续时间、以及缓冲液条件以解构或截短蛋白质并获得至少一个表面暴露的肽。例如，可以在多个(即至少两个)不同的反应温度、在多个不同的蛋白酶浓度
(相对于蛋白质的浓度)、和/或在多个不同的反应持续时间(包括不同的缓冲液条件)下进
行蛋白水解，如图1所示，以鉴别蛋白质和一种或多种蛋白酶的当前组合的最适当的蛋白水解条件。

[0232] 例如，适合的蛋白酶条件是导致蛋白质消化、解构或截短为一个或最多N个表面暴露的肽的温度、浓度和/或持续时间。参数N的典型值为7、优选为6或5、更优选为4或3、甚至更优选为2或1。

[0233] 在一个实施例中，功能测定测试、检查或验证蛋白质的至少一种生物功能。这种生物功能的非限制性实例包括蛋白质结合靶标(如配体或受体)的能力；蛋白质的酶活性；离子通道活性；等。

[0234] 在一个实施例中，将蛋白质暴露于限制性或约束的蛋白质水解包括：通过使蛋白质与多种蛋白酶接触以形成多个消化、解构或截短版本的蛋白质和多种表面暴露的肽来将
蛋白质暴露于限制性或约束的蛋白质水解。在一个具体实施例中，蛋白质连续(即一个接一个)地与多种蛋白酶接触。在另一个具体实施例中，蛋白质与多种蛋白酶并行地接触。

[0235] 在一个实施例中，鉴别抗原表位包括鉴别至少一种表面暴露的肽中的表面暴露的表位，该表面暴露的肽存在于区域中，导致当在限制性或约束的蛋白质水解期间该区域从
该蛋白质上切割掉或除去时，蛋白质的生物功能的缺乏或显著改变。

[0236] 在一个实施例中，该方法还包括基于蛋白质的生物功能的生物信息学和/或已知数据来选择蛋白质内的至少一个靶区域。在这种情况下，鉴别抗原表位包括鉴别至少一种
表面暴露的肽中的表面暴露的肽，该表面暴露的肽存在于至少一个靶区域中的蛋白质的区
域中。

[0237] 在该实施例中，使用生物信息学和/或生物功能的其他已知数据来指导抗原表位选择。这意味着在鉴别或选择抗原表位时，只有存在于所选一个或多个靶区域之一中的表
面暴露的肽才被用作候选物。因此，可以通过去除或省略存在于已知缺乏任何生物功能和/或已知不参与发挥蛋白质的生物功能的的区域中的表面暴露的肽来减少候选物的数目。

[0238] 实施例的另一方面涉及根据鉴别蛋白质中的抗原表位的上述方法鉴别的抗原表位。

[0239] 在一个实施例中，本发明提供TRPV1的抗原表位，该抗原表位包括选自下组的氨基酸序列(或由其组成)，该组由以下各项组成：

[0240] LLSQDSVAASTEK(SEQ ID NO:2)；

[0241] LLSQDSVAASTEKTLR(SEQ ID NO:3)；和

[0242] QFSGSLKPEDAEVFKSPAASGEK(SEQ ID NO:4)，

[0243] 或与其基本同源的序列。

[0244] 在另一个实施例中，本发明提供TRPV1的抗原表位，该抗原表位包括选自下组的氨基酸序列(或由其组成)，该组由以下各项组成：

[0245] LLSQDSVAASTEKTLRLYDRRS(SEQ ID NO:5)；和

[0246] GRHWKNFALVPLLRE(SEQ ID NO:6)。

[0247] 在一个实施例中，本发明提供TRPV1的抗原表位，该抗原表位包括LVENGADVQAAAHGDF(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列或与其基本同源的序列(或由其组成)。

[0248] 在另一个实施例中，本发明提供TRPV1的抗原表位，该抗原表位包括选自下组的氨基酸序列(或由其组成)，该组由以下各项组成：

[0249] DGPTGARLLSQ(SEQ ID NO:8)；和

[0250] DAEVFKSPAASGEK(SEQ ID NO:9)，

[0251] 或与其基本同源的序列。

[0252] 在另一个实施例中，本发明提供TRPV1的抗原表位，该抗原表位包括选自下组的氨基酸序列(或由其组成)，该组由以下各项组成：

[0253] SQDSVAASTEKTL(SEQ ID NO:10)；和

[0254] SGSLKPEDAEVF(SEQ ID NO:11)，

[0255] 或与其基本同源的序列。

[0256] 在一个实施例中，本发明提供TRPV1的抗原表位，该抗原表位包括选自下组的氨基酸序列(或由其组成)，该组由以下各项组成：

[0257] VSPVITIQRPGD(SEQ ID NO:12)；

[0258] VSPVITIQRPGDGPTGA(SEQ ID NO:13)；

[0259] LNLHDGQNTTIPLLL(SEQ ID NO:14)；

[0260] YTDSYYKGQ(SEQ ID NO:15)

[0261] SLPSESTSH(SEQ ID NO:16)

[0262] EDPGNCEGVKR(SEQ ID NO:17)

[0263] DRQSAQPEEVYLR(SEQ ID NO:18)；和

[0264] QSAQPEEVYLR(SEQ ID NO:19)，

[0265] 或与其基本同源的序列。

[0266] 在一些实施例中，本发明提供了TRPV1的抗原表位，该抗原表位包括如在本文实例3中表2、3、4、5和6中的每一个中的第二标题(标有双星号(**)的标题)下列出的氨基酸序列或与其基本同源的序列。使用更高的蛋白水解活性(或更严格或更强的蛋白水解条件)消化
的此类肽通常不如使用更低的蛋白水解活性(或更不苛刻或更弱的蛋白水解条件)(例如更
短的时间和/或更低浓度)消化的肽优选，例如，如在第一个标题(列于表2、3、4、5和6中的每一个中标有单个星号(*)的标题)下列出，但如果它们对蛋白质有或预测有功能重要性，则
可能是特别有意义的。在表2、3、4、5和6(**)中的第二个标题下列出的肽可以被认为是之后消化的肽，并且在表2、3、4、5和6(*)中的第一个标题下列出肽可以被认为是首先被消化的肽。

[0267] 在上述TRPV1的抗原表位的上下文中，与给定的氨基酸相比，所述基本同源的序列可以是包含1、2、3、4、5或6(优选1、2或3)个氨基酸取代或缺失的序列，或者是与给定氨基酸序列具有至少70％序列一致性的序列，或是具有给定氨基酸序列的至少6个连续氨基酸的
序列。关于与表面暴露的肽“基本同源”的氨基酸序列，“基本同源”序列的其他实例在本文中别处描述，并且“基本同源的”序列的这些实例也适用于上述特定的肽序列。上述特定的肽序列是表面暴露的肽序列。

[0268] 在一些实施例中，本发明提供了抗原表位，该抗原表位包括上述肽序列(或与其基本同源的序列)的延长、截短或环状版本(或由其组成)。在延长、截短和环状版本的表面暴露的肽的上下文中，本文在其他地方讨论了延长、截短的和环状版本的肽，并且该讨论也适用于上述肽序列。上述特定的肽序列是表面暴露的肽序列。

[0269] 在一个实施例中，本发明提供TRPV2的抗原表位，该抗原表位包括选自下组的氨基酸序列(或由其组成)，该组由以下各项组成：

[0270] FAPQIRVNLNYRKGTG(SEQ ID NO:20)；

[0271] ASQPDPNRFDRDR(SEQ ID NO:21)

[0272] LNLKDGVNACILPLL(SEQ ID NO:22)

[0273] CTDDYYRGH(SEQ ID NO:23)

[0274] LVENGANVHARACGRF(SEQ ID NO:24)

[0275] EDPSGAGVPR(SEQ ID NO:25)；和

[0276] GASEENYVPVQLLQS(SEQ ID NO:26)，

[0277] 或与其基本同源的序列。示例性基本同源的序列在本文其他地方讨论。

[0278] 实施例的另一方面涉及构造成用于产生抗体的轭合物。轭合物包括与肽载体偶联或与肽载体混合的至少一个如上定义的抗原表位。

[0279] 因此，在一个方面，本发明提供了包括本发明的或由本发明鉴别(或由本发明产生)的抗原表位的轭合物。轭合物可以包括抗原表位和任何不同的实体(即与抗原表位不同
的任何实体)，例如标记物或肽载体。典型地，轭合物包括抗原表位和肽载体，其中所述抗原表位与所述肽载体偶联或混合。

[0280] 在一个实施例中，肽载体选自下组，该组由以下各项组成(或包括以下各项)：钥孔戚血蓝蛋白(KLH)和卵清蛋白。例如,偶联可以是共价偶联或二硫桥。在一个实施例中，钥孔戚血蓝蛋白是优选的肽载体。在一些实施例中，抗原表位可以在其N‑末端或C‑末端(优选N‑末端)处提供半胱氨酸残基。此类半胱氨酸残基可以促进抗原表位与肽载体(例如KLH)的偶联。

[0281] 实施例的又另一方面涉及根据上述用于产生特异性结合蛋白质的抗体的抗原表位和/或轭合物的用途。

[0282] 实施例的仍另一方面涉及用于产生特异性结合蛋白质的抗体的方法。该方法包括针对根据上文的抗原表位和/或轭合物培育抗体并分离抗体。分离抗体可以包括从其生产
或产生的细胞(例如宿主细胞)和/或从生长培养基/上清液来分离抗体。

[0283] 在一个具体实施例中，该方法包括通过使蛋白质与至少一种蛋白酶接触以形成至少一种消化、解构或截短版本的蛋白质和至少一种表面暴露的肽来将蛋白质暴露于限制性
或约束的蛋白质水解。该方法还包括在测试、检查或验证蛋白质的至少一种生物功能的功
能测定中探测至少一种消化的、解构的或截短的版本的蛋白质。该方法进一步包括鉴别蛋
白质中的抗原表位，将其鉴别为在至少一种表面暴露的肽中的，并且存在于参与如基于功
能测定确定的发挥蛋白质的生物学功能的蛋白质的区域中的一种表面暴露的肽。该方法还
包括培育针对抗原表位的抗体并分离抗体。

[0284] 可以根据本领域已知的技术来培育针对抗原表位的抗体，这些技术包括例如本文前面所述的杂交瘤技术、噬菌体展示技术等。

[0285] 实施例的另一方面涉及针对根据上文的抗原表位和/或轭合物的抗体。抗体特异性结合蛋白质。

[0286] 因此，在一个方面，本发明提供由本发明的方法产生(或生产)的抗体。

[0287] 在另一个方面，本发明提供了针对本发明抗原表位的抗体。可替代地观察到，本发明提供了结合本发明的抗原表位的抗体。可替代地观察到，本发明提供了与本发明的抗原表位特异性结合的抗体。

[0288] 作为实例，本发明提供了针对抗原表位的抗体，该抗原表位包括选自下组的氨基酸序列(或由其组成)，该组由以下各项组成：LLSQDSVAASTEKTLRLYDRRS(SEQ ID NO:5)和
GRHWKNFALVPLLRE(SEQ  ID  NO:6)。在一个实施例中，针对包含氨基酸序列
LLSQDSVAASTEKTLRLYDRRS(SEQ ID NO:5)(或由其组成)的抗体是针对TRPV1的拮抗性(抑制
性)抗体，优选具有抗体OTV1的实例部分中描述的一种或多种功能特性。该表位对应于位于TRPV1的N‑末端细胞内结构域中的氨基酸序列。在一个实施例中，针对包含氨基酸序列
GRHWKNFALVPLLRE(SEQ ID NO:6)(或由其组成)的抗体是针对TRPV1的激动性抗体，优选具
有抗体OTV2的实例部分中描述的一种或多种功能特性。该表位对应于位于TRPV1的C‑末端
细胞内结构域中的氨基酸序列。

[0289] 在一些实施例中，抗体可以针对细胞内TRPV1表位(或结构域)。在一些此类实施例中，抗体可以是针对细胞内TRPV1表位(或结构域)的拮抗性(抑制性)抗体。在其他此类实施例中，抗体可以是针对细胞内TRPV1表位(或结构域)的激动性抗体。

[0290] 在一个实施例中，抗体与蛋白质的结合导致蛋白质的生物功能的缺乏或显著改变。

[0291] 因此，抗体可以是功能性抗体，例如激动性抗体或拮抗性抗体(例如针对TRPV1或TRPV2的拮抗性或激动性抗体)。拮抗性抗体能够结合蛋白质并抑制或降低蛋白质的功能。
激动性抗体能够结合蛋白质并增强或增加蛋白质的功能。在TRPV1或TRPV2(或任何其他离
子通道)的情况下，所涉及的功能可以是离子传输活性。例如，可以评估抗体阻断(降低)或增强(增加)辣椒素或钙调素结合的能力。具有此类能力的抗体形成本发明的优选实施例。

[0292] 实施例的相关方面定义了根据上述用作药物的抗体。

[0293] 针对抗原表位和/或轭合物的抗体可以通过用根据实施例的一种或多种抗原表位和/或一种或多种轭合物免疫动物来获得。免疫的动物可以选自下组，该组包括人、小鼠、大鼠、兔、绵羊、非人灵长类动物、山羊、马和家禽。

[0294] 根据实施例的抗体也可以通过使用根据实施例的一种或多种抗原表位和/或一种或多种轭合物的体外免疫方法获得。

[0295] 根据本发明的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。

[0296] 抗体可以是配体、抗体的一个或多个片段(例如Fab(片段抗原结合)片段、F(ab)'2片段(包含两个Fab的片段)、ScFv片段(单链可变片段)、双抗体、四抗体、或完整抗体。

[0297] 典型地，本发明的抗体能够与其所针对的蛋白质的全长版本，例如其天然形式的蛋白质的全长版本(例如在细胞中或细胞上)结合(例如特异性结合)。

[0298] 在一些实施例中，抗体是针对本文别处描述的蛋白质(或蛋白质类型)的抗体。

[0299] 抗体和抗原表位可以被分离或纯化。在本文的上下文中，使用的术语“分离的”或“纯化的”是指当此类分子从其天然环境中分离、纯化或天然环境中基本不含此类分子时(例如，从生物体分离或纯化(如果确实天然存在))，或者是指此类分子通过技术方法产生
时，即包括重组和合成产生的分子。因此，术语“分离的”或“纯化的”典型地是指基本上不含细胞材料的或衍生自其来源的其他蛋白质的抗体或抗原表位。在一些实施例中，当化学合
成时，当通过重组技术或化学前体或其它化学品生产时，此类分离的或纯化的分子基本上
不含培养基。

[0300] 可以评估由本发明产生的抗体对其靶蛋白的功能效应，并且本领域技术人员将容易地能够确定(例如基于靶蛋白的性质)使用的适合的测定法。例如，如果抗体是针对TRPV1(或任何其他离子通道)的抗体，则可以例如使用本文实例2中描述的电生理学和/或YO‑PRO摄取测定法来评估抗体的功能效应。

[0301] 本发明的方法可以用于产生抗体，然后可以将该抗体分离、生产或制造用于不同下游用途。因此，本发明的另一方面提供了生产或制造和/或分离抗体的方法。

[0302] 当已经使用本发明的方法产生、生产、选择、鉴别、分离和/或纯化一种或多种抗体时，可以制造，以及如果需要，与至少一种药学上可接受的载体或赋形剂来配制这些抗体或其组分、片段、变体、或衍生物。这样制造的分子或其组分、片段、变体或衍生物也涵盖在本发明中。可替代地，这些分子可以采用编码所述抗体的核酸的形式，这些核酸转而可以并入适当的表达载体和/或包含在适合的宿主细胞中。因此，编码所述抗体的核酸分子或包含所述核酸分子的表达载体形成本发明的其他方面。

[0303] 一旦根据本发明已经产生或产生具体抗体或其组分、片段、变体或衍生物，编码抗体的表达载体可以容易地用于(或适于使用)通过在适当的宿主细胞或系统中表达，并且酌情从宿主细胞或系统或其生长培养基或上清液中分离抗体来产生足够量的分子。对于多克
隆抗体，这些抗体可以从免疫的动物的血清中被分离或纯化。

[0304] 因此，本发明的仍另一方面提供了一种生产或制造抗体的方法，该方法包括以下步骤：根据如上所述的本发明的方法产生或生产抗体，制造或产生所述抗体或其组分、片
段、变体或衍生物，并任选地用至少一种药学上可接受的载体或赋形剂配制所述制造的抗
体。

[0305] 抗体的所述变体或衍生物包括类肽等同物，具有非肽合成骨架的分子、和与原始鉴别的多肽相关或衍生自原始鉴别的多肽的多肽，其中氨基酸序列已经通过单个或多个氨
基酸取代、添加和/或缺失进行修饰，这些取代、添加和/或修饰可替代地或另外地包括已经例如通过去糖基化或糖基化的化学修饰的氨基酸的取代或添加。方便地，此类衍生物或变
体可与其衍生的原始多肽具有至少60％、70％、80％、90％、95％或99％的序列一致性。

[0306] 由于本发明涉及抗体的产生，所述变体或衍生物进一步包括将一种形式的抗体分子转化为另一种形式(例如从Fab转化为scFv、或反之亦然，或在本文别处描述的任何形式
的抗体分子之间的转化，例如转化为如本文所述的任何其他类型的抗体片段)，或将抗体分子转化为具体类别的抗体分子(例如，抗体分子转化为IgG或其亚类(例如IgG1或IgG3)，这
些IgG特别适用于治疗性抗体)或人源化或任何抗体的嵌合版本的形成。

[0307] 所述变体或衍生物还包括抗体与另外的功能组分的联合，例如其可用于所述抗体的下游应用。例如，抗体可以与将其靶向体内具体位点的组分相关，或者与可用于例如成像或其他诊断应用的可检测的部分相关或与负荷(payload)如放射性同位素、毒素或化学治
疗剂(免疫轭合物形式)相关。

[0308] 清楚地，这些组分、片段、变体或衍生物结合配偶体分子或靶实体的主要要求是它们在结合能力方面保持其原始功能活性或具有改善的功能活性。

[0309] 使用本发明的方法产生或生产或制造的抗体分子可以用于需要对靶实体特异的抗体(例如对具体抗原特异的抗体)的任何方法。因此，抗体可以用作分子工具，并且本发明的另一方面提供了包括如本文所定义的此类抗体的试剂。此外，此类分子可用于体内治疗
或预防应用、体内或体外诊断或成像应用或体外测定。

[0310] 本发明的一些特定实施例如下：

[0311] 1.一种产生针对蛋白质的抗体的方法，所述方法包括：

[0312] (i)通过将蛋白质暴露于限制性或约束性蛋白水解来鉴别所述蛋白质中的抗原表位，所述限制性或约束性蛋白水解通过将所述蛋白质与至少一种蛋白酶接触以形成至少一
种消化的、解构的或截短的蛋白质版本和至少一种表面暴露的肽，所述表面暴露的肽通过
所述蛋白酶的作用从蛋白质切割掉，且生成基于所述表面暴露的肽的抗原表位；和

[0313] (ii)培育针该抗原表位的抗体。

[0314] 2.一种产生针对蛋白质的抗体的方法，包括以下步骤：

[0315] (i)将蛋白质暴露于限制性或约束性蛋白水解，所述限制性或约束性蛋白水解通过将所述蛋白质与至少一种蛋白酶接触以形成至少一种消化的、解构的或截短的蛋白质版
本和至少一种表面暴露的肽，所述表面暴露的肽通过所述蛋白酶的作用从蛋白质切割掉；
和；

[0316] (ii)通过鉴别存在于蛋白质区域中的至少一种表面暴露的肽中的表面暴露的表位来鉴别抗原表位，所述表位暴露的肽导致在限制性或约束性蛋白水解过程中，肽从蛋白
质切割掉或去除时，蛋白质的生物学功能缺乏或发生显著改变；或

[0317] 基于生物信息学和/或蛋白质的生物功能的已知数据选择蛋白质内的至少一个目标区域，并通过鉴别存在于所述至少一个目标区域内的至少一个表面暴露的肽中的表面暴
露的表位来鉴别抗原表位；和

[0318] (iii)培育针该抗原表位的抗体。

[0319] 3.实施例1或者实施例2中的方法，其中在导致至多8个或至多7个或至多5个表面暴露的肽，或至多8个或至多7个或至多5个独特表面暴露的肽的条件下使用所述至少一种
蛋白酶，表面暴露的肽通过在蛋白水解消化的材料样品中所述蛋白酶的作用从蛋白质切割
掉，并且任选地，多个样品依次或平行地处理或运行，任选地在不同的时间段和/或在所述蛋白酶的不同浓度下。

[0320] 4.实施例1‑3中任意一项的方法，其中所述至少一种蛋白酶在通过所述蛋白酶的作用导致至多8个或至多7个或至多5个表面暴露的肽从蛋白质切割掉的条件下使用。

[0321] 5.实施例1‑4中任意一项的方法，其中所述至少一种蛋白酶的动力学活性快速降低使得所述表面暴露的肽一次一个或最多一次几个切割掉，例如在样品中一次最多8个或
最多7个或最多5个，并且任选地，多个样品可以依次或平行地处理或运行。

[0322] 6.实施例1‑5中任意一项的方法，其中所述切割掉表面暴露的肽基于与所述至少一种蛋白酶接触后出现的顺序排序，其中首先或在所述蛋白酶的最低浓度下切割掉的表面
暴露的肽被给予高等级，并且后期或在所述蛋白酶的最高浓度下切割掉的表面暴露的肽被
给予低等级，并且任选地在其间切割掉的表面暴露的肽以它们出现的顺序排序。

[0323] 7.实施例6的方法，其中所述方法包括挑选具有高等级的表面暴露的肽用于抗原表位发育和培育针对所述抗原表位的抗体。

[0324] 8.实施例6的方法，其中所述方法包括挑选具有高等级的表面暴露的肽，基于所述表面暴露的肽构建抗原表位并培育针对所述抗原表位的抗体。

[0325] 9.实施例6的方法，其中所述方法包括挑选具有高等级的表面暴露的肽，将所述表面暴露的肽与蛋白质的限定的生物学特性相关联，基于所述表面暴露的肽构建抗原表位并
培育针对所述抗原表位的抗体。

[0326] 10.实施例1‑9中任意一项的方法，其中使用单一蛋白酶消化、解构和/或截短所述蛋白质。

[0327] 11.实施例1‑9中任意一项的方法，其中使用多种蛋白酶来消化、解构和/或截短所述蛋白质。

[0328] 12.实施例11的方法，其中所述多种蛋白酶一次一个地按顺序使用，并行使用，或者在多种蛋白酶的单一混合物中使用。

[0329] 13.实施例11或实施例12的方法，其中所述多种蛋白酶用于鉴别重叠、互补或独特的表面暴露的肽。

[0330] 14.实施例1‑13中任意一项的方法，其中所述蛋白酶选自：胰蛋白酶、Arg‑C蛋白酶、Asp‑N内肽酶、梭菌蛋白酶、谷氨酰内肽酶、Lys‑C、Lys‑N、胰凝乳蛋白酶、蛋白酶K、嗜热菌蛋白酶、胃蛋白酶、半胱天冬酶1、半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶4、半胱天冬酶5、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、半胱天冬酶10、肠激酶、因子Xa、颗粒酶B、中性白细胞弹性蛋白酶、脯氨酸‑内肽酶、葡萄球菌肽酶I和凝血酶。

[0331] 15.实施例1‑14中任意一项的方法，其中所述蛋白酶是胰蛋白酶。

[0332] 16.实施例1‑15中任意一项的方法，其中所述蛋白质是存在于衍生自细胞的蛋白脂质体中的膜蛋白。

[0333] 17.实施例1‑16中任意一项的方法，其中所述蛋白脂质体固定在流动细胞中以产生膜蛋白的固定相。

[0334] 18.实施例1‑15中任意一项的方法，其中所述蛋白质在含蛋白质的脂质囊泡中，所述脂质囊泡表面结合或悬浮在溶液中。

[0335] 19.实施例1‑15中任意一项的方法，其中所述蛋白质在表面结合或悬浮在溶液中的完整细胞中。

[0336] 20.实施例1‑15中任意一项的方法，其中所述蛋白质在溶液中。

[0337] 21.实施例1‑20中任一项的方法，其中所述蛋白质是人蛋白质组的任何蛋白质。

[0338] 22.实施例1‑21中任一项的方法，其中所述蛋白质是膜结合蛋白、可溶性蛋白、细胞外蛋白或细胞内蛋白。

[0339] 23.实施例1‑22中任一项的方法，其中所述蛋白质是膜蛋白或与膜相关蛋白。

[0340] 24.实施例1‑23中任一项的方法，其中所述蛋白质是TRP超家族中的离子通道。

[0341] 25.实施例24的方法，其中所述蛋白质是TRPV1或TRPV2。

[0342] 26.实施例1‑23中任一项的方法，其中所述蛋白质是兴奋性氨基酸受体。

[0343] 27.实施例26的方法，其中所述蛋白质是NMDA受体或G蛋白。

[0344] 28.实施例1‑23中任一项的方法，其中所述蛋白质是致癌蛋白质。

[0345] 29.实施例28的方法，其中所述蛋白质是选自KRAS、NRAS和HRAS的致癌小GTP酶。

[0346] 30.实施例1‑23中任一项的方法，其中所述蛋白质是免疫调节蛋白。

[0347] 31.实施例30的方法，其中所述蛋白质选自PD1、PDL1、CD40、OX40、VISTA、LAG‑3、TIM‑3、GITR和CD20。

[0348] 32.实施例1‑31中任一项的方法，其中所述切割掉的肽采用质谱法鉴别。

[0349] 33.实施例24的方法，其中用LC‑MS/MS鉴别所述切割掉的肽。

[0350] 34.实施例2‑33中任一项的方法，其中所述生物学功能选自所述蛋白质结合靶标例如配体或受体的能力、所述蛋白质的酶活性、离子通道活性、转运蛋白活性、和释放，例如胰岛素释放和摄取机制。

[0351] 35.实施例1‑34中任一项的方法，其中通过杂交瘤技术、噬菌体展示技术或通过用所述抗原表位免疫动物来进行针对抗原表位的抗体的培育。

[0352] 36.根据实施例1‑35中任一项的方法，其中所述抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。

[0353] 37.通过实施例1‑36中任一项的方法产生的抗体。

[0354] 38.TRPV1的抗原表位，其包含选自下述组别中的氨基酸序列：

[0355] LLSQDSVAASTEK(SEQ ID NO:2)；

[0356] LLSQDSVAASTEKTLR(SEQ ID NO:3)和

[0357] QFSGSLKPEDAEVFKSPAASGEK(SEQ ID NO:4)；

[0358] 或与其基本同源的序列；

[0359] 其中所述基本同源的序列是与给定的氨基酸序列相比含有1、2或3个氨基酸取代或缺失的序列，或者是与给定的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的序列，或者是具有
给定氨基酸序列的至少6个连续氨基酸的序列。

[0360] 39.TRPV1的抗原表位，其包含选自下述组别中的氨基酸序列：

[0361] LLSQDSVAASTEKTLRLYDRRS(SEQ ID NO：5)；和

[0362] GRHWKNFALVPLLRE(SEQ ID NO：6)。

[0363] 40.TRPV1的抗原表位，其包括LVENGADVQAAAHGDF(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列，或者与其基本同源的序列；

[0364] 其中所述基本同源的序列是与给定的氨基酸序列相比含有1、2或3个氨基酸取代或缺失的序列，或者是与给定的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的序列，或者是具有
给定氨基酸序列的至少6个连续氨基酸的序列。

[0365] 41.TRPV1的抗原表位，其包含选自下述组别中的氨基酸序列：

[0366] DGPTGARLLSQ(SEQ ID NO：8)；和

[0367] DAEVFKSPAASGEK(SEQ ID NO：9)

[0368] 或与其基本同源的序列；

[0369] 其中所述基本同源的序列是与给定的氨基酸序列相比含有1、2或3个氨基酸取代或缺失的序列，或者是与给定的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的序列，或者是具有
给定氨基酸序列的至少6个连续氨基酸的序列。

[0370] 42.TRPV1的抗原表位，其包含选自下述组别中的氨基酸：

[0371] SQDSVAASTEKTL(SEQ ID NO：10)；和

[0372] SGSLKPEDAEVF(SEQ ID NO：11)

[0373] 或与其基本同源的序列；

[0374] 其中所述基本同源的序列是与给定的氨基酸序列相比含有1、2或3个氨基酸取代或缺失的序列，或者是与给定的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的序列，或者是具有
给定氨基酸序列的至少6个连续氨基酸的序列。

[0375] 43.TRPV1的抗原表位，其包含选自下述组别中的氨基酸：

[0376] VSPVITIQRPGD(SEQ ID NO:12)；

[0377] VSPVITIQRPGDGPTGA(SEQ ID NO:13)；

[0378] LNLHDGQNTTIPLLL(SEQ ID NO:14)；

[0379] YTDSYYKGQ(SEQ ID NO:15)；

[0380] SLPSESTSH(SEQ ID NO:16)；

[0381] EDPGNCEGVKR(SEQ ID NO:17)；

[0382] DRQSAQPEEVYLR(SEQ ID NO:18)；和

[0383] QSAQPEEVYLR(SEQ ID NO:19)；

[0384] 或与其基本同源的序列；

[0385] 其中所述基本同源的序列是与给定的氨基酸序列相比含有1、2或3个氨基酸取代或缺失的序列，或者是与给定的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的序列，或者是具有
给定氨基酸序列的至少6个连续氨基酸的序列。

[0386] 44.TRPV2的抗原表位，其包含选自下述组别中的氨基酸：

[0387] FAPQIRVNLNYRKGTG(SEQ ID NO:20)；

[0388] ASQPDPNRFDRDR(SEQ ID NO:21)；

[0389] LNLKDGVNACILPLL(SEQ ID NO:22)；

[0390] CTDDYYRGH(SEQ ID NO:23)；

[0391] LVENGANVHARACGRF(SEQ ID NO:24)；

[0392] EDPSGAGVPR(SEQ ID NO:25)；和

[0393] GASEENYVPVQLLQS(SEQ ID NO:26)

[0394] 或与其基本同源的序列；

[0395] 其中所述基本同源的序列是与给定的氨基酸序列相比含有1、2或3个氨基酸取代或缺失的序列，或者是与给定的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的序列，或者是具有
给定氨基酸序列的至少6个连续氨基酸的序列。

[0396] 45.针对实施例38‑44中任一项的抗原表位的抗体。

[0397] 如上所述，我们开发了一种鉴别表面暴露的抗原表位的方法，该方法使用动力学控制的蛋白水解产生药理学活性抗体(即限制性或约束性蛋白水解)。理想地，蛋白水解步
骤(限制性或约束性蛋白水解步骤)进行得足够缓慢以使得蛋白酶在此时脱落(tear off)
单个或几个肽。首先出现的肽，且特别是他们各自的切割位点，是表面暴露的并且容易接近抗体，因此通常优于晚期出现的肽。这些肽的基于序列的功能性意义然后可以使用策划的
生物信息学数据以及对截短的蛋白质进行的功能测定进行交叉相关联。

[0398] 然而，本发明还提供了对上述方法进行改进的方法，其允许进一步优化表位设计和/或鉴别其他(另外的)表位。这种改进的方法如下描述并也称为方法C。

[0399] 这种改进的方法是多蛋白酶方法，其涉及在相同蛋白质上顺序使用多种蛋白酶，以最大化鉴别的表位的数量。这种改进的方法利用两个不同的蛋白水解步骤；限制性或约
束性蛋白水解的步骤，例如，如上所述，然后使用与限制性或约束性蛋白水解步骤中使用的那些不同的蛋白酶(protease)或多种蛋白酶(proteases)(具有不同特异性的蛋白酶)进行
进一步的蛋白水解步骤(例如，非限制性蛋白水解步骤)。有利地，这种方法可用于鉴别蛋白酶可接近的切割位点，但其中肽未被释放，所以不一定通过基于上述单一限制性蛋白水解
步骤的方法鉴别或检测。因此，该方法提供了鉴别蛋白酶可接近的切割位点处或附近的天
然蛋白质上的表位的手段，但其中肽未被释放。

[0400] 总之，这些改进的方法应该改善抗体开发并产生新的治疗和药理学活性抗体以对抗疾病。可以使用本文描述的方法生产细胞内和细胞外作用的药理学活性抗体。

[0401] 在与用于发现新抗体的许多已知技术不同的本发明的方法中，可以从一开始就设计抗体以结合特定位点并任选地执行特定功能，而不是盲目地完成，其中最初的焦点是通
常根据亲和力而非功能性，随后测试显示出良好结合特征的抗体子集的药理学和生物学效
应。

[0402] 当使用如上所述的限制性蛋白水解方法作为验证抗体结合的可接近区域的工具时，它依赖于从蛋白质释放肽，即它依赖于在围绕正确大小的序列的两个可接近位点的蛋
白酶切割的情况用于检测，例如通过质谱法。从这样的实验获得的信息可以提供对被消化
并导致肽释放的两个切割位点的可接近性的验证。然而，蛋白质中的一些感兴趣区域可能
不满足这些标准。蛋白酶可能只切割单个位点，产生缺口但不释放肽。肽的释放需要两次切割。如果没有肽被释放，则没有结合事件或蛋白水解活性的证据(例如，基于MS的证据)。单一切割还未检测。未检测的其他原因可包括肽上的糖基化，或肽通过离子键或共价键保持
与蛋白质结合。解决该问题的一种方法是产生针对这样的切割位点居留在其中的序列的抗
体。然而，首先，您必须找到一种方法来检测或鉴别这些无法释放多肽的可接近的切割位
点。本发明提供了这样做的方法。

[0403] 本发明人已经开发了额外的和改进的方法，因为使用先前的方法，可能缺少几个潜在的抗体结合位点(表位)，因为一些肽未被释放。例如，如果蛋白酶仅切割某个氨基酸序列周围的两个切割位点之一，或者如果蛋白酶在一个位点切割并且肽由于某些其他原因未
释放，则可能发生这种情况。在下面描述的改进方法(方法C)中，可以发现独特和新颖的抗体结合位点(表位)，并且另外，产生天然的和部分消化的蛋白质的新结构数据。因此，该技术可以提供用于探测蛋白质结构和功能的综合工具。

[0404] 方法C

[0405] 在一方面，本发明提供了鉴别蛋白质上可被抗体结合的表位的方法，所述方法包括：

[0406] (i)使用单一第一蛋白酶或第一蛋白酶的组合对所述蛋白质执行限制性或约束性蛋白水解；

[0407] (ii)使用单一第二蛋白酶或第二蛋白酶的组合对所述蛋白质执行非限制性蛋白水解或执行限制性或约束性蛋白水解，其中所述一种或多种第二蛋白酶均不同于步骤(i)
中使用的一种或多种蛋白酶；

[0408] (iii)分析在步骤(ii)中从所述蛋白质释放的肽，以鉴别其中一端已被所述第一蛋白酶切割而另一端已被所述第二蛋白酶切割的肽；

[0409] (iv)探测蛋白质区域中的一个或多个表位，所述蛋白质区域包含或侧接切割位点，所述切割位点是步骤(iii)中鉴别的所述第一蛋白酶的切割位点，其中一种或多种抗体针对所述表位，从而鉴别可被抗体结合的蛋白质上一个或多个表位。

[0410] 在一个方面，本发明提供鉴别蛋白质上可被抗体结合的表位的方法，所述方法包括：

[0411] (i)使用单一第一蛋白酶或第一蛋白酶的组合对所述蛋白质执行限制性或约束性蛋白水解；

[0412] (ii)使用单一第二蛋白酶或第二蛋白酶的组合对所述蛋白质执行非限制性蛋白水解，其中所述一种或多种第二蛋白酶均不同于步骤(i)中使用的一种或多种蛋白酶；

[0413] (iii)分析在步骤(i)和步骤(ii)中从所述蛋白质释放的肽，以鉴别其中一端已被所述第一蛋白酶切割而另一端已被所述第二蛋白酶切割的肽；

[0414] (iv)探测蛋白质区域中的一个或多个表位，所述蛋白质区域包含或侧接切割位点，所述切割位点是步骤(iii)中鉴别的所述第一蛋白酶的切割位点，其中一种或多种抗体针对所述表位，从而鉴别可被抗体结合的蛋白质上一个或多个表位。

[0415] 另一方面，本发明提供鉴别蛋白质上可被抗体结合的表位的方法，所述方法包括：

[0416] (i)使用单一第一蛋白酶或第一蛋白酶的组合对所述蛋白质执行限制性或约束性蛋白水解；

[0417] (ii)使用单一第二蛋白酶或第二蛋白酶的组合对所述蛋白质执行非限制性蛋白水解或执行限制性或约束性蛋白水解，其中所述一种或多种第二蛋白酶均不同于步骤(i)
中使用的一种或多种蛋白酶；

[0418] (iii)分析在步骤(i)和步骤(ii)中从所述蛋白质释放的肽，以鉴别其中一端已被所述第一蛋白酶切割而另一端已被所述第二蛋白酶切割的肽；

[0419] (iv)探测蛋白质区域中的一个或多个表位，所述蛋白质区域包含或侧接切割位点，所述切割位点是步骤(iii)中鉴别的所述第一蛋白酶的切割位点，其中一种或多种抗体针对所述表位，从而鉴别可被抗体结合的蛋白质上一个或多个表位。

[0420] 步骤(i)

[0421] 限制性或约束性蛋白水解的步骤(方法C的步骤(i))可以通过本文其他地方描述的任何适当的限制性或约束性蛋白水解方法或步骤实施。这样的步骤也可以被称为限制性
或约束性蛋白酶消化，或所选蛋白质暴露于限制性或约束性蛋白水解的步骤。换句话说，限制性或约束性蛋白水解的步骤是不走向或不进行或未实施至完成(which is not taken 
to or does not go toor is not carried out to completion)的蛋白水解步骤(或蛋白
水解消化)。因此，在该步骤中，给定的蛋白质可以仅被部分消化(或经历部分蛋白水解)。该步骤通过使所选蛋白质(天然蛋白质)在导致限制性或约束性蛋白水解(如本文其他地方所
述)的条件下与一种或多种适当的蛋白酶接触而方便地实施，所述条件。在这样的条件下，使蛋白质与一种或多种蛋白酶接触导致形成至少一种消化的、解构的或截短的蛋白质和至
少一种表面暴露的肽，其通过所述一种或多种蛋白酶的作用从蛋白质上切割掉。

[0422] 单一蛋白酶可用于该步骤。可替代地，多种蛋白酶可以组合在一起使用(例如，可以使用蛋白酶混合物，其同时加入蛋白质样品或与蛋白质样品接触)。在一些实施例中，优选使用单一蛋白酶。在该步骤中使用的一种或多种蛋白酶在本文中也被称为“一种或多种
第一蛋白酶”或“一种或多种蛋白酶A”。这是为了将这些蛋白酶与该方法的步骤(ii)中使用的蛋白酶区分开(这些蛋白酶在本文中也被称为“一种或多种第二蛋白酶”或“一种或多种蛋白酶B”)。在该方法的步骤(ii)中使用的一种或多种蛋白酶将不同于在步骤(i)中使用的蛋白酶，即它们将具有不同的特异性(不同的底物特异性)。

[0423] 可以使用任何适当的蛋白酶，并且可以在这种限制性或约束性蛋白水解步骤中使用的合适的蛋白酶在本文其他地方描述。通常优选的蛋白酶是具有强大或高特异性的蛋白
酶(例如，不具有消除其特异性之外的氨基酸的倾向)和/或经过充分验证和表征的蛋白酶
(例如，就特异性而言)(换言之，蛋白酶消化或切割的氨基酸序列是已知且一致的)。

[0424] 用于限制性或约束性蛋白水解步骤(i)的一组优选蛋白酶(即一种或多种第一蛋白酶、一种或多种蛋白酶A或第一消化步骤的蛋白酶的实例)包含一种或多种胰蛋白酶、
Arg‑C、Lys‑C和Lys‑N(本文有时称为第1组蛋白酶)。

[0425] 用于限制性或约束性蛋白水解步骤(i)的另一组优选的蛋白酶，(即一种或多种第一蛋白酶、一种或多种蛋白酶A或第一消化步骤的蛋白酶的实例)包含一种或多种胃蛋白
酶、胰凝乳蛋白酶和Glu‑C(本文有时称为第2组蛋白酶)。

[0426] 在一些实施例中，蛋白酶Asp‑N也可以与这些基团中的任一种组合使用(本文有时称为第3组蛋白酶)。

[0427] 在一些实施例中，在限制性或约束性蛋白水解步骤(i)中使用选自下组的蛋白酶，该组由以下各项组成(或包含)：胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和蛋白酶K。

[0428] 如上所述，可以根据该方面(方法C)使用本文所述的任何限制性或约束性蛋白水解条件。在一些实施例中，步骤(i)中使用高达2μg/ml的蛋白酶浓度，例如约0.5μg/ml、1μg/ml或约2μg/ml。在一些这样的实施例中，限制性或约束性蛋白水解在室温下进行。

[0429] 在一些实施例中，在步骤(i)中使用高达5μg/ml的蛋白酶浓度，例如约1μg/ml、约2μg/ml、约3μg/ml、约4μg/ml、或约5μg/ml。在一些这样的实施例中，限制性或约束性蛋白水解在室温下进行。

[0430] 在一些实施例中，限制性或约束性蛋白水解步骤(i)进行长达5分钟(例如1、2、3、4或5分钟)。在一些这样的实施例中，限制性或约束性蛋白水解在室温下进行。

[0431] 在一些实施例中，在室温下用2μg/ml胰凝乳蛋白酶进行限制性或约束性蛋白水解步骤(i)5分钟。

[0432] 在一些实施例中，在室温下用5μg/ml胰蛋白酶进行限制性或约束性蛋白水解步骤(i)5分钟。

[0433] 在一些实施例中，在室温下用2μg/ml蛋白酶K进行限制性或约束性蛋白水解步骤(i)5分钟。

[0434] 步骤(ii)

[0435] 在一些优选的实施例中，上述方法(方法C)的步骤(ii)是非限制性蛋白水解的步骤，并且对在步骤(i)中经受限制性或约束性蛋白水解的蛋白质进行，即步骤(i)和(ii)依
次对相同的蛋白质样品实施，并待分析的蛋白质经受顺序蛋白水解。

[0436] 在实施限制性蛋白水解步骤(i)之后，蛋白质可能含有步骤(i)中使用的一种或多种蛋白酶的几个额外位点，其在限制性蛋白水解步骤期间已经被消化(切割)但是肽仍然保
持附着(即未释放)，例如因为没有足够接近该位点(切割位点)的一种或多种蛋白酶的另一
个位点，或者因为肽通过其他方式保留在蛋白质上，例如，分子相互作用或力，例如离子键。
这样的切割位点代表天然蛋白质中暴露(可接近的)的蛋白酶位点(例如是表面暴露的位
点)的位点，因此形成抗体可以靶向的有用的表位的一部分的潜在感兴趣的位点，但其可能遗漏使用如本文其他地方所述的涉及限制性蛋白水解的其他方法，作为在一端具有该切割
位点的肽将不会通过蛋白酶的作用从蛋白质上被切割掉，且该切割位点(和与其对应的表
位)因此将不鉴别(例如，使用MS)。然而，方法C的第二蛋白酶步骤(第二消化步骤)，步骤
(ii)可用于释放这些肽，因此允许使用例如如本文所述的方法C的后续步骤鉴别切割位点
和探察天然蛋白质中的切割位点中或其周围的表位，。

[0437] 第二次消化步骤(步骤(ii))可以作为非限制性蛋白水解步骤实施，以便检索蛋白质中的最大序列覆盖度。

[0438] 在一些实施例中，方法(方法C)的步骤(ii)是蛋白水解步骤，其是非限制性蛋白水解(或非约束性或非限制性蛋白水解)的步骤。该步骤与步骤(i)中实施的限制性或约束性
蛋白水解形成直接对比。例如，步骤(i)通常在温和的蛋白水解条件下实施，目的是尽可能地保留天然蛋白质的结构，而在该方法的步骤(ii)中，蛋白质的天然结构不需要保留(实际上蛋白质的完整性经常受到显著损害或结构不被保留)，步骤(ii)中的目的是消化(切割)
尽可能多的蛋白酶位点(因此释放尽可能多的肽)，例如释放最大数量的肽。然而，释放的肽确实需要在该方法的步骤(iii)中进行分析，例如，通过质谱(MS)。因此，通常实施步骤(ii)以消化(切割)尽可能多的蛋白酶位点并尽可能多地释放可检测的肽(例如可通过MS检测)。
换句话说，目的是切割最大数量的消化位点，导致最大数量的肽仍然被优化用于检测，例
如，MS检测(针对MS检测优化的消化)。

[0439] 因此，在一些实施例中，如方法C的步骤(ii)中实施的非限制性(非限制性(non‑limiting))蛋白水解步骤优选是蛋白水解步骤实施至完成的步骤，或其中给定蛋白质被完
全消化的步骤(这有时被称为完全蛋白水解)。然而，如果这种完全消化会导致显著数目的
不可检测(例如，通过MS)的肽，例如因为它们太短，那么优选在达到该点之前停止消化，例如当仍然可以检测到最大数量或显著数量的肽时，换句话说，将发生几乎完全消化。

[0440] 本领域技术人员可容易地确定蛋白水解反应是否可以走向完成或接近完成(例如，到已经释放尽可能多的可检测肽的阶段)以及是否可检测到适当数量的肽。这将例如取决于所用仪器的检测能力，例如质谱仪的质量范围。质谱仪的典型肽长度为至少4、5、6、7或
8个氨基酸。因此，消化(蛋白水解)将优选在可检测大多数(或最大数量)的切割的肽的时间点停止，例如，通过质谱法。

[0441] 与用于步骤(i)的限制性或约束性蛋白水解的条件相比，非限制性蛋白水解步骤(ii)的适当条件对于技术人员而言是显而易见的。例如，对于一种或多种适当的蛋白酶，限制性或约束性蛋白水解的步骤可以在次优/次最优条件下实施，而对于一种或多种适当的
蛋白酶，非限制性蛋白水解的步骤可以在最优(或接近最优或正常或推荐的，例如制造商推荐的或标准的)条件下实施。

[0442] 步骤(ii)的适当条件的实例可以是缓冲液、pH和温度的一种或多种(或全部)。另一种适当条件可以是蛋白酶的浓度(例如高或饱和或最大或最优浓度)。因此，可以通过对
给定蛋白酶，最优pH和/或最优消化温度使用最优缓冲液的一种或多种(或所有)来完成非
限制性蛋白水解步骤。当涉及在非限制性蛋白水解步骤(ii)中使用的适当浓度的一种或多
种蛋白酶时，适当的浓度将通常对应于产生最大或最优或完全(全)或接近完全的(如果适
当的话)蛋白酶活性的浓度，例如最大或最优或完全(或接近完全，如果适当的话)肽切割
(与产生可用于限制性或约束性蛋白水解的次优活性的浓度相反)。

[0443] 尽管可以使用给定蛋白酶的最优条件进行非限制性蛋白水解步骤(步骤(ii))，但在非限制性蛋白水解步骤中并不总是需要使用蛋白酶的最优条件。给定蛋白酶的次优条件
可用于非限制性蛋白水解步骤，只要仍然发生适当量的蛋白质切割(例如，如本文其他地方所述)。纯粹作为举例，如果蛋白酶在步骤(ii)中在次优温度下使用(例如胰蛋白酶或胰凝
乳蛋白酶在<37℃，例如室温下使用)，则蛋白水解仍可被认为是非限制性的，例如，如果使用高(或更高)浓度的蛋白酶和/或使用长(或更长)的孵育时间。典型地，在该上下文中高
(或更高)浓度的蛋白酶的浓度将比步骤(i)中使用的蛋白酶的浓度更高(例如显著更高)。
典型地，在该上下文中的长(或更长)孵育时间将是比步骤(i)中使用的孵育时间更长(例如
显著更长)。纯粹作为举例，如果使用5μg/ml或更少的蛋白酶(例如，0.5、1、2、3、4或5μg/ml)在室温下(例如，20‑25℃)进行5分钟或更短时间的限制性蛋白水解反应(步骤(i))，然后在室温下用更高浓度的蛋白酶(例如20μg/ml的蛋白酶)和/或更长的孵育时间(例如1小时)进
行的步骤(ii)可以被认为是非限制性蛋白水解的步骤。

[0444] 因此，通过与用该蛋白酶进行限制性或约束性蛋白水解的适当条件进行比较，可以得到用一种或多种具体蛋白酶进行非限制性蛋白水解的一些示例性条件，例如本文其他
地方所述。例如，胰蛋白酶的最优工作温度是37℃，因此在使用胰蛋白酶进行非限制性蛋白水解步骤的实施例中，该温度是优选的。

[0445] 然而，在一些实施例中，步骤(i)和(ii)中用于蛋白水解的温度可以相同(例如室温)。在步骤(ii)是非限制性蛋白水解步骤并且步骤(i)和步骤(ii)使用相同孵育温度的实
施例中，步骤(ii)蛋白水解的条件典型地相对于用于步骤(i)的条件进行调节，以实现步骤(ii)中的蛋白水解相对于步骤(i)更严格(或更完全或接近完全)，例如通过在步骤(ii)中
使用比步骤(i)中使用的蛋白酶浓度更高的蛋白酶浓度和/或在步骤(ii)中具有比步骤(i)
中的孵育时间更长的孵育时间(和/或调节步骤(ii)中的任何其他条件，以在步骤(ii)中实
现更严格(或更完全或接近完全)的蛋白水解)。

[0446] 在例如蛋白酶的具体浓度将用于限制性或约束性蛋白水解的实施例中，然后，例如，更高，优选显著更高的浓度可用于非限制性蛋白水解，例如，浓度至少高2倍、3倍、4倍、5倍或10倍(或更高)。

[0447] 在一些实施例中，当在限制性蛋白水解步骤(步骤(i))中使用第一蛋白酶(或第一蛋白酶的组合)的给定浓度时，则第二蛋白酶(或第二蛋白酶的组合)的更高，优选显著更高的浓度用于非限制性蛋白水解(步骤(ii))，例如，浓度至少高2倍、3倍、4倍、5倍或10倍(或更高)。举例来说，在一些实施例中，如果用于限制性或约束性蛋白水解的第一蛋白酶(或第一蛋白酶组合)的浓度为5μg/ml或更低，则用于非限制性蛋白水解(步骤(ii))的第二蛋白
酶(或第二蛋白酶的组合)的浓度可以是20μg/ml或更高。

[0448] 在实施例中，例如，用蛋白酶的具体孵育时间将用于限制性或约束性蛋白水解，然后，例如，如果期望将该蛋白酶用于非限制性蛋白水解，则可以使用更长，优选显著更长的孵育时间，例如孵育时间至少为长2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍(或更长)。例如，当具体蛋白酶用于限制性或约束性蛋白水解的孵育时间以分钟为数量级时，如果期望将该蛋白酶用于非限制性蛋白水解，则可以使用至少为一小时的孵育时间(例如，至少1、2、3、4或5小时，或过夜)。可替代地，可允许使反应继续直至完成，例如，直到蛋白酶的活性耗尽或直到不可能进一步消化或接近完成(如果适当)。

[0449] 在一些实施例中，当在限制性蛋白水解步骤(步骤(i))中使用第一蛋白酶(或第一蛋白酶的组合)的给定孵育时间时，则第二蛋白酶(或第二蛋白酶的组合)的更长，优选显著更长的孵育时间用于非限制性蛋白水解(步骤(ii))，例如，孵育时间至少长2倍、3倍、4倍、5倍或10倍(或更长)。举例来说，在一些实施例中，如果用于限制性或约束性蛋白水解的第一蛋白酶(或第一蛋白酶组合)的孵育时间是5分钟或更短，则用于用第二蛋白酶(或第二蛋白
酶的组合)的非限制性蛋白水解(步骤(ii))的孵育时间可以是至少一小时(例如，至少1、2、
3、4或5小时，或过夜)。

[0450] 因为优选步骤(ii)中的消化(蛋白水解)完成或接近完成(或蛋白质中蛋白酶位点的最大可能数量被切割/消化，例如为了获得最大或显著数量的可检测肽，例如MS可检测的肽)，然后，如上所讨论，孵育时间是确保或进行非限制性蛋白水解的示例性条件(例如通过长时间消化)，例如直到蛋白酶的活性耗尽或直到不可能进一步消化、或直到任何进一步的消化将导致不可检测的肽的数量或比例的增加(例如，可测量的或显著的增加)(例如，因为它们太短而不能被(例如通过MS)检测到)。

[0451] 最广泛地，非限制性蛋白水解步骤(ii)可以被认为是比步骤(i)中实施更多，优选显著更多的蛋白水解的步骤，并且可以相应地选择适当的蛋白酶(和条件)，条件是在步骤
(i)和步骤(ii)中使用不同的蛋白酶(即具有不同特异性的蛋白酶)。可替代地观察到，非限制性蛋白水解步骤(ii)可以被认为是其中蛋白水解(或蛋白水解条件)比步骤(i)中使用的
蛋白水解(或蛋白水解条件)更严格(或更强或更苛刻)的步骤。进一步可替代地观察到，非
限制性蛋白水解步骤(ii)可以被认为是相对于步骤(i)中的蛋白水解更严格(或更强或更
苛刻)的蛋白水解。

[0452] 因此，如果给定的蛋白质对于给定的蛋白酶具有一定数量的潜在切割点/位点(即，给定的蛋白酶可识别的用于切割的位点)，那么在选择的限制性或约束性蛋白水解条
件下，蛋白酶可以仅在那些切割位点的子集切割，而如果选择在非限制性蛋白水解条件下
使用该蛋白酶，则选择这样的条件使得蛋白酶可以在所有(或显著所有)那些切割位点切
割，或者以比在限制性或约束性蛋白水解的条件下切割的切割位点的数量增加，优选显著
增加的那些切割位点的数量切割。

[0453] 因此，如果给定的蛋白质对于给定的蛋白酶A具有一定数量的潜在切割点/位点(即，给定的蛋白酶可识别的用于切割的位点)，那么在选择的限制性或约束性蛋白水解条
件下，蛋白酶可以仅在那些切割位点的子集切割，而在步骤(ii)中所选的非限制性蛋白水
解条件下，使用不同的蛋白酶(蛋白酶B)，蛋白酶可以在其所有(或显著所有)切割位点切
割，或者以比在限制性或约束性蛋白水解的条件下切割的切割位点的数量增加，优选显著
增加的其切割位点的数量切割多。

[0454] 可以使用计算机模拟(in silico)蛋白酶消化或任何用于预测蛋白质的蛋白酶消化的其他适当的方法或技术的步骤，以预测给定蛋白酶的潜在切割点/位点的数量。例如，可以通过眼睛检查蛋白质的氨基酸序列，并且基于给定蛋白酶的特异性和规则的知识鉴别
预测的切割位点(即，预测由蛋白酶切割的位点)。可选地和方便地，基于给定蛋白酶的特异性和规则的基于计算机的预测方法是优选的。所有这些方法都可以考虑蛋白酶特异性和规
则，例如，胰蛋白酶只能在精氨酸或赖氨酸的C末端位置切割。消化的规则和例外可用于大多数蛋白酶，参见例如肽切割器(Peptidecutter)(Expasy，SIB Swiss Institute of 
Bioinformatics)。

[0455] 在一些实施例中，非限制性蛋白水解(步骤(ii))是蛋白水解(蛋白水解反应)，其导致(或实现)蛋白质中的位点(键)的至少60％、或至少65％、或至少70％、或至少75％、或至少80％、或至少85％、或至少90％或至少95％或至少98％或至少99％或甚至100％的切
割，该蛋白质可通过使用的蛋白酶潜在地可切割(可消化)。可替代地观察到，在一些实施例中，非限制性蛋白水解实现至少60％、或至少65％、或至少70％、或至少75％、或至少80％、或至少85％、或至少90％或至少95％或至少98％或至少99％或甚至100％的蛋白水解。基于蛋白质序列的知识和所用蛋白酶的底物特异性(例如通过使用计算机，比如肽切割器
(Peptidecutter)(Expasy，SIB Swiss Institute of Bioinformatics))，本领域技术人员可以容易地鉴别给定蛋白质中潜在地可被所用蛋白酶切割的位点。典型地，蛋白质的线性
氨基酸序列中所有潜在位点的切割将代表“100％”值(尽管“100％”值可替代地设定为蛋白质中潜在位点的总数，如果切割后，将释放(或产生)具有所用仪器(例如所用的MS仪器)易
于检测的长度的肽。可替代地，可以将“100％”值设定为蛋白质中潜在地可切割的位点的数量，已知该位点是(或预测是例如通过使用蛋白质建模工具)在蛋白可接近蛋白酶的区域中
(例如蛋白质的细胞外部分或结构域，或例如不是细胞膜内蛋白质的部分或区域或结构域、或不是蛋白质的富含半胱氨酸的部分或不是蛋白质的翻译后修饰部分蛋白质，或不是β折
叠)。被蛋白酶实际切割的位点的数量(和位置)也可以由技术人员容易地确定(例如使用质
谱法)，因此实际切割的潜在地可切割位点的百分比可以容易地确定。

[0456] 在一些实施例中，非限制性蛋白水解(步骤(ii))是蛋白水解(蛋白水解反应)，其实现蛋白质切割的水平(或数量)(例如通过从蛋白质释放或切割肽来评估，例如通过MS确
定)，其不会增加(或不显著增加)例如，如果使用更长的孵育(或反应)时间和/或如果使用
蛋白酶的更高浓度和/或如果使用接近用于蛋白酶的最优温度的温度和/或如果使用更接
近用于蛋白酶的最优条件的一种或多种其他条件(例如，如本文其他地方所述的一种或多
种其他条件)。

[0457] 然而限制性或约束性蛋白水解包括在限制条件下(限制动力学)进行的蛋白水解，由此蛋白酶活性的动力学减慢到当时从蛋白质上一次切割掉一个，或者一次切割掉最多几
个肽的程度，非限制性蛋白水解的步骤包括当蛋白酶活性的动力学不减慢或降低(或不显
著或可测量地减慢或降低)，或优化、正常或最大化的条件。因此，在一些实施例中，所述蛋白酶在这种非限制性蛋白水解步骤中的动力学活性使得多个(优选8个或更多个)或尽可能
多的肽一次被切割。

[0458] 如上所述，在其最广泛的情况下，非限制性蛋白水解可被视为这样的步骤：其中比如果替代在限制性蛋白水解中使用相同的蛋白酶，进行更多(例如，就切割位点的数量而言)，优选显著更多的蛋白水解的步骤。因此，在设定限制性蛋白水解条件的实施例中，使得所述蛋白酶的动力学活性减慢得很多，使得所述表面暴露的肽一次被切割掉一个或者一次
最多切割几个，例如最多一次8个(1、2、3、4、5、6、7或8个)(例如，样品中最多8个肽或至多8个独特肽，例如如本文其他地方所述)，然后如果相同的蛋白酶使用在步骤(ii)中，非限制性蛋白水解的条件可以设定为，比在限制性水解条件下，一次切割掉更多，和优选显著更多的肽(例如，一次超过2、3、4、5、6、7或8个，如果适当)。

[0459] 在优选的实施例中，非限制性蛋白水解反应可以完成，使得蛋白质耗尽了可被给定蛋白酶切割掉的肽，或直到不可能进一步消化、或直到任何进一步消化将导致不可检测
的肽的数量或比例的增加，例如，可测量的或显著的增加(例如，因为它们太短而不能被检测到，例如通过MS检测)。

[0460] 单一蛋白酶可用于该非限制性蛋白水解步骤(ii)。可替代地，可以使用多种蛋白酶。这些多种蛋白酶可以组合一起使用(例如，可以使用蛋白酶混合物，其同时加入蛋白质样品或与蛋白质样品接触)，或者这些多种蛋白酶可以依次使用，例如一个接一个地(在一
些实施例中优选顺序使用)。在该一个或多个步骤中使用的一种或多种蛋白酶在本文中称
为“一种或多种第二蛋白酶”或“一种或多种蛋白酶B”。这是为了将这些蛋白酶与该方法的步骤(i)中使用的那些蛋白酶区分开(在本文中称为“一种或多种第一蛋白酶”或“一种或多种蛋白酶A”)。在该方法的步骤(ii)中使用的一种或多种蛋白酶将不同于在步骤(i)中使用的蛋白酶，即它们将具有不同的特异性。

[0461] 可以使用任何适当的蛋白酶，并且可以在这种非限制性蛋白水解步骤中使用的适合的蛋白酶是本领域技术人员公知的。通常，优选的蛋白酶是那些具有强大或高特异性的
蛋白酶(例如，不具有消化其特异性以外的氨基酸的倾向)和/或例如就特异性而言具有良
好验证和表征的蛋白酶(换言之，蛋白酶消化或切割的氨基酸序列是已知且一致的)。本文
其他地方讨论的任何蛋白酶可用于非限制性蛋白水解。

[0462] 用于非限制性蛋白水解步骤(ii)的一组优选的蛋白酶(即，一种或多种第二蛋白酶、一种或多种蛋白酶B或第二消化步骤的蛋白酶的实例)包括胰蛋白酶、Arg‑C、Lys‑C和Lys‑N(第1组蛋白酶)中的一种或多种。

[0463] 用于非限制性蛋白水解步骤(ii)的另一组优选的蛋白酶(即，一种或多种第二蛋白酶、一种或多种蛋白酶B或第二消化步骤的蛋白酶的实例)包括胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶
和Glu‑C(第2组蛋白酶)中的一种或多种。

[0464] 在一些实施例中，蛋白酶Asp‑N也可以与这些组中的任一个(第3组蛋白酶)组合使用。

[0465] 因此，例如，为了实施本发明的方法，来自第1组的一种或几种蛋白酶的组合可用于第一步(步骤(i))中的限制性蛋白水解，然后来自第2组的一种或几种蛋白酶的组合(或
顺序使用)可在第二步(步骤(ii)中的非限制性蛋白水解期间使用。

[0466] 可替代地，来自第2组的一种或几种蛋白酶的组合可用于第一步(步骤(i))中的限制性蛋白水解，然后来自第1组的一种或几种蛋白酶的组合(或顺序使用)可在第二步(步骤
(ii)中的非限制性蛋白水解期间使用。

[0467] 第3组蛋白酶可任选地与第1组或第2组组合。

[0468] 在一些实施例中，非限制性蛋白水解可以被认为是在本文所述的一种或多种条件下与非限制性蛋白水解结合进行蛋白水解步骤。

[0469] 如上所述，可以根据这方面使用本文所述的任何非限制性蛋白水解条件(方法C)。在一些实施例中，在步骤(ii)中使用约20μg/ml的蛋白酶(例如胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶)
的浓度。在一些这样的实施例中，限制性或约束性蛋白水解在室温下进行。

[0470] 在一些实施例中，非限制性蛋白水解步骤(ii)进行约1小时。在一些这样的实施例中，限制性或约束性蛋白水解在室温下进行。

[0471] 在一些实施例中，非限制性蛋白水解步骤(ii)在室温下用20μg/ml胰凝乳蛋白酶进行1小时分钟。

[0472] 在一些实施例中，非限制性蛋白水解步骤(ii)在室温下用20μg/ml胰蛋白酶进行1小时。

[0473] 纯粹作为示例，适当的蛋白酶和条件的具体实例可以是：

[0474] 步骤(i)：用5μg/ml胰凝乳蛋白酶进行限制性蛋白水解，5分钟，缓冲液：例如，100mM NH4HCO3，pH8.0，21℃

[0475] 步骤(ii)：用20μg/ml胰蛋白酶进行非限制性蛋白水解，2小时，缓冲液：例如，100mM NH4HCO3，pH8.0，37℃。

[0476] 作为另一个示例，适当的蛋白酶和条件的具体实例可以是：

[0477] 步骤(i)：用2μg/ml胰凝乳蛋白酶进行限制性蛋白水解，5分钟，室温，缓冲液：例如，Tris‑HCl 100mM和CaCl2·10mM，pH8.0。

[0478] 步骤(ii)：用20μg/ml胰蛋白酶进行非限制性蛋白水解‑，1小时，室温，缓冲液：例如，100mM碳酸氢铵，pH8。

[0479] 作为另一个示例，适当的蛋白酶和条件的具体实例可以是：

[0480] 步骤(i)：用5μg/ml胰蛋白酶进行限制性蛋白水解，5分钟，室温，缓冲液：例如，100mM碳酸氢铵，pH8。

[0481] 步骤(ii)：用20μg/ml胰凝乳蛋白酶进行限制性蛋白水解，5分钟，室温，缓冲液：例如，Tris‑HCl 100mM和CaCl2 10mM，pH 8.0。

[0482] 作为另一个示例，适当的蛋白酶和条件的具体实例可以是：

[0483] 步骤(i)：用2μg/ml蛋白酶K进行限制性蛋白水解，5分钟，室温，缓冲液：例如Tris‑HCl 100mM和CaCl2 10mM，pH 8.0。

[0484] 步骤(ii)：用20μg/ml胰蛋白酶进行非限制性蛋白水解，1小时，室温，缓冲液：例如，100mM碳酸氢铵，pH8。

[0485] 可以看出，一种或多种相同的蛋白酶可适当用于限制性蛋白水解步骤(i)或非限制性蛋白水解步骤(ii)中的任一种。实施该方法(方法C)的一些实施例的关键点在于，根据所使用的一种或多种蛋白酶，相应地选择蛋白质暴露于一种或多种蛋白酶的条件，以实现
限制性或非限制性蛋白水解。对于这些方法而言，对于这两个步骤使用不同的蛋白酶(具有不同特异性的蛋白酶)也是重要的。具有不同特异性的蛋白酶意指蛋白酶在不同的氨基酸
序列处消化或切割。

[0486] 使用如本文所述的多种蛋白酶包括但不限于使用2、3、4、5种不同的蛋白酶。

[0487] 在该方法的一些实施例中，仅使用两种不同的蛋白酶；步骤(i)中的单一蛋白酶和步骤(ii)中的不同蛋白酶。在该方法的一些实施例中，仅实施两个蛋白水解步骤(一个蛋白水解步骤(i)和一个蛋白水解步骤(ii))。

[0488] 在该方法(方法C)的一些实施例中，其中在步骤(ii)中执行非限制性蛋白水解，所述方法在步骤(i)之后，但在步骤(ii)之前，还包括使用在步骤(ii)中使用的(或待使用的)所述单一的第二蛋白酶或第二蛋白酶组合对所述蛋白质执行限制性或约束性蛋白水解的
额外步骤(例如一个或多个步骤)。这种方法可以包括分析从在步骤(ii)之前执行的额外的
限制性蛋白水解步骤中所述蛋白质释放的肽的步骤，和任选地还分析从步骤(i)和/或步骤
(ii)中所述蛋白质释放的肽的步骤以鉴别其中一端被所述第一种蛋白酶切割而另一端被
所述第二种蛋白酶切割的肽。也可以执行探测蛋白质区域中的一个或多个表位，蛋白质含
有或侧接切割位点，切割位点是所述第一蛋白酶的鉴别的切割位点，其中一种或多种抗体
针对所述表位，从而鉴别可被抗体结合的蛋白质上一个或多个表位。不希望被理论束缚，据信包括使用在步骤(ii)中使用(待使用)的第二蛋白酶或第二蛋白酶的组合的限制性或约
束性蛋白水解的这种额外步骤可能是有益的，相对于在非限制性蛋白水解步骤(ii)中释放
的肽的数量，典型地在这种额外的限制性蛋白水解步骤中将释放更少的肽，并且因此在额
外的限制性蛋白水解步骤之后其中一端已经被所述第一蛋白酶切割而另一端已经被所述
第二蛋白酶切割的肽将比在步骤(ii)之后更容易检测到(例如通过MS)，因由于释放的其中
两端已被第二种蛋白酶切割的肽的数量减少，“噪音”将减少。

[0489] 本领域技术人员可以很好地装备以选择适当的蛋白酶用于该方法的各个步骤。通常，优选的蛋白酶是那些具有强大或高特异性的蛋白酶(例如，不具有消化其特异性以外的氨基酸的倾向)和/或例如，就特异性而言具有良好验证和表征的蛋白酶(换言之，蛋白酶消化或切割的氨基酸序列是已知且一致的)。如本文其他地方所述，主要标准之一是步骤(i)
中使用的一种或多种蛋白酶具有不同的特异性，例如，就从步骤(ii)中使用的一种或多种
蛋白酶消化/切割的氨基酸序列而言。

[0490] 出于这个原因，如上所述的第1、2和3组蛋白酶是优选的(例如强大且高且可靠的特异性)并且由于它们在一个或多个氨基酸的子集之后消化而被置于同一组中。因此，可以基于在单个或相对小的氨基酸组(亚组)消化的性质，可以将一组蛋白酶放在一起(选择)
(例如，1、2、3、4或5个氨基酸，例如至多2、3、4或5个氨基酸)。因此，第1组蛋白酶在精氨酸和/或赖氨酸后全部消化。第2组中的蛋白酶在酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和/或亮氨酸后消化。这意味着这两组具有完全不同的特异性，例如精氨酸后切割的所有肽可以被指定为被
第1组消化(并因此在其中使用一种或多种第1组蛋白酶的方法的任何一步中被消化)。这些
组可以甚至进一步划分，例如第1组可分为精氨酸(即单个氨基酸)后消化的蛋白酶组和赖
氨酸后消化的不同组。因此，如果需要，当然可以由本领域技术人员提供或选择可替代和适当的单一蛋白酶或蛋白酶组。

[0491] 为了增加蛋白质中蛋白酶位点的最大数量被切割的前景(或通过该方法进一步增加序列覆盖度)，可任选地实施额外的变性步骤。这种变性步骤可以在非限制性蛋白水解步骤之前(before)(之前(prior)、同时(期间)或之后实施。用于促进或诱导蛋白质变性的适
当条件对于本领域技术人员来说是公知的，例如，使用适当的变性剂、缓冲剂、pH和/或温度。变性条件因蛋白质而异，但常用的试剂是尿素和氯化胍、具有高或低盐浓度和/或高或低pH的缓冲剂、以及高于40℃的温度。

[0492] 尽管第一蛋白水解步骤(步骤(i))是限制性或约束性蛋白水解步骤以及第二蛋白水解(步骤(ii))是非限制性蛋白水解步骤的方法是优选的，但在一些实施例中包括两步限
制性蛋白水解，即是限制性或约束性蛋白水解的步骤的上述方法(方法C)的步骤(i)和
(ii)，例如如本文其他地方所述，可用于产生肽和鉴别表位。

[0493] 在一个方面，本发明提供了鉴别蛋白质上可被抗体结合的表位的方法，所述方法包括：

[0494] (i)使用单一第一蛋白酶或第一蛋白酶的组合对所述蛋白质执行限制性或约束性蛋白水解；

[0495] (ii)使用单一第二蛋白酶或第二蛋白酶的组合对所述蛋白质执行蛋白水解，其中所述一种或多种第二蛋白酶均不同于步骤(i)中使用的一种或多种蛋白酶；

[0496] (iii)分析在步骤(i)和步骤(ii)中从所述蛋白质释放的肽，以鉴别其中一端已被所述第一蛋白酶切割而另一端已被所述第二蛋白酶切割的肽；

[0497] (iv)探测蛋白质区域中的一个或多个表位，所述蛋白质区域含有或侧接切割位点，所述切割位点是步骤(iii)中鉴别的所述第一蛋白酶的切割位点，其中一种或多种抗体针对所述表位，从而鉴别可被抗体结合的蛋白质上一个或多个表位。

[0498] 本文所述的其他方法的优选特征可以适用于(加上有必要的变更)本发明的这个方面。

[0499] 另一方面，本发明提供鉴别蛋白质上可被抗体结合的表位的方法，所述方法包括：

[0500] (i)使用单一第一蛋白酶或第一蛋白酶的组合对所述蛋白质执行蛋白水解；

[0501] (ii)使用单一第二蛋白酶或第二蛋白酶的组合对所述蛋白质执行蛋白水解，其中所述一种或多种第二蛋白酶均不同于步骤(i)中使用的一种或多种蛋白酶；

[0502] 其中步骤(ii)中执行的蛋白水解比步骤(i)中执行的蛋白水解更严格(或更完全或更苛刻)；

[0503] (iii)分析在步骤(i)和步骤(ii)中从所述蛋白质释放的肽，以鉴别其中一端已被所述第一蛋白酶切割而另一端已被所述第二蛋白酶切割的肽；

[0504] (iv)探测蛋白质区域中的一个或多个表位，所述蛋白质区域含有或侧接切割位点，所述切割位点是步骤(iii)中鉴别的所述第一蛋白酶的切割位点，其中一种或多种抗体针对所述表位，从而鉴别可被抗体结合的所述蛋白质上一个或多个表位。

[0505] 技术人员可以容易地确定步骤(ii)的蛋白水解条件，其比步骤(i)中使用的蛋白水解条件更严格，例如基于本文其他地方的讨论。本文所述的其他方法的优选特征可以适
用于(加上有必要的变更)本发明的这个方面。

[0506] 在一些实施例中，消化的、释放的或切割的肽，例如，在进行步骤(iii)之前，将步骤(i)和步骤(ii)中从蛋白质上切割掉或释放的肽冷冻(或以其他方式适当地储存)。

[0507] 步骤(iii)

[0508] 在该方法的步骤(iii)中，消化的、释放的或切割的肽，例如，对在步骤(ii)中从蛋白质被切割掉或释放的肽(和任选地，在步骤(i)中从蛋白质上被切割掉或释放的肽)进行分析，例如，收集和分析。这种分析可以通过任何适当的技术实施，但是方便且优选使用质谱法实施，例如本文其他地方和实例中描述的。

[0509] 该步骤用于鉴别其中一端(例如N‑末端或C‑末端)已被所述第一蛋白酶(即在限制性蛋白水解步骤中使用的蛋白酶(蛋白酶A))切割，以及另一端(例如，C‑末端或N‑末端，视情况而定)已被所述第二蛋白酶(即在非限制性蛋白水解步骤中使用的蛋白酶(蛋白酶B))
切割的肽。然后，这允许鉴别天然蛋白质中的位点，其对应于已被所述第一蛋白酶(即在限制性蛋白水解步骤中使用的蛋白酶)切割的末端，。天然蛋白质中的这些位点是蛋白酶可接近的位点，其可能对应于在限制性蛋白水解步骤中被蛋白酶切割的位点(切割位点)，但在
这个步骤中肽不被释放。这些位点还鉴别天然蛋白质的区域，其可含有一个或多个可被抗
体(或其他特异性结合剂)结合或靶向的有用表位。因此，在上述方法的部分(iii)中鉴别的位点可称为切割位点。

[0510] 因此，在该步骤中，通常不希望鉴别在两端已被相同的蛋白酶切割的肽，例如在两端用限制性蛋白水解步骤中使用的蛋白酶之一切割，或在两端用非限制性蛋白水解步骤中使用的蛋白酶之一切割。然而，在一些实施例中，鉴别在步骤(ii)中产生但在步骤(i)中未产生的肽可能是有用的，所述肽在两端被限制性蛋白水解步骤中使用的蛋白酶之一切割。
这些肽可以对应于天然蛋白质中的蛋白酶可接近的位点，其可能对应于在限制性蛋白水解
步骤中两端被蛋白酶切割的位点(切割位点)(即在两端用第一蛋白酶(蛋白酶A)切割，即A‑A肽)，这个步骤中肽不被释放，因为它们通过一些其它方式保留在蛋白质上，例如，分子相互作用或力，例如离子键。这些肽(A‑A肽)可以在步骤(ii)中释放，并且还可以鉴别天然蛋白质的区域，其可以含有一个或多个可以被抗体(或其他特异性结合剂)结合或靶向的有用
表位。在一些实施例中，该方法进一步包括在步骤(iii)(或者可替代地包括步骤(iii)中)
鉴别在步骤(ii)中释放但在步骤(i)中未释放的肽，其通过一个在限制性蛋白水解步骤(步
骤(i))中使用的第一蛋白酶中的一种在两端切割。

[0511] 可以在步骤(i)和步骤(ii)之后实施单独的分析或鉴别步骤，并且通常这是优选的。然而，可以在步骤(ii)之后对在步骤(i)和(ii)中已从蛋白质释放的肽实施单个分析步骤。在实践中，需要在开始(步骤(ii))(例如，非限制性蛋白水解步骤(ii))之前停止限制性蛋白水解步骤(步骤(i))。因此，在加入步骤(ii)的蛋白酶(例如，非限制性蛋白水解步骤)之前，可以除去用于实施限制性蛋白水解的蛋白酶(例如通过洗涤)。适合的洗涤缓冲液的
实例描述于本文的实施例部分中。使用流动池以实施方法的蛋白水解步骤为此提供了方便
的手段。

[0512] 分析或鉴别通过上述方法(方法C)的步骤(ii)的蛋白酶消化从所述蛋白质释放的肽(肽序列)(和任选通过步骤(i)的蛋白酶消化从蛋白质释放的肽)以便鉴别例如其中一端
已被所述第一蛋白酶(蛋白酶A)切割而另一端已被所述第二蛋白酶(蛋白酶B)切割的肽，在
这种情况下为A‑B或B‑A肽，可以通过任何适当的方法或技术进行，例如通过质谱法(例如，LC‑MS/MS)。鉴别了从所述蛋白质释放(或切割)的肽(肽序列)后，容易鉴别天然蛋白质上的位点(一种或多种蛋白酶已在该位点切割所述蛋白质)(切割位点)，因为通过蛋白水解(例
如通过质谱法鉴别)从蛋白质释放的一个或多个肽序列的知识可提供切割位点的信息，例
如通过将序列定位(mapping)回天然蛋白质的序列。在这方面，释放的一个或多个肽(切割
掉的肽)末端的残基提供了蛋白质(例如天然或全长蛋白质)中切割位点的信息。

[0513] 在一个优选的实施例中，收集消化的肽并使用质谱法分析，例如本文其他地方所述。肽谱的鉴别可以使用搜索引擎执行，比如但不限于MASCOT。可以设置搜索引擎以基于所使用的所有蛋白酶和/或不使用特异性蛋白酶的消化规则来鉴别肽。作为澄清实例，如果通过实验使用这种组合，则MASCOT中应用的消化规则可以指定对用胰蛋白酶切割或胃蛋白酶
切割的肽的搜索。结合来自步骤(i)和步骤(ii)中所有鉴别的肽的序列数据，可以区分天然蛋白质上的使用限制性蛋白水解消化，但是肽未被释放或肽仍然附着的切割位点(这些肽
将对应于具有对应于该方法中使用的第一和第二蛋白酶的末端的肽，例如，A‑B或B‑A肽，或有时如上所讨论的A‑A肽)与在天然蛋白质上使用限制性蛋白水解消化，通过该方法的步骤(i)中的蛋白酶的作用肽从天然蛋白质中释放/切割掉的切割位点(这些肽将通常对应于具
有对应于方法中限制性蛋白水解步骤中使用的第一蛋白酶的两端的肽，A‑A肽，并且将在方法的步骤(i)后可检测到)，。

[0514] 在本发明方法的一些实施例中，在步骤(iii)中，仅分析在步骤(ii)中(或之后)从所述蛋白质释放的肽(例如没有分析在步骤(i)中(或之后)释放的肽)。然而，在一些实施例中，步骤(iii)涉及分析在步骤(i)和步骤(ii)中从蛋白质释放的肽。

[0515] 在本发明的一些方法中，仅对在步骤(i)之后但在步骤(ii)(例如，如本文其他地方所述)之前使用所述单一第二蛋白酶或第二蛋白酶的组合进行的限制性蛋白水解的额外
步骤中从蛋白质释放的肽进行分析。在本发明的一些方法中，对在步骤(i)之后但在步骤
(ii)(例如，如本文其他地方所述)之前使用所述单一第二蛋白酶或第二蛋白酶的组合进行
的限制性蛋白水解的额外步骤中从蛋白质释放的肽进行分析且对在步骤(i)和/或步骤
(ii)中从蛋白质释放的肽进行分析。

[0516] 步骤(iv)

[0517] 该方法的步骤(iv)包括探测蛋白质区域中的一个或多个表位的步骤，所述蛋白质区域含有或侧接切割位点，所述切割位点是步骤(iii)中鉴别的所述第一蛋白酶的切割位
点，其中一种或多种抗体针对所述表位，从而鉴别可被抗体结合的所述蛋白质上一个或多
个表位。可替代地观察到，该方法的步骤(iv)包括探测蛋白质区域中的一个或多个表位，所述蛋白质区域含有或侧接切割位点，所述切割位点是步骤(iii)中鉴别的所述第一蛋白酶
的切割位点用一种或多种抗体，并鉴别是否所述一种或多种抗体与所述一种或多种表位结
合，从而鉴别可被抗体结合的所述蛋白质上一个或多个表位。

[0518] 以上关于步骤(iii)描述了根据上述方法(方法C)的步骤(iv)的“切割位点”。在一些实施例中，“切割位点”可以被认为是蛋白质的氨基酸序列中的位点(或位置)(例如在天然蛋白质或全长蛋白质或野生型蛋白质或原位蛋白质或非变性蛋白质中)，其对应于(步骤(i))中由蛋白酶切割的位点(切割位点)，但在步骤(i)中肽未从其中释放。可替代地观察
到，在一些实施例中，上述方法(方法C)的步骤(iv)中的“切割位点”可以被认为是蛋白质的氨基酸序列中的位点(或位置)(例如在天然蛋白质中或全长蛋白质或野生型蛋白质)，其对
应于步骤(iii)中鉴别的由第一蛋白酶切割的肽的末端。

[0519] 探测如本文所述的一个或多个(例如多个)表位是意指分析(或评估或研究)蛋白质(例如天然或全长蛋白质)上的一个或多个表位(或潜在表位)被抗体结合的能力，所述抗
体已经针对(或结合)与蛋白质上的表位(或潜在表位)相对应的分离的表位产生。在优选的
实施例中，探测多个表位(或表位阵列)。

[0520] 在一些实施例中，该方法可以进一步包括产生(或合成)一种或多种(例如多种，例如2种或更多种、3种或更多种、5种或更多种、10种或更多种、20种或更多种、50种或更多种，例如最多3种、最多4种、最多5种、最多10种、最多20种或最多50种)分离的表位的步骤(步骤(iv)之前)，分离的表位具有对应于所述蛋白质上的一个或多个表位(或序列)的序列，所述一个或多个表位(或序列)位于包含或侧接在步骤(iii)鉴别的所述第一蛋白酶的切割位点
的蛋白质区域中，并产生(引发)针对(结合)所述分离的表位的抗体(例如多克隆抗体)。在
优选的实施例中，产生多个表位(或表位阵列)并产生多个抗体(或抗体阵列)。然后可将这
些抗体用于上述方法的步骤(iv)中，以探测所述蛋白质上(例如天然或全长蛋白质中)的一
个或多个表位。可以使用用于产生分离的表位或用于产生抗体的任何合适的方法或技术
(例如，如本文其他地方所述)，并且技术人员将熟悉这些。

[0521] 在一些实施例中，表位具有不同的长度和/或序列。因此，在多个(或组)表位内，可存在彼此具有不同长度和/或序列的表位。在其他实施例中，表位具有相同(或相似)的长度并且通常具有不同的序列。因此，在一些实施例中，在多个(或组)表位内，表位具有相同(或相似)的长度。

[0522] 表位可以是任何适当的长度。在一些实施例中，分离的表位长度为7‑8个氨基酸或具有如本文其他地方所述的长度。

[0523] 在优选的实施例中，表位包含切割位点(或与切割位点重叠或包围)。在其他实施例中，表位侧接切割位点。

[0524] 通常，表位(或任何给定表位的至少一部分)将在切割位点(切割位点是在步骤(iii)中鉴别的第一蛋白酶、蛋白酶A的切割位点，其可能是蛋白酶可接近的切割位点，但肽不被释放)的50个氨基酸内，即相对于切割位点的+50至‑50个氨基酸。优选地，表位(或任何给定表位的至少一部分)将在切割位点(切割位点是在步骤(iii)中鉴别所述第一蛋白酶的
切割位点)的20个氨基酸内，即相对于切割位点的+20至‑20个氨基酸，或切割位点的10个氨基酸内，即相对于切割位点的+10至‑10个氨基酸，或在切割位点的5个氨基酸内，即相对于切割位点的+5至‑5个氨基酸。

[0525] 在一些实施例中，“含有或侧接切割位点蛋白质区域中”可以指切割位点的50个氨基酸内，即相对于切割位点为+50至‑50个氨基酸，优选在切割位点的20个氨基酸内，即相对于切割位点的+20至‑20个氨基酸、或切割位点的10个氨基酸内，即相对于切割位点的+10至‑10个氨基酸、或切割位点的5个氨基酸以内，即相对于切割位点的+5至‑5个氨基酸。

[0526] 在一些实施例中，多个表位(多于一个表位)是一组(set)(或组(group))表位，其中该组中每个表位的序列从该组中的另一个表位偏移一个或几个(例如1、2或3个)氨基酸，优选一个。换句话说，在一些实施例中，在一组(多个)表位中，每个表位序列被一个或几个(例如1、2或3个)氨基酸(优选一个)移位到该组中的另一个表位序列。因此，多个表位可以是嵌套的表位组，例如，如图15所示。通常，这种嵌套的表位组将相对于(或围绕)切割位点(切割位点是在步骤(i)中鉴别的计算机模拟预测的蛋白酶切割位点但不是步骤(iii)中鉴
别的切割位点)在任一方向(或两个方向)上覆盖蛋白质序列的多达约50个氨基酸(在步骤
(iii)鉴别的所述第一蛋白酶位点，其可能是蛋白酶可接近的切割位点，但肽不被释放)。优选地，这种嵌套的表位组将相对于(或围绕)切割位点(切割位点是在步骤(iii)中鉴别的所
述第一蛋白酶的切割位点)在任一方向(或两个方向)上覆盖蛋白质序列的多达约20个氨基
酸。在一些实施例中，这种嵌套的表位组将相对于(或围绕)切割位点(切割位点是在步骤
(iii)中鉴别的所述第一蛋白酶的切割位点)在任一方向(或在两个方向上，优选在两个方
向上)覆盖蛋白质序列的多达约6个氨基酸。

[0527] 当使用嵌套的表位组时，在优选的实施例中，显著数量的表位将包含切割位点，优选地，嵌套组中的基本上所有表位将包含切割位点，更优选地，嵌套组中的所有表位将包含切割位点。

[0528] 如上所述，可以利用针对所述表位的抗体(即抗体充当探针)来探测蛋白质上的表位，所述表位包含切割位点、或与切割位点重叠或位于侧接切割位点的区域中。实际上，用抗体(例如Fab片段或其他抗体片段)进行探测是优选的。然而，备选地，其他结合实体可以用作探针(例如可以使用其他亲和探针或结合剂)。亲和体是可以使用的亲和探针的一个实
例。

[0529] 在一个方面，本发明提供表位(或抗原表位)，例如，分离的表位，其通过鉴别蛋白质上可被如上所述的抗体结合的表位的方法鉴别(方法C)。本文其他地方描述了表位的示例性和优选特征。一方面，本发明提供了与蛋白质上的这种表位结合(特异性结合)的抗体。
本文其他地方描述了抗体的示例性和优选特征。在一些实施例中，在如本文所述的切割位
点附近，例如，切割位点的5、10、20或50个氨基酸内结合的抗体是优选的。本领域技术人员熟悉用于产生表位(例如分离的表位)和针对给定表位的抗体的方法或技术，并且可以使用
任何合适的方法(例如，如本文其他地方所述)。优选类型的抗体也在本文其他地方描述。因此，本发明的方法(例如方法C)包括额外的步骤，其中针对一种或多种鉴别的表位培育
(raised)或产生(generated)抗体。因此，还提供了产生针对蛋白质的抗体(antibody)(多
种抗体(antibodies))的方法。此类抗体产生(或生产或制造)方法还可包括纯化抗体或蛋
白质产物和/或将抗体或产物配制成包含至少一种额外组分(诸如药学上可接受的载体或
赋形剂)的组合物的步骤。

[0530] 在一个方面，本发明提供缀合物，其可用于抗体的产生(或生产)。缀合物可包含如本文定义的至少一个表位并与肽载体偶联或混合。缀合物的其他特征在本文其他地方描述。

[0531] 在一个方面，本发明提供了包含本发明的抗体或表位的组合物(例如药物组合物)。这种组合物典型地包含一种或多种稀释剂、赋形剂和/或缓冲剂。

[0532] 在一个方面，本发明提供了抗原表位，该抗原表位包括选自下组的氨基酸序列(或由其组成)，该组由以下各项之一组成(或包括)SEQ ID NOs：82、83、84、85、86、87、88、89、
90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、
111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、
130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、
149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、
168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183和184，或与其基本同源的序列。SEQ ID NOs 82‑184列于本文表9‑14中。“与其基本上同源的”序列在本文其他地方描述。

[0533] 在一些实施例中，本发明提供了抗原表位，该抗原表位包括选自下组的氨基酸序列(或由其组成)，该组由以下各项之一组成(或包括)SEQ ID NOs：82、83、84、85、86、87、88、
89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、
111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、
130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、
149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、
168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183和184，或与其基本同源的序列，其中与给定的氨基酸序列相比，所述基本上同源的序列是含有1、2或3个氨基酸取代或缺失的序列，或者是与给定的氨基酸序列具有至少70％序列一致性的序列，或
者是具有给定氨基酸序列的至少6个连续氨基酸的序列。

[0534] 在一个方面，本发明提供了抗原表位，该抗原表位包括选自下组的氨基酸序列(或由其组成)，该组由以下各项之一组成(或包括)SEQ ID NOs：82、88、90、94、95、96、98、99、
102、104、107、110、114、115、121、122、126、130、132、137、138、139、140、141、142、143、144、
145、146、147、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、163、165、167、168、169、
171、173、174、175、176、178、180、181和182，或与其基本同源的序列。“与其基本上同源的”序列在本文其他地方描述。

[0535] 在一些实施例中，本发明提供了抗原表位，该抗原表位包括选自下组的氨基酸序列(或由其组成)，该组由以下各项之一组成(或包括)SEQ ID NOs：82、88、90、94、95、96、98、
99、102、104、107、110、114、115、121、122、126、130、132、137、138、139、140、141、142、143、
144、145、146、147、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、163、165、167、168、
169、171、173、174、175、176、178、180、181和182，或与其基本同源的序列，其中与给定的氨基酸序列相比，所述基本上同源的序列是含有1、2或3个氨基酸取代或缺失的序列，或者是与给定的氨基酸序列具有至少70％序列一致性的序列，或者是具有给定氨基酸序列的至少
6个连续氨基酸的序列。

[0536] 在一些实施例中，本发明提供了抗原表位，该抗原表位包括选自下组的氨基酸序列(或由其组成)，该组由以下各项组成(或包括)SEQ ID NOs：82、83、84、85、86、87、88、89、
90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105和106，或与其基本同源的序列。

[0537] 在一些实施例中，本发明提供了抗原表位，该抗原表位包括选自下组的氨基酸序列(或由其组成)，该组由以下各项组成(或包括)SEQ ID NOs：107、108、109、110、111、112、
113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、
132、133、134、135、136，或与其基本同源的序列。

[0538] 在一些实施例中，本发明提供了抗原表位，该抗原表位包括选自下组的氨基酸序列(或由其组成)，该组由以下各项组成(或包括)SEQ ID NOs：137、138、139、140、141、142、
143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154和155，或与其基本同源的序列。

[0539] 在一些实施例中，本发明提供了抗原表位，该抗原表位包括选自下组的氨基酸序列(或由其组成)，该组由以下各项组成(或包括)SEQ ID NOs：156、157、158、159、160、161、
162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、
181、182、183和184，或与其基本同源的序列。

[0540] 在一个方面，本发明提供与蛋白质上的表位结合(特异性结合)的抗体，其中所述表位包括选自下组的氨基酸序列(或由其组成)，该组由以下各项之一组成(或包括)SEQ ID NOs：82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、
104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、
123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、
142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、
161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、
180、181、182、183和184，或与其基本同源的序列。优选的基本同源的序列在本文其他地方描述。其中发现此类序列的蛋白质(因此本发明的某些抗体可与之结合)列于本文表9‑12
中。

[0541] 在一个方面，本发明提供结合(特异性结合)蛋白质上的表位的抗体，其中所述表位包括选自下组的氨基酸序列(或由其组成)，该组由以下各项之一组成(或包括)SEQ ID 
NOs：82、88、90、94、95、96、98、99、102、104、107、110、114、115、121、122、126、130、132、137、
138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、149、150、151、152、153、154、155、156、157、
158、159、163、165、167、168、169、171、173、174、175、176、178、180、181和182，或与其基本同源的序列。优选的基本同源的序列在本文其他地方描述。其中发现此类序列的蛋白质(因此本发明的某些抗体可与之结合)列于本文表9‑12中。

[0542] 在一个方面，本发明提供了与蛋白质上的表位结合的抗体，所述蛋白质含有或侧接(优选含有)切割位点，所述切割位点是步骤(iii)中鉴别的所述第一蛋白酶的切割位点
(其可能是是一个蛋白酶可接近的切割位点，但肽不被释放)。

[0543] 可以测试蛋白质上靶向表位(优选多个表位)的抗体(例如组或阵列或大量抗体)结合蛋白质的能力，例如评估它们的结合亲和力或其他功能效应(例如，如本文其他地方所述)蛋白质。因此可以筛选抗体以鉴别最佳结合物。因此，可以鉴别特别有用的表位(例如用于抗体靶向)，例如，表位特别适合被高亲和力抗体靶向或其靶向导致对靶蛋白的显著或可测量的功能效应(例如拮抗或激动作用)。因此，可以鉴别最佳表位(例如用于抗体靶向)。因此，作为另外一种选择，本发明提供了一种优化表位设计或选择最佳表位的方法(例如用于针对或靶向的抗体)。该方法可以允许确定表位相对于切割位点的最佳长度和位置。

[0544] 结合由方法C鉴别的表位的抗体(或方法C鉴别的表位)可用于治疗。

[0545] 下面概述用于说明本发明的实施例和优点的更具体的描述。

[0546] 在用蛋白酶A的步骤(i)中，切割掉的肽(鉴别的肽)将是在两端具有蛋白酶A的切割位点的肽(其中两端已被蛋白酶A切割的肽，A‑A肽)。然而，你不会获得(鉴别)一端已被蛋白酶A切割，但肽由于一些原因未被释放(切割)的肽，例如，因为没有一种或多种蛋白酶的另一个位点足够接近这个位点(切割位点)，或者因为肽通过一些其他手段保留在蛋白质
上，例如，分子相互作用或力，例如离子键。

[0547] 在用蛋白酶B的步骤(ii)中，切割掉的肽(鉴别的肽)将是在两端具有蛋白酶B的切割位点的肽(其中两端已经被蛋白酶B切割的肽，B‑B肽)，但是还有一端带有蛋白酶B的切割位点和另一端带有蛋白酶A的切割位点的肽(其中一端已被第一蛋白酶切割，另一端已被第
二蛋白酶切割的肽，B‑A肽，A‑B肽，或如本文其他地方所述，有时还鉴别了附加的A‑A肽)。研究B‑A(或A‑B)肽(或有时是额外的A‑A肽)允许鉴别(在步骤(iii)中)蛋白酶A的切割位点，其在步骤(i)中未检测到，因为肽未被从蛋白质物理切割掉(释放)。

[0548] 在步骤(iii)中鉴别的这些蛋白酶A切割位点是目的位点，因为它们通常在天然肽中表面暴露，因为它们在本文其他地方描述的限制性蛋白水解步骤中产生，其可以设计成
靶向表面暴露的肽和氨基酸残基(例如它们代表如本文其他地方所述的优选的表面暴露的
肽，优选具有高级别的表面暴露的肽，例如首先或在蛋白酶的最低浓度或最不适合(most 
non‑optimum)或最温和的蛋白酶条件下切割掉的肽，除了其他因素不允许切割的事实，例如另一种蛋白酶A位点不够接近之外，其会被切割掉)。由于这样的位点位于天然蛋白质的
表面上或者可以以其他方式可接近，因此这些位点也可以代表蛋白质的基于或靶向表位设
计的良好部分。

[0549] 重要的是，如在一些实施例中，蛋白酶B步骤(步骤(ii))在非限制性条件下实施，例如，完成(或接近完成)，这意指所有(或显著全部或大量的)B‑A、A‑B或额外的A‑A型肽将释放，因此鉴别在限制性蛋白水解步骤(i)中切割但未释放的所有(或显著全部或大量的)
蛋白酶A位点。以这种方式，增加数量的潜在有用的位点，例如表面暴露的位点，因此与如果仅进行限制性蛋白水解步骤或如果步骤(ii)在限制性蛋白水解条件下进行相比，则可以鉴
别潜在有用的表位。

[0550] 也就是说，包括限制性蛋白水解的两个步骤的方法，即上述方法(方法C)的步骤(i)和(ii)是限制性或约束性蛋白水解的步骤，例如，如本文其他地方所述，可用于产生肽和鉴别表位。

[0551] 本文所述的其他方法的优选特征可以适用于(加上有必要的变更)本发明的这个方面(方法C)。例如，如本文其他地方所述可以使用方法C鉴别适合的蛋白质上的表位，适合的蛋白质。此外，适合的和优选的方法，例如使用质谱法分析切割的肽和流动池的使用，例如，在本文其他地方描述实施蛋白水解步骤的微流体细胞或微流体平台和/或蛋白脂质体。
另外，该方法(方法C)的步骤通常在体外实施。

[0552] 方法C可有利地用于鉴别蛋白质表面上的蛋白酶可接近/切割但未释放的表位。该方法在限制性蛋白水解步骤(使用一种或多种蛋白酶)中依次使用几种(2种或更多种)蛋白
酶进行体外蛋白酶消化，然后进行非限制性蛋白水解步骤或限制性蛋白水解(使用一种或
多种蛋白酶)的进一步的步骤。该方法可以使用如本文其他地方所述的微流体平台进行消
化。质谱(MS)，优选LS‑MS/MS，可用于鉴别来自靶蛋白的蛋白酶释放的肽。从肽图谱中阐明实验确定的切割位点，例如，由MS获得。目的切割位点，即用于限制性蛋白水解步骤但不释放肽的蛋白酶的切割位点，可以使用针对包含切割位点的序列的抗体(例如切割位点周围
的‑20至+20个氨基酸)探测。

[0553] 该方法的目的是使用新方法鉴别抗体结合位点(表位)和/或阐明蛋白质结构，其中抗体用于鉴别蛋白酶可接近/切割但未释放的表位。该方法基于在限制性蛋白水解(使用
一种或多种蛋白酶)的步骤中依次使用几种(2种或更多种)蛋白酶进行体外蛋白酶消化，然
后进行非限制性蛋白水解步骤或限制性蛋白水解的进一步的步骤(使用一种或多种蛋白
酶)。可以使用具有MS‑MS检测的微流体多蛋白酶消化。该程序将能够发现独特的和新颖的抗体结合位点(表位)，并且可以产生天然的和部分消化的蛋白质的新结构数据。

[0554] 蛋白水解的步骤通常在体外实施。因此，进行体外蛋白水解实验。对于膜相关蛋白，含有天然蛋白的蛋白脂质体可以在微流体流动池(LPI，Nanoxis Consulting AB)内消
化。流动池技术能够对固定相中包含的膜蛋白进行灵活的化学反应，例如限制性和非限制
性蛋白水解(Jansson ET，Trkulja CL，Olofsson J等，Microfluidic flow cell for 
sequential digestion of immobilized proteoliposomes.Anal Chem.2012；84(13)：
5582‑5588)，其可以经历几轮溶液和不同类型的化学调制，例如通过酶。因此，限制性和非限制性蛋白水解的步骤可以顺序实施。在非限制性蛋白水解或进一步限制蛋白水解步骤开
始之前，需要停止限制性蛋白水解的步骤。因此，可以在加入用于非限制性蛋白水解步骤或进一步的限制性蛋白水解步骤的蛋白酶之前，除去用于进行限制性蛋白水解的蛋白酶(例
如通过洗涤)。细胞膜可以从里向外翻转，并且跨膜蛋白的细胞内和细胞外结构域都可以直接查询。使用标准的溶液内技术可以对可溶性蛋白质进行限制性和非限制性蛋白水解。

[0555] 在顺序反应中可以使用具有不同特异性的多种蛋白酶，以便覆盖尽可能多的序列。已经建立的限制条件，例如2‑5μg/mL范围内的蛋白酶浓度和5分钟消化，可用于限制蛋白质表面的蛋白水解。释放的肽可以通过质谱法(例如通过LC‑MS/MS)鉴别，优选通过使用高分辨率质谱仪(例如，通过LC‑MS/MS)鉴别，优选的，通过使用高分辨率质谱仪(例如Q 
Exactive，Thermo Fisher)和Mascot肽/蛋白质鉴别。通过手头的肽图，我们此时可以确定哪些切割位点可被蛋白酶物理接近。然后我们实施如本文其他地方所述的非限制性蛋白水
解的步骤。

[0556] 为了查明蛋白酶可接近/切割但不释放的位点，在非限制性蛋白水解步骤后，我们可以通过质谱法分析释放的肽，以鉴别其中一端已经被限制性蛋白水解步骤中使用的蛋白
酶中的一种切割和另一端已经被非限制性蛋白水解步骤中使用的蛋白酶切割的肽(这可以
通过查看蛋白质的氨基酸序列和释放的肽的末端并且了解使用的蛋白酶的特异性规则来
容易地完成)。

[0557] 可以合成含有这些位点的肽序列，优选7‑8个氨基酸长，并用于产生多克隆抗体(pAb)。长度选择的原因是为了通过最小化靶序列来最小化pAb的多克隆性，但不能太短以
至于序列变得免疫原性差。

[0558] 单个氨基酸框架移位可用于选择该长度在切割位点每侧上的设定距离内的线性序列(例如6个氨基酸)。然后可以使用这些创建一系列序列靶向pAb，随后可以使用例如
ELISA筛选所述序列靶向pAb与天然完整蛋白质的结合。

[0559] 本文所述的其他方法的优选特征可以适用于(加上有必要的变更)本发明的这个方面(方法C)。

[0560] 在一个方面，本发明提供了鉴别蛋白质上的表面暴露位点(或表面可接近的位点，例如蛋白酶或抗体可接近的)的方法，所述方法包括：

[0561] (i)使用单一第一蛋白酶或第一蛋白酶的组合对所述蛋白质进行限制性或约束性蛋白水解；

[0562] (ii)使用单一第二蛋白酶或第二蛋白酶的组合对所述蛋白质进行非限制性蛋白水解或进行限制性或约束性蛋白水解，其中所述一种或多种第二蛋白酶均不同于步骤(i)
中使用的一种或多种蛋白酶；

[0563] (iii)分析在步骤(ii)中从所述蛋白质释放的肽，以鉴别其中一端已被所述第一蛋白酶切割而另一端已被所述第二蛋白酶切割的肽。

[0564] 其中步骤(iii)中鉴别的已经被所述第一蛋白酶切割的肽的末端(例如末端的残基)对应于蛋白质中的表面暴露位点(天然蛋白质或野生型蛋白质或全长蛋白质)，从而鉴
别出蛋白质上的表面暴露位点。本文所述的其他方法的优选特征可以适用于(加上有必要
的变更)本发明的这个方面。

[0565] 本发明的其他特征和优点从以下实例变得明显。所提供的实例说明在实施本发明中有用的不同组分和方法。所述实例不限制要求保护的发明。基于本披露，本领域技术人员可以识别和使用对实施本发明有用的其他组分和方法。

[0566] 实例

[0567] 实例1

[0568] 在这个实例中，我们描述了一种成功的方法，其中我们已经发现并开发了基于所提出的发明并包括方法在人类TRPV1离子通道的细胞内侧作用的多克隆抗体OTV1。该抗体
具有药理学活性，并且当用激动剂辣椒素刺激时，对蛋白质显示出强烈的抑制作用。据我们所知，这是第一次发现靶向TRPV1细胞内结构域的抑制性抗体。这表明该概念具有高的工作概率，并且如果起源于远远更丰富的多蛋白酶数据集的表位的起始矩阵将可用，则可以鉴
别甚至更好的和优化的抗体。从限制性的蛋白水解和生物信息学分析的多个匹配中选择抗
体。抗体是第一选择的，并且它显示出功效的强证据。这是一个显著的进步，并且与目前的抗体鉴别努力相辅相成，因为不需要筛选步骤，因为它直接导致可以被药理学活性抗体靶
向的独特表位。

[0569] 基于在LPI微流体平台中使用优化方案的靶蛋白的限制性消化来选择靶向表位区域，并进一步优化。通过用半胱氨酸残基修饰靶肽表位并将其连接到钥孔戚血蓝蛋白(KLH)来产生多克隆抗体。通过在注射具有联合特异性肽的KLH后免疫特异性无病原体(SPF)兔来
进行特异性抗体的产生。纯化抗体，并根据标准方案使这些抗体经受ELISA试验。用ELISA进行针对线性表位的抗体滴度，得到0.25μg/ml的浓度。使用内面向外膜片钳研究抗体对天然TRPV1的功效，其中TRPV1的细胞内侧可以暴露于抗体溶液。使用用于膜片钳记录的微流体
装置(Dynaflow公司，Cellectricon AB，瑞典哥德堡( Sweden))进行内面向外记
录。通过将包含若干个离子通道的膜片暴露于具有和不具有抗体的辣椒素来测量电流幅
度。将对照物暴露于1μM辣椒素30s，然后暴露于缓冲液70s，然后再暴露于1μM辣椒素30s。将抗体处理的膜片暴露于1μM辣椒素30s，然后用0.14mg/ml抗体暴露70s，并且然后将1μM辣椒素与0.14mg/ml抗体一起暴露30s。对于所有测量，将抗体活性与仅暴露于缓冲液后的活性
进行比较，以排除脱敏或增强的任何影响。计算电流‑时间积分面积，并计算第二和第一电流的积分面积之间的比率，并在处理间进行比较。与仅用缓冲液相比，用抗体处理的细胞观察到电流响应减少50％(图3)。用学生t检验来计算统计学显著性(p>0.05)。

[0570] 实例2

[0571] 治疗性mAb市场正在快速增长，预计2020年将达到值约1250亿美元。新颖mAb不断达到监管机构的认可，目前，免疫原性mAb如PD1抑制剂被广泛讨论，因为它们大大改善了某些类型的难转移性癌症的结果。然而，用于治疗目的的新颖抗体的发现在很大程度上依赖
于筛选并且盲目地完成。重点是亲和力，并且针对生物学效应测试显示良好结合特征的抗
体的一个子集。关于结合相互作用、抗原决定簇和作用机制的细节仍然未知。

[0572] 我们提出了一种使用微流体方法和质谱法、基于限制性的蛋白水解动力学攻击来选择抗原表位的方法。蛋白水解步骤如此缓慢地进行，在蛋白酶攻击之后，在那时抗原将单个或几个肽撕下来。首先下来的肽对于pAb或mAb是容易接近的，并且因此对于残留在蛋白
质的区域的之后下来的肽(更难接近)很有利。然后使用策划的生物信息学数据，针对基于
序列的功能重要性，将这些肽按等级排序并且交叉关联。快速脱离靶蛋白的、也具有功能意义的高等级肽，用于表位开发、免疫和随后的抗体产生。此外，截短的蛋白质可用于药理学测试。该方法依赖于基于序列的信息，并且是基于药理学、作用机制来发现抗体的方法，并且可以用于细胞内靶标、循环靶标和细胞外靶标。我们已经使用这种方法开发两种抗体，一种是激活解决(addressing)钙调素结合序列的抗体，另一种是抑制解决(addressing)人类
TRPV1离子通道胞内区N‑末端的辣椒素结合位点的抗体。

[0573] 开发治疗性抗体时的两个重要参数是结合亲和力和生物功效。抗体是大约150kDa的大蛋白质，并且主要结合位于蛋白质表面上的抗原位点。天然蛋白质结构的表面附近氨
基酸的位置可以指导这些位点的鉴别和预测。我们使用限制性的蛋白水解来探测蛋白质的
表面暴露和灵活性。这是通过控制温度、浓度和/或消化时间来限制蛋白酶的活性的方法。
仅可以在局部展开并容纳蛋白酶的灵活区域、表面暴露区域和几乎没有局部相互作用(如
氢键和二硫桥)的区域将在这种条件下被消化。我们一前一后地使用了若干种蛋白酶，以最大限度地一起提取结构信息。易被若干种蛋白酶消化的区域应位于蛋白质的最暴露、最易
接近的区域，并且对于进一步的抗体开发具有高适应性。仅被单一蛋白酶消化的区域可能
位于蛋白质的隐藏区域并且不太可接近。能够达到和消化这些区域的蛋白酶的物理化学特
性可能在这种情况下潜在地指导抗体开发。我们基于消化的容易程度将消化的肽排序，这
取决于哪些参数用于限制性蛋白水解。这可能是它们被消化的时间点、使用的浓度或温度。
然后将由每个蛋白酶消化的肽彼此相关联，以便找到起源于蛋白质最易接近区域的那些
肽。

[0574] 在常规抗体开发过程期间，通常在抗体和抗原之间确认阳性结合后测试生物学功效。我们认为抗体开发将受益于早期机制驱动的方法，通过将免疫接种集中在生物活性位
点上或其附近的可接近位点，而不是产生靶向所有可能的抗原位点的抗体。这最小化筛选
程序连同优化对远离生物活性位点的区域具有高结合亲和力的抗体的风险。我们想找到对
靶蛋白具有功能重要性的可接近表位。这是通过将限制性蛋白水解的排序肽与生物信息学
数据进行比较来完成的。

[0575] 我们展示了使用人类TRPV1离子通道作为模型蛋白的机制驱动方法。TRPV1是对例如低pH、高温(T>42℃)、辣椒素、和若干种炎症介质的有害刺激物敏感的离子通道。TRPV1离子通道主要位于周围神经系统的伤害感受神经元中，并且以四聚体构象排列。TRPV1的四个单体中的每一个由六个跨膜区组成，其中N‑末端和C‑末端都面向质膜的细胞内侧。孔区由第5和第6跨膜区组成。TRPV1的细胞内部分容纳许多对热激活、致敏和脱敏重要的调节区。

[0576] 表位产生

[0577] 包含TRPV1的蛋白质脂质体来源于CHO细胞，并且分别使用胰蛋白酶和Asp‑N，在LPI流动细胞内对包含TRPV1的蛋白质脂质体进行限制性的蛋白水解。蛋白酶的活性被限制
到以下程度，直到通过使用室温和低浓度只有少数肽被消化。然后用串联质谱(LC‑MS/MS)的液相色谱检测消化的肽。在用Asp‑N蛋白水解后，用胰蛋白酶和一个肽进行蛋白水解后检测到三种肽。将这些肽与已知功能数据和与表1中列出的功能重要区域相关的若干肽进行
比较。选择两种肽用于进一步抗体开发，aa96‑117和aa785‑799，分别命名为OTV1和OTV2。
TRPV1结构内表位的可视化可以在图4和图5中看到。OTV1的肽序列包括arg115(arg114针对
rTRPV1)，arg115已被示出对于用辣椒素或质子的激活是重要的。在该氨基酸附近的两种蛋白酶消化区域，增加了这是三级蛋白质结构中暴露区域的可能性。针对OTV2的肽序列包括
钙调素结合位点aa786‑aa798(aa785‑aa797针对rTRPV1)，并且仅用胰蛋白酶消化。在这一部分TRPV1中，没有Asp‑N的消化位点，Asp‑N在N‑末端侧切割Asp和Cys。aa96‑117和aa785‑
799的合成肽与钥孔戚血蓝蛋白(KLH)连接，并且进一步用于在注射KLH连接的肽之后，通过免疫兔产生多克隆抗体。所产生的抗体显示在冷冻期间和溶液中随时间聚集的趋势。结果，新鲜解冻的抗体在使用之前进行端超声(tip‑sonicated)处理，所有实验在尖端超声处理
的30分钟内进行。

[0578] 表1‑用Asp‑N和胰蛋白酶消化的肽及其生物相关性

[0579]

[0580] 免疫细胞化学

[0581] 进行免疫细胞化学以便可视化表达TRPV1的CHO细胞内的抗体分布(图6)。非诱导细胞用作非特异性结合的对照。将细胞固定并用OTV1抑或OTV2，然后使用山羊抗兔Alexa 
488第二抗体染色。对于OTV1和OTV2两者，仅在诱导细胞中观察到可见的质膜中的清晰染
色。第二抗体的非特异性结合是可忽略的(数据未显示)。

[0582] 电生理学

[0583] 使用内面向外膜片钳记录评估OTV1对辣椒素诱导的TRPV1活性的功能效应连同2+
OTV2对钙调素//Ca 依赖性脱敏的影响。从CHO细胞切下包含若干个离子通道的膜片，使抗
体能够暴露于TRPV1的细胞内区域。对于OTV1，用辣椒素激活TRPV1，然后用OTV1处理，随后在OTV1存在下用辣椒素激活。对照用辣椒素激活，用缓冲液处理，并且再次用辣椒素激活。
当将用OTV1处理和仅用缓冲液处理进行比较时，观察到辣椒素介导的电流降低50％(图7)。
2+ 2+
测试OTV2的干扰钙调素/Ca 依赖性脱敏的能力。用辣椒素激活TRPV1，然后用钙调素、Ca
2+
和OTV2处理，随后在钙调素、Ca +和OTV2存在下用辣椒素激活。用辣椒素激活对照，用钙调
2+ 2+
素和Ca 处理，并在钙调素和Ca 存在下用辣椒素激活。在钙的存在下钙调素使TRPV1脱敏。
用OTV2处理减少了45％的这一效果(图7)。

[0584] TRPV1介导的YO‑PRO摄取测定

[0585] 使用电穿孔作为递送方法测试全细胞内抗体的功效，随后用激光扫描共聚焦显微镜测量TRPV1介导的YO‑PRO摄取。在OTV1、OTV2或缓冲液存在下，使用Neon转染系统(生命技术公司(Life Technologies))对细胞进行电穿孔。将用OTV1或缓冲液电穿孔的细胞在包含
钙螯合剂的PBS中经受辣椒素和YO‑PRO。随后监测由TRPV1介导的YO‑PRO摄取引起的荧光的细胞内增加。可以在最初12秒观察到OTV1处理的细胞摄取率降低60％，在20秒之后可以观
察到OTV1处理的细胞的最高摄取率，与对照组的8秒相比(图8)。用OTV2或缓冲液电穿孔的
细胞在包含钙的PBS中经受辣椒素和YO‑PRO，依赖由施用的钙触发的内源性钙调素脱敏。在OTV2处理的细胞激活15秒后，可以观察到摄取率增加80％。使用免疫细胞化学验证了抗体
与电穿孔的内化(图9)。

[0586] 我们已经开发了用于抗体产生(位于靶蛋白的功能重要区域内和/或附近的暴露和可接近的抗原位点)的微流体方法。在LPI流动细胞内使用动力学限制的蛋白水解来探测
可接近区域。靶蛋白保持在其天然状态，而其环境的复杂性可以被小心地控制(例如，通过允许协同因素存在)。与使用纯化的蛋白质的结合测定相比，这可以更好地了解抗原位点的可接近性。该方法非常适用于不需要洗涤剂的另外难以纯化和用于结合测定的跨膜靶标。
可以使用这种方法靶向细胞内和细胞外结构域二者。

[0587] 了解抗原位点的位置及其生物功能对于预测和评价与其他蛋白质的非特异性结合和交叉反应性非常重要。位于非常保守区域的表位可以从潜在的表位候选物的分析中排
除，以使交叉反应性最小化。

[0588] 尽管不是用整个蛋白质免疫产生的，本文开发的抗体是多克隆抗体。我们的方法与用于使用杂交瘤和随后的筛选程序生产单克隆抗体的常规方案相容。使用多克隆抗体作
为第一步骤来实验验证若干种有希望的表位候选物的生物学功效，然后使用最佳一个或多
个表位来生产单克隆抗体，以及高结合亲和力的筛选方法，组合两种中最好的一个。

[0589] 验证抗体内化

[0590] 在电穿孔后24小时后，用免疫细胞化学验证用电穿孔的抗体的内化。在PBS中0.14mg/ml OTV1或0.27mg/ml OTV2的存在下电穿孔细胞。然后将电穿孔的细胞在玻璃底培
养皿(Willco wells)中培养24小时。做了两个不同的对照。一组未经电穿孔、但以其他等同方式处理并经受相同抗体溶液，另一组未经受OTV1和OTV2。后者用于定量第二抗体的非特
异性结合。培养24小时后，用PBS小心清洗细胞以除去任何残留抗体，否则这些抗体在固定期间可能进入细胞。然后使用 固定/透化试剂盒(英杰公司(Invitrogen))将细胞
固定并透化。将固定和透化细胞与山羊抗兔Alexa 488第二抗体(英杰公司)在室温下孵育
30min。在最后的洗涤步骤之后可视化细胞，并且在电穿孔细胞、非电穿孔细胞和只进行第二抗体的细胞之间比较荧光强度(图9)。观察到电穿孔和非电穿孔细胞之间强度值的明显
差异。用学生t检验进行统计学分析，并且p<0.05被认为具有统计学意义。在非电穿孔的细胞中发现低水平第一抗体，这可能是在固定和透化过程中进入的残留抗体。

[0591] 我们在此提供了一种用于利用微流体和限制性蛋白水解的组合产生高亲和力、生物活性抗体的方法。该方法使用人TRPV1离子通道进行验证，并开发了两种抗体。基于它们各自的表位区域的功能重要性，两种抗体引起TRPV1应答的预测改变。

[0592] 材料与方法

[0593] 化学品

[0594] 细胞培养培养基(具有谷氨酰胺的DMEM/HamF12)、胎牛血清、和Accutase细胞消化液购自PAA。Zeocin(博来霉素)、Na4BAPTA、K4BAPTA和山羊抗兔Alexa 488第二抗体购自英杰公司(invitrogen)。测序级修饰胰蛋白酶和测序级Asp‑N购自普洛麦格公司(Promega)。所有其他化学品均购自西格玛公司(Sigma)。使用以下缓冲液：A：300mM NaCl、10mM Tris、pH 
8.0，B：20mM NH4HCO3、pH 8.0。C：140mM NaCl、5mM KCl、1mM MgCl2、10mM HEPES、10mM D‑葡萄糖、10mM Na4BAPTA、pH 7.4，D；140mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、10mM K4BAPTA pH 
7.2、E：140mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、pH 7.2。F：140mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、pH 7.4。G：120mM KCl、2mM MgCl2、10mM HEPES、10mM K4BAPTA、pH 8.0

[0595] 细胞培养

[0596] 在具有和不具有载玻片的培养瓶或培养皿(Nunc)中，在补充有10％胎牛血清、博来霉素(350μg/ml)和杀稻瘟菌素(5μg/ml)的培养基(具有谷氨酰胺的DMEM/F12)中培养具
有四环素调节表达系统(T‑REx)的粘附的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在使用前18‑24小时，将细胞在补充有10％胎牛血清和多西环素(1μg/ml)的培养基(具有谷氨酰胺的DMEM/F12)中
孵育以诱导人类TRPV1的表达。常规测试细胞系的支原体感染。

[0597] 蛋白脂质体制备

[0598] 在缓冲液A中如先前其他地方[1]制备蛋白脂质体。每种蛋白脂质体制剂来源于若干种不同的培养瓶。

[0599] 消化方案

[0600] 如其他地方[1]所述进行流动细胞内的单一消化。将5μg/ml胰蛋白酶和5μg/ml Asp‑N分别溶于缓冲液G和B中。在室温下，在流动细胞内用每种蛋白酶进行5min的消化。通过添加甲酸至12％的终浓度抑制洗脱液中的进一步消化。

[0601] 液相色谱与串联质谱法

[0602] 如前所述[1]，在瑞典，哥德堡，哥德堡大学(Gothenburg University，Sweden)蛋白质组学核心设施(Proteomics Core Facility)分析了来自CHO蛋白脂质体的
消化的肽样品。所有串联质谱均由MASCOT(英国伦敦的矩阵科学(Matrix Science，London，UK))针对2013_04发布的UniProtKB(人类，[智人])(用于用胰蛋白酶消化)和2015_06发布
的UniProtKB((人类，[智人])(用于用Asp‑N消化)进行检索。Thermo Proteome Discoverer 
1.3版本(赛默科技(Thermo Scientific))用于验证基于MS/MS的肽和蛋白质鉴别。使用肽
水平的假发现率为0.01，并通过检索反向数据库来确定。

[0603] 抗体开发

[0604] 合成并纯化aa96‑117和aa785‑799的关于hTRPV1的氨基酸序列的合成肽，包括在N‑末端侧的另外的半胱氨酸残基。然后将肽通过半胱氨酸残基连接至钥孔戚血蓝蛋白
(KLH)，并且然后用于在注射KLH连接的肽后通过免疫特异性无病原体(SPF)兔来产生多克
隆抗体。纯化抗体并使这些抗体经受ELISA试验。由Innovagen AB(瑞典，隆德(Lund，
Sweden))进行合成肽和多克隆抗体两者的产生。

[0605] 使用新鲜解冻的并在尖端超声处理30分钟内的抗体。使用来自超声材料公司(Sonics&Materials Inc)(美国康涅狄格牛顿(Newtown，CT，USA))的Vibra Cell VCX 600
将抗体以14％振幅超声处理3次，间隔1分钟静息。总超声处理时间为40秒，其中有0.5s脉冲时间和0.5s静息时间，以减少探头的加热。

[0606] 电生理学

[0607] 使用用于膜片钳记录的微流体装置(Dynaflow公司，Cellectricon AB，瑞典哥德堡( Sweden))和HEKA EPC10(德国Heka Elektronik)膜片钳放大器进行内面向外
记录。水浴和移液管溶液包含缓冲液C.膜片被夹紧在+60mV，并以20kHz的取样频率记录电
流信号，并在5kHz下进行低通滤波。

[0608] 对于OTV1，通过将包含若干个离子通道的膜片暴露于具有和不具有抗体的辣椒素来测量电流幅度。将对照在缓冲液D中暴露于1μM辣椒素30s，随后暴露于缓冲液D中70s，并且然后再在缓冲液D中暴露于1μM辣椒素30s。将OTV1处理的膜片在缓冲液D中暴露于1μM辣椒素30s，然后在缓冲液D中暴露于0.14mg/ml抗体70s，并且然后将1μM辣椒素与0.14mg/ml抗体在缓冲液D中一起暴露30s。对于OTV2，通过将膜片暴露于具有和不具有抗体和钙调蛋
2+
白/Ca 的辣椒素中来测量当前幅度。将对照在缓冲液E中暴露于1μM辣椒素30s，随后在缓冲
2+
液E中暴露于0.5μM钙调素和50μM Ca 70s，并且然后再在缓冲液E中暴露于1μM辣椒素30s。
将抗体处理的膜片在缓冲液E中暴露于1μM辣椒素30s，然后在缓冲液E中暴露于0.14mg/ml
2+
抗体、0.5μM钙调素和50μM Ca 70s，并且然后在缓冲液E中暴露于1μM辣椒素以及0.14mg/ml
2+
抗体、0.5μM钙调素和50μM Ca 30s。处理后密封阻力发生很大变化的测量值被排除在进一步分析之外。

[0609] 数据分析电生理学

[0610] 对于所有测量，将抗体处理后的活性与仅暴露于缓冲液后的活性进行比较，以排除由于重复激活引起的脱敏或增强的任何作用。对于包含电流迹线的数据，使用Fitmaster(德国HEKA Elektronik)和Matlab(美国马萨诸塞州矩阵实验室(Mathworks，MA，USA))计算电流‑时间积分面积，用于在OTV1的应用和去除之间、以及OTV2的完全激活和去除之间每次用辣椒素的激活。计算第二和第一电流的积分面积之间的比率，并且在处理之间进行比较。
对于OTV2，由于作用的时间依赖性降低，数据点分为两类(尖端超声后<15min，和尖端超声后<30min)。

[0611] 使用单因素方差分析进行统计分析，结合Dunnett的事后检验和学生t检验(适用时)。P<0.05被认为具有统计学意义。数据呈现为平均值±SEM。

[0612] 电穿孔

[0613] 使用Neon转染系统(生命技术公司(Life Technologies))进行细胞溶质抗体递送。使用Accutase细胞消化液分离粘附的CHO细胞，并用缓冲液F进行洗涤。将105个细胞沉淀并重新悬浮于缓冲液F、，缓冲液F中0.14mg/ml OTV1、抑或0.27mg/ml OTV2中。将10μl的细胞/抗体悬浮液使用氖管移液管移液，并在系统移液管站中经受电穿孔。使用针对抗体递送优化的方案[5]，其中细胞在10ms期间暴露于1550V并且持续3个脉冲。将电穿孔细胞转移到玻璃底培养皿(Willco wells)

[0614] 成像

[0615] 使用来自荧光显微照片的感兴趣区域(ROI)测量来对通过免疫细胞化学和TRPV1介导的YO‑PRO摄取的抗体位置进行测量。使用Thorlabs CLS系统形成显微照片，该系统装备有Galor：Resonant扫描仪和高敏感性GaAsP PMT(记录入ThorImageLS软件(美国新泽西
州的Thorlabs公司(Thorlabs Inc，New Jersey，U.S.A))。将扫描仪装置安装在配有油浸63×NA 1.47Leica HCX PL APO物镜的Leica DMIRB显微镜上。使用Coherent Sapphire 
488LP激光(美国加利福尼亚州的相干公司(Coherent Inc.，CA，U.S.A.)在488nm的激发下
从单个细胞测量荧光检测，并在500‑550nm之间收集发射。使用Image J和Matlab(美国马萨诸塞州矩阵实验室(Mathworks，MA，USA))分析ROI数据。

[0616] 免疫细胞化学

[0617] 将细胞培养在玻璃底培养皿(Willco wells)上，并在使用前18‑24小时在一些培养皿中诱导TRPV1表达。将包含表达TRPV1的细胞和非诱导细胞的两个培养皿用缓冲液F洗
涤，并且然后使用 固定/透化试剂盒(英杰公司(invitrogen))进行固定和透化。
将固定的和透化的细胞在缓冲液F中在37℃下经受25μg/ml抗体30min，然后用缓冲液F洗
涤，随后在室温下与山羊抗兔Alexa 488第二抗体孵育30。在最后的洗涤步骤之后可视化细胞，并比较诱导的和未诱导的细胞之间的抗体分布。

[0618] TRPV1介导YO‑PRO摄取

[0619] 将包含10μl的电穿孔细胞的玻璃底培养皿安装在显微镜上。以0.5Hz的速率初始化记录。对于OTV1，将缓冲液F中包含辣椒素、YO‑PRO和K4BAPTA的20μl液滴小心地移液到电穿孔的细胞上，以使分离最小化，导致最终浓度为1μM的辣椒素、1μM的YO‑PRO和10mM的
2+
K4BAPTA。对于OTV2，将缓冲液F中包含辣椒素、YO‑PRO和Ca 的20μl液滴类似地移液到电穿
2+
孔的细胞上，导致最终浓度为1μM的辣椒素、1μM的YO‑PRO和50μM的Ca 。

[0620] 上述实施例将被理解为本发明的几个说明性实例。本领域技术人员将理解，在不偏离本发明的范围的情况下，可以对实施例进行不同修改、组合和改变。具体地，不同实施例中的不同部分解决方案可以在技术上可能的其他构型中组合。

[0621] 参考文献

[0622] 1 Jansson,E.T.等人，Anal.Chem.[分析化学]2012,84:5582‑5588

[0623] 2国际申请号WO 2006/068619

[0624] 3欧洲专利申请号EP 2174908

[0625] 4 Trkulja,C.L.等人，J.Am.Chem.Soc.[美国化学会志]2014,136:14875‑14882

[0626] 5 Freund,G.等人，MAbs,2013,5:518‑522

[0627] 实例3

[0628] 通过使用多种蛋白酶在CHO细胞中表达的离子通道TRPV1的限制性消化和质谱的肽鉴别

[0629] 这一实例描述了并行地使用多种蛋白酶以鉴别来自TRPV1的肽的蛋白酶特异性集合。本实例中使用的蛋白酶是胰蛋白酶、Asp‑N、胃蛋白酶、蛋白酶K和胰凝乳蛋白酶。当彼此进行比较时，肽的蛋白酶特异性集合可以是重叠的、互补的或独特的。通过使用不同的蛋白酶浓度，并且在几个实例中通过使用不同的孵育时间来实现不同的蛋白水解活性。

[0630] 材料与方法

[0631] 细胞培养

[0632] 简言之，根据Trkulja等人(J.Am.Chem.Soc.[美国化学会志]2014,136,14875‑14882)培养CHO细胞。简言之，在T175或T500培养瓶(Nunc)或玻璃培养皿中，在补充有10％FBS、博来霉素(350μg/ml)和杀稻瘟菌素(5μg/ml)的培养基(具有谷氨酰胺的DMEM/F12)中培养具有四环素调节表达系统(T‑REx)的粘附的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在使用前(18‑24小时)，将细胞在补充有10％FBS和多西环素(1μg/ml)的培养基(具有谷氨酰胺的DMEM/F12)中孵育以诱导人类TRPV1的表达。常规测试细胞系的支原体感染。细胞收获后，将细胞冷冻并储存在‑80度。将细胞进一步如下所述进行处理。

[0633] 细胞裂解和匀浆

[0634] 将细胞悬浮液离心580×g 3分钟。丢弃上清液，并且小心地用4ml的冰冷的PBS填充管。将细胞沉淀小心地重新悬浮，并且然后用冰冷的PBS将管加满至14ml。将细胞悬浮液再次离心(580xg，3分钟)，并且重复该过程两次。

[0635] 将细胞沉淀物(大约800μl体积)重新悬浮在大约6ml的裂解缓冲液(10mM NaHCO3，pH7.4)中，并保持在冰上10分钟。

[0636] 然后将裂解缓冲液中的细胞转移到Dounce匀浆器(7ml)中，每个细胞悬浮液对应一个。然后用紧杵(tight pestle)使细胞匀浆20次。匀浆后，将裂解的细胞进行离心步骤
(580xg，3分钟)。收集上清液，并且弃去细胞沉淀物。将上清液经受第二离心步骤(580xg，3分钟)，并且然后弃去细胞沉淀物(小)。

[0637] 将上清液汇集并转移到Beckman离心管(50ml)中，并且然后添加裂解缓冲液至20ml。将上清液以7300xg离心10分钟以除去线粒体和细胞碎片。将上清液分到两个Falcon
管(每个10ml)，并在‑80冰箱中冷冻以进一步处理。

[0638] 超速离心法

[0639] 将上清液在冰上解冻并转移到两个Beckman透明超速离心管(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter)，商品编号344057)。用冰冷的缓冲液(10mM Tris，300mM NaCl，pH 8)将管加满，并且小心地平衡后使用SW55Ti转子(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter))以
100,000xg(32900rpm)离心45分钟。弃去上清液，将沉淀物重新悬浮在冰冷的缓冲液(10mM Tris，300mM NaCl，pH 8)中，并再次用相同的冰冷缓冲液加满管。小心平衡并且以100,
000xg(32900rpm)离心45分钟后，弃去上清液，并且将沉淀物重新悬浮在冰冷的缓冲液
(10mM Tris，300mM NaCl，pH 8)中，大约800μl/沉淀物。总共收集大约1.6ml的膜制剂，并在‑80度冷冻。

[0640] 尖端超声

[0641] 将冷冻的膜制剂在冰上解冻并汇集在一起，然后使用超声波仪(Vibracell)在冰冷的锥形瓶中进行超声处理。首先用冰冷的缓冲液(10mM Tris，300mM NaCl，pH 8)将膜制剂稀释至4ml，并使用15％振幅、0.5秒脉冲/静息循环进行超声处理30秒。然后将锥形瓶和膜制剂在冰上冷却几分钟，并且然后使用15％振幅、0.5秒脉冲/静息30秒钟的另一个循环
进行膜制备，并再次重复。将所得的膜制剂(蛋白脂质体)在‑80度下、310μl等分试样中冷冻。

[0642] 蛋白酶

[0643] 所有蛋白酶均购自普洛麦格公司(Promega)。所有溶液都是用来自飞世尔科技(Fisher Scientific)的LC‑MS级水制成的。

[0644] 目录号V1621

[0645] Asp‑N，测序等级，2μg

[0646] 目录号V1959

[0647] 胃蛋白酶，250mg

[0648] 目录号V3021

[0649] 蛋白酶K，100mg

[0650] 目录号V1062

[0651] 胰凝乳蛋白酶，测序等级，25μg

[0652] 目录号V5111

[0653] 测序等级修饰的胰蛋白酶，20μg

[0654] 胰蛋白酶

[0655] 将胰蛋白酶溶于100mM的碳酸氢铵(Ambic公司，pH 8)

[0656] Asp‑N

[0657] 将Asp‑N溶解在100mM的碳酸氢铵(Ambic公司，pH 8)

[0658] 胃蛋白酶

[0659] 将胃蛋白酶溶于100mM碳酸氢铵(Ambic公司，pH 8)

[0660] 蛋白酶K

[0661] 将蛋白酶K溶于100mM碳酸氢铵(Ambic公司，pH 8)

[0662] 胰凝乳蛋白酶

[0663] 将胰凝乳蛋白酶溶于100mM Tris‑HCl、10mM CaCl2，pH 8中。

[0664] LPI处理

[0665] 实验使用LPI HexaLane芯片进行以用于消化每个芯片内的一条泳道用于一次消化。简言之，将等分的蛋白脂质体解冻至室温，用100μl移液管手动注入泳道并固定1小时。

[0666] 还使用100μl移液管手动进行泳道的洗涤。每个孔用200μl洗涤缓冲液(与消化缓冲液相同，除了胃蛋白酶消化方案，其中使用100mM Ambic pH 8作为洗涤缓冲液,这是为了避免在流动细胞中低pH持续长时间)洗涤。然后使用100μl移液管用4×100μl洗涤缓冲液洗涤泳道。

[0667] 然后将蛋白酶注射到泳道中，并根据以下规格进行孵育。使用200μl的消化缓冲液(2×100μl)从泳道洗脱肽。通过添加4μl甲酸，通过将所得肽溶液酸化至约pH 2来终止蛋白酶活性。对除了胃蛋白酶之外的所有样品进行这个操作，在胃蛋白酶中添加16μl氨溶液(25％)作为替代以使溶液呈碱性(pH 9)。

[0668] 进行以下消化条件，每条泳道一个：

[0669] 胰蛋白酶：

[0670] 0.5μg/ml，2.5分钟

[0671] 0.5μg/ml，5分钟

[0672] 2μg/ml，5分钟

[0673] 5μg/ml，5分钟

[0674] 10μg/ml，5分钟

[0675] 20μg/ml，5分钟

[0676] Asp‑N

[0677] 20μg/ml，5分钟

[0678] 2μg/ml，24小时

[0679] 胰凝乳蛋白酶

[0680] 5μg/ml，5分钟

[0681] 10μg/ml，5分钟

[0682] 20μg/ml，5分钟

[0683] 蛋白酶K

[0684] 5μg/ml，5分钟

[0685] 10μg/ml，5分钟

[0686] 20μg/ml，5分钟

[0687] 胃蛋白酶

[0688] 2μg/ml，5分钟

[0689] 5μg/ml，5分钟

[0690] 10μg/ml，5分钟

[0691] 20μg/ml，5分钟

[0692] 将样品标记并在‑80℃下冷冻。

[0693] MS分析

[0694] 根据制造商的指导在PepClean C18旋转柱(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific，Inc.)，沃尔瑟姆(Waltham)，美国马萨诸塞州(MA，USA))上将胰蛋白酶肽脱盐、干燥并用15微升的0.1％甲酸复水(西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich)，圣路易斯市，密苏里州(St Louis，MO))(在3％梯度乙腈(默克集团(Merck KGaA)，德国达姆施塔特
(Darmstadt，Germany))中)。使用Easy‑nLC自动进样器(赛默飞世尔科技公司(Thermo 
Fisher Scientific，Inc.)，沃尔瑟姆(Waltham)，美国马萨诸塞州(MA，USA))进行两次微升样品注射，并用互动式Q Exactive混合质谱仪(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher 
Scientific)进行分析。将肽捕获在预柱(45x 0.075mm i.d.)上并在反相柱(200x 
0.075mm)上分离，该反相柱在内部装入3μm的Reprosil‑Pur C18‑AQ颗粒(德国阿梅尔布迈克公司(Dr.Maisch,Ammerbuch,Germany))。nanoLC(液相色谱)梯度以200nl/min运行，以在
0.2％甲酸中的7％乙腈(ACN)开始，在25min内增加至27％ACN，然后在5min内增加至40％，最后5min内达到80％ACN，并保持10分钟的80％ACN。

[0695] 在数据依赖的正离子模式下，在1.8kV的电压和320℃的毛细管温度下，产生离子并喷射到质谱仪中。在轨道阱中，在400‑1,600的m/z范围内获得全扫描(MS1)光谱，电荷范围为2‑6，分辨率为70,000，直到AGC靶值为1e6，最大值为250ms。对于十个最大丰度的母体离子，使用更高的能量碰撞解离(HCD)获得MS/MS光谱，其中30％来自m/z110，分辨率为35,
000，使用2Da的前体隔离窗(precursor isolation window)，直到在110ms的注射时间内
AGC靶值为1e5。MS/MS选择后30秒内的动态排除使得能够允许检测尽可能多的前体。

[0696] 结果概述

[0697] 图10显示了通过胰蛋白酶限制性蛋白水解后,检测到的肽的TRPV1在3D模型上的位置。通过胰蛋白酶限制性蛋白水解后,检测到的肽的序列如下表2所示。首先显示了用0.5μg/ml胰蛋白酶消化2.5min的肽。已经将分别用0.5μg/ml胰蛋白酶消化5min、2μg/ml胰蛋白酶消化5min、5μg/ml胰蛋白酶消化5min、10μg/ml胰蛋白酶消化5min和20μg/ml胰蛋白酶消化5min的肽汇集，以用于展示目的，并且其次显示。

[0698] 表2

[0699]

[0700]

[0701] 图11显示了通过Asp‑N限制性蛋白水解后检测到的肽的TRPV1在3D模型上的位置。通过Asp‑N限制性蛋白水解后检测到的肽的序列如下表3所示。首先显示了用20μg/ml的
Asp‑N消化5min的肽。其次显示了用2μg/ml的Asp‑N消化24小时的肽。

[0702] 表3

[0703]

[0704] 图12显示了通过胰凝乳蛋白酶限制性蛋白水解后检测到的肽的TRPV1在3D模型上的位置。通过胰凝乳蛋白酶限制性蛋白水解后检测到的肽的序列如下表4所示。首先显示了用5μg/ml胰凝乳蛋白酶消化5min的肽。已经将分别用10μg/ml胰凝乳蛋白酶消化5min和20μg/ml胰凝乳蛋白酶消化5min的肽汇集，以用于展示目的，并且其次显示。

[0705] 表4

[0706]

[0707] 图13显示了通过胃蛋白酶限制性蛋白水解后检测到的肽的TRPV1在3D模型上的位置。通过胃蛋白酶限制性蛋白水解后检测到的肽的序列如下表5所示。首先显示了用2μg/ml胃蛋白酶消化5min的肽。将分别用5μg/ml胃蛋白酶消化5min、10μg/ml胃蛋白酶消化5min和
20μg/ml胃蛋白酶消化5min的肽汇集，以用于展示目的，并且其次显示。

[0708] 表5

[0709]

[0710]

[0711] 图14显示了通过蛋白酶K限制性蛋白水解后检测到的肽的TRPV1在3D模型上的位置。通过蛋白酶K限制性蛋白水解后检测到的肽的序列如下表6所示。首先显示了用5μg/ml蛋白酶K消化5min的肽。已经将分别用10μg/ml蛋白酶K消化5min和20μg/ml蛋白酶K消化
5min的肽汇集，以用于展示目的，并且其次显示。

[0712] 表6

[0713]

[0714]

[0715] 在表2、3、4、5和6中，术语“起始”和“结束”是指TRPV1序列中的氨基酸残基的位置。

[0716] 在评估数据期间，0.01的Mascot显著性阈值(Mascot Significance Threshold)已在结果过滤器(Results Filters)(肽)下进行了设置。

[0717] 随着蛋白酶浓度增加，胰蛋白酶产生增加数量的肽和增加的置信度。

[0718] 胃蛋白酶和胰凝乳蛋白酶均在低浓度和更高浓度下产生许多肽。

[0719] 实例4

[0720] 该实例涉及方法C。

[0721] 材料与方法

[0722] 细胞培养，细胞收获和蛋白脂质体制备

[0723] 根据标准细胞培养方法，人胚肾细胞(Human embryonic kidney cells)在5％CO2和37℃下在补充了胎牛血清(PAA，目录号A15‑649)，非必需氨基酸(Invitrogen，目录号
11140035)的Ham's F12培养基(Invitrogen，目录号31765)中在塑料烧瓶中培养。常规检测细胞的支原体感染。使用Accutase(PAA，目录号L11‑007)分离细胞，以PBS洗涤三次并沉淀。
将沉淀重悬于1：1裂解缓冲液中，其含有甘露醇(225mM)、蔗糖(75mM)、EGTA(0.1mM)和Tris‑HCl(30mM)，pH值为7.4。细胞收获后，将细胞冷冻并在储存在‑80℃。

[0724] 将细胞沉淀在冰上解冻并使用裂解缓冲液调节体积。将细胞悬浮液裂解并使用具有紧杵(tight pestle)的Dounce匀浆器均质化。使用带有JA‑3050转子的Beckman Avanti J‑301离心机以7000xg离心20分钟，通过两次重复离心从线粒体和细胞碎片中清除上清液。
TM
使用具有SW 41Ti转子的Beckman Optima  XE‑90，通过两轮100,000xg的超速离心从上清
液中沉淀包括质膜的细胞内膜。在4℃下进行超速离心45分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于冰冷的PBS中并在‑20℃冷冻直至进一步使用。

[0725] 将膜制剂在冰上解冻并使用超声波仪(Vibracell)在冰冷的锥形瓶中超声处理以产生蛋白脂质体。将得到的蛋白脂质体制剂稀释到磷酸盐缓冲盐水(pH7.4)中并在‑20℃下储存直至进一步使用。

[0726] 样品处理

[0727] 使用流动池(flowcell)(Nanoxis Consulting AB，Gothenburg，Sweden)进行实验。简言之，将50μL等份的样品解冻至室温，并手动注入流动池泳道并固定1小时。用200μl洗涤缓冲液(100mM Ambic pH 8)洗涤每个泳道以除去未结合的物质，然后根据每种特定方
案除去蛋白酶溶液或洗涤溶液。对于限制性消化，5分钟后，我们通过使用pH值为8的100μL的100mM碳酸氢铵从流动池中洗脱蛋白酶溶液，停止蛋白脂质体样品的消化。立即加入三氟乙酸以降低pH，然后冷冻样品。

[0728] 蛋白酶来自Promega(胰凝乳蛋白酶，测序等级，25μg，目录号V1062；测序等级修饰的胰蛋白酶，20μg，目录号V5111；蛋白酶K，100mg，目录号V3021)。胰蛋白酶工作溶液在100mM碳酸氢铵，pH8中制备。蛋白酶K和胰凝乳蛋白酶工作溶液在Tris‑HCl 100mM+CaCl2‑
10mM，pH8.0中制备。

[0729] 3个复制通道用于每个方案。在MS分析之前合并肽样品。

[0730] MS分析

[0731] 分析了表7中方案的步骤1和3中通过蛋白水解释放的肽。将步骤1中的蛋白水解后获得的样品与步骤3中的蛋白水解后获得的样品分开进行分析。

[0732] 根据制造商的指导，在PepClean C18旋转柱(Thermo Fisher Scientific，Inc.，沃尔瑟姆(Waltham)，美国马萨诸塞州(MA，USA))上将肽脱盐，干燥并用15微升的0.1％甲酸复水(西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich)，圣路易斯市，密苏里州(St Louis，MO))(在
3％梯度乙腈(默克集团(Merck KGaA)，德国达姆施塔特(Darmstadt，Germany))中)。

[0733] 使用Easy‑nLC自动进样器(赛默飞世尔科技公司Thermo Fisher Scientific，Inc.)，沃尔瑟姆(Waltham)，美国马萨诸塞州(MA，USA))进行两次微升样品注射。在高精度轨道阱(Orbitrap)仪器上分析样品。Orbitrap Fusion Tribrid，Q‑Exactive或Orbitrap Elite质谱仪(赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific))与Easy nanoLC 1200液相色
谱系统相连接(interfaced with)。使用内部构建的分析柱分离肽(300x 0.075mm I.D.)超
过35、50或75分钟，分离柱使用3μm Resrosil‑Pur C18‑AQ颗粒(Dr.Maisch，德国)填充，使用5‑7％至30‑32％B的梯度，然后增加至100％B以300nL/min的流速进行5分钟。溶剂A是水中0.2％的甲酸，溶剂B是80％乙腈中0.2％的甲酸。MS/MS分析以数据依赖模式进行，其中选择电荷状态2至7的最强前体离子用于破碎(fragmentation)。动态排除设置为30秒。

[0734] 每个样品注射3次，并且将3次注射的MS数据合并并作为单个样品处理。

[0735] 使用Proteome  Discoverer版本1.4(赛默飞世尔科技(Thermo  Fisher Scientific))进行数据分析。使用Mascot 2.3.2.0(英国伦敦的矩阵科学(Matrix 
Science))作为搜索引擎，其母离子质量允差(precursor mass tolerance)为5ppm，片段质量允差(fragment mass tolerance)为0.6Da，序列数据库来自UniProt(Swissprot部分，分类部＝人(taxonomic division＝human)，版本2017_03，大约20,100种蛋白质序列)。通过1至3个缺少的切割(missed cleavage)和蛋氨酸氧化、半胱氨酸烷基化和PNGase F的可变修
饰来接受肽。通过针对反向数据库搜索，将软件中检测到的肽阈值设定为1％假发现率。仅考虑具有高鉴别置信度(identification confidence)的肽。纳入标准如下：包括得分等于或大于19的肽，以及2或3的肽置信度(其中3是最好的，1是最差的)。这些标准代表Mascot显著性是0.01或更高，这是用于已公布的蛋白质组学数据的标准的标准(criterion)。在此设置下，只有1％的肽鉴别可能是错误的。肽评分由Mascot指定，置信度值由Proteome 
Discoverer指定。

[0736] 蛋白质注释(Protein annotations)，包括膜结合，取自The Universal Protein Resource(UniProt)。UniProt是欧洲生物信息学研究所(EMBL‑EBI)，SIB瑞士生物信息学研究所和蛋白质信息资源(PIR)之间的合作(collaboration)。

[0737] 结果

[0738] 使用实例中的多蛋白酶方案，第一步中使用的蛋白酶在由其底物特异性决定(dictated)的不同位置切割蛋白质。有时整个肽被切断并且可通过质谱法检测，并且这些
可检测的肽通常至少8个氨基酸且至多30‑40个氨基酸长，这取决于分析方法的性质。在其他情况下，特别是如果使用限制性消化，蛋白酶进行切割但不释放肽。另一种观察方法是蛋白酶产生缺口。例如，胰凝乳蛋白酶将在氨基酸F、W、L和Y的C‑末端侧产生缺口。通过限制性消化，表面缺口是最有可能的。当一个或多个后续步骤使用具有不同于第一个的底物特异
性的蛋白酶时，可以在后续步骤中检测在第一个蛋白水解步骤中产生的，在该步骤中未检
测到的切割。例如，如果第一步使用胰凝乳蛋白酶，第二步使用胰蛋白酶，其在氨基酸K和R的C‑末端侧切割，在第二步中检测到的肽可能显示胰凝乳蛋白酶确实在一端切割(缺口)和胰蛋白酶在另一端切割。随后的步骤可以利用非限制性消化条件来确保肽被释放，但是可
以使用几个顺序限制性消化步骤。优选地，一个或多个顺序步骤中的蛋白酶具有与第一步
骤中使用的蛋白酶不同的特异性，因此很明显在第一步中产生哪些切口。由第一种蛋白酶
产生的切口或缺口是表面暴露的证据，因此可用于表位发现。

[0739] 以下实施例显示了使用表7中的方案获得的数据，并且证明了如何通过第二步消化检测到第一步中通过限制性消化产生的切割。表8列出了所应用的蛋白酶的切割特异性。
表9‑13显示使用这些方案鉴别的蛋白质和肽。

[0740] 表7.

[0741]

[0742] 在多蛋白酶方案1、2和3中(参见表7)，“步骤1”和“步骤3”均在室温(20℃‑25℃)下进行。

[0743] 在多蛋白酶方案1、2和3的每一个中，“步骤1”是限制性或约束性蛋白水解的步骤。

[0744] 在多蛋白酶方案1和3的每一个中，“步骤3”是非限制性蛋白水解的步骤。在多蛋白酶方案2中，“步骤3”是限制性或约束性蛋白水解的步骤。

[0745] 表8.

[0746]

[0747] 在表9‑12中，根据UniprotKB的命名法，Acc#和蛋白质名称分别表示蛋白质登录号和蛋白质名称。起始和结束给出肽的N‑末端和C‑末端的蛋白质序列内的氨基酸位置。L_flank表示蛋白质序列中侧接肽的左(N‑末端)氨基酸。R_flank表示肽序列中的最终(C‑末端)氨基酸。

[0748] 表9显示了多蛋白酶方案1的胰蛋白酶消化步骤(胰凝乳蛋白酶2μg/mL 5分钟，然后胰蛋白酶20μg/mL 1小时)后检测到的跨膜蛋白的子集及其各自的肽。样品含有仅由胰蛋白酶切割的肽。样品还含有肽，其一端用胰凝乳蛋白酶切割，另一端用胰蛋白酶切割。这些肽在名为MultiProtCut的列中用星号表示，即多蛋白酶切割。一个实例是来自蛋白质甘露
糖基‑寡糖1,2‑α‑甘露糖苷酶IA(Mannosyl‑oligosaccharide 1,2‑alpha‑mannosidase IA)的肽SSPAGGVLGGGLGGGGGR。左侧接氨基酸是F，肽中的最后一个氨基酸是R。蛋白质在第一蛋白水解步骤中，在F之后被胰凝乳蛋白酶切割，并且在第二蛋白水解步骤中，在R之后被胰蛋白酶切割。

[0749] 根据每种蛋白质的切割位点的大小、丰度和可用性，检测每种蛋白质的肽的不同数量。在第一蛋白水解步骤(步骤1)中未检测到所列出的蛋白质。

[0750] 表10显示了多蛋白酶方案1的非跨膜蛋白的子集。该方法对膜和非膜蛋白质的效果类似。在一端用胰凝乳蛋白酶切割并在另一端用胰蛋白酶切割的肽在名为MultiProtCut
的列中用星号表示。

[0751] 表11显示了在多蛋白酶方案2的胰凝乳蛋白酶消化步骤中检测到的跨膜蛋白的子集及其各自的肽(胰蛋白酶5μg/mL 5分钟，然后胰凝乳蛋白酶20μg/mL 5分钟)。样品含有仅由胰凝乳蛋白酶切割的肽。样品还含有肽，其一端用胰蛋白酶切割，另一端用胰凝乳蛋白酶切割(用星号标记)。

[0752] 表12显示了多蛋白酶方案2的非跨膜蛋白的子集。样品还含有肽，其一端用胰蛋白酶切割，另一端用胰凝乳蛋白酶切割(用星号标记)。

[0753] 在上述两个实例(方案1和2)中，蛋白酶是相同的但使用顺序相反，显示了该方法独立于蛋白酶顺序起作用。

[0754] 还使用多蛋白酶方案3鉴别肽序列，包括通过两种不同的蛋白酶切割蛋白质释放的肽序列，即包括其中一端已被蛋白酶K切割而另一端被胰蛋白酶切割的肽序列。

[0755] 表13显示了多蛋白酶方案3中蛋白酶K切割的氨基酸，以及每个氨基酸的频率，基于在一端用胰蛋白酶切割和在另一端用蛋白酶K切割的肽。列出的切割位点源自高置信度
肽鉴别，其中肽得分等于或大于19。如所见，特异性非常广，因此蛋白酶K是一种蛋白酶，其可有利地用于限制性消化步骤中的一个。具有广泛特异性的蛋白酶对蛋白质表面上可接近
的切割位点的数量和位置不太敏感。

[0756] 表9.多蛋白酶方案1(胰凝乳蛋白酶2μg/mL 5分钟，然后胰蛋白酶20μg/mL 1小时)。跨膜蛋白。

[0757]

[0758] 表9.续

[0759]

[0760] 表10.多蛋白酶方案1(胰凝乳蛋白酶2μg/mL 5分钟，然后胰蛋白酶20μg/mL 1小时)。非跨膜蛋白。

[0761]

[0762] 表10.续

[0763]

[0764] 表11.多蛋白酶方案2(胰蛋白酶5μg/mL 5分钟，然后胰凝乳蛋白酶20μg/mL 5分钟)。跨膜蛋白。

[0765]

[0766] 表11.续

[0767]

[0768] 表12.多蛋白酶方案2(胰蛋白酶5μg/mL 5分钟，然后胰凝乳蛋白酶20μg/mL 5分钟)。非跨膜蛋白。

[0769]

[0770] 表12.续

[0771]

[0772] 表13蛋白酶K切割特异性，多蛋白酶方案3

[0773]在切割位点的N‑末端氨基酸 计数
L 112
Q 100
A 73
V 73
T 64
N 51
M 47
S 46
F 28
H 27
D 25
P 25
G 22
E 21
C 20
Y 19
I 16
W 15