榆树皮提取的化合物及其制备方法和应用 |
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| 申请号 | CN202311512869.X | 申请日 | 2023-11-14 | 公开(公告)号 | CN118047822A | 公开(公告)日 | 2024-05-17 |
| 申请人 | 延边大学; | 发明人 | 郑明善; 崔东日; 于跃; 郎明越; 呼德日; 康东周; 闵俊哲; 李镐; 李喜玲; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了榆树皮提取的化合物及其制备方法和应用，属于医药技术领域，本发明丰富了榆树皮的化学成分，并一定程度上阐明了其抗炎活性物质 基础 ，找出了具有良好开发潜 力 的防治败血症的先导化合物，为后续的抗败血症等药物的研究及开发奠定了基础。本发明提取的化合物1、9、23、24对LPS诱导的RAW264.7细胞释放NO、TNF‑α和IL‑6有较好的抑制作用；同时通过实验验证了化合物23能显著降低败血症肝损伤死亡率，降低血清AST、ALT、TNF‑α和NO含量，具有显著的肝保护作用；同时升高了肝组织SOD活性和降低了MDA的含量，具有明显的抗 氧 化作用。 | ||||||
| 权利要求 | 1.榆树皮提取的化合物，其特征在于：包括12个黄酮及其苷类、9个三贴及其苷类、4个苯丙素类、3个甾醇、2个香豆素和6个其他类化合物，具体包括：(‑)‑epicatechin‑7‑O‑apiofuranoside(化合物1)、(‑)‑epicatechin(化合物2)、(+)‑catechin(化合物3)、catechin‑7‑O‑β‑D‑xylopyranoside(化合物4)、catechin‑7‑O‑β‑D‑glucopyranoside(化合物5)、(‑)‑Catechin(化合物6)、(‑)‑Catechin‑7‑O‑β‑D‑apiofuranoside(化合物7)、UlmosideA(化合物8)、Taxifolin‑6‑C‑glucoside(化合物9)、(‑)‑Salipurposide(化合物 |
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| 说明书全文 | 榆树皮提取的化合物及其制备方法和应用技术领域[0001] 本发明涉及医药技术领域，具体为榆树皮提取的化合物及其制备方法和应用。 背景技术[0002] 肝脏不仅是败血症中最易受损的器官之一，还对败血症发生、发展有举足轻重的作用。败血症诱导急性肝损伤在多器官功能障碍综合征的发生、发展中起着重要作用，是引起败血症死亡的最重要的原因之一。 [0003] 榆白皮是榆科植物榆榆(Ulmus pumilaL.)的树皮和根皮的韧皮部部分，广泛分布于中国各省区，资源非常丰富。关于该植物的记载始见于《神农本草经》，“主大小便不通，利水道除邪气”，在中国的传统医学上具有利水、通淋、消肿的功效，多用于治疗便秘或皮肤溃烂、发炎。榆的研究始于20世纪90年代初，先后发现了该同属植物无毛榆具有抗炎作用和抗菌作用，随后有关榆白皮的化学成分与药理活性等方面研究取得了很大进展。 [0004] 近年来，榆白皮的化学成分和药理活性备受研究者们的关注。然而，榆白皮的药理研究迄今多以提取物及水煎液为主，针对活性成分的研究仍相对较少。所以我们提出了榆树皮提取的化合物及其制备方法和应用，以便于解决上述中提出的问题。 发明内容[0005] 本发明的目的在于提供榆树皮提取的化合物及其制备方法和应用，以解决上述背景技术提出的问题。 [0006] 为实现上述目的，本发明提供榆树皮提取的化合物，包括12个黄酮及其苷类、9个三贴及其苷类、4个苯丙素类、3个甾醇、2个香豆素和6个其他类化合物，具体包括： [0007] (‑)‑epicatechin‑7‑O‑apiofuranoside(化合物1)，化学结构如下： [0008] [0009] (‑)‑epicatechin(化合物2)，化学结构如下： [0010] [0011] (+)‑catechin(化合物3) [0012] catechin‑7‑O‑β‑D‑xylopyranoside(化合物4) [0013] catechin‑7‑O‑β‑D‑glucopyranoside(化合物5)，化学结构如下： [0014] [0015] (‑)‑Catechin(化合物6)， [0016] (‑)‑Catechin‑7‑O‑β‑D‑apiofuranoside(化合物7)，化学结构如下： [0017] [0018] UlmosideA(化合物8)，化学结构如下： [0019] [0020] Taxifolin‑6‑C‑glucoside(化合物9)，化学结构如下： [0021] [0022] (‑)‑Salipurposide(化合物10)，化学结构如下： [0023] [0024] 2'‑Hydroxyisoorientin(化合物11)，化学结构如下： [0025] [0026] Isosalipurposide(化合物12)，化学结构如下： [0027] [0028] Iupenone(化合物13)，化学结构如下： [0029] [0030] Betulinicacid(化合物14)，化学结构如下： [0031] [0032] Friedelin(化合物15)，化学结构如下： [0033] [0034] Camaldulenicacid(化合物16)，化学结构如下： [0035] [0036] Oleanolicacid(化合物17)、 [0037] Maslinicacid(化合物18)、 [0038] Arjunoicacid(化合物19)，化学结构如下： [0039] [0040] Ursolicacid(化合物20)、 [0041] Tormenticacid(化合物21)，化学结构如下： [0042] [0043] Nudiposide(化合物22)，化学结构如下： [0044] [0045] (+)‑5'‑Methoxyisolariciresinol‑9‑O‑β‑D‑xylopyranoside(化合物23)，化学结构如下： [0046] [0047] IcarisideE3(化合物24)，化学结构如下： [0048] [0049] IcarisideE4(化合物25)，化学结构如下： [0050] [0051] 7β‑Hydroxysitosterol(化合物26)、 [0052] β‑Sitosterol(化合物27)、 [0053] β‑Daucosterol(化合物28)，化学结构如下： [0054] [0055] 4,5‑Methoxy,3‑hydroxy‑1‑henol‑β‑D‑glucoside(化合物29)，化学结构如下： [0056] [0057] Salidroside(化合物30)、 [0058] EchipurosideA(化合物31)，化学结构如下： [0059] [0060] Escoparone(化合物32)，化学结构如下： [0061] [0062] Scopolin(化合物33)，化学结构如下： [0063] [0064] (11E)‑10,13,14‑Trihydroxy‑11‑en‑octadecenoicacidmethylester(化合物34)，化学结构如下： [0065] [0066] Methylα‑D‑apiofuranoside(化合物35)，化学结构如下： [0067] [0068] Uridine(化合物36)，化学结构如下： [0069] [0070] 榆树皮提取化合物的制备方法，包括如下步骤： [0071] 步骤一： [0073] 将浸膏充分溶于水中，并依次用石油醚(5L×3次)、乙酸乙酯(5L×3次)和正丁醇(5L×3次)对提取物进行萃取，萃取后合并萃取液，减压干燥回收并称重，最终得到石油醚萃取物39.0g、乙酸乙酯萃取物71.6g、正丁醇萃取物709.3g和水层萃取物410.0g； [0074] 步骤二： [0076] Fr.P3(1.3g)经正相硅胶(200～300目)柱层析，以石油醚–乙酸乙酯(100:1‑20:1)梯度洗脱，TLC检测合并后得Fr.P3‑1～P3‑6；其中Fr.P3‑2经正相硅胶(200～300目)柱层析，以石油醚–乙酸乙酯(100:1‑20:1)梯度洗脱后得到化合物13(7.1mg)；Fr.P3‑3经重结晶(甲醇)后得到化合物15(20.0mg)； [0077] Fr.P4(1.6g)经正相硅胶(200～300目)柱层析，以石油醚–乙酸乙酯(80:1‑20:1)梯度洗脱，TLC检测合并后得Fr.P4‑1～P4‑9；其中Fr.P4‑9经正相硅胶(200～300目)柱层析，以石油醚–乙酸乙酯(50:1‑20:1)梯度洗脱得到化合物26(12.3mg)； [0078] Fr.P5(2.3g)多次经正相硅胶(200～300目)柱层析，以石油醚–乙酸乙酯(50:1‑5:1)梯度洗脱后得化合物14(5.1mg)和化合物17(28.8mg)； [0079] 步骤三： [0080] 取乙酸乙酯萃取物65.0g，经正相硅胶(100～200目)柱层析，以二氯甲烷–甲醇(100:1‑0:100)梯度洗脱，经TLC检测合并相同流分，得到10个流分Fr.E1～E10； [0081] Fr.E3(1.4g)经正相硅胶(200～300目)柱层析，以二氯甲烷–甲醇(100:1‑20:1)梯度洗脱，TLC检测合并后得Fr.E3‑1～E3‑10；其中Fr.E3‑6经正相硅胶(200～300目)柱层析，以二氯甲烷–甲醇(80:1‑20:1)梯度洗脱后得到化合物20(30.6mg)；Fr.E3‑7和Fr.E3‑8经正相硅胶(200～300目)柱层析，以二氯甲烷–甲醇(50:1‑10:1)梯度洗脱，分别经重结晶(甲醇)纯化得到化合物27(200.3mg)和到化合物32(12.4mg)； [0082] Fr.E4(3.2g)经正相硅胶(200～300目)柱层析，以二氯甲烷–甲醇(50:1‑10:1)多次梯度洗脱后得到化合物16(9.8mg)，化合物18(9.8mg)，化合物21(12.6mg)和化合物27(10.1mg)； [0083] 步骤四： [0084] Fr.E6(3.8g)经正相硅胶(200～300目)柱层析，以二氯甲烷–甲醇(100:1‑0:100)梯度洗脱，TLC检测合并后得Fr.E6‑1～E6‑7，其中Fr.E6‑1经正相硅胶(200～300目)柱层析，以二氯甲烷–甲醇(50:1‑10:1)梯度洗脱后得到化合物34(387.9mg)；Fr.E6‑4经重结晶(甲醇)纯化后得到化合物28(312.7mg)；Fr.E6‑6经SephadexLH‑20凝胶柱色谱(二氯甲烷–甲醇1:1)纯化后得到化合物3(267.0mg)和化合物6(17.1mg)； [0085] Fr.E8(3.7g)经SephadexLH‑20凝胶柱色谱(二氯甲烷–甲醇1:1)后，经正相硅胶(300～400目)柱层析，以二氯甲烷–甲醇(20:1‑10:1)梯度洗脱得到化合物7(546.8mg)和化合物35(11.2mg)； [0086] 步骤五： [0087] 取正丁醇萃取物80.0g，经正相硅胶(100～200目)柱层析，以二氯甲烷–甲醇(100:1‑0:100)梯度洗脱，经TLC检测合并相同流分，得到13个流分Fr.B1～B13； [0088] Fr.B4(1.2g)经重结晶(甲醇)纯化后得到化合物14(8.9mg)； [0089] Fr.B5(1.5g)经正相硅胶(200～300目)柱层析，以二氯甲烷–甲醇(100:1‑2:1)梯度洗脱后，经SephadexLH‑20凝胶柱色谱(甲醇)纯化得到化合物3(84.0mg)； [0090] Fr.B6(11.7g)经正相硅胶(200～300目)柱层析，以二氯甲烷–甲醇(100:1‑1:1)梯度洗脱，经TLC检测合并相同流分，得到10个流分Fr.B6‑1～B6‑10；其中Fr.B6‑3经SephadexLH‑20凝胶柱色谱(甲醇)纯化后得到化合物35(8.4mg)；Fr.B6‑4经正相硅胶(200～300目)柱层析，以二氯甲烷–甲醇(50:1‑3:1)梯度洗脱后，经反相硅胶柱层析，以甲醇‑水(20:80～100:0)进行梯度洗脱后得到化合物2(5.2mg)，化合物6(54.0mg)和化合物22(20.0mg)；Fr.B6‑7通过反相硅胶柱层析，以甲醇‑水(20:80～100:0)梯度洗脱，分别得到化合物10(8.2mg)，化合物12(6.2mg)，化合物23(26.5mg)，化合物29(25.6mg)，化合物30(9.5mg)，化合物33(8.4mg)和化合物36(6.4mg)； [0091] 步骤六： [0092] Fr.B6‑7通过反相硅胶柱层析，以甲醇‑水(30:70～100:0)梯度洗脱后，经SephadexLH‑20凝胶柱色谱(甲醇)纯化得到化合物1(26.0mg)和化合物7(24.0mg)； [0093] Fr.B7(11.5g)通过反相硅胶柱层析，以甲醇‑水(15:85～100:0)梯度洗脱后，经SephadexLH‑20凝胶柱色谱(甲醇)纯化得到化合物11(14.0mg)，化合物24(26.0mg)和化合物25(22.0mg)； [0094] Fr.B8(3.1g)通过反相硅胶柱层析，以甲醇‑水(15:85～100:0)梯度洗脱后得到化合物4(40.0mg)； [0095] Fr.B9(6.1g)经正相硅胶(200～300目)柱层析，以二氯甲烷–甲醇(30:1‑1:1)梯度洗脱，经TLC检测合并相同流分，得到5个流分Fr.B9‑1～B9‑5；其中Fr.B9‑2经SephadexLH‑20凝胶柱色谱(甲醇)纯化得到化合物31(40.0mg)；Fr.B9‑3通过反相硅胶柱层析，以甲醇‑水(10:90～100:0)梯度洗脱后得到化合物8(18.0mg)；Fr.B9‑3‑2和Fr.B9‑3‑5分别经SephadexLH‑20凝胶柱色谱(甲醇)纯化后得到化合物5(17.0mg)和化合物9(31.0mg)。 [0096] 榆树皮提取的化合物在抗败血症诱导急性肝损伤中的应用。 [0097] 与现有技术相比，本发明的有益效果是： [0099] (2)本发明提取的化合物1、9、23、24对LPS诱导的RAW264.7细胞释放NO、TNF‑α和IL‑6有较好的抑制作用；同时通过实验验证了化合物23能显著降低败血症肝损伤死亡率，降低血清AST、ALT、TNF‑α和NO含量，具有显著的肝保护作用；同时升高了肝组织SOD活性和降低了MDA的含量，具有明显的抗氧化作用。附图说明 [0100] 图1为本发明榆树皮提取化合物的制备方法步骤一流程示意图； [0101] 图2为本发明榆树皮提取化合物的制备方法步骤二流程示意图； [0102] 图3为本发明榆树皮提取化合物的制备方法步骤三流程示意图； [0103] 图4为本发明榆树皮提取化合物的制备方法步骤四流程示意图； [0104] 图5为本发明榆树皮提取化合物的制备方法步骤五流程示意图； [0105] 图6为本发明榆树皮提取化合物的制备方法步骤六流程示意图； [0106] 图7为化合物对RAW264.7小鼠巨噬细胞增值的影响图示一； [0107] 图8为化合物对RAW264.7小鼠巨噬细胞增值的影响图示二； [0108] 图9为化合物对RAW264.7小鼠巨噬细胞增值的影响图示三； [0109] 图10为不同浓度化合物对LPS诱导RAW264.7细胞产生NO含量的影响图示一； [0110] 图11为不同浓度化合物对LPS诱导RAW264.7细胞产生NO含量的影响图示二； [0111] 图12为不同浓度化合物对LPS诱导RAW264.7细胞产生NO含量的影响图示三； [0112] 图13为不同浓度化合物对LPS诱导RAW264.7细胞产生TNF‑α含量的影响图示一； [0113] 图14为不同浓度化合物对LPS诱导RAW264.7细胞产生TNF‑α含量的影响图示二； [0114] 图15为不同浓度化合物对LPS诱导RAW264.7细胞产生TNF‑α含量的影响图示三； [0115] 图16为不同浓度化合物对LPS诱导RAW264.7细胞产生IL‑6含量的影响图示一； [0116] 图17为不同浓度化合物对LPS诱导RAW264.7细胞产生IL‑6含量的影响图示二； [0117] 图18为不同浓度化合物对LPS诱导RAW264.7细胞产生IL‑6含量的影响图示三； [0118] 图19为化合物1、9、23和24对败血症性肝损伤小鼠死亡率的影响图示； [0119] 图20为各组小鼠肝脏组织切片在光镜下示意图，其中A正常对照，B模型组，C阳性对照组，D低剂量组，E高剂量组； [0120] 图21为化合物23对败血症性肝损伤小鼠血清ALT和AST的影响图示； [0121] 图22为化合物23对败血症性肝损伤小鼠血清SOD和MDA的影响图示； [0122] 图23为化合物23对败血症性肝损伤小鼠血清TNF‑α和NO含量的影响图示。 具体实施方式[0123] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。 [0124] 榆树皮提取的化合物，包括12个黄酮及其苷类、9个三贴及其苷类、4个苯丙素类、3个甾醇、2个香豆素和6个其他类化合物，具体包括： [0125] (‑)‑epicatechin‑7‑O‑apiofuranoside(化合物1)、 [0126] (‑)‑epicatechin(化合物2)、 [0127] (+)‑catechin(化合物3)、 [0128] catechin‑7‑O‑β‑D‑xylopyranoside(化合物4)、 [0129] catechin‑7‑O‑β‑D‑glucopyranoside(化合物5)、 [0130] (‑)‑Catechin(化合物6)、 [0131] (‑)‑Catechin‑7‑O‑β‑D‑apiofuranoside(化合物7)、 [0132] UlmosideA(化合物8)、 [0133] Taxifolin‑6‑C‑glucoside(化合物9)、 [0134] (‑)‑Salipurposide(化合物10)、 [0135] 2'‑Hydroxyisoorientin(化合物11)、 [0136] Isosalipurposide(化合物12)、 [0137] Iupenone(化合物13)、 [0138] Betulinicacid(化合物14)、 [0139] Friedelin(化合物15)、 [0140] Camaldulenicacid(化合物16)、 [0141] Oleanolicacid(化合物17)、 [0142] Maslinicacid(化合物18)、 [0143] Arjunoicacid(化合物19)、 [0144] Ursolicacid(化合物20)、 [0145] Tormenticacid(化合物21)、 [0146] Nudiposide(化合物22)、 [0147] (+)‑5'‑Methoxyisolariciresinol‑9‑O‑β‑D‑xylopyranoside(化合物23)、[0148] IcarisideE3(化合物24)、 [0149] IcarisideE4(化合物25)、 [0150] 7β‑Hydroxysitosterol(化合物26)、 [0151] β‑Sitosterol(化合物27)、 [0152] β‑Daucosterol(化合物28)、 [0153] 4,5‑Methoxy,3‑hydroxy‑1‑henol‑β‑D‑glucoside(化合物29)、[0154] Salidroside(化合物30)、 [0155] EchipurosideA(化合物31)、 [0156] Escoparone(化合物32)、 [0157] Scopolin(化合物33)、 [0158] (11E)‑10,13,14‑Trihydroxy‑11‑en‑octadecenoicacidmethylester(化合物34)、 [0159] Methylα‑D‑apiofuranoside(化合物35)、 [0160] Uridine(化合物36)。 [0161] 榆树皮提取化合物的制备方法，包括如下步骤： [0162] 步骤一： [0163] 取榆树皮药材9.0kg，粉碎后加入75％的乙醇50L，恒温加热(温度控制在60℃左右)浸泡，过滤、浓缩，重复提取三次，每次用时3h，最后浓缩合并得到提取物浸膏1.6kg； [0164] 将浸膏充分溶于水中，并依次用石油醚(5L×3次)、乙酸乙酯(5L×3次)和正丁醇(5L×3次)对提取物进行萃取，萃取后合并萃取液，减压干燥回收并称重，最终得到石油醚萃取物39.0g、乙酸乙酯萃取物71.6g、正丁醇萃取物709.3g和水层萃取物410.0g； [0165] 步骤二： [0166] 取石油醚萃取物34.0g，经正相硅胶(100～200目)柱层析，以石油醚–乙酸乙酯(100:1‑20:1)梯度洗脱，经TLC检测合并相同流分，得到10个流分Fr.P1～P10； [0167] Fr.P3(1.3g)经正相硅胶(200～300目)柱层析，以石油醚–乙酸乙酯(100:1‑20:1)梯度洗脱，TLC检测合并后得Fr.P3‑1～P3‑6；其中Fr.P3‑2经正相硅胶(200～300目)柱层析，以石油醚–乙酸乙酯(100:1‑20:1)梯度洗脱后得到化合物13(7.1mg)；Fr.P3‑3经重结晶(甲醇)后得到化合物15(20.0mg)； [0168] Fr.P4(1.6g)经正相硅胶(200～300目)柱层析，以石油醚–乙酸乙酯(80:1‑20:1)梯度洗脱，TLC检测合并后得Fr.P4‑1～P4‑9；其中Fr.P4‑9经正相硅胶(200～300目)柱层析，以石油醚–乙酸乙酯(50:1‑20:1)梯度洗脱得到化合物26(12.3mg)； [0169] Fr.P5(2.3g)多次经正相硅胶(200～300目)柱层析，以石油醚–乙酸乙酯(50:1‑5:1)梯度洗脱后得化合物14(5.1mg)和化合物17(28.8mg)； [0170] 步骤三： [0171] 取乙酸乙酯萃取物65.0g，经正相硅胶(100～200目)柱层析，以二氯甲烷–甲醇(100:1‑0:100)梯度洗脱，经TLC检测合并相同流分，得到10个流分Fr.E1～E10； [0172] Fr.E3(1.4g)经正相硅胶(200～300目)柱层析，以二氯甲烷–甲醇(100:1‑20:1)梯度洗脱，TLC检测合并后得Fr.E3‑1～E3‑10；其中Fr.E3‑6经正相硅胶(200～300目)柱层析，以二氯甲烷–甲醇(80:1‑20:1)梯度洗脱后得到化合物20(30.6mg)；Fr.E3‑7和Fr.E3‑8经正相硅胶(200～300目)柱层析，以二氯甲烷–甲醇(50:1‑10:1)梯度洗脱，分别经重结晶(甲醇)纯化得到化合物27(200.3mg)和到化合物32(12.4mg)； [0173] Fr.E4(3.2g)经正相硅胶(200～300目)柱层析，以二氯甲烷–甲醇(50:1‑10:1)多次梯度洗脱后得到化合物16(9.8mg)，化合物18(9.8mg)，化合物21(12.6mg)和化合物27(10.1mg)； [0174] 步骤四： [0175] Fr.E6(3.8g)经正相硅胶(200～300目)柱层析，以二氯甲烷–甲醇(100:1‑0:100)梯度洗脱，TLC检测合并后得Fr.E6‑1～E6‑7，其中Fr.E6‑1经正相硅胶(200～300目)柱层析，以二氯甲烷–甲醇(50:1‑10:1)梯度洗脱后得到化合物34(387.9mg)；Fr.E6‑4经重结晶(甲醇)纯化后得到化合物28(312.7mg)；Fr.E6‑6经SephadexLH‑20凝胶柱色谱(二氯甲烷–甲醇1:1)纯化后得到化合物3(267.0mg)和化合物6(17.1mg)； [0176] Fr.E8(3.7g)经SephadexLH‑20凝胶柱色谱(二氯甲烷–甲醇1:1)后，经正相硅胶(300～400目)柱层析，以二氯甲烷–甲醇(20:1‑10:1)梯度洗脱得到化合物7(546.8mg)和化合物35(11.2mg)； [0177] 步骤五： [0178] 取正丁醇萃取物80.0g，经正相硅胶(100～200目)柱层析，以二氯甲烷–甲醇(100:1‑0:100)梯度洗脱，经TLC检测合并相同流分，得到13个流分Fr.B1～B13； [0179] Fr.B4(1.2g)经重结晶(甲醇)纯化后得到化合物14(8.9mg)； [0180] Fr.B5(1.5g)经正相硅胶(200～300目)柱层析，以二氯甲烷–甲醇(100:1‑2:1)梯度洗脱后，经SephadexLH‑20凝胶柱色谱(甲醇)纯化得到化合物3(84.0mg)； [0181] Fr.B6(11.7g)经正相硅胶(200～300目)柱层析，以二氯甲烷–甲醇(100:1‑1:1)梯度洗脱，经TLC检测合并相同流分，得到10个流分Fr.B6‑1～B6‑10；其中Fr.B6‑3经SephadexLH‑20凝胶柱色谱(甲醇)纯化后得到化合物35(8.4mg)；Fr.B6‑4经正相硅胶(200～300目)柱层析，以二氯甲烷–甲醇(50:1‑3:1)梯度洗脱后，经反相硅胶柱层析，以甲醇‑水(20:80～100:0)进行梯度洗脱后得到化合物2(5.2mg)，化合物6(54.0mg)和化合物22(20.0mg)；Fr.B6‑7通过反相硅胶柱层析，以甲醇‑水(20:80～100:0)梯度洗脱，分别得到化合物10(8.2mg)，化合物12(6.2mg)，化合物23(26.5mg)，化合物29(25.6mg)，化合物30(9.5mg)，化合物33(8.4mg)和化合物36(6.4mg)； [0182] 步骤六： [0183] Fr.B6‑7通过反相硅胶柱层析，以甲醇‑水(30:70～100:0)梯度洗脱后，经SephadexLH‑20凝胶柱色谱(甲醇)纯化得到化合物1(26.0mg)和化合物7(24.0mg)； [0184] Fr.B7(11.5g)通过反相硅胶柱层析，以甲醇‑水(15:85～100:0)梯度洗脱后，经SephadexLH‑20凝胶柱色谱(甲醇)纯化得到化合物11(14.0mg)，化合物24(26.0mg)和化合物25(22.0mg)； [0185] Fr.B8(3.1g)通过反相硅胶柱层析，以甲醇‑水(15:85～100:0)梯度洗脱后得到化合物4(40.0mg)； [0186] Fr.B9(6.1g)经正相硅胶(200～300目)柱层析，以二氯甲烷–甲醇(30:1‑1:1)梯度洗脱，经TLC检测合并相同流分，得到5个流分Fr.B9‑1～B9‑5；其中Fr.B9‑2经SephadexLH‑20凝胶柱色谱(甲醇)纯化得到化合物31(40.0mg)；Fr.B9‑3通过反相硅胶柱层析，以甲醇‑水(10:90～100:0)梯度洗脱后得到化合物8(18.0mg)；Fr.B9‑3‑2和Fr.B9‑3‑5分别经SephadexLH‑20凝胶柱色谱(甲醇)纯化后得到化合物5(17.0mg)和化合物9(31.0mg)。 [0187] 榆树皮提取的化合物在抗败血症诱导急性肝损伤中的应用。 [0188] 为了更好理解本发明的内容，以下通过实验及相关数据进一步说明。 [0189] 1、榆树皮分离得到的化合物对LPS刺激巨噬细胞释放NO，IL‑6和TNF‑α抗炎因子的影响 [0190] 对小鼠原代肝星状细胞分离与纯化，进行小鼠单核巨噬细胞RAW264.7系的培养； [0191] 1.1对细胞毒性进行测定：如图7‑图9所示，榆树皮分离得到的化合物在浓度100μM下除化合物2、15～17、20～21、35～36之外均对体外培养巨噬细胞RAW264.7的存活率在70％以上，说明其他化合物对小鼠巨噬细胞RAW264.7无明显的毒性细胞作用。 [0192] 1.2对LPS刺激巨噬细胞释放NO含量的测定：选取增值率超过70％的23个化合物1、3～5、6、7～11、13、15、22～27、29～33、36，分别在10,30,100μM浓度时测定化合物抑制LPS诱导RAW264.7细胞产生NO含量的实验，如图10‑图12所示，模型组和正常组比较时有极显著性差异(P<0.001)，模型组构建成功，说明LPS能够诱导RAW264.7细胞大量产生NO；地塞米松组与模型组比较时极具有显著性差异(P<0.001)，说明地塞米松能够非常明显地抑制LPS诱导RAW264.7细胞分泌NO。100μM给药组中化合物3～5、23～26与模型组比较时较好地能够抑制NO释放的含量(P<0.01)。 [0193] 1.3对LPS刺激巨噬细胞释放肿瘤坏死因子(TNF‑α)含量的测定：选取增值率超过70％的23个化合物1、3～5、6、7～11、13、15、22～27、29～33、36，分别在10,30,100μM浓度时测定化合物抑制LPS诱导RAW264.7细胞产生TNF‑α含量的实验，如图13‑图15所示，模型组和正常组比较时有极显著性差异(P<0.001)，模型组构建成功，说明LPS能够诱导RAW264.7细胞大量产生IL‑6；地塞米松组与模型组比较时具有极显著性差异(P<0.001)，说明地塞米松能够非常明显地抑制LPS诱导RAW264.7细胞分泌IL‑6。100μM给药组中化合物1、8～9、24～ 26、15、22～23、26与模型组比较时能够显著抑制细胞分泌TNF‑α的含量(P<0.001)。 [0194] 1.4对LPS刺激巨噬细胞释放IL‑6含量的测定：选取增值率超过70％的23个化合物1、3～5、6、7～11、13、15、22～27、29～33、36，分别在10,30,100μM浓度时测定化合物抑制LPS诱导RAW264.7细胞产生IL‑6含量的实验，如图16‑图18所示，模型组和正常组比较时有极显著性差异(P<0.001)，模型组构建成功，说明LPS能够诱导RAW264.7细胞大量产生IL‑6； 地塞米松组与模型组比较时具有极显著性差异(P<0.001)，说明地塞米松能够非常明显地抑制LPS诱导RAW264.7细胞分泌IL‑6。100μM给药组中化合物1、3～4、7、9～10、15、22～24、 26与模型组比较时能够显著抑制细胞分泌IL‑6的含量(P<0.001)。 [0195] 2、化合物(1、9、23、24)对败血症小鼠死亡率、肝功指标进行活性筛选[0196] 2.1建立动物模型：模型对照组的5只小鼠24h死亡率是100％，说明败血症性肾衰竭小鼠模型造模成功。选择在高剂量(50mg/kg)下，对小鼠48h存活率较高的化合物1、9、23、24进一步观察在低剂量(50mg/kg、25mg/kg和10mg/kg)下，对小鼠48h存活率的影响，发现化合物23在中剂量25mg/kg时，仍对败血症性肝损伤小鼠48h存活率达到40％，如图19所示。 [0197] 2.2肝损伤指标：在化合物23的高剂量组(E)小鼠肝脏组织切片在光镜下可见炎性肝细胞明显减少，肝细胞脂肪变性明显好转，正常肝细胞数目增多；小剂量组(D)效果不明显，如图20所示。 [0198] 实验结果如图21‑图23所示，化合物23能显著不仅降低了败血症肝损伤小鼠死亡率，降低了小鼠血清AST、ALT、TNF‑α和NO含量，具有显著的肝保护作用；同时升高了小鼠肝组织SOD活性和降低了MDA的含量，提示具有明显的抗氧化作用。 [0199] 在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。 |
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