一种二降碳无羁烷三萜化合物及其制备与应用

(一)技术领域

本发明涉及一种具有抗衰老活性的新化合物——二降碳无羁烷三萜 化合物及其制备方法和应用。

(二)背景技术

卫矛科植物中富含三萜类化合物，而这其中则特别引人注意的是醌甲 基三萜及苯环三萜类化合物，由于它们特有的结构而表现出的抗衰老抗氧 化药理活性更是诸多科学家所研究的课题。

粉背南蛇藤(Celastrus hypoleucus(Oliv.)Warb.)为卫矛科植物，又 名：博根藤、落霜红。藤状灌木，高达5米。小枝幼时被白粉。叶互生， 椭圆形或宽椭圆形，长6～14厘米，宽5～7厘米，先端短渐尖，基部宽楔 形，背面被白粉，脉上有时有疏毛；叶柄长1～1.5厘米。聚伞圆锥花序顶 生，长6～12厘米，腋生花序短小，3～7花；花梗长2～8毫米，中部以上 有关节：花白绿色，4数，单性，雄花有退化子房：雌花有短花丝的退化 雄蕊，子房具细长花柱，柱头3裂，平展。果序顶生，长而下垂，腋生花 多不结实；蒴果有长梗，疏生，球状，橙黄色，果皮裂瓣内侧有樱红色斑 点。种子黑棕色，有橙红色假种皮。生山地丛林中。分布河南、陕西、甘 肃、四川、湖北、湖南、贵州、云南、广西、广东、浙江、安徽等地。

人体内的自由基包括超氧阴离子、羟自由基、脂质过氧化物等，它是 人体内的正常代谢产物，在正常情况下人体内的自由基处于动态平衡中， 但是一旦该平衡被打破就会对机体造成损害，从而引发一系列与衰老氧化 相关的疾病，如心脑血管疾病、癌症、艾滋病、糖尿病、早老性痴呆、震 颤麻痹症等，因此加入外源性抗衰老抗氧化剂，使已生成的自由基淬灭， 以终止自由基链反应起到治疗与预防的作用。近年研究表明很多天然药物 中含有抗衰老抗氧化成份，可有效清除产生的过量自由基介质，从天然药 物中寻找清除体内自由基的物质将是现代医药、保健行业的发展趋势，研 究天然药物抗衰老抗氧化成分，对天然药物的开发与应用将具有十分重要 的现实意义。

(三)发明内容

本发明则是为了提供一种从卫矛科植物粉背南蛇藤根部分离得到的 二降碳无羁烷三萜化合物：2-羟基-3-甲基-21-羰基-12，24-二降碳-D：A- 无羁烷-1，3，5(10)，7-四烯-29-酸，该化合物为新化合物，具有一定的 生物活性。

本发明的技术方案是：

一种二降碳无羁烷三萜化合物：2-羟基-3-甲基-21-羰基-12，24-二降碳 -D：A-无羁烷-1，3，5(10)，7-四烯-29-酸，结构如式(I)所示：

本发明还涉及所述的二降碳无羁烷三萜化合物的制备方法，所述方法 如下：取粉背南蛇藤(Celastrus hypoleucus(Oliv.)Warb.)干燥根部碎片， 用丙酮浸渍5～10天，回收溶剂后得到浸膏，浸膏用200～300目柱层析硅 胶进行柱层析分离，以石油醚/丙酮为洗脱液梯度洗脱至丙酮冲柱，回收 溶剂后进行薄层层析，收集Rf值分0.3～0.45的组份，用石油醚进行纯化， 得到所述的二降碳无羁烷三萜化合物。

所述洗脱液中石油醚和丙酮体积比为20～10∶1。

所述薄层层析使用硅胶GF254板，展开剂为体积比为5～3∶1的石油 醚/丙酮混合液。

所述展开剂为体积比为3∶1的石油醚/丙酮混合液。

所述薄层层析时，以紫外灯检测，显色剂为5％H2SO4/EtOH。

具体的，所述方法如下：取粉背南蛇藤根部干燥、粉碎后，用5～10 倍质量的丙酮室温冷浸一周，共三次，回收溶剂后得到浸膏，用200～300 目柱层析硅胶进行柱层析分离，以体积比为20～10∶1的石油醚/丙酮为 洗脱液进行梯度洗脱至丙酮冲柱，回收溶剂后以体积比5～3∶1石油醚/ 丙酮为薄层展开剂、以硅胶GF254板进行薄层层析，以紫外灯检测，以 5％H2SO4/EtOH显色后，合并Rf值分0.3～0.45的组份，用石油醚进行纯 化，得到所述的二降碳无羁烷三萜化合物。

本发明还涉及所述的二降碳无羁烷三萜化合物在制备抗衰老抗氧化 药物中的应用。根据体外对Fe2+-VitC诱导的大鼠心、肝、肾丙二醛生成 影响的研究结果可以看到：该化合物表现了体外对Fe2+-VitC诱导的大鼠 心、肝、肾组织匀浆MDA生成具有明显的抑制作用，IC50值分别为5.30、 4.27和6.18μg/ml；同时该化合物表现了好的抑制二苯代苦味酰基自由 (DPPH·)基作用，药物浓度为100μg/ml、33.3μg/ml、11.1μg/ml时DPPH· 自由基清除率分别为98.28％、95.46％和69.23％。这表明该化合物可以有 效的清除自由基，有抗衰老抗氧化作用，可能是潜在的抗衰老抗氧化药物， 有可能减少由于羟基自由基氧化引起的DNA损伤。

本发明的有益效果主要体现在：提供了一种具有抗衰老抗氧化活性的 新化合物，为新药筛选提供了基础。

(四)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围 并不仅限于此：

实施例1：

二降碳无羁烷三萜化合物的制备：

粉背南蛇藤根部(1.2kg)干燥粉碎后，用10L丙酮室温冷浸一周， 共三次，回收溶剂后得到浸膏100g，用200～300目柱层析硅胶(900g) 进行柱层析分离，以石油醚/丙酮(20∶1)梯度洗脱至丙酮冲柱(3500ml)， 以每份500ml接收，回收溶剂后以石油醚/丙酮(5∶1)作薄层条件以紫 外灯检测，GF254板以5％H2SO4/EtOH显色后，根据Rf值分组。当石油醚 /丙酮体积比为5∶1时，Rf＝0.3的组份合并，用石油醚进行纯化，得到 二降碳无羁烷三萜化合物15.3mg。

化合物测试：

仪器：Nicolet 5DX-FT-IR红外光谱仪(KBr压片)，岛津UV-260紫外分 光光度计，HP-5988型、VGZAB-HS(70ev)和APEX TMII Bruker 4.7T AS 型质谱仪，日产JASCO J-20C自动记录旋光仪，Brucker AM-400型超导 核磁共振波谱仪(δ/ppm，TMS内标)，254 nm紫外灯。

试剂：溶剂均为分析纯试剂，未进行处理。

对前述制得的二降碳无羁烷三萜化合物进行测试：

C29H38O4，红色漆状物，[α]D 20：-3.3°(CHCl3，c 0.65)；HR-ESIMS： [M+H]+·，451.2834.C29H39O4，理论值：[M+H]+·451.2843)；IR vmax KBr：3400， 2926，2859，1719，1455，1372，1265，1104，1027，728cm-1；UVλmax MeOH：212 (2.11)，282(0.64)nm；EIMS：m/z 450[M]+(3.9)，405(1.1)，331(1.0)，267 (2.9)，253(5.2)，243(23.3)，215(18.4)，201(100)，187(4.3)，121(6.3)，109 (8.7)，95(11.5)，55(8.8)，43(18.2)；FABMS：m/z 451[M+H]+；1H and13C NMR见表1。

表1：二降碳无羁烷三萜化合物的NMR数据(400MHz，CDCl3)

    No.   δC(DEPT)   δH   (JHz)     HMBC     (2J，3J，4J)     No.   δC   (DEPT)   δH   (JHz)   HMBC   (2J，3J，4J)     1     2     3     4     5     6     7     8     9     10     11     13     14     15   109.3(CH)   140.3(C)   121.5(C)   120.0(C)   127.9(C)   28.9(CH2)   -   121.6(CH)   -   150.2(C)   37.1(C)   142.2(C)   35.6(CH2)   -   37.7(C)   43.8(C)   29.7(CH2)   6.73，s   -   -   -   -   1.51，d(6.4)   3.86，brs   5.77，d(6.4)   -   -   -   -   1.65，d(12.6)   2.02，d(12.6)   -   -   1.51-1.78，m     C-2     -     -     -     -     C-5，7，     8，10     C-5，9，     14，25，27     -     -     -     C-5，7，8，     10，14，18     -     -     -     16     17     18     19     -     20     21     22     -     23     25     26     27     28     29     30     31   36.7(CH2)   30.9(C)   44.3(CH)   30.5(CH2)   -   40.2(C)   209.4(C)   51.8(CH2)   -   11.1(CH3)   36.7(CH3)   223(CH3)   18.8(CH3)   31.5(CH3)   183.1(C)   32.8(CH3)   11.1(CH3)   1.51-1.78，m   -   1.78，t   2.02，d(12.6)   2.46，d(12.6)   -   -   2.40，d(13.2)   2.65，d(13.2)   2.16，s   1.43，s   1.16，s   0.63，s   1.05，s   -   1.25，s   2.10，s   -   -   C-16，19   C-20，21，30   -   -   -   C-16，18，20   ，21，28，30   C-4，5   C-1，8，10，11   C-11，14，18   C-13，14，18   C-15，16，17   -   C-22，29   C-2，4，5

实施例2：

二降碳无羁烷三萜化合物的制备：

粉背南蛇藤根部(2.5kg)干燥粉碎后，用20L丙酮室温冷浸一周， 共三次，回收溶剂后得到浸膏215g，用200-300目柱层析硅胶(1100g) 进行柱层析分离，以石油醚/丙酮(10∶1)梯度洗脱至丙酮冲柱(4500ml)， 以每份500ml接收，回收溶剂后以石油醚/丙酮(3∶1)作薄层条件以紫 外灯检测，GF254板以5％H2SO4/EtOH显色后，根据Rf值分组。当石油醚 /丙酮体积比为3∶1时，Rf＝0.45的组份合并，用石油醚进行纯化，得到 二降碳无羁烷三萜化合物32.5mg。

采用与实施例1相同方法，对上述制得的二降碳无羁烷三萜化合物进 行测试，结果如下：

C29H38O4，红色漆状物，[α]D 20：-4.8°(CHCl3，c 0.85)；IR vmax KBr：3400， 2926，2859，1719，1455，1372，1265，1104，1027，728 cm-1；UVλmax MeOH：212 (2.11)，282(0.64)nm；EIMS：m/z 450[M]+(3.9)，405(1.1)，331(1.0)，267 (2.9)，253(5.2)，243(23.3)，215(18.4)，201(100)，187(4.3)，121(6.3)，109 (8.7)，95(11.5)，55(8.8)，43(18.2)；FABMS：m/z 451[M+H]+；1H-NMR (CDCl3，400 MHz)，与实施例1相同。

实施例3

对实施例1制得的二降碳无羁烷三萜化合物进行了体外对Fe2+-VitC 诱导的大鼠心、肝、肾丙二醛(MDA)生成影响的实验。

试剂：硫代巴比妥酸(TBA)为上海试剂二厂产品，其余试剂均为国 产分析纯。

动物：Wistar大鼠，雌雄兼用，由杭州医学科学研究院动物中心提供。

方法：Wistar大鼠脱颈处死，迅速剖取心脏、肝脏和肾脏，用生理 盐水制成5％的组织匀浆，实验分空白组(加二甲基亚砜溶媒)，对照组 (加FeSO4和抗坏血酸即Fe2+-VitC各50μmol·L-1)和给药组(加Fe2+-VitC 和各浓度药液：11.1、33.3、100μg/ml)，每组平行5管，每管1ml组织匀 浆，以上各步均在冰浴中进行。在相应管中加入各浓度药液或溶媒，37℃ 水浴温育10min，再给相应管中加入Fe2+-VitC，继续温育30min，按TBA 法测MDA。以稳定氮氧自由基HTMPO为对照品测定半抑制率浓度(IC50 μg/ml)。

结果：如表2中结果显示实施例1所得二降碳无羁烷三萜化合物体外 对Fe2+-VitC诱导的大鼠心、肝、肾组织匀浆MDA生成具有明显的抑制 作用，这表明它可以有效的清除羟基自由基(·OH)，有抗脂质过氧化抗 衰老作用，可能是潜在的天然抗衰老抗氧化剂，有可能减少由于羟基自由 基氧化引起的DNA损伤。

表2：体外对Fe2+-VitC诱导的大鼠心、肝、肾MDA生成影响的研究(IC50 μg/ml)结果

  化合物   心   肝     肾   二降碳无羁烷三萜   化合物(I)   HTMPO   5.30±0.31   10.20±0.20   4.27±0.28   7.10±0.42     6.18±0.51     2.03±0.19

实施例4

对实施例1制得的二降碳无羁烷三萜化合物进行了体外对二苯代苦 味酰基自由基(DPPH·)清除能力的测定实验。

试剂：二苯代苦味酰基自由基(DPPH·)购自上海百灵威公司，其余 试剂均为国产分析纯。

方法：称取一定量二降碳无羁烷三萜化合物样品放入试管中，分别加 入一定体积的80％甲醇超声溶解，配得药物母液浓度为1mg/ml，以此溶液 配成药物浓度为100μg/ml、33.3μg/ml、11.1μg/ml的溶液。加各浓度的 样品溶液100μl和0.1mmol/l DPPH溶液100μl于96孔板中(样品实际 反应浓度为50μg/ml、16.7μg/ml、5.6μg/ml)，每份设5个平行。样品加 入后中速振荡30s，在室温(25℃)和517nm波长下测定其吸光值(Ap)； 室温下放置20min后再测定依次；同时测定不加DPPH的样品空白吸收 光(Ac：100μl样品+100μl甲醇)和加DPPH但不加样品的吸光值(Amax： 100μl DPPH+100μl甲醇)。以100μg/ml VC作为对照测定抑制率(IR％)。

结果：如表3中结果显示，实施例1所得二降碳无羁烷三萜化合物体 外对二苯代苦味酰基自由基(DPPH·)具有一定的清除能力，有抗氧化抗 衰老作用，可能是潜在的天然抗衰老抗氧化剂。

表3：体外对二苯代苦味酰基自由基(DPPH·)清除能力的测定结果(IR％)

  化合物     11.1μg/ml     33.3μg/ml     100μg/ml   二降碳无羁烷三萜   化合物(I)   VC     69.23±0.25     90.56±0.34     95.46±0.34     98.25±0.47     98.28±0.17     100.00±0.59