芸苔素内酯的纯化方法 |
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| 申请号 | CN202311120865.7 | 申请日 | 2023-09-01 | 公开(公告)号 | CN117186169A | 公开(公告)日 | 2023-12-08 |
| 申请人 | 兰升生物科技集团股份有限公司; 天津兰氏工程科技有限公司; | 发明人 | 王石华; 宋书琴; 郭红永; 张涛; 荣德茂; 鲍志存; 郭庆春; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及芸苔素内酯的纯化方法，包括以下步骤：(I)衍生：将芸苔素内酯和芳基 硼 酸溶于 溶剂 中进行反应，结晶过滤，得芸苔素内酯芳基硼酸酯化合物；(II)脱保护：将上述芸苔素内酯芳基硼酸酯化合物在 碱 性条件下通过双 氧 水 氧化进行脱芳基硼酸，使芸苔素内酯芳基硼酸酯化合物变成游离的芸苔素内酯；(III)重结晶：脱保护后游离的芸苔素内酯使用 乙醇 水混合溶剂进行结晶，得到纯化后的芸苔素内酯。 | ||||||
| 权利要求 | 1.芸苔素内酯的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤： |
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| 说明书全文 | 芸苔素内酯的纯化方法技术领域[0001] 本发明涉及芸苔素内酯的纯化方法，更具体地，涉及去除芸苔素内酯中未知杂质的方法。 背景技术[0002] 芸苔素内酯是多功能型植物生长调节剂，广泛存在于植物的花粉、种子、茎和叶等器官内，与早期发现的生长素、赤霉酸、细胞分裂素、脱落酸、乙烯利5种生长调节剂相比，因功能更加多样，不仅能促进生长，还能促进开花坐果，提高座果率、促进果实膨大，提高产量和品质，用量小而效果高，被称为第6类植物激素。 [0003] 芸苔素内酯是高效、广谱的植物生长调节剂。目前我国登记使用的主要是24‑表芸苔素内酯、24‑表芸·三表芸苔素内酯(包含24‑表芸苔素内酯和22,23,24‑表芸苔素内酯两种成分，二者是同分异构体)、28‑高芸苔素内酯、28‑表高芸苔素内酯，结构分别如下： [0004] [0005] 目前，通过人工合成得到的芸苔素内酯纯度低，难以满足要求，因此需要对其进行纯化。 发明内容[0007] 本发明旨在提供一种芸苔素内酯的纯化方法，通过该方法可以有效去除芸苔素内酯中包含的上述多种未知杂质，获得高纯度的芸苔素内酯。 [0008] 具体地，本发明涉及： [0009] (1)芸苔素内酯的纯化方法，该方法包括以下步骤： [0012] (III)重结晶：脱保护后游离的芸苔素内酯使用溶剂进行重结晶，得到纯化后的芸苔素内酯。 [0013] (2)根据上述(1)所述的纯化方法，其特征在于，所述芸苔素内酯为所述芸苔素内酯为24‑表芸苔素内酯、22,23,24‑三表芸苔素内酯、24‑表芸·三表芸苔素内酯、28‑高芸苔素内酯、28‑表高芸苔素内酯中的一种或任意两种以上的混合物，优选为24‑表芸苔素内酯、22,23,24‑三表芸苔素内酯或24‑表芸·三表芸苔素内酯。 [0014] (3)根据上述(2)所述的纯化方法，其特征在于，第(I)步中芳基硼酸为苯硼酸或者萘硼酸，优选为苯硼酸；更优选地，第(I)步中芳基硼酸加入量为芸苔素内酯的2.0摩尔当量以上，优选2.2‑2.6摩尔当量。 [0015] (4)根据上述(1)至(3)中任意一项所述的纯化方法，其特征在于，第(I)步中溶剂为甲醇、乙醇或者叔丁醇，优选甲醇。 [0016] (5)根据上述(1)至(4)中任意一项所述的纯化方法，其特征在于，第(I)步中溶剂的加入量为芸苔素内酯的5‑60质量倍，优选为10‑20质量倍。 [0017] (6)根据上述(1)至(5)中任意一项所述的纯化方法，其特征在于，第(II)步中脱保护的溶剂为甲醇、乙醇或乙二醇，优选乙二醇。 [0019] (8)根据上述(7)所述的纯化方法，其特征在于，碱的质量浓度为1％‑20％，优选5％。 [0020] (9)根据上述(1)至(8)中任意一项所述的纯化方法，其特征在于，第(III)步中重结晶乙醇和水的混合溶剂，优选乙醇和水的质量比约为1:1.4。 [0021] (10)根据上述(1)至(9)中任意一项所述的纯化方法，其特征在于，纯化后的芸苔素内酯中未知杂质的纯度均小于0.1％。 具体实施方式[0022] 本发明的苔素内酯纯化方法包括衍生、脱保护和结晶步骤。 [0023] 第(Ⅰ)步衍生步骤是使苔素内酯与芳基硼酸反应，生成酯化合物。 [0024] 在一些具体的实施方式中，芳基硼酸包括但不限于苯硼酸或萘硼酸，优选为苯硼酸。 [0025] 在一些具体实施方式中，芸苔素内酯为22,23,24‑三表芸苔素内酯，芳基硼酸为苯硼酸，所述衍生步骤的酯化反应如下所示： [0026] [0027] 在另一些具体实施方式中，所述芸苔素内酯为24‑表芸苔素内酯，所述芳基硼酸为苯硼酸，所述衍生步骤的酯化反应如下所示： [0028] [0029] 在更具体的实施方式中，上述反应如下执行但不限如此。往反应瓶中加入苯硼酸，加入甲醇全部溶解后，加入22,23,24‑三表芸苔素内酯或24‑表芸苔素内酯，升温，搅拌。蒸发光反应器监测反应完成后，降温，过滤，得到22,23,24‑三表芸苔素内酯苯硼酸酯化合物或24‑表芸苔素内酯苯硼酸酯化合物。 [0030] 在一些更具体的实施方式中，所述衍生步骤中，相对于芸苔素内酯，芳基硼酸的加入量为2摩尔当量以上，优选为2.2‑2.6摩尔当量，以保证芸苔素内酯能够完全酯化。 [0031] 在一些更具体的实施方式中，所述衍生步骤中，使用甲醇、乙醇、叔丁醇作为溶剂，优选甲醇。相对于芸苔素内酯，甲醇的加入量为5‑60质量倍，优选为20质量倍。 [0032] 目前芸苔素内酯的检测分析中采用硼酸衍生的手段，但未曾报道先通过该衍生手段酯化、然后脱酯去保护的方法可以去除芸苔素内酯中的杂质，特别是可以有效去除保留时间为7.9min的杂质。 [0033] 第(II)步脱保护步骤是使上述衍生得到的芸苔素内酯芳基硼酸酯化合物脱芳基硼酸生成游离苔素内酯。 [0034] 在一些具体的实施方式中，芸苔素内酯为22,23,24‑三表芸苔素内酯，芳基硼酸为苯硼酸，所述脱保护为如下反应： [0035] [0036] 在另一些具体的实施方式中，芸苔素内酯为24‑表芸苔素内酯，所述芳基硼酸为苯硼酸，所述脱保护为如下反应： [0037] [0038] 在更具体的实施方式中，上述反应如下执行但不限如此。在上述芸苔素内酯苯硼酸酯化合物中加入溶剂和碱，搅拌升温，缓慢滴加双氧水，监测原料反应完成后，滴加水，降温抽滤。 [0039] 在一些更具体的实施方式中，所述脱保护反应中，使用甲醇、乙醇、或乙二醇为溶剂，乙二醇作为溶剂时，反应中间体的转化率相对于甲醇和乙醇更高，可以达到90％以上，因此优选使用乙二醇为溶剂。 [0040] 在一些更具体的实施方式中，所述脱保护反应中，使用碱金属碳酸盐或氢氧化钠作为碱，相比于碱金属碳酸盐，使用氢氧化钠时，溶剂用量更小，且反应更好，因此优选。氢氧化钠浓度太高时，会导致双氧水分解剧烈，不安全，而浓度太低时，会降低反应效率。因此，优选使用质量浓度为1％‑20％、更优选质量浓度为5％的氢氧化钠水溶液。 [0041] 在一些更具体的实施方式中，第(III)步结晶步骤使用乙醇‑水混合物作为结晶溶剂。混合溶剂中，如果乙醇的比例过大，结晶收率会降低，如果其比例过小，杂质可能不合格，会影响产品质量。优选乙醇和水的质量比为1：1至1：2，更优选约为1：1.4。 [0042] 经上述三个步骤纯化后获得的22,23,24‑表芸苔素内酯和24‑表芸苔素内酯中未知杂质纯度均小于0.1％。 [0043] 芸苔素内酯的具体例子包括但不限于24‑表芸苔素内酯、22,23,24‑三表芸苔素内酯、24‑表芸·三表芸苔素内酯、28‑高芸苔素内酯或28‑表高芸苔素内酯等、或它们中任意两种以上的混合物，优选为24‑表芸苔素内酯、22,23,24‑三表芸苔素内酯、24‑表芸·三表芸苔素内酯或它们的混合物。 [0044] 由于24‑表芸·三表芸苔素内酯包含24‑表芸苔素内酯和22,23,24‑表芸苔素内酯两种成分，22,23,24‑表芸苔素内酯质量分数≥60％，24‑表芸苔素内酯的质量分数≥30％，将24‑表芸苔素内酯和22,23,24‑表芸苔素内酯两种成分按照上述方法分别纯化完成后，然后按照其各自的质量分数进行混合，即得到纯化的24‑表芸·三表芸苔素内酯，纯化的24‑表芸·三表芸苔素内酯的未知杂质纯度均小于0.1％。 [0045] 实施例 [0047] 实施例1 22,23,24‑三表芸苔素内酯的纯化 [0048] (1)衍生化反应 [0049] [0050] 在室温下将15.5g苯硼酸和520g甲醇加入反应瓶中，搅拌全溶后，加入22,23,24‑三表芸苔素内酯26.5g，升温至50‑55℃继续搅拌1h，使用蒸发光检测器监测反应。22,23,24‑三表芸苔素内酯反应完全后，降温至10‑15℃，过滤，固体为22,23,24‑三表芸苔素内酯苯硼酸酯。 [0051] 蒸发光检测器条件：Kromasil 100‑5C18的色谱柱，流动相为乙腈：水(用甲酸调节pH至3.5～4.0)＝65：35(V：V)，柱温30℃，检测器温度100℃，流速1.0mL/min，气流流速2.2mL/min，不分流模式。 [0052] 3个不同批次的原料22,23,24‑三表芸苔素内酯进行上述衍生化后的检测结果如表1所示。虽然由于原料批次不同，衍生后的22,23,24‑三表芸苔素内酯苯硼酸衍生物纯度存在差异，但经过衍生后，保留时间为3.5‑3.9min和7.9min的未知杂质纯度均小于0.1％。 [0053] 表1 [0054] [0055] (说明：保留时间为9.0min的是已知杂质，保留时间为9.9min的是22,23,24‑三表芸苔素内酯，保留时间为12.7min的是24‑表芸苔素内酯，其余为未知杂质。)[0056] (2)脱保护反应 [0057] [0058] 将上述22,23,24‑三表芸苔素内酯苯硼酸酯24.4g加入反应瓶中，进一步加入乙二醇500g和5％NaOH水溶液120g，在20‑25℃搅拌1h后升温至30‑40℃，加2滴消泡剂，再缓慢滴加质量浓度25％的H2O261.2g，通过高效液相色谱监测原料反应完全，再用蒸发光检测器监测中间体硼酸酯不再变化后，向其中滴加590g水，降温到20℃进行抽滤，固体为22,23,24‑三表芸苔素内酯。 [0060] 蒸发光检测器条件：Kromasil 100‑5C18色谱柱，流动相为乙腈：水(用甲酸调节pH至3.5～4.0)＝65：35(V：V)，柱温30℃，检测器温度100℃，流速1.0mL/min，气流流速2.2mL/min，不分流模式。 [0061] (3)重结晶 [0062] 将第(Ⅱ)步脱保护后的湿品5g溶于40g乙醇中，升温回流至固体全溶后，缓慢滴加56g水并引入晶种，搅拌，缓慢降温至35‑40℃，过滤，固体为22,23,24‑三表芸苔素内酯。 [0063] 使用高效液相衍生检测并计算其纯度，结果如表2所示。由表2可知，通过重结晶保留时间为4.1‑5.0min和11.1min的未知杂质纯度均小于0.1％。 [0064] 表2 [0065] [0066] (说明：保留时间为9.0min的是已知杂质，保留时间为9.9min的是22,23,24‑三表芸苔素内酯，保留时间为12.7min的是24‑三表芸苔素内酯，其余为未知杂质)[0067] 衍生溶液的配置： [0068] (1)苯硼酸甲醇溶液：称取100mg苯硼酸于50mL容量瓶中，用甲醇定容，超声至完全溶解,备用。 [0069] (2)配置对照品溶液：用称量纸精密称对照品30‑40mg放入50mL容量瓶，加10mL纯甲醇和20mL苯硼酸甲醇溶液，超声至完全溶解，50℃衍生2h，降至室温后，用甲醇定容，液相色谱检测。平行称定两次，计算平行响应值之间RSD≤0.5％。 [0070] (3)配置样品溶液：用称量纸精密称样品30‑40mg放入50mL容量瓶，加入10mL纯甲醇和20mL苯硼酸甲醇溶液，超声至完全溶解，50℃衍生2h，降至室温后，用甲醇定容，液相色谱检测。平行称定两次，计算平行响应值之间RSD≤0.5％。 [0071] 高效液相色谱条件：C18色谱柱，流动相为乙腈：水(用甲酸调节pH至3.7～4.1)＝80：20(V：V)，柱温30℃，流速1.5mL/min，检测波长222nm。 [0072] 实施例2 24‑表芸苔素内酯的纯化 [0073] (1)衍生化反应 [0074] [0075] 在室温下将5.59g苯硼酸和240g甲醇加入反应瓶中，搅拌全溶后，加入24‑表芸苔素内酯12g，升温至50‑55℃继续搅拌1h。使用蒸发光检测器监测反应。24‑表芸苔素内酯反应完全后，降温至0‑5℃，过滤，固体为24‑表芸苔素内酯苯硼酸酯。 [0076] 蒸发光检测器条件：Kromasil 100‑5C18的色谱柱，流动相为乙腈：水(用甲酸调节pH至3.5～4.0)＝65：35(V：V)，柱温30℃，检测器温度100℃，流速1.0mL/min，气流流速2.2mL/min，不分流模式。 [0077] (2)脱保护反应 [0078] [0079] 将上述衍生化的24‑表芸苔素内酯苯硼酸酯24.4g加入反应瓶中，进一步加入乙二醇500g和5％NaOH水溶液120g，在20‑25℃搅拌1h后升温至30‑40℃，加2滴消泡剂，缓慢滴加25％的H2O261.2g，通过高效液相色谱监测原料反应完全，再用蒸发光检测器监测中间体硼酸酯的纯度小于1.5％。反应完成后，向其中滴加590g水，降温至20℃进行抽滤，固体为24‑表芸苔素内酯。 [0080] 高效液相色谱条件：C18色谱柱，流动相为乙腈：水(用甲酸调节pH至3.7～4.1)＝80：20(V：V)，柱温30℃，流速1.5ml/min，检测波长222nm。 [0081] 蒸发光检测器条件：Kromasil 100‑5C18色谱柱，流动相为乙腈：水(用甲酸调节pH至3.5～4.0)＝65：35(V：V)，柱温30℃，检测器温度100℃，流速1.0mL/min，气流流速2.2mL/min，不分流模式。 [0082] (3)重结晶 [0083] 将第(Ⅱ)步脱保护后的湿品5g溶于40g乙醇中，升温回流至固体全溶后，缓慢滴加56g水并引入晶种，搅拌，缓慢降温至35‑40℃，过滤，固体为24‑表芸苔素内酯。 [0084] 使用高效液相衍生检测并计算其纯度(衍生检测过程同实施例1)，结果如表3所示。由表3可知，通过衍生‑脱保护‑重结晶，保留时间为4.6min，7.9min和8.7min的未知杂质纯度均小于0.1％。 [0085] 表3 [0086] [0087] (说明：保留时间为9.9min的是22,23,24‑三表芸苔素内酯，保留时间为11.6min的是24‑表芸苔素内酯异构体，保留时间为12.7min的是24‑表芸苔素内酯，其余为未知杂质。)[0088] 高效液相色谱条件：C18色谱柱，流动相为乙腈：水(用甲酸调节pH至3.7～4.1)＝80：20(V：V)，柱温30℃，流速1.5mL/min，检测波长222nm。 [0089] 对比例1 22,23,24‑三表芸苔素内酯粗品直接结晶纯化 [0090] (1)22,23,24‑三表芸苔素内酯粗品的制备 [0091] 将30％H2O26.1mL和50mL CH2Cl2加入到反应瓶中，降温至0℃，于0℃以下滴加38.1mL三氟乙酸酐，滴加完毕后，搅拌10min。将2.5g 22,23,24‑三表芸苔素内酯中间体((22S,23S,24R)‑2a,3a,22,23‑四羟基‑5a‑麦角甾烷‑6‑酮和(22R,23R,24R)‑2a,3a,22, 23‑四羟基‑5a‑麦角甾烷‑6‑酮按质量比为2：1的混合物)溶于150mL CH2Cl2后加入到上述反应瓶中，室温搅拌2‑6h，加入25mL水继续搅拌10min，静止分液。有机相用25mL饱和Na2CO3洗涤两次后再用25mL饱和NaHSO3洗涤两次，分液有机相旋蒸除去溶剂，用乙酸乙酯结晶得22, 23,24‑三表芸苔素内酯粗品2.07g，70‑75℃烘干。 [0092] (2)第一次重结晶 [0093] 将通过如上方法获得的22,23,24‑三表芸苔素内酯粗品110g溶于660g甲醇中，升温回流至粗品全溶后，搅拌30min，降温至20‑25℃，过滤，固体为第一次重结晶的22,23,24‑三表芸苔素内酯。 [0094] (3)第二次重结晶 [0095] 把第一次重结晶的22,23,24‑三表芸苔素内酯4g加入到反应瓶中，加入116g乙酸乙酯，升温回流至全溶，搅拌30min，降温至20‑25℃，过滤，固体为第二次重结晶的22,23,24‑三表芸苔素内酯。 [0096] 通过直接结晶法纯化22,23,24‑三表芸苔素内酯粗品时，采用甲醇进行第一次重结晶，然后尝试分别使用不同溶剂(如乙酸乙酯、乙醇、乙腈、甲醇、乙醇/乙酸乙酯和乙醇/水)、按不同的溶剂倍数(如乙醇和乙醇/水)进行第二次重结晶，结晶产物通过液相衍生检测计算其纯度(衍生检测过程同实施例1)，结果如表4所示。 [0097] 通过二次重结晶可以有效去除保留时间为9.0min的已知杂质，但保留时间3.9min、4.1min、4.7min和7.9min的未知杂质在二次重结晶后无提纯效果。 [0098] 表4 [0099] [0100] (说明：保留时间为9.0min的是已知杂质，保留时间为9.9min的是22,23,24‑三表芸苔素内酯，保留时间为12.7min的是24‑表芸苔素内酯，其余为未知杂质。)[0101] 高效液相色谱条件：C18色谱柱，流动相为乙腈：水(用甲酸调节pH至3.7～4.1)＝80：20(V：V)，柱温30℃，流速1.5mL/min，检测波长222nm。 [0102] 本发明的纯化方法同样适用于28‑高芸苔素内酯和28‑表高芸苔素内酯等其它芸苔素内酯化合物的纯化。 |
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