[0001] 本发明涉及12β-羟基藜芦酰棋盘花碱、藜芦新碱和藜芦胺制备方法，以及在治疗精神分裂症、抑郁性躁狂症等精神疾病的应用。技术背景

[0002] 精神分裂症和抑郁性躁狂症，临床主要表现：精神活动脱离现实，思维情感、意志活动互不协调，部分病人还会出现强迫症状，其发病机理很多，有遗传因素、体质因素、中枢神经介质的功能等因素。随着生活节奏加快，生活和工作压力增大，增加了发病机率，对整个家庭及社会造成了严重不良影响。目前用于治疗抗精神分裂症的药物主要分为二大类，第一类为传统的抗精神病药物，包括氯丙嗪、奋乃静、氟哌啶醇、舒必利、泰尔登、甲硫达嗪、五氟利多等药物；第二类为非传统的抗精神病药物，也称非典型抗精神病药，包括利培酮、奥氮平、奎硫平、氯氮平、阿立哌唑等。第一类主要对阳性症状疗效肯定，但副作用较大，对心血管和肝脏毒性较强，产生过度镇静(如氯丙嗪)和锥体外系反应(如氟哌啶醇、五氟利多等)，服药片数多，剂量难于掌握，往往影响病人对治疗的依从性和社会功能的恢复。第二类对阳性症状、阴性症状都有疗效，除氯氮平外，副作用相对小，但价格昂贵。另外，长期服用对身体的呼吸系统、消化系统、心血管系统、代谢和营养、皮肤系统等有不良影响，病人的复发率高，发作次数越多，下次发作的治疗就越困难，也越可能频繁发作，并且联合用药会极大提高出现耐受性、依赖性和戒断综合症的机会，使情况更为严重，最终把患者推向新的痛苦。

[0003] 传统中药及天然植物药具有相对安全和价格低廉的特点，开发中药及天然植物药作为治疗精神分裂症、抑郁性躁狂症的药物来源，可起到标本兼治的功效。

[0004] 藜芦为百合科藜芦(Veratrum nigrum L.)的根和根茎，其味苦、辛，性寒，具有涌吐风痰、除湿宣壅、杀虫解毒功效，用于中风痰壅，风痫癫疾，头痛，黄疸等疾病的治疗。据《中国植物志》记载，我国藜芦属Veratrum植物有13种和一个变种，藜芦属Veratrum植物含有的甾体生物碱是其有效成分，其母核为异胆甾烷和胆甾烷生物碱。据1984年统计数据，从国产藜芦属植物中已发现70余种甾体生物碱，近2年来又分离到近30种甾体生物碱。现代临床用藜芦单方或复方治疗精神分裂症、抑郁性躁狂症疗效显著，标本兼治，没有复发记录。研究发现藜芦胺能够诱发非钙离子依赖的5-HT释放，并且能够竞争性抑制摄入(Nagata R，et al.European Journal of Pharmacology，183，1914(1990))；最近研究发现藜芦碱(veratrine)能够影响神经细胞钠离子通道(Prica C，et al.Behavioural Brain Research，191，49-54(2008))。目前，关于藜芦治疗精神分裂症、抑郁性躁狂症等精神疾病的有效成分研究未见报道。

[0005] 本发明的目的在于从百合科藜芦(Veratrum nigrum L.)制备得到具有镇静作用的藜芦胺、藜芦新碱和12β-羟基藜芦酰棋盘花碱，提供化合物的制备方法，并提供这三个化合物在制备抗精神分裂症、抑郁性躁狂症药物中的应用。

[0006] 本发明以百合科(Liliaceae)植物藜芦(Veratrum nigrum L.)的干燥根和根茎为原料，通过乙醇提取，经酸溶碱沉，层析分离得到三个下述式(1)、(2)、(3)分别表示的12β-羟基藜芦酰棋盘花碱、藜芦新碱和藜芦胺。

[0007] 本发明的12β-羟基藜芦酰棋盘花碱由式(1)表示：

[0008]

[0009] 式(1)

[0010] 本发明的藜芦新碱由式(2)表示：

[0011]

[0012] 式(2)

[0013] 本发明的藜芦胺由式(3)表示：

[0014]

[0015] 式(3)

[0016] 本发明式(1)、(2)、(3)表示的12β-羟基藜芦酰棋盘花碱、藜芦新碱和藜芦胺都从百合科(Liliaceae)植物藜芦(Veratrum nigrum L.)的干燥根和根茎中分离得到，其制备方法包括以下步骤：

[0017] (1)以百合科(Liliaceae)植物藜芦(Veratrum nigrum L.)的干燥根和根茎为原料，将药材粉碎成粗粒，采用10倍量的有机溶剂加热回流提取，滤液减压浓缩成浸膏。其中有机溶剂的特征为：乙酸乙酯、乙酸乙酯-氯仿不同比例混合液、氯仿、乙醇、乙醇-水不同比例混合液等，其中最优为95％乙醇和乙酸乙酯-氯仿(1∶1)混合液。

[0018] (2)步骤(1)得到的浸膏加入酸液调酸性，pH至3～7，产生沉淀，过滤，再用1倍量的pH＝3～7酸水搅拌溶解沉淀3次，过滤，合并滤液，滤液用碱水调至中性或碱性，pH大于6(最优为10)，放置过滤收集沉淀。

[0019] (3)将步骤(2)得到的沉淀物用1倍量的有机溶剂A溶解上样，经大孔树脂HPD100，用乙醇-水系统洗脱，乙醇-水(35∶65)洗脱得到馏分，减压回收溶剂，再用有机溶剂B重结晶得到上述式(2)化合物；乙醇-水(50∶50)洗脱得到馏分，减压回收溶剂，再经200-300目硅胶柱色谱，用有机溶剂C洗脱，得到上述式(1)化合物；乙醇-水(70∶30)洗脱得到馏分，减压回收溶剂，再用有机溶剂D重结晶得到上述式(3)化合物。其中有机溶剂A的特征为：乙酸乙酯、乙酸乙酯-氯仿不同比例混合液、氯仿、乙醇、乙醇-水不同比例混合液等，其中最优为乙酸乙酯-氯仿(1∶1)混合液。其中有机溶剂B的特征为：乙酸乙酯、乙酸乙酯-氯仿不同比例混合液、氯仿、甲醇、乙醇、氯仿-甲醇不同比例混合液、乙醇-水不同比例混合液等，其中最优为95％乙醇和氯仿-甲醇(10∶1)混合液。其中有机溶剂C的特征为：乙酸乙酯、乙酸乙酯-氯仿不同比例混合液、氯仿、甲醇、乙醇、氯仿-甲醇不同比例混合液、乙醇-水不同比例混合液等，其中最优为氯仿-甲醇(5∶1)混合液。其中有机溶剂D的特征为：乙酸乙酯、乙酸乙酯-氯仿不同比例混合液、氯仿、甲醇、乙醇、氯仿-甲醇不同比例混合液、乙醇-水不同比例混合液等，其中最优为氯仿-甲醇(100∶3)混合液。

[0020] 步骤(2)中所述酸液是酒石酸，硫酸溶液、盐酸等有机酸或无机酸的水溶液；所述碱液是28％氨水、三乙胺、二乙胺或1-5％的氢氧化钠或氢氧化钾等无机碱或有机碱。

[0021] 经实验证明本发明12β-羟基藜芦酰棋盘花碱、藜芦新碱和藜芦胺可在制备治疗精神分裂症和抑郁性躁狂症药物中的应用。

[0022] 本发明12β-羟基藜芦酰棋盘花胺、藜芦新碱和藜芦胺对正常小鼠有明显的降低自主活动性，显示很好的镇静作用，其作用强度随给药剂量的增加而增强，且作用缓和和持久，对于指导临床应用具有实际价值，而阳性对照药地西泮虽同样有较好的镇静作用，但其副作用是比较多而明显的，常见的不良反应有嗜睡，头昏，乏力等，大剂量可有共济失调，震颤；连续用药可产生依赖性和成瘾性。

[0023] 以下的实施例是对本发明的进一步说明，但本发明不限于下述实施例。

[0024] 实施例1：上述式(1)、(2)、(3)化合物的制备

[0025] 藜芦干燥根和根茎(4kg)粉碎成粗粒，采用10倍量的乙酸乙酯-氯仿(1∶1)混合液加热回流提取，滤液减压浓缩成浸膏(223g)。浸膏加入7％盐酸溶液调pH至3，产生沉淀，过滤，再用1倍量的pH＝3盐酸溶液搅拌溶解沉淀3次，过滤，合并滤液，滤液用5％氢氧化钠溶液调pH至10，放置过滤收集沉淀物(105g)。沉淀物用1倍量的乙酸乙酯-氯仿(1∶1)混合液溶解上样，经大孔树脂HPD100色谱柱(取大孔树脂500g，柱子直径约8cm，高度约60cm)，用乙醇-水系统洗脱，乙醇-水(35∶65)洗脱得到馏分，减压回收溶剂，再用氯仿-甲醇(10∶1)重结晶得到上述式(2)化合物(21g)；乙醇-水(50∶50)洗脱得到馏分，减压回收溶剂，再经200-300目硅胶柱色谱，以氯仿-甲醇(5∶1)洗脱，得到上述式(1)化合物(14g)；乙醇-水(70∶30)洗脱得到馏分，减压回收溶剂，再用氯仿-甲醇(100∶3)重结晶得到上述式(3)化合物(29g)。

[0026] 结构解析如下：

[0027] 12β-羟基藜芦酰棋盘花碱

[0028] 无定型白色粉末，mp250-252℃，[α]D20-13.8(c＝0.003，CHCl3)，改良的碘化铋钾试剂反应阳性。在IR(KBr)中，吸收峰分别在3475，2910，2760(trans-quinolizidine)，-1 +1718，1604，1517cm .HR-MS和 ESI-MS分 别 给 出 准 离 子 峰m/z：[M+H]674.3554 和+ 1
[M+H]674，确定分子式C36H51NO11。H-NMR谱中给出3个甲基氢信号δ：1.08(3H，s，H-19)，
1.15(3H，d，J＝7.2Hz，H-27)，1.28(3H，s，H-21)，确定该化合物为西藜芦碱类(梁光义.藜
2
芦属植物中生物碱的研究概况，药学学报，1984，19，309-320)。另外，还有3个sp 的ABX系统的氢信号δ：7.54(1H，d，J＝1.8Hz，H-3’)，7.01(1H，d，J＝8.4Hz，H-6’)，7.67(1H，dd，
13
J＝8.4，1.8Hz，H-7’)和2个甲氧基信号δ：3.89(3H，s)，3.91(3H，s)；结合 C-NMR，HSQC和HMBC谱，推测结构中有藜芦酰基片段(veratroyl group)。在HMBC谱中，δ5.09(1H，brd，
13
J＝4.2Hz，H-3)与δ167.2(C-1’)有远程相关，说明藜芦酰基连接在3位上。 C-NMR谱中
1
给出特征性的4，9位半缩酮结构的碳信号δ：105.5(C-4)，95.7(C-9)。将化合物1的 H-NMR
13
和 C-NMR谱数据与已知化合物藜芦酰棋盘花碱核磁数据(Kadota S，et al.A steroidal alkaloid from Veratrum Oblongum.Phytochemistry，1995，38，777-781)比较，比藜芦酰棋盘花碱多一个连氧季碳信号δ81.7(C-12)，少一个叔碳信号。根据HMBC和HMQC谱，碳信号δ：81.7、43.0、36.9、71.7、80.9、57.5分别归属为C-12、11、13、15、14、18。与化合物
7的碳谱数据相比，C-12、11、13、15分别向低场移37.6，9.0，3.5，2.6ppm；C-14、18分别向高场移2.1，2.0ppm。因此，推测C-12位上的氢被羟基取代，化学位移为δ81.7(C-12)。在HMBC谱中，碳信号δ81.7(C-12)与氢信号δ2.35(1H，d，J＝15.6Hz，H-11)，1.88(1H，d，J＝15.6Hz，H-11)，3.70(1H，d，J＝3.3Hz，H-15)，1.76(1H，d，J＝10.8Hz，H-17)有远程相关，进一步确认C-12位上的氢被羟基取代。结合NOESY谱(见Figure 1)，结构确定为
12β-羟基藜芦酰棋盘花胺(12β-hydroxylveratroylzygadenine)，波谱数据见表1。

[0029]

[0030] 图1.12β-羟基藜芦酰棋盘花碱NOESY谱中主要的NOE相关

[0031] 藜芦新碱

[0032] 无定型白色，mp242-244℃，[α]D20-20(c＝0.015，MeOH)，改良的碘化铋钾试剂1
反应阳性。H-NMR谱中给出4个甲基氢信号：δ2.54(3H，s，H-18)、0.98(3H，s，H-19)、
1.63(3H，d，J＝7.2Hz，H-21)、0.74(3H，d，J＝6.3Hz，H-27)，还有2个芳香氢信号：
δ7.66(1H，d，J＝7.8Hz，H-16)，7.05(1H，d，J＝7.8Hz，H-16)，一个双键氢信号5.39(1H，d，
13
J＝3.3Hz，H-6)，一个糖的端基氢信号δ5.06(1H，d，J＝7.8Hz，glc-1)。C-NMR给出33个碳信号，与藜芦胺碳谱数据相比较，藜芦新碱多出一个葡萄糖的碳信号：δ102.8(glc-1)、
75.4(glc-2)、78.7(glc-3)、71.7(glc-4)、78.5(glc-5)、62.9(glc-6)。在HMBC谱中我们可以见到δ5.06(1H，d，J＝7.8Hz，glc-1)与78.4(C-3)有远程相关，证实了葡萄糖连接在3位，结合文献(Kadota S，et al.A steroidal alkaloid fromVeratrum Oblongum.Phytochemistry，1995，38，777-781)，确定了该化合物为藜芦新碱(veratrosine)，波谱数据见表1。

[0033] 藜芦胺

[0034] 无定型白色粉末，mp238-240℃，[α]D20-20(c＝0.015，CHCl3)，改良的碘化铋钾试+ 1剂反应阳性。ESI-MS分别给出准离子峰m/z：[M+H]410，确定分子式C29H39NO2。H-NMR谱中给出4个甲基氢信号：δ2.57(3H，s，H-18)、1.11(3H，s，H-19)、1.63(3H，d，J＝7.2Hz，H-21)、
0.75(3H，d，J＝6.3Hz，H-27)，还有2个芳香氢信号δ：7.66(1H，d，J＝7.8Hz，H-16)，
7.11(1H，d，J＝7.8Hz，H-15)，一个双键氢信号5.49(1H，d，J＝3.3Hz，H-6)，两个连氧氢信
13
号：δ3.83(1H，m，H-3)、3.54(1H，m，H-23)。 C-NMR给出27个碳信号，其中有6个芳香碳信号：δ142.9(C-12)、143.8(C-14)、120.0(C-15)、126.9(C-16)、141.4(C-17)、133.3(C-13)，一个双键碳信号：δ143.8(C-6)、121.7(C-6)，2个连氧碳信号：δ71.4(C-3)、70.8(C-23)。
根据HSQC和HMBC谱，将碳氢信号进行了归属。结合文献(Yasuhiro T，et al.Two New Steroidal Alkaloids，20-Isoveratramine and Verapatuline，from the Roots and Rhizomes of Veratrumpatulum.J.Nat.Prod.，1998，61，1078-1081)，确定该化合物为藜芦胺(veratramine)，波谱数据见表1。

[0035] 表1藜芦胺(300MHz，C5D5N)、藜芦新碱(600MHz，C5D5N)和12β-羟基藜芦酰棋盘花碱(600MHz，CDCl3 and CD3OD)的碳谱、氢谱核磁数据

[0036]

[0037]

[0038] 实施例2：实施例1得到的化合物对正常小鼠自主活动的影响

[0039] 取昆明种小鼠140只，雄性，体重20-24g，随机分为14组，每组10只，即阴性空白