[0001] 本发明属于生物医药技术领域，具体为基于偶氮还原酶激活的CDDO‑Me/Ozanimod共前药及其制备方法和应用。

[0002] 炎症性肠病(IBD)是由克罗恩病和溃疡性结肠炎组成的慢性、进行性、不可治愈的肠道疾病，起源于遗传易感个体对环境因素的肠黏膜免疫反应失衡。目前，年轻人中免疫介导性的IBD患病率稳步上升，这与快节奏的生活、高脂肪食物的摄入、不规律的饮食以及工作或学校的巨大压力长期以来对他们的身心健康造成了损害有关。因此，临床迫切需要对IBD的早期诊断和治疗进行研究。

[0003] 齐墩果酸衍生物2‑腈基‑3,12‑二氧代齐墩果酸‑1,9(11)‑二烯‑28‑羧酸甲酯(CDDO‑Me)是一种抗炎和抗氧化剂，已被用于抑制和治疗慢性疾病，如胃肠道、心血管、肝脏、神经退行性疾病、肾脏疾病等，然而，高剂量的CDDO‑Me显著增加了不良反应，尤其是心力衰竭的风险。目前，人们普遍认为CDDO‑Me的A环α‑氰基‑α，β‑不饱和酮片段(CUK)具有强亲电性，是CDDO‑Me引起心脏副作用的原因。因此，本发明设想通过引入亲核基团来掩盖CUK片段的亲电性，减少其副作用。Ozanimod是一种口服的鞘氨醇1‑磷酸(S1P)受体调节剂，已被FDA批准用于治疗活动性继发性进行性疾病，特别是中重度活动性克罗恩病和结肠炎。尽管S1P在炎症组织中过度表达，但S1P在其他正常器官或组织中也有表达，包括心、脑、肝和胃。在正常组织中，Ozanimod对SIP的不良调节作用与Ozanimod的高血压、心脏传导阻滞、心动过缓和黄斑水肿等不良反应有关。鉴于此，可以采用前药策略，增强Ozanimod在结肠炎部位的优先分布，从而减少副作用。

[0004] 荧光成像已成为医药领域的研究热点之一，通常将选择性成像与治疗合二为一，提高诊疗效率，减轻患者痛苦。同时有助于药物在靶部位的可视化分布及释放，实现治疗效果的实时监控及个体化给药。同时，偶氮还原酶主要由肠道菌群产生，IBD伴偶氮还原酶水平异常升高，是结肠炎的理想生物标志物。因此，开发偶氮还原酶激活的诊疗共前药具有良好的应用前景。

[0005] 本发明的目的在于提供基于偶氮还原酶激活的CDDO‑Me/Ozanimod共前药及其制备方法和应用，以解决上述背景技术中提出的问题。

[0006] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：基于偶氮还原酶激活的CDDO‑Me/Ozanimod共前药，该共前药具有通式I所示结构：

[0007]

[0008] 本发明还提供了基于偶氮还原酶激活的CDDO‑Me/Ozanimod共前药制备方法，包括如下步骤：

[0009] S1.将1,9‑二甲基‑6‑硝基‑9H‑吡啶并[3,4‑b]吲哚‑3‑甲醛(1)与碘化1,4‑二甲基喹啉嗡(2)缩合反应得到化合物3，接着经过铁粉还原得到化合物4；

[0010] S2.4‑硝基苯甲醇(7)通过锌粉还原，FeCl3·6H2O氧化得到化合物8；

[0011] S3.化合物4与化合物8在醋酸催化下生成化合物5，接着在CBr4和PPh3作用下发生Appel反应得到化合物6；

[0012] S4.CDDO‑Me与Ozanimod经/K2CO3的DMF溶液中反应得到中间体11，接着中间体11与化合物6经K2CO3的DMF溶液条件下醚化反应得到化合物Ⅰ。

[0013] 合成路线如下所示：

[0014]

[0015] 本发明还提供了上述基于偶氮还原酶激活的CDDO‑Me/Ozanimod共前药在制备具有偶氮还原酶激活响应的结肠炎选择性近红外荧光成像试剂中的应用。

[0016] 本发明还提供了上述基于偶氮还原酶激活的CDDO‑Me/Ozanimod共前药在制备对结肠炎具有治疗作用的试剂中的应用。

[0017] 本发明还提供了上述的CDDO‑Me/Ozanimod共前药在制备用于监测原药CDDO‑Me和Ozanimod在体内释放的试剂中的应用。该CDDO‑Me/Ozanimod共前药可实现CDDO‑Me和Ozanimod原药在体内可视化释放和动态分布的监测。

[0018] 本发明还提供了上述基于偶氮还原酶激活的CDDO‑Me/Ozanimod共前药在制备具有偶氮还原酶激活响应的结肠炎选择性药物释放试剂中的应用。

[0019] 本发明还提供了上述的CDDO‑Me/Ozanimod共前药在制备具有发挥双原药CDDO‑Me和Ozanimod协同抗炎作用的试剂中的应用。

[0020] 本发明还提供了上述的CDDO‑Me/Ozanimod共前药在在制备用于实时监测结肠炎治疗效果的试剂中的应用。该CDDO‑Me/Ozanimod共前药可实现对体内结肠炎治疗效果的实时监控作用的应用。

[0021] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明采用了共前药策略，结合酶响应的荧光片段和药物释放特点，设计合成了基于偶氮还原酶激活的CDDO‑Me/Ozanimod诊疗共前药I，本发明利用Ozanimod的羟基与CDDO‑Me的缺电子CUK偶联，并能够在结肠炎组织靶部位利用偶氮还原酶选择性降解本发明化合物中偶氮基团，经1，6消除反应释放出β‑咔啉喹啉鎓荧光探针和双原药CDDO‑Me、Ozanimod，不仅发挥双原药CDDO‑Me和Ozanimod协同高效的抗炎作用，而且可以减少原药对其他组织的副作用；另一方面利用β‑咔啉喹啉鎓荧光探针发挥对结肠炎部位的成像诊断作用，同时监测原药CDDO‑Me和Ozanimod在体内释放，后期可监测结肠炎治疗效果，实现对结肠炎的诊断、疗效监控和双药协同治疗的作用。附图说明

[0022] 图1本发明化合物在偶氮还原酶响应的荧光光谱数据图；

[0023] 图2本发明化合物偶氮还原酶特异性响应的荧光数据图；

[0024] 图3本发明化合物体外偶氮还原酶响应的CDDO‑Me和Ozanimod原药释放图；

[0025] 图4本发明化合物在结肠炎细胞模型中成像示意图；

[0026] 图5本发明化合物在体内结肠炎模型中荧光成像图；

[0027] 图6‑7本发明化合物体内抗结肠炎能力数据图。

[0028] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0029] 实施例1：4‑((((E)‑4‑(E)‑2‑(6‑(E)‑(4‑((((4aR,6aS,6aS)6aS,6bR,8aS,12aS,12bR,14bR,14bS)‑2‑氰基‑1‑(2‑(((S)‑4‑(5‑(3‑氰基‑4‑异丙氧基苯基)‑1,2,4‑恶二唑‑
3‑基)‑2,2,4‑恶二唑‑3基)‑2,3‑二氢‑1H‑二氢‑1H茚‑1‑基)乙氧基)‑8a‑(甲氧羰基)‑4,4,
6a,6a,6ba,11,11,11,14b‑庚甲基‑甲基‑甲基‑1‑氧代‑1,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,
11,12,12a,12b,13,14b‑十八氢丙烷‑3‑基)氧基)甲基)苯基)二氮烯基)‑1,9‑二甲基‑9H‑吡啶并[3,4‑b]吲哚‑3‑基)乙烯基)‑1‑甲基喹啉‑1‑碘盐(Ⅰ)

[0030] S1.化合物3的制备

[0031] 化合物3：(E)‑4‑(2‑(1,9‑二甲基‑6‑硝基‑9H‑吡啶并[3,4‑b]吲哚‑3‑基)乙烯基)‑1‑甲基喹啉‑1‑碘盐

[0032] 将1,9‑二甲基‑6‑硝基‑9H‑吡啶并[3,4‑b]吲哚‑3‑甲醛(1)(538mg，2.0mmol)和碘化1,4‑二甲基喹啉嗡(2)(587.56mg,2.0mmol)加入单口瓶中，用无水乙醇(10mL)溶解，随后加入1‑2滴哌啶，85℃回流12h。经TLC监测反应结束后，抽滤，再次重结晶纯化得到化合物3，1
产率79％。H NMR(DMSO‑d6,400MHz)δ9.36(d,J＝6.5Hz,1H,ArH),9.30(d,J＝2.3Hz,1H,ArH),8.92(d,J＝8.1Hz,1H,ArH),8.65(m,1H,ArH),8.49(dd,J＝9.3,2.5Hz,2H,2ArH),
8.32(d,J＝7.8Hz,1H,ArH),8.13(d,J＝7.6Hz,1H,ArH),7.97(s,1H,ArH),7.71(dd,J＝
7.7,1.6Hz,1H,CH＝C),7.48(m,1H,CH＝C),4.57(s,3H,CH3),4.30(s,3H,CH3),3.17(s,3H,CH3).

[0033] S2.化合物4的制备

[0034] 化合物4：(E)‑4‑(2‑(6‑氨基‑1,9‑二甲基‑9H‑吡啶并[3,4‑b]吲哚‑3‑基)乙烯基)‑1‑甲基喹啉‑1‑碘盐

[0035] 将化合物3(580mg，1.7mmol)用乙醇溶解后，向反应体系中加入3g铁粉和4g氯化1
铵，80℃反应0.5h。反应完成后将反应液趁热过滤，旋干得到化合物4，产率71.2％。HNMR(DMSO‑d6,400MHz)δ9.36(d,J＝6.5Hz,1H,ArH),9.30(d,J＝2.3Hz,1H,ArH),8.92(d,J＝
8.1Hz,1H,ArH),8.65(m,1H,ArH),8.49(dd,J＝9.3,2.5Hz,2H,2ArH),8.32(d,J＝7.8Hz,
1H,ArH),8.13(d,J＝7.6Hz,1H,ArH),7.97(s,1H,ArH),7.71(dd,J＝7.7,1.6Hz,1H,CH＝C),7.48(m,1H,CH＝C),4.57(s,3H,CH3),4.47(s,2H,NH2),4.30(s,3H,CH3),3.17(s,3H,CH3).

[0036] S3.化合物8的制备

[0037] 化合物8：(4‑亚硝基苯基)甲醇

[0038] 向4‑硝基苄醇(3.5g,21.0mmol)的40mL乙醇溶液中加入氯化铵(1.6g,29.4mmol)和锌粉(4.1g,63.0mmol)。将反应混合物在室温搅拌30分钟。反应后，滤除不溶物。在‑5℃下将剩余溶液逐滴加入六水合氯化铁(6.8g，25.2mmol)在20mL水和8mL乙醇中的溶液中。保持温度低于‑5℃，将反应混合物再搅拌30分钟。所得溶液用盐水稀释并用DCM萃取。有机层用水洗涤，用硫酸镁干燥，减压除去有机溶剂。粗产物无需纯化即可获得化合物8。

[0039] S4.化合物5的制备

[0040] 化合物5：4‑((E)‑2‑(6‑((E)‑(4‑(羟甲基)苯基)二氮烯基)‑1,9‑二甲基‑9H‑吡啶并[3,4‑b]吲哚‑3‑基)乙烯基)‑1‑甲基喹啉‑1‑碘盐

[0041] 将化合物4(2g，3.96mmol)和化合物8(0.96g，7.92mmol)用5mL乙醇溶解，接着加入5mL醋酸，室温反应12h。待反应结束后，减压浓缩，柱层析分离(DCM：MeOH＝50：1，v/v)，获得
1
黄色固体为化合物5，产率65.5％。H NMR(DMSO‑d6,400MHz)δ9.34(m,1H,ArH),8.92(m,2H,
2ArH),8.80(s,1H,ArH),8.59(m,1H,ArH),8.51(d,J＝15.4Hz,1H,ArH),8.44(d,J＝8.3Hz,
1H,ArH),8.28(dd,J＝14.4,6.2Hz,2H,2ArH),8.22(m,1H,ArH),8.17(m,2H,2ArH),8.12(s,
1H,CH＝C),7.99(m,2H,2ArH),7.93(d,J＝9.1Hz,1H,CH＝C),5.27(s,1H,OH),4.54(s,3H,CH3),4.27(s,2H,CH2),3.92(s,3H,CH3),3.15(s,3H,CH3).

[0042] S5.化合物6的制备

[0043] 化合物6：4‑((E)‑2‑(6‑((E)‑(4‑(溴甲基)苯基)二氮烯基)‑1,9‑二甲基‑9H‑吡啶并[3,4‑b]吲哚‑3‑基)乙烯基)‑1‑甲基喹啉‑1‑碘盐

[0044] 将化合物5(1.25g，2.0mmol)和CBr4(1.35g，4mmol)用无水(10mL)THF溶解，N2保护，室温搅拌1h，接着加入PPh3(1.1g，4mmol)，继续搅拌5h。待反应完毕后，将反应液用DCM(10mL)稀释后，用盐水(3×10mL)洗涤溶液，并将有机层经Na2SO4干燥并浓缩，残留物经硅胶1
柱层析纯化(DCM：MeOH＝100：1，v/v)，得到化合物6，产率71.0％。H NMR(DMSO‑d6,400MHz)δ
9.34(m,1H,ArH),8.92(m,2H,2ArH),8.80(s,1H,ArH),8.59(m,1H,ArH),8.51(d,J＝
15.4Hz,1H,ArH),8.44(d,J＝8.3Hz,1H,ArH),8.28(dd,J＝14.4,6.2Hz,2H,2ArH),8.22(m,
1H,ArH),8.17(m,2H,2ArH),8.12(s,1H,CH＝C),7.99(m,2H,2ArH),7.93(d,J＝9.1Hz,1H,CH＝C),4.54(s,3H,CH3),4.27(s,2H,CH2),3.92(s,3H,CH3),3.15(s,3H,CH3).ESI‑MS(m/+
z):calcd for C32H27N5Br:560.1444,found 560.1450.

[0045] S6.化合物Ⅰ的制备

[0046] 4‑((((E)‑4‑(E)‑2‑(6‑(E)‑(4‑((((4aR,6aS,6aS)6aS,6bR,8aS,12aS,12bR,14bR,14bS)‑2‑氰基‑1‑(2‑(((S)‑4‑(5‑(3‑氰基‑4‑异丙氧基苯基)‑1,2,4‑恶二唑‑3‑基)‑
2,2,4‑恶二唑‑3基)‑2,3‑二氢‑1H‑二氢‑1H茚‑1‑基)乙氧基)‑8a‑(甲氧羰基)‑4,4,6a,6a,
6ba,11,11,11,14b‑庚甲基‑甲基‑甲基‑1‑氧代‑1,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,12,
12a,12b,13,14b‑十八氢丙烷‑3‑基)氧基)甲基)苯基)二氮烯基)‑1,9‑二甲基‑9H‑吡啶并[3,4‑b]吲哚‑3‑基)乙烯基)‑1‑甲基喹啉‑1‑碘盐(Ⅰ)

[0047] 将CDDO‑Me(100mg，0.198mmol)用无水DMF(4mL)溶解，再加入K2CO3(54.7mg，0.396mmol)和Ozanimod(80.1mg，0.198mmol)在N2保护0℃下反应12h。然后在剧烈搅拌下将中间体6(187.4mg，0.30mmol)用DMF溶解后滴加到混合液中，反应2h。待反应完毕后，用CH2Cl2(60mL)萃取，并将有机层经Na2SO4干燥并浓缩，柱色谱使用二氯甲烷/甲醇(20:1，v/
1
v)作为洗脱剂，纯化得到黄色固体Ⅰ，产率48.0％。H NMR(CDCl3,400MHz)δ8.57(d,J＝
8.1Hz,1H,ArH),8.36(m,2H,2ArH),8.27(s,1H,ArH),8.18(s,1H,ArH),8.05(s,1H,ArH),
8.01(m,2H,2ArH),7.71(q,J＝4.6Hz,3H,3ArH),7.55(d,J＝8.3Hz,2H,2ArH),7.33(d,J＝
8.2Hz,2H,2ArH),7.09(m,4H,4ArH),6.84(m,2H,2ArH),6.72(dd,J＝11.1,5.3Hz,2H,
2ArH),6.50(s,1H,NH),5.77(s,1H,CH＝C),5.49(d,J＝11.0Hz,1H,CH),5.42(d,J＝
11.1Hz,1H,CH),4.97(d,J＝8.1Hz,1H,CH),4.80(s,2H,CH2),4.47(s,3H,CH3),4.01(s,1H,CH),3.80(s,3H,OCH3),3.69(s,3H,CH3),3.47(s,3H,CH3),3.10(m,1H,CH),2.92(d,J＝
4.7Hz,1H,CH),1.99(dd,J＝9.9,4.4Hz,1H,CH),1.88(dt,J＝13.6,4.3Hz,2H,CH2),1.78(m,1H,CH),1.70(m,9H,4CH2,CH),1.44(m,1H,CH),1.34(m,1H,CH),1.25(d,J＝7.1Hz,6H,
13
2CH3),1.13(d,J＝10.1Hz,7H,2CH3,CH),1.07(m,21H,CH3,9CH2). C NMR(CDCl3,101MHz)δ
199.9,178.4,176.8,173.8,173.0,149.5,147.4,146.6,138.2,131.0,129.1,124.4,
121.2,119.3,83.5,83.2,74.0,60.8,58.2,53.9,51.9,49.8,47.4,45.4,44.2,43.82,
42.56,41.58,40.65,36.0,34.5,33.3,32.9,31.6,30.7,28.3,25.0,23.9,23.7,23.4,+
23.1,22.7,21.4,21.3,21.3,21.0,20.7,19.3,18.5.ESI‑MS(m/z):calcd for C87H93N10O7:
1389.7223,found 1389.7276.

[0048] 实施例2：本发明化合物基于偶氮还原酶激活响应的荧光光谱测试

[0049] 将本发明化合物Ⅰ溶于含有5％(v/v)DMSO的去离子水中，加入不同浓度偶氮还原酶(0‑0.40μg/mL)，并在37℃下孵育。用荧光光谱仪(RF‑5301PC)记录发射光谱。

[0050] 结果显示，本发明化合物Ⅰ在650nm激发时显示出相对较弱的荧光。然而，在用偶氮还原酶处理后，在650nm处立即观察到高达11倍的荧光响应。此外，荧光滴定分析显示荧光强度呈剂量依赖性增加，当使用0.4μg/mL偶氮还原酶时达到最大值(图1A)。在这种情况下，荧光强度与偶氮还原酶浓度在0到0.4μg/mL之间具有良好的线性相关性(图1B)。由此可知本发明化合物在低浓度下具有检测和量化偶氮还原酶的存在的用途。

[0051] 实施例3：本发明化合物偶氮还原酶特异性响应的荧光测试

[0052] 将本发明化合物Ⅰ溶解在脱氧DMSO中。在试管中，混合4mL PBS(pH 7.4)，然后加入+ 2+偶氮还原酶或含各种生物分析物的溶液(K、Zn 、LAP、L‑苯丙氨酸、L‑丝氨酸、NQO1、VcNa、H2O2和偶氮还原酶(AzoR))。用PBS将最终体积调整为5mL。在37℃下孵育90分钟后，将配置的溶液转移到1cm长的石英池中以测量。

[0053] 如图2所示，与其他竞争性分析物(K+、Zn2+、LAP、L‑苯丙氨酸、L‑丝氨酸、NQO1、VcNa、H2O2、AzoR)相比，本发明化合物Ⅰ对偶氮还原酶具有优异的选择性。

[0054] 实施例4：本发明化合物体外偶氮还原酶响应CDDO‑Me和Ozanimod原药释放测试[0055] 将本发明化合物Ⅰ溶于含有5％(v/v)DMSO的去离子水中，然后将其与偶氮还原酶在37℃避光条件下孵育。在不同时间点(0、1、2、4、6、8和12h)用高效液相色谱法监测CDDO‑Me和Ozanimod原药释放情况。

[0056] 结果表明本发明化合物Ⅰ本身在20.9min有一个信号峰值。与偶氮还原酶反应后，本发明化合物Ⅰ的信号峰降低，在19.2min和7.8min分别出现一个新峰，其中7.8min的峰与CDDO‑Me的保留时间相同，另外19.2min的峰与Ozanimod的保留时间相同(图3)。因此，本发明化合物Ⅰ可以在靶部位有效的释放药物分子，发挥对结肠炎的治疗诊断功能。

[0057] 实施例5：本发明化合物对结肠炎细胞模型选择性荧光成像测试

[0058] 通过共焦显微图像评估RAW 264.7的细胞内荧光活化和细胞选择性。将RAW 264.75
细胞(2×10 细胞/孔)接种到35mm玻璃底细胞培养皿中，在细胞培养箱中生长12h后，将RAW264.7细胞洗涤并在新鲜培养基中用脂多糖(LPS，10μg/mL)在37℃下处理12h。然后将所有细胞用PBS溶液洗涤两次，并在DMEM培养基中与化合物Ⅰ(20μM)一起孵育1、2和4h。此后，使用具有40X物镜的Leica TCS SP5LSM共聚焦显微镜记录荧光图像。

[0059] 结果表明当RAW 264.7细胞与本发明化合物Ⅰ一起培养时，在红色通道中发现荧光，而使用PBS孵育时，红色荧光很弱(图4A)。随着时间的延长，荧光强度逐渐增加，并在4h达到最大值，相比于PBS组其荧光值提高了9倍左右(图4B)。这意味着本发明化合物可以检测结肠炎细胞中的偶氮还原酶，并释放出荧光用于结肠炎的诊断。

[0060] 实施例6：本发明化合物的体内荧光成像测试

[0061] 为评估本发明化合物Ⅰ的体内荧光成像，将雌性BALB/c小鼠分为2组(n＝3)。对于葡聚糖硫酸钠盐(DSS)组，给小鼠喂食3.5％DSS溶液7天，对照组饮用蒸馏水。在第7天，给所有小鼠静脉注射本发明化合物Ⅰ(200μM，50μL)。使用IVIS Lumina成像系统捕获全身荧光图像。最后，小鼠被安乐死，并立即收集它们的心肝脾肺肾和肠道，在IVIS Lumina系统上进行离体荧光成像。

[0062] 实验结果表明IBD小鼠的荧光强度随时间逐渐增强。如图5A和5B所示，DSS诱导的IBD小鼠在注射后1h表现出强烈的NIR荧光，并保持在高强度水平至少12h。此外，还收集了小鼠其他主要器官(心、肝、脾、肺和肾)。除结肠外，其他器官没有明显的荧光信号(图5C和5D)。这些结果表明偶氮还原酶主要分布在结肠炎症部位，可实现对体内结肠炎治疗效果的实时监控作用，作为研究结肠炎疾病的诊断试剂。

[0063] 实施例7：本发明化合物的体内抗结肠炎能力评价

[0064] 为了评估本发明化合物Ⅰ对小鼠结肠炎模型的治疗效果，通过测量体重、评估结肠长度和组织H&E染色来实现。实验共分为七组(a.PBS；b.DSS；c.DSS+Ozanimod；d.DSS+CDDO‑Me；e.DSS+Ozanimod+CDDO‑Me；f.DSS+0.74μmol/LⅠ；g.DSS+1.48μmol/LⅠ)。

[0065] 首先，DSS组从第二天开始小鼠体重出现明显的下降，在第7天达到峰值，表明小鼠DSS结肠炎模型的成功构建(图6A)。其次，阳性对照组、药物组和空白组的疾病发生指标、小鼠体重、结肠长度存在显著差异。模型组结肠损伤后发生变化，DSS组结肠长度(4.5±0.23cm)明显短于PBS组(8.2±0.41cm)，而经过本发明化合物Ⅰ治疗的小鼠体重增加(8.1±
0.2g)和结肠长度增长(2.2±0.25cm)较为显著(图6B‑6D)，同时随着本发明化合物Ⅰ浓度的增加治疗效果更明显。然后，通过苏木精和伊红(H&E)染色评估各组的结肠组织。如图6E所示，PBS组结肠黏膜完整，细胞排列整齐。DSS组结肠黏膜受损，固有层可见炎性细胞。治疗组中上述症状消失，组织形态恢复正常。这些结果有力地证明了本发明化合物Ⅰ对IBD小鼠具有明显的抗结肠炎能力。

[0066] 最后，通过酶联免疫吸附试验测定所有组小鼠结肠组织中的TNF‑α、IL‑6和钙粪蛋白水平。将冷冻的远端结肠标本用含有蛋白酶抑制剂混合物的磷酸钾缓冲液(pH 6.0)匀浆，并在2500rpm和4℃下离心5分钟。收集上清液并在10000rpm和4℃下离心10分钟。通过ELISA分析最终样品以量化TNF‑α、IL‑6和钙粪蛋白水平。ELISA试剂盒根据制造商的说明，使用BCA试剂盒(Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)通过Lowery方法测定总蛋白质浓度。

[0067] 如图7所示，观察到DSS组中TNF‑α和IL‑6以及钙卫蛋白水平明显升高，而对照组升高的水平基本可忽略。与DSS组相比，药物治疗组都显著降低了小鼠血清中的细胞因子水平。其中用化合物Ⅰ治疗组显示小鼠血清中TNF‑α和IL‑6以及钙卫蛋白产生的剂量依赖性降低，且治疗效果优于单独CDDO‑Me和Ozanimod组。

[0068] 综上所述，本发明的基于偶氮还原酶特异性响应的CDDO‑Me/Ozanimod共前药，获得了在肠道中偶氮还原酶响应的近红外荧光成像，在结肠炎组织中选择性释放出原药，发挥肠道部位和原药的选择性荧光成像示踪和协同高效结肠炎治疗作用。