抑制缺氧诱导因子1α的CDDO喹啉衍生物及其制备方法与应用 |
|||||||
| 申请号 | CN202410002769.0 | 申请日 | 2024-01-02 | 公开(公告)号 | CN117964676A | 公开(公告)日 | 2024-05-03 |
| 申请人 | 中国药科大学; | 发明人 | 陈莉; 姜丽婷; 李娜; 李丽婧; 金雪琼; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了结构如式Ⅲ所示的CDDO喹啉衍 生物 ，R选自 R1选自 R2选自n选自2～5的整数。药理实验研究表明，本发明CDDO喹啉衍生物能够减少 肿瘤 细胞HIF‑1α蛋白的含量，可以在低 氧 下抑制肿瘤 细胞增殖 ，对多种肿瘤细胞的增殖抑制作用显著优于CDDO及CDDO‑Me，本发明公开了所述的CDDO喹啉衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。 | ||||||
| 权利要求 | 1.结构如式Ⅲ所示的CDDO喹啉衍生物： |
||||||
| 说明书全文 | 抑制缺氧诱导因子1α的CDDO喹啉衍生物及其制备方法与应用技术领域[0001] 本发明属于药物化学领域，涉及CDDO喹啉衍生物及其制备方法与应用，具体涉及抑制缺氧诱导因子1α的CDDO喹啉衍生物及其制备方法与应用。 背景技术[0002] 齐墩果酸(OA)是一种广泛存在于植物中的五环三萜类天然产物，具有微弱的抗肿瘤、抗炎、肝脏保护等多种生物活性。针对OA进行研究改造，获得了一系列抗肿瘤活性显著提升的衍生物，其中又以CDDOs系列较为突出，包括CDDO、CDDO‑Me(Bardoxolone methyl)及CDDO‑Im等。 [0003] CDDO‑Me是CDDO衍生物中的明星分子，具有很强的抗肿瘤活性，曾数次进入治疗胰腺癌、黑色素瘤等临床实验中。因此CDDO作为母体化合物设计衍生物具有较大的前景。 [0004] 实体肿瘤常处于缺氧状态(氧气含量小于＜21％)，需要适应缺氧环境以维持其快速生长。缺氧诱导因子(hypoxia‑inducible factor，HIF)作为一种转录因子，是细胞缺氧反应的主要调节因子。在缺氧条件下，HIF‑1α可以稳定存在，通过HIF‑1对下游效应基因的转录激活作用，肿瘤组织可以激发和发展一系列错综复杂的基本生物学机制来应对缺氧应激并促进生存，如血管生成、糖酵解、造血、转移、侵袭、化疗耐药和放疗耐药。因此将以CDDO为先导化合物，设计一系类化合物抑制HIF‑1α蛋白，进而抑制肿瘤的发展。 发明内容[0005] 本发明的目的是以CDDO为先导物进行结构修饰改造，提供了一种CDDO喹啉衍生物，药理研究表明，本发明CDDO衍生物的抗肿瘤活性优良，减少肿瘤细胞HIF‑1α蛋白的含量。 [0006] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的： [0007] 结构如式Ⅲ所示的CDDO喹啉衍生物： [0008] [0009] 其中，R选自 R1选自R2选自 n选自2～5的整数。 [0010] 优选的，R选自 R1选自R2选自 n选自2～5的整数；但不包 括：R选自 R1选自 n＝5。 [0011] 更优选的，R选自 R1选自R2选自 n选自2～5的整数；但不包 括：R选自 R1选自 n＝5。 [0012] 作为本发明CDDO喹啉衍生物的其中一项技术方案，CDDO喹啉衍生物类的结构如式Ⅰ所示： [0013] [0014] 其中，R1选自 n选自2～5的整数。 [0015] 优选的，R1选自 n选自2～5的整数；但不包括：R选自 R1选自 n＝5。 [0016] 作为本发明CDDO喹啉衍生物的其中一项技术方案，CDDO喹啉衍生物类的结构如式Ⅱ所示： [0017] [0018] 其中，R2选自 n选自2～5的整数。 [0019] 具体的，本发明所述的CDDO喹啉衍生物选自结构如下所示的化合物： [0020] [0021] [0022] 本发明的另一个目的在于提供一种所述的CDDO衍生物的制备方法， [0023] 当R选自 时，合成路线如下： [0024] [0025] 其中，R1、n如前所述；R1‑OH选自 [0026] 包括以下步骤： [0027] 步骤(1)、以碳酸钾为催化剂，N,N‑二甲基甲酰胺(DMF)为反应溶剂，式R1‑OH所示的喹啉羟基类化合物与式 所示的二溴代烷室温反应得到中间体d；其中，所述的喹啉羟基类化合物与二溴代烷的摩尔比为1:3～1:5；二溴代烷与碳酸钾的体积比为1:1～1:1.5； [0028] 步骤(2)、以碳酸钾、碘化钾为催化剂、N,N‑二甲基甲酰胺(DMF)为反应溶剂，中间体d与CDDO在常温下反应得到CDDO喹啉衍生物；其中，所述的CDDO与中间体d的摩尔比为1:1.1～1:1.5；所述的CDDO与碳酸钾的摩尔比为1:4～1:6；所述的CDDO与碘化钾的摩尔比为 1:0.3～1:0.5。 [0029] 当R选自 时，合成路线如下： [0030] [0031] 其中，R1、n如前所述； 选自 [0032] 包括以下步骤： [0033] 步骤(1)、以碳酸钾为催化剂，N,N‑二甲基甲酰胺(DMF)为反应溶剂，式 所示的喹啉羟基类化合物与式 所示的二溴代烷室温反应得到中间体h；其中，所述的喹啉羧基类化合物与二溴代烷的摩尔比为1:3～1:5；二溴代烷与碳酸钾的体积比为1:1～1:1.5； [0034] 步骤(2)、以碳酸钾、碘化钾为催化剂、N,N‑二甲基甲酰胺(DMF)为反应溶剂，中间体d与CDDO在常温下反应得到CDDO喹啉衍生物；其中，所述的CDDO与中间体h的摩尔比为1:1.1～1:1.3；所述的CDDO与碳酸钾的摩尔比为1:3～1:5；所述的CDDO与碘化钾的摩尔比为 1:0.3～1:0.5。 [0035] 本发明的另一个目的在于提供所述的CDDO喹啉衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。 [0037] 优选的，所述的应用为所述的CDDO喹啉衍生物在制备通过抑制HIF‑1α蛋白抗肿瘤药物中的应用。 [0038] 所述的肿瘤为黑色素瘤、肝癌、乳腺癌、胃癌。 [0039] 本发明的另一个目的在于提供结构如下所示的CDDO喹啉衍生物在制备抗肝癌药物中的应用： [0040] [0041] 本发明的另一个目的在于提供一种药物组合物，它以CDDO喹啉衍生物为有效成分，辅以药学上可接受的载体，制成任何药学上可接受的剂型。 [0042] 所述的CDDO喹啉衍生物可以单独或与一种或一种以上药用载体制成不同剂型。 [0043] 所述的剂型选自片剂、胶囊、滴丸、颗粒、粉剂、锭剂、水性或油性悬浮剂、注射剂、贴剂、纳米制剂，以供临床口服、注射或局部用药。在这些不同制剂中，本发明CDDO喹啉衍生物的含量可以是0.1％‑99.9％。 [0044] 本发明的有益效果： [0045] 本发明CDDO喹啉衍生物的结构新颖，其制备方法反应条件温和，所用试剂低毒，原料易得，后处理方便，产率较高。 [0046] 药理研究表明，本发明CDDO喹啉衍生物能够减少肿瘤细胞HIF‑1α蛋白的含量，对多种肿瘤细胞的增殖抑制作用显著优于CDDO。与CDDO和CDDO‑Me相比，本发明CDDO喹啉衍生物在低氧下对肿瘤细胞的抑制作用显著增强，毒性较CDDO减小。附图说明 [0047] 图1为化合物I‑7对B16‑F10细胞HIF‑1α蛋白含量水平免疫荧光结果。 [0048] 图2为化合物I‑7对B16‑F10细胞HIF‑1α蛋白含量免疫荧光柱状图。 [0049] 图3为化合物I‑7对B16‑F10细胞HIF‑1α、VEGF蛋白含量Western Bolt结果图。 [0050] 图4为化合物I‑7对B16‑F10细胞HIF‑1α蛋白含量Western Bolt柱状图。 [0051] 图5为化合物I‑7对B16‑F10细胞VEGF蛋白含量Western Bolt柱状图。 具体实施方式[0052] 为进一步阐明本发明，下面列举一系列实施例。这些实施例是例证性的，不应当理解为对本发明的限制。 [0053] 实施例1 [0054] 中间体A1的合成 [0055] [0056] 在一单颈瓶中，加入3‑羟基喹啉(2.06mmol，0.30g)、碳酸钾0.82g(6.18mmol)、1,2‑二溴乙烷0.73mL(8.24mmol)，加入10mL DMF溶解，室温反应，TLC监测反应。反应完成后，旋干有机相，经硅胶柱层析(洗脱剂为石油醚:乙酸乙酯＝10：1v:v)得到3‑(2‑溴乙氧基)喹啉(白色固体)0.21g，产率40.6％。 [0057] ESI‑MS：溴同位素特征峰249.9、251.9[M+H]+。 [0058] 化合物Ⅰ‑1的合成 [0059] [0060] 将0.10g(0.22mmol)CDOO溶于2mL DMF，加入0.091g碳酸钾(0.66mmol)，加入0.018g碘化钾(0.11mmol)，搅拌后，加入3‑(2‑溴乙氧基)喹啉0.060g(0.24mmol)，常温反应，直至TLC检测显示反应完毕，加入30mL乙酸乙酯稀释，水洗3次，取有机层，有机层饱和碳酸氢钠洗3次，饱和食盐水洗3次，无水硫酸钠干燥过夜。有机相旋干，经硅胶柱层析(洗脱剂为石油醚:乙酸乙酯＝3:1v:v)得到白色固体0.04g，产率27.4％。 [0061] ESI‑MS：663.3[M+H]+。 [0062] 1H NMR(400MHz,DMSO，TMS)，δppm：δ8.63(s,1H),8.54(d,J＝2.9Hz,1H),7.98‑7.93(m,1H),7.91‑7.86(m,1H),7.83(d,J＝2.9Hz,1H),7.63‑7.55(m,2H),6.20(s,1H), 4.59‑4.36(m,4H),2.89(d,J＝13.5Hz,1H),2.80(d,J＝4.7Hz,1H),1.81‑1.70(m,2H), 1.64‑1.47(m,6H),1.30(s,2H),1.26(s,5H),1.24(s,3H),1.14(s,3H),1.02(s,6H),0.89(s,3H),0.88(s,3H),0.86(s,3H). [0063] 实施例2 [0064] 中间体A2的合成 [0065] [0066] 以1,3‑二溴丙烷0.86mL(8.24mmol)，替换实施例1中1,2二溴乙烷得到3‑(3‑溴丙氧基)喹啉(化合物A2)0.25g，白色固体，产率45.7％。 [0067] ESI‑MS：溴同位素特征峰264.0、266.0[M+H]+。 [0068] 化合物Ⅰ‑2的合成 [0069] [0070] 参照实施例1化合物I‑1的制备方法，以等摩尔量化合物A2替换化合物A1，其他条件不变，得到目标化合物I‑2(白色固体)0.04g，产率26.8％。 [0071] ESI‑MS：677.3[M+H]+。 [0072] 1H NMR(400MHz,DMSO，TMS)，δppm：δ8.60(d,J＝2.9Hz,1H),7.97‑7.81(m,2H),7.66(s,1H),7.56(d,J＝6.0Hz,2H),7.41‑7.30(m,1H),6.05(d,J＝12.8Hz,1H),4.38‑4.12(m,4H),2.85(d,J＝13.2Hz,1H),2.69(d,J＝4.7Hz,1H),2.19(d,J＝8.7Hz,2H),1.63(d,J＝12.0Hz,2H),1.29(d,J＝1.8Hz,4H),1.23(d,J＝12.2Hz,9H),1.14(d,J＝2.3Hz,3H), 1.07(s,3H),0.98(d,J＝3.0Hz,3H),0.88(s,6H),0.84(d,J＝2.5Hz,6H). [0073] 实施例3 [0074] 中间体A3的合成 [0075] [0077] ESI‑MS：溴同位素特征峰278.0、280.0[M+H]+。 [0078] 化合物Ⅰ‑3的合成 [0079] [0080] 参照实施例1化合物I‑1的制备方法，以等摩尔量化合物A3替换化合物A1，其他条件不变，得到目标化合物I‑3(白色固体)0.05g，产率32.8％。 [0081] ESI‑MS：691.0[M+H]+。 [0082] 1H NMR(400MHz,DMSO，TMS)，δppm：δ8.62(d,J＝3.0Hz,2H),7.98‑7.91(m,1H),7.92‑7.85(m,1H),7.79(d,J＝2.9Hz,1H),7.62‑7.52(m,2H),6.22(s,1H),4.18(t,J＝ 6.1Hz,4H),2.87(d,J＝13.2Hz,1H),2.81(d,J＝4.8Hz,1H),1.99(s,1H),1.92‑1.78(m, 6H),1.71‑1.40(m,8H),1.34(s,3H),1.31‑1.22(m,4H),1.18(d,J＝1.5Hz,3H),1.15(s, 3H),1.03(s,3H),0.92(s,3H),0.87(s,3H),0.85(s,3H). [0083] 实施例4 [0084] 中间体A4的合成 [0085] [0086] 以1,5‑二溴戊烷1.12mL(8.24mmol)替换实施例1中1,2二溴乙烷得到3‑((5‑溴戊基)氧基)喹啉(化合物A4，白色固体)0.4g，产率66.2％。 [0087] ESI‑MS：溴同位素特征峰292.0、294.0[M+H]+。 [0088] 化合物Ⅰ‑4的合成 [0089] [0090] 参照实施例1化合物I‑1的制备方法，以等摩尔量化合物A4替换化合物A1，其他条件不变，得到目标化合物I‑4(白色固体)0.05g，产率32.2％。 [0091] ESI‑MS：705.4[M+H]+。 [0092] 1H NMR(400MHz,DMSO，TMS)，δppm：δ8.63(q,J＝2.9Hz,1H),8.57(s,1H),7.98‑7.92(m,1H),7.88(dt,J＝7.9,2.4Hz,1H),7.79‑7.70(m,1H),7.56(td,J＝6.4,3.7Hz,2H), 6.18(s,1H),4.25‑4.06(m,4H),2.87(d,J＝13.3Hz,1H),2.79(dd,J＝11.3,4.7Hz,1H), 1.86(dt,J＝14.6,6.6Hz,3H),1.77‑1.66(m,3H),1.61‑1.41(m,8H),1.30(d,J＝8.5Hz, 5H),1.27(s,3H),1.24(s,3H),1.18(s,3H),1.11(s,3H),0.98(s,2H),0.91(s,3H),0.90(s, 3H),0.87(s,3H). [0093] 实施例5 [0094] 中间体A5的合成 [0095] [0096] 以4‑羟基喹啉(2.06mmol，0.30g)替换实施例1中3‑羟基喹啉，其他条件不变，得到(化合物A5，白色固体)0.4g，产率77.7％。 [0097] ESI‑MS：溴同位素特征峰250.0、252.0[M+H]+。 [0098] 化合物Ⅰ‑5的合成 [0099] [0100] 参照实施例1化合物I‑1的制备方法，以等摩尔量化合物A5替换化合物A1，其他条件不变，得到目标化合物I‑5(白色固体)0.05g，产率34.3％。 [0101] ESI‑MS：663.3[M+H]+。 [0102] 1H NMR(400MHz,DMSO，TMS)，δppm：δ8.73(d,J＝5.2Hz,1H),8.02(dt,J＝8.4,1.9Hz,1H),7.95(d,J＝9.0Hz,1H),7.75(ddd,J＝8.4,6.8,1.5Hz,1H),7.55(ddt,J＝8.3, 6.9,1.6Hz,1H),7.08(d,J＝5.2Hz,1H),6.27(s,1H),5.10(s,1H),4.54(dt,J＝10.4, 4.9Hz,4H),2.91(d,J＝13.7Hz,1H),2.80(d,J＝4.8Hz,1H),1.99(p,J＝6.9Hz,1H),1.92‑ 1.83(m,1H),1.79‑1.70(m,2H),1.61(d,J＝13.8Hz,1H),1.45(s,2H),1.25(d,J＝10.2Hz, 7H),1.08(s,3H),1.03(s,3H),1.00(s,2H),0.90(s,3H),0.87(s,3H),0.86(s,3H),0.85(s, 3H). [0103] 实施例6 [0104] 中间体A6的合成 [0105] [0106] 以4‑羟基喹啉(2.06mmol，0.30g)替换实施例2中3‑羟基喹啉，其他条件不变，得到化合物A6(白色固体)0.3g，产率54.7％。 [0107] ESI‑MS：溴同位素特征峰264.0、266.0[M+H]+。 [0108] 化合物Ⅰ‑6的合成 [0109] [0110] 参照实施例1化合物I‑1的制备方法，以等摩尔量化合物A6替换化合物A1，其他条件不变，得到目标化合物I‑6(白色固体)0.04g，产率26.8％。 [0111] ESI‑MS：677.3[M+H]+。 [0112] 1H NMR(400MHz,DMSO，TMS)，δppm：δ8.68(d,J＝5.2Hz,1H),8.51(s,1H),8.10(dd,J＝8.5,1.5Hz,1H),7.90(d,J＝7.9Hz,1H),7.70(ddd,J＝8.5,6.9,1.5Hz,1H),7.52(ddd,J＝8.2,6.9,1.3Hz,1H),6.92(d,J＝5.2Hz,1H),6.06(s,1H),4.25(dtd,J＝15.9,9.0,5.2Hz,4H),2.76(d,J＝13.3Hz,1H),2.61(d,J＝4.7Hz,1H),2.29‑2.11(m,2H),1.87‑1.75(m,1H),1.70‑1.57(m,2H),1.52(d,J＝13.7Hz,1H),1.46‑1.12(m,10H),1.09(s,3H),1.07(s,3H),0.96(s,3H),0.81(s,4H),0.79(s,3H),0.76(s,3H),0.62(s,3H). [0113] 实施例7 [0114] 中间体A7的合成 [0115] [0116] 以4‑羟基喹啉(2.06mmol，0.30g)替换实施例3中3‑羟基喹啉，其他条件不变，得到化合物A7(白色固体)0.4g，产率69.6％。 [0117] ESI‑MS：溴同位素特征峰278.0、280.0[M+H]+。 [0118] 化合物Ⅰ‑7的合成 [0119] [0120] 参照实施例1化合物I‑1的制备方法，以等摩尔量化合物A7替换化合物A1，其他条件不变，得到目标化合物I‑7(白色固体)0.04g，产率26.3％。 [0121] ESI‑MS：691.4[M+H]+。 [0122] 1H NMR(400MHz,DMSO，TMS)，δppm：(400MHz,DMSO)δ8.72(d,J＝5.2Hz,1H),8.61(s,1H),8.14(dd,J＝8.3,1.5Hz,1H),7.95(d,J＝8.4Hz,1H),7.74(ddd,J＝8.4,6.8,1.5Hz,1H),7.56(ddd,J＝8.2,6.8,1.2Hz,1H),7.02(d,J＝5.2Hz,1H),6.20(s,1H),4.29(t,J＝6.1Hz,2H),4.21(q,J＝6.1Hz,2H),2.92‑2.83(m,1H),2.80(d,J＝4.8Hz,1H),1.94(q,J＝6.5Hz,2H),1.90‑1.62(m,6H),1.56(d,J＝9.5Hz,5H),1.31(s,4H),1.25(dd,J＝ 11.3,5.7Hz,3H),1.14(d,J＝8.0Hz,9H),1.04(s,3H),0.91(s,3H),0.88(s,3H),0.86(s, 3H). [0123] 实施例8 [0124] 化合物A8的合成 [0125] [0126] 以4‑羟基喹啉(2.06mmol，0.30g)替换实施例4中3‑羟基喹啉，其他条件不变，得到化合物A8(白色固体)0.50g，产率82.8％。 [0127] ESI‑MS：溴同位素特征峰292.0、294.0[M+H]+。 [0128] 化合物Ⅰ‑8的合成 [0129] [0130] 参照实施例1化合物I‑1的制备方法，以等摩尔量化合物A8替换化合物A1，其他条件不变，得到目标化合物I‑8(白色固体)0.05g，产率32.3％。 [0131] ESI‑MS：705.4[M+H]+。 [0132] 1H NMR(400MHz,DMSO，TMS)，δppm：δ8.72(d,J＝5.2Hz,1H),8.58(s,1H),8.14(dd,J＝8.4,1.5Hz,1H),7.94(dd,J＝8.5,1.2Hz,1H),7.73(ddd,J＝8.5,6.9,1.5Hz,1H),7.56(ddd,J＝8.3,6.8,1.2Hz,1H),7.00(d,J＝5.2Hz,1H),6.18(s,1H),4.23(td,J＝6.2,2.4Hz,2H),4.19‑4.05(m,2H),2.85(dt,J＝13.7,4.2Hz,1H),2.79(d,J＝4.8Hz,1H),1.96‑ 1.81(m,3H),1.72(ddd,J＝17.0,10.8,4.2Hz,4H),1.61(ddd,J＝17.0,11.1,4.2Hz,4H), 1.46(td,J＝20.3,6.9Hz,5H),1.26(s,3H),1.24‑1.15(m,3H),1.13(s,6H),1.08(s,2H), 1.00(s,3H),0.88(s,3H),0.86(s,3H),0.84(s,3H). [0133] 实施例9 [0134] 中间体A9的合成 [0135] [0136] 以6‑羟基喹啉(2.06mmol，0.30g)替换实施例1中3‑羟基喹啉，其他条件不变，得到化合物A9(白色固体)0.42g，产率81.2％。 [0137] ESI‑MS：溴同位素特征峰250.0、252.0[M+H]+。 [0138] 化合物Ⅰ‑9的合成 [0139] [0140] 参照实施例1化合物I‑1的制备方法，以等摩尔量化合物A9替换化合物A1，其他条件不变，得到目标化合物I‑8(白色固体)0.05g，产率34.3％。 [0141] ESI‑MS：663.3[M+H]+。 [0142] 1H NMR(400MHz,DMSO，TMS)，δppm：δ8.75(dd,J＝4.2,1.7Hz,1H),8.62(s,1H),8.25(dd,J＝8.5,1.7Hz,1H),7.94(d,J＝9.2Hz,1H),7.49(dd,J＝8.3,4.2Hz,1H),7.40(d,J＝2.7Hz,1H),7.30(dd,J＝9.2,2.8Hz,1H),6.19(s,1H),4.50(q,J＝3.9Hz,2H),4.37(t,J＝4.5Hz,2H),2.90(d,J＝13.5Hz,1H),2.80(d,J＝4.7Hz,1H),1.95‑1.83(m,1H),1.76(td,J＝13.4,5.3Hz,2H),1.60‑1.29(m,10H),1.24(s,5H),1.14(s,3H),1.02(s,6H),0.90(s, 3H),0.89(s,3H),0.86(s,3H). [0143] 实施例10 [0144] 中间体A10的合成 [0145] [0146] 以6‑羟基喹啉(2.06mmol，0.30g)替换实施例2中3‑羟基喹啉，其他条件不变，得到化合物A10(白色固体)0.32g，产率46.4％。 [0147] ESI‑MS：溴同位素特征峰264.0、265.0[M+H]+。 [0148] 化合物Ⅰ‑10的合成 [0149] [0150] 参照实施例1化合物I‑1的制备方法，以等摩尔量化合物A10替换化合物A1，其他条件不变，得到目标化合物I‑10(白色固体)0.05g，产率33.6％。 [0151] ESI‑MS：677.3[M+H]+。 [0152] 1H NMR(400MHz,DMSO，TMS)，δppm：δ8.75(dd,J＝4.2,1.7Hz,1H),8.52(s,1H),8.26(dd,J＝8.5,1.7Hz,1H),7.94(d,J＝9.2Hz,1H),7.50(dd,J＝8.3,4.2Hz,1H),7.39(dd,J＝9.1,2.8Hz,1H),7.33(d,J＝2.8Hz,1H),6.10(s,1H),4.38‑4.11(m,4H),2.84(dd,J＝11.3,6.8Hz,1H),2.71(d,J＝4.7Hz,1H),2.18(q,J＝6.0Hz,2H),1.94‑1.84(m,1H), 1.77‑1.58(m,3H),1.51‑1.22(m,11H),1.15(s,3H),1.08(s,3H),0.98(s,3H),0.88(s,6H), 0.85(s,3H),0.84(s,3H). [0153] 实施例11 [0154] 中间体A11的合成 [0155] [0156] 以6‑羟基喹啉(2.06mmol，0.30g)替换实施例3中3‑羟基喹啉，其他条件不变，得到化合物A11(白色固体)0.40g，产率69.6％。 [0157] ESI‑MS：溴同位素特征峰278.0、280.0[M+H]+。 [0158] 化合物Ⅰ‑11的合成 [0159] [0160] 参照实施例1化合物I‑1的制备方法，以毫摩尔量化合物A11替换化合物A1，其他条件不变，得到目标化合物I‑11(白色固体)0.05g，产率32.9％。 [0161] ESI‑MS：691.4[M+H]+。 [0162] 1H NMR(400MHz,DMSO，TMS)，δppm：δ8.73(dd,J＝4.2,1.7Hz,1H),8.63(s,1H),8.24(dd,J＝8.4,1.7Hz,1H),7.92(d,J＝10.0Hz,1H),7.48(dd,J＝8.3,4.2Hz,1H),7.42‑ 7.30(m,2H),6.22(s,1H),4.16(dt,J＝13.0,6.5Hz,4H),2.87(d,J＝13.4Hz,1H),2.81(d,J＝4.7Hz,1H),1.93‑1.74(m,6H),1.65‑1.36(m,7H),1.34(s,3H),1.32‑1.21(m,5H),1.18(s,3H),1.15(s,3H),1.03(s,3H),0.92(s,3H),0.87(s,3H),0.85(s,3H). [0163] 实施例12 [0164] 中间体A12的合成 [0165] [0166] 以6‑羟基喹啉(2.06mmol，0.30g)替换实施例4中3‑羟基喹啉，其他条件不变，得到化合物A12(白色固体)0.38g，产率62.9％。 [0167] ESI‑MS：溴同位素特征峰292.0、294.0[M+H]+。 [0168] 化合物Ⅰ‑12的合成 [0169] [0170] 参照实施例1化合物I‑1的制备方法，以等摩尔量化合物A12替换化合物A1，其他条件不变，得到目标化合物I‑12(白色固体)0.06g，产率38.7％。 [0171] ESI‑MS：705.4[M+H]+。 [0172] 1H NMR(400MHz,DMSO，TMS)，δppm:δ8.73(dd,J＝4.2,1.7Hz,1H),8.60(s,1H),8.26(dd,J＝8.4,1.7Hz,1H),7.93(d,J＝8.8Hz,1H),7.48(dd,J＝8.3,4.2Hz,1H),7.40(d,J＝2.8Hz,1H),7.37(d,J＝2.5Hz,1H),6.20(s,1H),4.14(dt,J＝33.9,5.5Hz,4H),2.86(d,J＝14.2Hz,1H),2.80(d,J＝4.7Hz,1H),1.82(t,J＝7.3Hz,2H),1.72‑1.66(m,3H),1.56‑ 1.36(m,10H),1.29(s,4H),1.25(d,J＝10.6Hz,5H),1.16(s,3H),1.10(s,3H),0.96(s,3H), 0.91(s,3H),0.89(s,3H),0.86(s,3H). [0173] 实施例13 [0174] 中间体A13的合成 [0175] [0176] 在一单颈瓶中，加入3‑羧基喹啉(1.73mmol，0.30g)、碳酸钾0.96g(6.92mmol)、1,2‑二溴乙烷0.60mL(6.92mmol)，加入10mLDMF溶解，室温反应，TLC监测反应。反应完成后，旋干有机相，经硅胶柱层析(洗脱剂为石油醚:乙酸乙酯＝6:1v:v)，得到2‑溴乙基喹啉‑3‑羧酸盐(化合物A13，白色固体)0.23g，产率47.6％。 [0177] ESI‑MS：溴同位素特征峰277.9、279.9[M+H]+。 [0178] 化合物Ⅱ‑1的合成 [0179] [0180] 将0.10g(0.22mmol)CDOO溶于2mL DMF，加入0.091g碳酸钾(0.66mmol)和0.018g碘化钾(0.11mmol)，搅拌，加入2‑溴乙基喹啉‑3‑羧酸盐0.184g(0.66mmol)，常温反应，直至TLC检测显示反应完毕，加入30mL乙酸乙酯稀释，水洗3次，取有机层，有机层饱和碳酸氢钠洗3次，饱和食盐水洗3次，无水硫酸钠干燥过夜。有机相旋干，经硅胶柱层析(洗脱剂为石油醚:乙酸乙酯＝3:1v:v)得到化合物Ⅱ‑1(白色固体)0.06g，产率39.5％。 [0181] ESI‑MS：691.3[M+H]+。 [0182] 1H NMR(400MHz,DMSO，TMS)，δppm:δ9.31(d,J＝2.2Hz,1H),9.01(d,J＝2.1Hz,1H),8.51(s,1H),8.26(dd,J＝8.2,1.4Hz,1H),8.16(d,J＝8.5Hz,1H),7.98(ddd,J＝8.5, 6.9,1.5Hz,1H),7.78(ddd,J＝8.1,6.9,1.2Hz,1H),6.10(s,1H),4.79(ddd,J＝12.5,7.8, 2.4Hz,1H),4.58(ddt,J＝13.0,7.6,4.1Hz,2H),4.37(ddd,J＝12.5,5.4,2.4Hz,1H),2.84(d,J＝13.3Hz,1H),2.73(d,J＝4.8Hz,1H),1.93‑1.81(m,1H),1.77‑1.55(m,3H),1.52‑ 1.22(m,11H),1.18(s,3H),1.07(s,3H),0.96(s,6H),0.84(d,J＝2.2Hz,6H),0.82(s,3H).[0183] 实施例14 [0184] 中间体A14的合成 [0185] [0186] 以1,3‑二溴丙烷0.72mL(6.92mmol)替换实施例13中1,2二溴乙烷，得到3‑溴丙基喹啉‑3‑羧酸酯(化合物A14，白色固体)0.25g，产率49.3％。 [0187] ESI‑MS：溴同位素特征峰292.0、294.0[M+H]+。 [0188] 化合物Ⅱ‑2的合成 [0189] [0190] 参照实施例13化合物Ⅱ‑1的制备方法，以等摩尔量化合物A14替换化合物A13，其他条件不变，得到目标化合物Ⅱ‑2(白色固体)0.07g，产率45.2％。 [0191] ESI‑MS：705.3[M+H]+。 [0192] 1H NMR(400MHz,DMSO，TMS)，δppm:δ9.35(d,J＝2.1Hz,1H),9.07(d,J＝2.2Hz,1H),8.60(s,1H),8.26(dd,J＝8.4,1.5Hz,1H),8.14(d,J＝8.4Hz,1H),7.95(ddd,J＝8.4, 6.8,1.5Hz,1H),7.75(ddd,J＝8.2,6.8,1.2Hz,1H),6.17(s,1H),4.45(ddt,J＝28.5,11.1, 5.6Hz,2H),4.35‑4.23(m,2H),2.82(d,J＝11.5Hz,2H),2.17(h,J＝6.2Hz,2H),2.04‑1.83(m,2H),1.77‑1.24(m,14H),1.22(s,3H),1.12(s,3H),0.99(s,3H),0.96(s,3H),0.88(s, 6H),0.85(s,3H).实施例15 [0193] 中间体A15的合成 [0194] [0195] 以1,4‑二溴丁烷0.84mL(6.92mmol)，替换实施例13中1,2二溴乙烷得到中间体A15，白色固体)0.26g，产率48.9％。 [0196] ESI‑MS：溴同位素特征峰306.0、308.0[M+H]+。 [0197] 化合物Ⅱ‑3的合成 [0198] [0199] 参照实施例13化合物Ⅱ‑1的制备方法，以等摩尔量化合物A15替换化合物A13，其他条件不变，得到目标化合物Ⅱ‑3白色固体0.07g，产率44.3％。 [0200] ESI‑MS：719.4[M+H]+。 [0201] 1H NMR(400MHz,DMSO，TMS)，δppm:δ9.32(d,J＝2.2Hz,1H),9.03(d,J＝2.2Hz,1H),8.57(s,1H),8.24(dd,J＝8.4,1.5Hz,1H),8.12(d,J＝8.5Hz,1H),7.94(ddd,J＝8.5, 6.9,1.5Hz,1H),7.74(ddd,J＝8.2,6.8,1.2Hz,1H),6.17(s,1H),4.40(tt,J＝7.5,3.7Hz, 2H),4.22(dt,J＝11.6,6.0Hz,1H),4.14(dt,J＝11.2,6.0Hz,1H),2.85(d,J＝13.4Hz,1H), 2.78(d,J＝4.8Hz,1H),1.81(dtd,J＝19.8,9.6,4.8Hz,5H),1.54‑1.44(m,4H),1.39(s, 1H),1.23(s,7H),1.11(s,8H),0.96(s,3H),0.89(s,3H),0.86(s,3H),0.84(s,6H).[0202] 实施例16 [0203] 中间体A16的合成 [0204] [0205] 以1,5‑二溴戊烷0.94mL(6.92mmol)替换实施例13中1,2二溴乙烷得到化合物A16(白色固体)0.27g，产率48.6％。 [0206] ESI‑MS：溴同位素特征峰320.0、322.0[M+H]+。 [0207] 化合物Ⅱ‑4的合成 [0208] [0209] 参照实施例13化合物Ⅱ‑1的制备方法，以等摩尔量化合物A16替换化合物A13，其他条件不变，得到目标化合物Ⅱ‑4白色固体0.06g，产率37.2％。 [0210] ESI‑MS：733.4[M+H]+。 [0211] 1H NMR(400MHz,DMSO，TMS)，δppm:δ9.31(d,J＝2.2Hz,1H),9.01(d,J＝2.2Hz,1H),8.58(s,1H),8.23(dd,J＝8.2,1.5Hz,1H),8.11‑8.07(m,1H),7.91(ddd,J＝8.4,6.9, 1.5Hz,1H),7.72(ddd,J＝8.1,6.8,1.2Hz,1H),6.17(s,1H),4.39‑4.33(m,2H),4.09(q,J＝ 5.7Hz,2H),2.84‑2.74(m,2H),1.77(dd,J＝17.8,10.4Hz,4H),1.71‑1.43(m,11H),1.31(s, 4H),1.28‑1.17(m,6H),1.15(s,3H),1.11(s,3H),0.97(s,5H),0.84(s,3H),0.79(s,3H), 0.77(s,3H). [0212] 实施例17 [0213] 中间体A17的合成 [0214] [0215] 以4‑羧基喹啉(1.73mmol，0.30g)替换实施例13中3‑羧基喹啉，其他条件不变，得到化合物A17(白色固体)0.37g，产率76.6％。 [0216] ESI‑MS：溴同位素特征峰277.9、279.9[M+H]+。 [0217] 化合物Ⅱ‑5的合成 [0218] [0219] 参照实施例13化合物Ⅱ‑1的制备方法，以等摩尔量化合物A17替换化合物A13，其他条件不变，得到目标化合物Ⅱ‑5(白色固体)0.05g，产率32.9％。 [0220] ESI‑MS：691.3[M+H]+。 [0221] 1H NMR(400MHz,DMSO，TMS)，δppm:δ9.08(d,J＝4.3Hz,1H),8.68‑8.51(m,2H),8.13(d,J＝8.4Hz,1H),7.85(q,J＝5.6Hz,2H),7.73(t,J＝7.8Hz,1H),6.14(s,1H),4.65(tp,J＝9.4,4.3Hz,2H),4.47(dddd,J＝44.1,12.7,6.0,2.9Hz,2H),2.82(dd,J＝11.5, 6.8Hz,1H),2.72(d,J＝4.8Hz,1H),1.91‑1.53(m,4H),1.40(dt,J＝29.5,10.0Hz,6H),1.19(s,5H),1.10(s,5H),0.99(s,3H),0.91(s,4H),0.82(s,3H),0.80(s,6H). [0222] 实施例18 [0223] 中间体A18的合成 [0224] [0225] 以4‑羧基喹啉(1.73mmol，0.30g)替换实施例14中3‑羧基喹啉，其他条件不变，得到化合物A18(白色固体)0.31g，产率61.2％。 [0226] ESI‑MS：溴同位素特征峰292.01、294.0M+H]+。 [0227] 化合物Ⅱ‑6的合成 [0228] [0229] 参照实施例13化合物Ⅱ‑1的制备方法，以等摩尔量化合物A18替换化合物A13，其他条件不变，得到目标化合物Ⅱ‑6(白色固体)0.05g，产率32.3％。 [0230] ESI‑MS：705.3[M+H]+。 [0231] 1H NMR(400MHz,DMSO，TMS)，δppm:δ9.09(d,J＝4.4Hz,1H),8.71‑8.56(m,2H),8.15(d,J＝8.4Hz,1H),7.99(d,J＝4.4Hz,1H),7.88(t,J＝7.7Hz,1H),7.76(t,J＝7.7Hz, 1H),6.19(s,1H),4.49(h,J＝5.4Hz,2H),4.26(t,J＝6.1Hz,2H),2.90‑2.72(m,2H),2.16(p,J＝6.2Hz,2H),1.93‑1.46(m,10H),1.28(s,5H),1.14(s,6H),1.02(d,J＝4.0Hz,6H), 0.88(s,3H),0.86(s,3H),0.84(s,3H). [0232] 实施例19 [0233] 中间体A19的合成 [0234] [0235] 以4‑羧基喹啉(1.73mmol，0.30g)替换实施例15中3‑羧基喹啉，其他条件不变，得到化合物A19(白色固体)0.27g，产率50.8％。 [0236] ESI‑MS：溴同位素特征峰306.0、308.0[M+H]+。 [0237] 化合物Ⅱ‑7的合成 [0238] [0239] 参照实施例13化合物Ⅱ‑1的制备方法，以等摩尔量化合物A19替换化合物A13，其他条件不变，得到目标化合物Ⅱ‑7(白色固体)0.05g，产率32.3％。 [0240] ESI‑MS：719.4[M+H]+。 [0241] 1H NMR(400MHz,DMSO，TMS)，δppm:δ9.09(d,J＝4.5Hz,1H),8.66‑8.55(m,2H),8.14(d,J＝8.4Hz,1H),7.94(d,J＝4.4Hz,1H),7.87(ddd,J＝8.5,6.8,1.4Hz,1H),7.75(td,J＝7.5,1.4Hz,1H),6.18(s,1H),4.45(t,J＝6.1Hz,2H),4.26‑4.08(m,2H),2.85(dd,J＝13.7,4.1Hz,1H),2.77(d,J＝4.8Hz,1H),1.93‑1.44(m,14H),1.24(s,6H),1.13(s,3H), 1.07(s,5H),1.01(s,3H),0.89(s,3H),0.86(s,3H),0.84(s,3H). [0242] 实施例20 [0243] 中间体A20的合成 [0244] [0245] 以4‑羧基喹啉(1.73mmol，0.30g)替换实施例16中3‑羧基喹啉，其他条件不变，得到化合物A20(白色固体)0.27g，产率48.6％。 [0246] ESI‑MS：溴同位素特征峰320.0、322.0[M+H]+。 [0247] 化合物Ⅱ‑8的合成 [0248] [0249] 参照实施例13化合物Ⅱ‑1的制备方法，以等摩尔量化合物A20替换化合物A13，其他条件不变，得到目标化合物Ⅱ‑8(白色固体)0.06g，产率37.2％。 [0250] ESI‑MS：733.4[M+H]+。 [0251] 1H NMR(400MHz,DMSO，TMS)，δppm:δ9.08(d,J＝4.4Hz,1H),8.71‑8.52(m,2H),8.14(d,J＝8.4Hz,1H),7.95(d,J＝4.4Hz,1H),7.86(t,J＝7.6Hz,1H),7.75(t,J＝7.7Hz, 1H),6.19(s,1H),4.42(t,J＝6.3Hz,2H),4.10(q,J＝6.8Hz,2H),2.89‑2.71(m,2H),1.88‑ 1.58(m,9H),1.57‑1.30(m,12H),1.15(s,3H),1.13(s,3H),1.01(s,6H),0.84(s,3H),0.81(s,6H). [0252] 实施例21 [0253] 中间体A21的合成 [0254] [0255] 以6‑羧基喹啉(1.73mmol，0.30g)替换实施例13中3‑羧基喹啉，其他条件不变，得到化合物A21(白色固体)0.27g，产率56.0％。 [0256] ESI‑MS：溴同位素特征峰277.9、279.9[M+H]+。 [0257] 化合物Ⅱ‑9的合成 [0258] [0259] 参照实施例13化合物Ⅱ‑1的制备方法，以等摩尔量化合物A21替换化合物A13，其他条件不变，得到目标化合物Ⅱ‑9(白色固体)0.06g，产率39.5％。 [0260] ESI‑MS：691.3[M+H]+。 [0261] 1H NMR(400MHz,DMSO，TMS)，δppm:δ9.07(dd,J＝4.2,1.7Hz,1H),8.70(d,J＝1.9Hz,1H),8.63(dd,J＝8.3,1.8Hz,1H),8.54(s,1H),8.23‑8.14(m,2H),7.70(dd,J＝8.4, 4.2Hz,1H),6.13(s,1H),4.79‑4.72(m,1H),4.55(tdd,J＝12.5,6.4,2.3Hz,2H),4.45‑4.34(m,1H),2.85(d,J＝13.5Hz,1H),2.74(d,J＝4.8Hz,1H),1.93‑1.82(m,1H),1.77‑1.57(m, 4H),1.40(s,2H),1.30(s,1H),1.25(d,J＝10.4Hz,5H),1.16(s,6H),1.07(s,3H),0.96(s, 5H),0.85(s,3H),0.84(t,J＝1.0Hz,3H),0.83(s,3H). [0262] 实施例22 [0263] 中间体A22的合成 [0264] [0265] 以6‑羧基喹啉(1.73mmol，0.30g)替换实施例14中3‑羧基喹啉，其他条件不变，得到化合物A22(白色固体)0.28g，产率55.2％。 [0266] ESI‑MS：溴同位素特征峰292.0、294.0[M+H]+。 [0267] 化合物Ⅱ‑10的合成 [0268] [0269] 参照实施例13化合物Ⅱ‑1的制备方法，以等摩尔量化合物A22替换化合物A13，其他条件不变，得到目标化合物Ⅱ‑10(白色固体)0.06g，产率38.7％。 [0270] ESI‑MS：705.3[M+H]+。 [0271] 1H NMR(400MHz,DMSO，TMS)，δppm:δ9.05(dd,J＝4.2,1.8Hz,1H),8.75(d,J＝2.0Hz,1H),8.64(dd,J＝8.4,1.8Hz,1H),8.60(s,1H),8.25(dd,J＝8.8,2.0Hz,1H),8.15(d,J＝8.8Hz,1H),7.67(dd,J＝8.3,4.2Hz,1H),6.17(s,1H),4.50‑4.34(m,2H),4.28(ddt,J＝11.1,7.3,4.1Hz,2H),2.82(d,J＝9.8Hz,2H),2.16(q,J＝6.2Hz,2H),1.95‑1.86(m, 1H),1.76‑1.64(m,2H),1.59(d,J＝14.0Hz,1H),1.40(t,J＝6.2Hz,4H),1.34(s,1H),1.30(s,2H),1.25(d,J＝10.2Hz,4H),1.22(s,3H),1.12(s,3H),0.98(s,3H),0.96(s,3H),0.88(s,6H),0.85(s,3H). [0272] 实施例23 [0273] 中间体A23的合成 [0274] [0275] 以6‑羧基喹啉(1.73mmol，0.30g)替换实施例15中3‑羧基喹啉，其他条件不变，得到化合物A23(白色固体)0.27g，产率50.8％。 [0276] ESI‑MS：溴同位素特征峰306.0、308.0[M+H]+。 [0277] 化合物Ⅱ‑11的合成 [0278] [0279] 参照实施例13化合物Ⅱ‑1的制备方法，以等摩尔量化合物A23替换化合物A13，其他条件不变，得到目标化合物Ⅱ‑11(白色固体)0.05g，产率31.6％。 [0280] ESI‑MS：719.4[M+H]+。 [0281] 1H NMR(400MHz,DMSO，TMS)，δppm:δ9.04(dd,J＝4.2,1.8Hz,1H),8.72(d,J＝2.0Hz,1H),8.65‑8.56(m,2H),8.23(dd,J＝8.8,2.0Hz,1H),8.14(d,J＝8.8Hz,1H),7.66(dd,J＝8.3,4.2Hz,1H),6.18(s,1H),4.43‑4.36(m,2H),4.27‑4.10(m,2H),2.90‑2.77(m, 2H),1.79(ddd,J＝23.4,12.2,7.3Hz,5H),1.49‑1.25(m,12H),1.23(s,5H),1.11(s,3H), 1.10(s,3H),0.96(s,3H),0.90(s,3H),0.86(s,3H),0.85(s,3H). [0282] 实施例24 [0283] 中间体A24的合成 [0284] [0285] 以6‑羧基喹啉(1.73mmol，0.30g)替换实施例16中3‑羧基喹啉，其他条件不变，得到化合物A24(白色固体)0.28g，产率50.4％。 [0286] ESI‑MS：溴同位素特征峰320.0、322.0[M+H]+。 [0287] 化合物Ⅱ‑12的合成 [0288] [0289] 参照实施例13化合物Ⅱ‑1的制备方法，以等摩尔量化合物A24替换化合物A13，其他条件不变，得到目标化合物Ⅱ‑12(白色固体)0.05g，产率31.0％。 [0290] ESI‑MS：733.4[M+H]+。 [0291] 1H NMR(400MHz,DMSO，TMS)，δppm:δ9.04(dd,J＝4.2,1.7Hz,1H),8.72(d,J＝2.0Hz,1H),8.62(d,J＝9.1Hz,2H),8.24(dd,J＝8.9,2.0Hz,1H),8.14(d,J＝8.8Hz,1H), 7.66(dd,J＝8.3,4.2Hz,1H),6.20(s,1H),4.36(t,J＝6.3Hz,2H),4.11(q,J＝5.7Hz,2H), 2.87‑2.75(m,2H),1.89‑1.73(m,4H),1.73‑1.60(m,4H),1.59‑1.46(m,6H),1.40(s,1H), 1.33(s,3H),1.30(s,1H),1.25(d,J＝10.7Hz,5H),1.18(s,3H),1.13(s,3H),0.99(s,3H), 0.86(s,3H),0.82(s,3H),0.80(s,3H). [0292] 实施例25 [0293] (一)化合物的体外抗肿瘤细胞增殖实验 [0294] 采用四甲基氮唑蓝比色法(MTT法)对本发明CDDO喹啉衍生物(受试化合物)进行抗肿瘤活性测试，选取CDDO、CDDO‑Me(Bardoxolone methyl)作为阳性对照药。 [0295] 仪器：超净工作台(SW‑CJ‑1FD，AIRTECH，苏净安泰)、恒温CO2培养箱(3111，Thermo，美国)、高压灭菌锅(YXO.SG41.280，上海华线)，离心机(SIGMA)，多生物显微镜(IX71，Olympus，日本)，多功能酶标仪(POLARstar，Omega，美国)。 [0296] 试剂：DMEM、1640培养基(KeyGEN)、胎牛血清(GIBCO)、胰蛋白酶(SIGMA)、DMSO(SIGMA)。 [0297] 细胞株：小鼠黑色素瘤细胞株B16‑F10，人乳腺癌细胞株MDA‑MB‑231，人胃癌细胞BGC‑823，人肝癌细胞HepG2；其中，BGC‑823细胞用RPMI‑1640培养基培养，B16‑F10、MDA‑MB‑231和HepG2细胞均用DMEM(高糖)培养基培养(均购自江苏凯基生物技术股份有限公司)。 [0298] 方法：将冻存的细胞株复苏，置于恒温37℃、5％CO2培养箱中培养，每天换液一次，待其处于指数生长期且状态良好时即可铺板。加入1mL 0.25％胰蛋白酶消化液，消化1‑2min，在显微镜下观察细胞状态，当贴壁细胞变圆收缩时即可吸除消化液，加入1‑2mL含 3 10％胎牛血清的培养基制成细胞悬液，进行细胞计数，按照每孔3×10 个细胞数及总孔数计算所需细胞悬液的量，将细胞悬液接种于96孔板上，100μL/孔，周围用PBS液封，置于恒温 37℃、5％CO2培养箱中培养24h。 [0299] 称取适量受试化合物、CDDO和CDDO‑Me，用DMSO溶解配制浓度均为10mmol/L的母液，再用培养基稀释成0.25、0.5、1、2、4μmol/L的系列溶液，并设置空白对照(DMSO用培养基稀释为浓度4μmol/L的溶液)，每个药物浓度设3个复孔，将96孔板置于恒温37℃、5％CO2培养箱中常氧培养48h。 [0300] 称取适量受试化合物、CDDO和CDDO‑Me，用DMSO溶解配制浓度为10mmol/L的母液，再用培养基稀释成0.05、0.1、0.2、0.4、0.8μmol/L的系列溶液，并设置空白对照(DMSO用培养基稀释为浓度0.8μmol/L的溶液)，每个药物浓度设3个复孔，将96孔板置于恒温37℃、1％O2培养箱中低氧培养72h。 [0301] 将MTT试剂(5mg/mL)加入到96孔板中，10μL/孔，继续孵育4h。吸除板内培养基，每孔加入150μL DMSO，用多功能酶标仪在波长570nm处检测每孔的吸光值，并按下列公式计算细胞抑制率。 [0302] 细胞抑制率％＝[(空白对照OD值－给药组OD值)/空白对照组OD值]×100％。 [0304] 表1.受试化合物在21％ O2下对肿瘤细胞的抑制作用 [0305] [0306] 表2.受试化合物在1％ O2下对肿瘤细胞的抑制作用 [0307] [0308] 根据表1和表2可知，与CDDO相比，本发明CDDO喹啉衍生物在常氧和低氧下，对细胞MDA‑MB‑231、BGC‑823、HepG2、B16‑F10细胞的抑制作用均显著增强；与CDDO‑Me相比，在常氧下对细胞MDA‑MB‑231、BGC‑823、HepG2、B16‑F10细胞的抑制作用相差不大，在低氧下，抑制作用均相差不大或显著增强。其中，本发明CDDO喹啉衍生物尤其是化合物Ⅰ‑7，在黑色素瘤细胞中，低氧下活性比常氧下提高了4.75倍，比CDDO提高13.13倍，比CDDO‑Me提高4.75倍。 [0309] (二)化合物的免疫荧光实验 [0310] 仪器：高内涵细胞成像仪(ImageXpress Micro)。 [0311] 试剂：HIF‑1α一抗(Proteintech)、Alexa Fluor 488标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(Biosharp)、DAPI染色液(Biosharp)、TritonX‑100(曲拉通)、牛血清蛋白V(Biosharp)、4％多聚甲醛(Biosharp)。 [0312] 方法：参照“化合物的体外抗肿瘤细胞增殖实验”中的细胞消化计数方法，收集细胞悬液(1000个/mL)，将B16‑F10细胞均匀接种于96孔板中，常氧下培养24h，设置给药组和空白对照组，给药组：化合物Ⅰ‑7用DMSO溶解配制成浓度为10mmol/L的母液，再用培养基稀释成0.1μmol/L，空白对照组(DMSO用培养基稀释为浓度4μmol/L的溶液)，设3个复孔，置于恒温37℃、1％O2培养箱中低氧培养24h。每孔加入预冷的4％多聚甲醛100μL，固定10min，吸出，在PBS中冲洗3次，每次5分钟；每孔加入50μL Triton X‑100，透化约2min，加100μL PBS冲洗，吸出PBS并冲洗3次，每次5min；用适当的封闭溶液封闭0.5h(封闭溶液：3％BSA)；孵育一抗在PBS中冲洗3次，每次5分钟；孵育二抗：每孔中加入60μL二抗(二抗的稀释比例按说明书用5％山羊血清稀释，一般为1:500)，室温避光孵育0.5h取出二抗(注意：二抗步骤后的所有步骤都需要避光)，冲洗PBS两次，每次5分钟；核染色：加入核染色试剂(DAPI，一般1‑2min即可使用，视具体情况而定)。染色后，取出成核试剂，用PBS冲洗一次，然后加入1mL PBS保持湿润。 [0313] 如图1、图2所示，给药组(记为Ⅰ‑7)相较于空白对照组(记为DMSO)，HIF‑1α蛋白荧光强度减弱，说明化合物Ⅰ‑7在低氧下降低细胞内HIF‑1α蛋白含量。 [0314] (三)化合物对HIF‑1α蛋白及下游蛋白VEGF蛋白的影响 [0315] 仪器：天能凝胶成像系统(Tanon‑5200，上海天能)，湿转转印槽(Mini Trans‑Blot 170‑3930，Bio‑Rad)。 [0316] 试剂：另有BCA蛋白浓度测定试剂盒(KeyGEN)，SDS‑PAGE蛋白上样缓冲液(5X)TM(KeyGEN)，BeyoColor 彩色预染蛋白分子量标准(10‑170kD)(碧云天，货号：P0075)，TM BeyoGel SDS‑PAGE预制胶(Tris‑Gly,4‑20％,12孔)(碧云天，货号：P0057A)，SDS‑PAGE电泳液(Tris‑Gly,Powder)(碧云天，货号：P0014B)，PVDF膜(进口分装,6.6×8.5cm,0.45μm)(碧TM 云天，货号：FFP32)，Western转膜液(云天，货号：P0021B)，QuickBlock Western封闭液(碧TM 云天，货号：P0252)，QuickBlock Western一抗稀释液(碧云天，货号：P0256)，TM QuickBlock Western二抗稀释液(碧云天，货号：P0258)，Western洗涤液(10X)(碧云天，货号：P0023C3)，重组Anti‑HIF‑1α抗体(Abcam)，重组Anti‑Vegf抗体(Abcam)。 [0317] 方法：将处于对数生长期的B16‑F10细胞接种于10cm培养皿中(2×105个细胞/皿)，于37℃、5％ CO2的培养箱内培养24h，于指定皿中分别加入化合物I‑7(用DMSO溶解配制浓度为10mmol/L的母液，再用培养基稀释成0.05、0.1、0.2μmol/L)，并设置两个空白对照组(DMSO用培养基稀释为浓度4μmol/L的溶液)。其中一个空白对照组常氧下继续培养48h，给药组与另一空白对照组置于37℃、1％ O 2，继续培养48h，收集细胞，离心，PBS洗涤，加入100μL IP裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂)，于0℃裂解1h，4℃、10000g离心5min，弃上清，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒对蛋白样品进行定量，‑80℃保存待用。用5X SDS‑PAGE蛋白上样缓冲液和裂解液将蛋白样品浓度稀释至3μg/μL。冷却至室温，将样品与Marker加到SDS‑PAGE凝胶上，开启电源，电压60V。待样品电泳进入分离胶，电压调至90V，参考Marker，目标条带跑至凝胶大约2/3处时，终止电泳。将含有目标条带的分离胶进行切割，放到预先活化好的PVDF膜上，并做好标记，稳流300mA，60min转膜。将转好的膜放入加有封闭液的皿中，慢摇孵育1h，弃封闭液。加入用一抗稀释液稀释好的一抗，于4℃振荡孵育过夜。回收一抗后，用Western洗涤液洗3次，每次10min。加入用二抗稀释液稀释好的二抗，于4℃缓慢振荡，孵育 1.5h后，用Western洗涤液洗膜3次，每次8min。取出PVDF膜，滴加适量已配制好的工作液，保鲜膜覆盖。经天能凝胶成像系统显影成像，Image J软件进行灰度分析。 [0318] 如图3、图4、图5所示，低氧下，HIF‑1α蛋白含量升高，随着化合物给药浓度升高，HIF‑1α含量降低，且HIF‑1α的下游蛋白VEGF也有浓度依赖性的降低。 [0319] 综上所述，本发明CDDO喹啉衍生物化合物在低氧下可抑制上述肿瘤的增殖，减少HIF‑1α、VEGF的蛋白含量，均有望成为新的抗肿瘤候选药物，值得深入研究。 |
||||||
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈