甾类阳离子脂质化合物、脂质纳米颗粒及其制备方法与应用 |
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| 申请号 | CN202311530635.8 | 申请日 | 2023-11-16 | 公开(公告)号 | CN117567541A | 公开(公告)日 | 2024-02-20 |
| 申请人 | 中国科学技术大学; | 发明人 | 王育才; 蒋为; 苏义坦; 郭子萱; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供了一种具有式(I)所示结构的甾类阳离子脂质化合物或其立体异构体或其药学上可接受的盐或其 溶剂 合物、其脂质纳米颗粒及其制备方法与应用。本发明提供的新型甾类阳离子脂质化合物能够与核酸药物形成稳定的脂质纳米颗粒结构，该甾类可电离阳离子脂质化合物在完全质子化状态下带有2个及以上电荷以实现高膜电荷 密度 ，其可促进脂质纳米颗粒组合物的内涵体逃逸，提高核酸 转染 效率。 | ||||||
| 权利要求 | 1.具有式(I)所示结构的甾类阳离子脂质化合物或其立体异构体或其药学上可接受的 |
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| 说明书全文 | 甾类阳离子脂质化合物、脂质纳米颗粒及其制备方法与应用技术领域背景技术[0002] 核酸药物是指具有治疗疾病功能的DNA或者RNA，通过直接作用于致病靶基因或者靶mRNA，调控致病相关基因的表达而治疗疾病，在肿瘤和遗传病等多种重大疾病的治疗中 取得了革命性进展。核酸药物类型较多，主要包括了反义核酸、小干扰核酸(siRNA)、mRNA药 物、基因编辑系统等，是未来实现精准医疗的有效手段之一。随着多种基因药物陆续获批临 床试验或上市，核酸药物已成为临床上治疗肿瘤、单基因遗传病、重大传染病等疾病的又一 重要手段。与小分子药物和蛋白药物相比，核酸药物对致病基因明确但下游蛋白难以成药 的治疗靶点具有明显优势。 [0003] 尽管核酸药物展现了良好的前景，但是核酸药物通常为强负电性亲水大分子，在体内易被血浆中核酸酶解失活、靶部位分布特异性差且难透过膜屏障，导致其疗效受限。正 因为如此，核酸药物极其依赖递送载体系统，均是依靠脂质纳米粒(LNP)方可实现最终的临 床转化。因此，提高LNP的体内稳定性和治疗效果是目前研究的重点。 [0004] 表面电荷可以影响细胞‑脂质体的静电相互作用，并已被用于控制脂质纳米颗粒在悬浮液中储存的稳定性。Nakamori等人报道，带正电荷的脂质体在六个月的时间内对聚 集稳定。阳离子脂质，一般为两亲性分子，具有含有一个或者多个烃基的脂质亲和性区域、 和含有至少带一个正电的极性头基的亲水性区域。在基础研究中，尽管各种新的阳离子脂 质纳米载体不断被开发报道，但这些阳离子载体材料不能很好地实现内涵体逃逸，进入细 胞后易被内含体降解，对于核酸药物的递送效率有待提升，并且其临床前期效果不佳，很大 程度制约着核酸药物的临床转化。 发明内容[0006] 第一个方面，本发明提供了一种具有式(I)所示结构的甾类阳离子脂质化合物或其立体异构体或其药学上可接受的盐或其溶剂合物， [0007] [0008] 其中，A为甾类化合物脱掉一个羟基后的残基； [0009] L是由1或多个如下基团组成的连接单元：C1～C12亚烷基、‑O(C＝O)‑、‑O(C＝O)O‑、‑C(＝O)‑、‑O‑、‑S‑、‑NR5‑、‑C(＝O)S‑、‑C(＝O)NR5‑、‑NR5C(＝O)NR5‑、‑OC(＝O)NR5‑、‑SC(＝O)NR5‑； [0010] X选自：N、CB3、SiB3； [0011] B1、B2分别独立地选自：‑(CH2)pNR1R2； [0012] B3选自：氢、R3取代或者未取代的烷基、R3取代或者未取代的不饱和链烃基、R3取代或者未取代的环烷基； [0013] R1、R2分别独立地选自：氢、R3取代或者未取代的烷基、R3取代或者未取代的不饱和链烃基、R3取代或者未取代的环烷基； [0015] 并且，R1、R2中至少有一个选自：羟基取代的烷基、羟基取代的不饱和链烃基、烷氧基取代的烷基、烷氧基取代的不饱和链烃基、HO‑(R4‑O)n‑取代的烷基、HO‑(R4‑O)n‑取代的不饱和链烃基； [0016] 各n分别独立地选自：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10； [0017] 各p分别独立地选自：1、2、3、4、5、6； [0018] 各R4分别独立地选自：C1‑C6亚烷基； [0019] 各R5分别独立地选自：H、C1～C12烷基。 [0020] 第二个方面，本发明提供了一种脂质载体组合物，包括阳离子脂质、磷脂、聚乙二醇‑脂质；所述阳离子脂质为本发明所述的甾类阳离子脂质化合物或其立体异构体或其药 学上可接受的盐或其溶剂合物。 [0021] 其中，所述阳离子脂质、磷脂、聚乙二醇‑脂质的摩尔比优选为38～60：40～60：1～3，优选为48～60：40～50：1.5～2，更优选为52～58：42～45：1.5～2。 [0022] 优选地，所述磷脂选自磷脂酰胆碱(PC)和/或磷脂酰乙醇胺(PE)；更进一步地选自二月桂酰基磷脂酰胆碱(DLPC)、二月桂酰基磷脂酰乙醇胺(DLPE)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆 碱(DMPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二棕榈酰磷脂 酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、1‑硬脂酰 基‑2‑油酰基卵磷脂(SOPC)、SOPE、二油酰基卵磷脂(DOPC)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)；更进一步优选地选自二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)、 二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、1‑硬脂酰基‑2‑油酰基卵磷脂(SOPC)。 [0023] 优选地，所述聚乙二醇‑脂质为二肉豆蔻酰甘油‑聚乙二醇和/或ALC‑0159。 [0024] 第三个方面，本发明提供了一种脂质纳米颗粒，由核酸药物和药学上可接受的辅料制备而成，所述药学上可接受的辅料包括本发明所述的脂质载体组合物。 [0025] 其中，所述脂质载体组合物和核酸药物的N/P比优选为3～12，优选为4～8。 [0026] 第四个方面，本发明提供了一种所述的脂质纳米颗粒的制备方法，包括： [0027] 将含有所述脂质载体组合物的醇溶液和含有所述核酸药物的水溶液通过微流控制备系统制备所述脂质纳米颗粒。 [0028] 其中，所述醇溶液和水溶液经微流控芯片的流速比优选为1：2.5～3.5，总流速为12ml/min～20ml/min。 [0029] 第五个方面，本发明提供了所述甾类阳离子脂质化合物或其立体异构体或其药学上可接受的盐或其溶剂合物，和/或所述的脂质载体组合物在制备核酸药物递送系统中的 应用。 [0031] 其中，所述脂质纳米颗粒可以通过肌肉注射、皮下注射、静脉注射、经鼻给药等方式给药。 [0032] 其中，所述药物是用于基因治疗、基因疫苗接种、反义治疗或通过干扰RNA的治疗的药物；优选地，所述基因治疗可用于癌症和遗传疾病的治疗；更优选地，所述癌症为肺癌、 胃癌、肝癌、食管癌、结肠癌、胰腺癌、脑癌、淋巴癌、血癌、前列腺癌；所述遗传疾病为血友病、地中海贫血、高雪氏病；优选地，所述基因疫苗接种用于治疗癌症、过敏、毒性和病原体 感染；更优选地，所述病原体为病毒、细菌或真菌中的一种或多种。 [0033] 本发明提供的新型甾类阳离子脂质化合物能够与核酸药物形成稳定的脂质纳米颗粒结构。本发明的甾类可电离阳离子脂质化合物在完全质子化状态下带有2个及以上电 荷以实现高膜电荷密度，其可促进脂质纳米颗粒组合物的内涵体逃逸，提高核酸转染效率。 相比于商业化的单价可电离阳离子CKK‑E12，本发明的甾类可电离阳离子脂质化合物大大 提高了核酸药物的转染效率。 [0034] 另外，本发明的甾类阳离子脂质化合物是多价可电离阳离子脂质化合物，其能够络合多个核酸分子，可以大大降低组分中LNP可电离阳离子的比例，从而降低载体的毒性。 本发明的甾类阳离子脂质化合物同时含有可电离阳离子脂质与固醇组分，可以实现核酸药 物的三组分脂质纳米颗粒递送，从而降低LNP的生产成本，更利于临床转化。 附图说明 [0035] 图1为甾类阳离子脂质纳米颗粒的粒径分布。 [0036] 图2为甾类阳离子脂质纳米颗粒的PDI分布。 [0037] 图3为甾类阳离子脂质纳米颗粒的mRNA包封率结果。 [0038] 图4为甾类阳离子脂质纳米颗粒在转染293T细胞后mRNA的表达效率结果。 [0039] 图5为甾类阳离子脂质纳米颗粒促进内涵体逃逸的实验结果。 具体实施方式[0041] 本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块， 而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有 的其它步骤。 [0042] 在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。 [0044] 在本发明的一实施方式中，提供一种具有式(I)所示结构的甾类阳离子脂质化合物或其立体异构体或其药学上可接受的盐或其溶剂合物， [0045] [0046] 其中，A为甾类化合物脱掉一个羟基后的残基； [0047] L是由1或多个如下基团组成的连接单元：C1～C12亚烷基、‑O(C＝O)‑、‑O(C＝O)O‑、‑C(＝O)‑、‑O‑、‑S‑、‑NR5‑、‑C(＝O)S‑、‑C(＝O)NR5‑、‑NR5C(＝O)NR5‑、‑OC(＝O)NR5‑、‑SC(＝O)NR5‑； [0048] X选自：N、CB3、SiB3； [0049] B1、B2分别独立地选自：‑(CH2)pNR1R2； [0050] B3选自：氢、R3取代或者未取代的烷基、R3取代或者未取代的不饱和链烃基、R3取代或者未取代的环烷基； [0051] R1、R2分别独立地选自：氢、R3取代或者未取代的烷基、R3取代或者未取代的不饱和链烃基、R3取代或者未取代的环烷基； [0052] 各R3分别独立地选自：羟基、卤素、氰基、烷氧基、HO‑(R4O)n‑； [0053] 并且，R1、R2中至少有一个选自：羟基取代的烷基、羟基取代的不饱和链烃基、烷氧基取代的烷基、烷氧基取代的不饱和链烃基、HO‑(R4‑O)n‑取代的烷基、HO‑(R4‑O)n‑取代的不饱和链烃基； [0054] 各n分别独立地选自：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10； [0055] 各p分别独立地选自：1、2、3、4、5、6； [0056] 各R4分别独立地选自：C1‑C6亚烷基； [0057] 各R5分别独立地选自：H、C1～C12烷基。 [0058] 术语“烷基”意指包括具有一定碳原子数目的支链的和直链的饱和脂肪烃基。例如：“C1～C6烷基”中“C1～C6”的定义包括以直链或支链排列的具有1、2、3、4、5或6个碳原子的基团。例如：“C1～C6烷基”具体包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、戊基、己基等。 [0059] 术语“亚烷基”是指在“烷基”基础上少一个氢的基团，例如，‑CH2‑、‑CH2CH2‑、‑CH2CH2CH2‑、‑CH2CH2CH2CH2‑等。 [0060] 术语“不饱和链烃基”指具有特定碳原子数目的支链的和直链的不饱和脂肪烃基，即非环状的不饱和链状烃基，并且碳链中含有1个或者多个碳碳双键，或者含有碳碳三键， 如：CH2＝CHCH2‑，‑(CH2)8(CH＝CH)CH3，‑(CH2)7CH＝CH2，‑(CH2)8CH＝CH2等。 [0061] 术语“环烷基”指具有特定碳原子数目的单环饱和脂肪烃基。例如“C3～C8环烷基”包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基。 [0062] 术语“烷氧基”指烷基与氧直接连接的基团，即具有‑O‑烷基结构的基团，如‑OCH3、‑OCH2CH3、‑OCH2CH2CH3、‑O‑CH2CH(CH3)2、‑OCH2CH2CH2CH3、‑O‑CH(CH3)2等。 [0063] 术语“卤素”或“卤”意指氯、氟、溴和碘。 [0064] 术语“取代的”是指用指定取代基的基团置换特定结构中的氢基。本发明所述化合物中，当任何变量(例如R3等)在任何组分中出现超过一次，则其每次出现的定义独立于其 它每次出现的定义。同样，允许取代基及变量的组合，只要这种组合使化合物稳定。要理解 本领域普通技术人员可选择本发明化合物的取代基及取代型式而提供化学上稳定的并可 通过本领域技术和下列提出的方法自可容易获得的原料容易的合成的化合物。如果取代基 自身被超过一个基团取代，应理解这些基团可在相同碳原子上或不同碳原子上，只要使结 构稳定。 [0065] 在其中一些实施例中，所述甾类阳离子脂质化合物具有如下式(II)所示结构： [0066] [0067] 其中，G1、G2分别独立地选自：‑CH2‑、‑(CH2)mO(C＝O)‑、‑(CH2)m(C＝O)O‑、‑(CH2)mO(C＝O)O‑、‑(CH2)mC(＝O)‑、‑(CH2)mO(CH2)m‑、‑(CH2)mS(CH2)m‑、‑(CH2)mNR5(CH2)m‑、‑O(CH2)mO‑、‑(CH2)mC(＝O)S‑、‑(CH2)mSC(＝O)‑、‑(CH2)mNR5C(＝O)‑、‑(CH2)mC(＝O)NR5‑、‑(CH2)mNR5C(＝O)NR5‑、‑(CH2)mOC(＝O)NR5‑、‑(CH2)mNR5C(＝O)O‑、‑(CH2)mSC(＝O)NR5‑、‑(CH2)mNR5C(＝O)S‑、不存在； [0068] L1选自：C1～C12亚烷基、‑[O(CH2)x]y‑； [0069] m选自：0、1、2、3、4； [0070] x选自：1、2、3、4； [0071] y选自：1、2、3、4、5、6。 [0072] 在其中一些实施例中，G1、G2分别独立地选自：‑CH2O‑、‑O‑、‑CH2‑、‑(C＝O)O‑、‑O(C＝O)O‑、‑NR5C(＝O)O‑、‑(CH2)3NR5C(＝O)O‑、‑(CH2)3NR5(CH2)3‑、NR5、不存在； [0073] L1选自：C3～C8亚烷基、‑[O(CH2)2]y‑； [0074] y选自：1、2、3、4、5、6； [0075] R5选自：H、C1～C6烷基。 [0076] 在其中一些实施例中，‑G1‑L1‑G2‑形成如下结构： [0077] [0078] 其中，a选自：2、3、4、5、6、7； [0079] y选自：1、2、3、4、5、6； [0080] m选自：0、1、2、3。 [0081] 在其中一些实施例中，A选自： [0082] [0083] 在其中一些实施例中，B1、B2分别独立地选自：‑CH2NR1R2，‑(CH2)2NR1R2，‑(CH2)3NR1R2。 [0084] 在其中一些实施例中，R1、R2分别独立地选自：氢、R3取代或者未取代的C1‑C12烷基、R3取代或者未取代的C1‑C12不饱和链烃基、R3取代或者未取代的C3‑C8环烷基； [0085] 各R3分别独立地选自：羟基、卤素、氰基、C1‑C12烷氧基、HO‑(R4O)n‑； [0086] 并且，R1、R2中至少有一个选自：羟基取代的C1‑C12烷基、羟基取代的C1‑C12不饱和链烃基、C1‑C12烷氧基取代的C1‑C12烷基、C1‑C12烷氧基取代的C1‑C12不饱和链烃基、HO‑(R4‑O)n‑取代的C1‑C12烷基、HO‑(R4‑O)n‑取代的C1‑C12不饱和链烃基。 [0087] 在其中一些实施例中，R1、R2分别独立地选自：氢、R3取代或者未取代的C1‑C6烷基、R3取代或者未取代的C1‑C6不饱和链烃基、R3取代或者未取代的C5‑C6环烷基； [0088] 各R3分别独立地选自：羟基、卤素、氰基、C1‑C6烷氧基、HO‑(R4O)n‑； [0089] 各R4分别独立地选自：C1‑C3亚烷基； [0090] 各n分别独立地选自：1、2、3、4； [0091] 并且，R1、R2中至少有一个选自：羟基取代的C1‑C6烷基、羟基取代的C1‑C6不饱和链烃基、C1‑C6烷氧基取代的C1‑C6烷基、C1‑C6烷氧基取代的C1‑C6不饱和链烃基、HO‑(R4‑O)n‑取代的C1‑C6烷基、HO‑(R4‑O)n‑取代的C1‑C6不饱和链烃基。 [0092] 在其中一些实施例中，R1、R2分别独立地选自：氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、羟甲基、羟乙基、羟基取代的正丙基、羟基取代的异丙基、羟基取代的正丁基、羟基取代的异丁基、羟基取代的戊基、HO(CH2CH2O)n‑取代的甲基、HO(CH2CH2O)n‑取代的乙基、HO(CH2CH2O)n‑取代的丙基、乙氧基甲基、乙氧基乙基、乙氧基丙基、丙氧基甲基、丙氧基乙基、丙氧基丙基； [0093] 并且，R1、R2中至少有一个选自：羟甲基、羟乙基、羟基取代的正丙基、羟基取代的异丙基、羟基取代的正丁基、羟基取代的异丁基、羟基取代的戊基、HO(CH2CH2O)n‑取代的甲基、HO(CH2CH2O)n‑取代的乙基、HO(CH2CH2O)n‑取代的丙基、乙氧基甲基、乙氧基乙基、乙氧基丙基、丙氧基甲基、丙氧基乙基、丙氧基丙基。 [0094] 在其中一些实施例中，B1和B2相同。 [0095] 在其中一些实施例中，B3选自：氢、R3取代或者未取代的C1‑C12烷基、R3取代或者未取代的C1‑C12不饱和链烃基、R3取代或者未取代的C3‑C8环烷基； [0096] 各R3分别独立地选自：羟基、卤素、氰基、C1‑C12烷氧基、HO‑(R4O)n‑。 [0097] 在其中一些实施例中，B3选自：氢、R3取代或者未取代的C1‑C6烷基、R3取代或者未取代的C1‑C6不饱和链烃基、R3取代或者未取代的C5‑C6环烷基； [0098] 各R3分别独立地选自：羟基、卤素、氰基、C1‑C6烷氧基、HO‑(R4O)n‑； [0099] 各n分别独立地选自：1、2、3、4； [0100] 各R4分别独立地选自：C1‑C3亚烷基。 [0101] 在其中一些实施例中，B3选自：氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、羟甲基、羟乙基、羟基取代的正丙基、羟基取代的异丙基、羟基取代的正丁基、羟基取代的异丁基、羟基取代的戊基、HO(CH2CH2O)n‑取代的甲基、HO(CH2CH2O)n‑取代的乙基、HO(CH2CH2O)n‑取代的丙基、乙氧基甲基、乙氧基乙基、乙氧基丙基、丙氧基甲基、丙氧基乙基、丙氧基丙基。 [0102] 在其中一些实施例中， 选自如下结构： [0103] [0104] [0105] [0106] 本发明的甾类阳离子脂质化合物或其立体异构体或其药学上可接受的盐或其溶剂合物可能够络合核酸分子，形成稳定的脂质纳米颗粒结构，促进脂质纳米颗粒组合物的 内涵体逃逸，提高核酸转染效率，因而可以用于制备核酸药物的递送载体或者递送系统。 [0107] 在本发明的另一实施方式中，本发明提供了一种脂质载体组合物，包括阳离子脂质、磷脂、聚乙二醇‑脂质；所述阳离子脂质为本发明所述的甾类阳离子脂质化合物或其立 体异构体或其药学上可接受的盐或其溶剂合物。该脂质载体组合物可以作为核酸药物的递 送载体，其具有较好的内涵体逃逸能力，可以有效提高所载核酸的转染效率。 [0108] 在其中一些实施例中，所述阳离子脂质、磷脂、聚乙二醇‑脂质的摩尔比为38～60：40～60：1～3，优选为48～60：40～50：1.5～2，更优选为52～58：42～45：1.5～2。 [0109] 在其中一些实施例中，所述磷脂选自磷脂酰胆碱(PC)和/或磷脂酰乙醇胺(PE)；更进一步地选自二月桂酰基磷脂酰胆碱(DLPC)、二月桂酰基磷脂酰乙醇胺(DLPE)、二肉豆蔻 酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、 二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 (DSPE)、1‑硬脂酰基‑2‑油酰基卵磷脂(SOPC)、SOPE、二油酰基卵磷脂(DOPC)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)；更进一步优选地选自二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、二肉豆蔻酰基磷脂 酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰磷 脂酰胆碱(DSPC)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、1‑硬脂酰基‑2‑油酰基卵磷脂(SOPC)。 [0110] 在其中一些实施例中，所述聚乙二醇‑脂质为二肉豆蔻酰甘油‑聚乙二醇和/或ALC‑0159。 [0111] 在本发明的另一实施方式中，本发明提供了一种脂质纳米颗粒，由核酸药物和药学上可接受的辅料制备而成，所述药学上可接受的辅料包括本发明所述的脂质载体组合 物。该脂质纳米颗粒组合物的内涵体逃逸能力强，核酸转染效率高。 [0112] 在其中一些实施例中，所述脂质载体组合物和核酸药物的N/P比为3～12，例如可以是：3、4、5、6、7、8、9、10、11、12；优选为4～8，更优选为5‑7。 [0113] 在其中一些实施例中，所述核酸药物选自：siRNA、miRNA、pri‑miRNA、mRNA、单指导RNA(sgRNA)、CRISPR‑RNA(crRNA)、反式活化crRNA(tracrRNA)、质粒DNA(pDNA)、转移RNA(tRNA)、反义寡核苷酸(ASO)、指导RNA、双链DNA(dsDNA)、单链DNA(ssDNA)、单链RNA (ssRNA)、双链RNA(dsRNA)中的一种或多种。 [0114] 在其中一些实施例中，所述脂质纳米颗粒的粒径为50nm～200nm，进一步为60nm～150nm。 [0115] 本发明的脂质纳米颗粒可以用本领域常规方法进行制备。例如，在本发明的另一实施方式中，本发明提供了一种脂质纳米颗粒的制备方法，包括：将含有所述脂质载体组合 物的醇溶液和含有所述核酸药物的水溶液通过微流控制备系统制备所述脂质纳米颗粒。 [0116] 在其中一些实施例中，所述醇溶液和水溶液经微流控芯片的流速比为1：2.5～3.5，总流速为12ml/min～20ml/min。 [0117] 在其中一些实施例中，所述醇溶液和水溶液经微流控芯片的流速比为1：3，总流速为14‑18ml/min。 [0118] 在其中一些实施例中，所述醇溶液中的溶剂为乙醇。 [0119] 以下为具体实施例。 [0120] 实施例1：甾醇中间体的合成 [0121] [0122] 将二碳酸二叔丁酯(4.36g，20mmol)溶解于二氯甲烷中；将6‑氯‑1‑己醇(1.36g,10mmol)与三乙胺(2.02g，20mmol)溶解于二氯甲烷中，得6‑氯‑1‑己醇混合溶液。将二碳酸 二叔丁酯的二氯甲烷溶液逐滴向6‑氯‑1‑己醇混合溶液中滴加，冰水浴1h内滴加完毕，室温 下搅拌6小时。反应结束后，沉淀通过过滤除去，减压除去有机溶剂。加入饱和食盐水进行萃 取3次，再次于乙醚中沉淀，以除去未反应的二碳酸二叔丁酯，得到叔丁基‑(6‑氯己基‑)碳 酸酯(1.95g，产率81％)。 [0123] 将胆固醇(1.97g，5mmol)，碳酸钾(0.69g，5mmol)和叔丁基(6‑氯己基)碳酸酯(1.14g，5mmol)溶于200mL的无水1,4‑二氧六环中，在50℃下搅拌2小时，反应结束后，减压 除去有机溶剂。随后使用有机试剂乙酸乙酯及饱和食盐水进行萃取，减压除去有机溶剂。并 用硅胶柱层析方法(洗脱剂：二氯甲烷：甲醇＝10:1,v/v)纯化得到粗产品。 [0124] 将粗产品溶于含有20％(v/v)三氟乙酸(TFA)的二氯甲烷(DCM)中，在室温下搅拌2小时，反应结束后，减压除去有机溶剂。得到S1，产率67％。 [0125] 1H NMR(400MHz,Chloroform)δ5.27(s,1H),3.62(s,2H),3.34(d,J＝7.2Hz,3H),2.20(d,J＝6.1Hz,2H),2.09‑1.73(m,5H),1.72‑1.42(m,15H),1.40‑1.19(m,10H),1.17‑ 0.98(m,4H),0.95‑0.83(m,12H),0.75(S,3H). [0126] 基于β‑谷甾醇的衍生物S1‑2的合成方法与S1一致。1H NMR(400MHz,Chloroform)δ5.27(s,1H),3.62(s,2H),3.35(d,J＝6.9Hz,3H),2.20(d,J＝6.0Hz,2H),1.96(t,J＝ 31.5Hz,4H),1.83(s,1H),1.71‑1.45(m,16H),1.43‑1.20(m,9H),1.20‑0.98(m,4H),0.98‑ 0.91(m,6H),0.88(s,4H),0.86(s,3H),0.84(s,3H),0.72(s,3H). [0127] [0128] 将S1(0.97g，2mmol)和三乙胺(1.02g，10mmol)溶解在50mL无水二氯甲烷中，在0℃下搅拌0.5小时，将溶解于无水二氯甲烷中的三光气(1.2g，4mmol)逐滴添加到反应混合物 中，滴加完毕后，在0℃下继续搅拌2小时。反应结束后，减压除去有机溶剂。用硅胶柱层析方 法(洗脱剂：二氯甲烷：甲醇＝5:1,v/v)纯化得到S2，产率74％。 [0129] 1H NMR(400MHz,Chloroform)δ5.25(s,1H),4.19(s,2H),3.33(d,J＝7.1Hz,3H),2.19(d,J＝5.5Hz,2H),2.08‑1.75(m,5H),1.70‑1.43(m,15H),1.41‑1.18(m,10H),1.07 (dd,J＝26.0,22.7Hz,4H),0.96‑0.82(m,15H). [0130] S2‑2产物的合成方法与S2相同。1H NMR(400MHz,Chloroform)δ5.24(s,1H),4.19(s,2H),3.33(d,J＝7.1Hz,3H),2.19(d,J＝6.5Hz,2H),2.07‑1.74(m,5H),1.72‑1.42(m, 17H),1.42‑1.19(m,8H),1.09(t,J＝7.5Hz,3H),1.00‑0.91(m,6H),0.90‑0.78(m,13H). [0131] [0132] 将胆固醇(1.95g，5mmol)，1‑乙基‑3(3‑二甲基丙胺)碳二亚胺盐酸盐(EDCI，1.92g，10mmol)、4‑二甲氨基吡啶(1.24g，10mmol)和6‑溴己酸(1.96g，10mmol)溶于200mL的无水N,N‑二甲基甲酰胺中，在室温下搅拌4小时，反应结束后，减压除去有机溶剂。随后使用 有机试剂乙酸乙酯和饱和食盐水进行萃取，随后收集有机相后并浓缩，最后使用硅胶柱层 析方法(洗脱剂：二氯甲烷：甲醇＝20:1,v/v)纯化得到产品S3，产率68％。 [0133] 1H NMR(400MHz,Chloroform‑d)1H NMR(400MHz,Chloroform)δ5.22(s,1H),4.76(s,1H),3.49(s,2H),2.29(d,J＝20.0Hz,3H),2.17(s,1H),1.97‑1.74(m,6H),1.60(ddd,J ＝27.3,24.4,21.4Hz,10H),1.43‑1.17(m,13H),1.16‑0.98(m,3H),0.95‑0.82(m,12H), 0.74(s,3H). [0134] 化合物S3‑2的合成方法与S3相同。1HNMR(400MHz,Chloroform)δ5.27(s,1H),4.73(s,1H),3.52(s,2H),2.54(s,1H),2.40(s,2H),2.19(s,1H),1.90(dd,J＝38.3,21.7Hz, 6H),1.59(ddd,J＝54.1,20.0,15.1Hz,11H),1.46‑1.36(m,5H),1.36‑1.22(m,6H),1.18‑ 0.97(m,5H),0.93(d,J＝5.0Hz,6H),0.88(s,3H),0.86(s,3H),0.84(s,3H),0.82(s,3H). [0135] [0136] 将胆固醇(1.95g，5mmol)和三乙胺(1.02g，10mol)溶解在50mL无水CH2Cl2中，在0℃下搅拌0.5小时。将溶解于无水二氯甲烷中的三光气(3.04g，10mmol)逐滴添加到反应混合 物中，滴加完毕后，在0℃下继续搅拌2小时，反应结束后，减压除去有机溶剂。用硅胶柱层析 方法(洗脱剂：二氯甲烷：甲醇＝5:1,v/v)纯化得到胆固醇甲酰氯S4，产率89％。 [0137] 1H NMR(400MHz,Chloroform)δ5.27(s,1H),4.79(s,1H),2.41(s,1H),2.19(s,1H),2.01‑1.84(m,4H),1.80‑1.49(m,8H),1.39(d,J＝1.5Hz,2H),1.33‑1.19(m,8H),1.18‑ 0.97(m,3H),0.97‑0.84(m,12H),0.78(s,3H). [0138] 将胆固醇甲酰氯(1.81g，4mmol)，三乙胺(0.41g，4mmol)溶于200mL的无水二氯甲烷中，在0℃下搅拌0.5小时。将溶解于100mL无水二氯甲烷中的1,6‑二己醇(4.72g， 40mmol)，逐滴缓慢滴加至反应混合液中，滴加完毕后，在0℃中继续反应1小时。随后转移至 室温，继续反应过夜。随后使用有机试剂二氯甲烷和饱和食盐水进行萃取，并用硅胶柱层析 方法(洗脱剂：二氯甲烷：甲醇＝10:1,v/v)纯化得到S5，产率91％。 [0139] 1H NMR(400MHz,Chloroform)δ5.25(s,1H),4.92(s,1H),4.22(s,2H),3.61(s,2H),2.77(s,1H),2.18(s,1H),2.02‑1.81(m,4H),1.78‑1.37(m,17H),1.37‑1.18(m,9H), 1.17‑0.96(m,4H),0.95‑0.82(m,12H)0.76(s,3H). [0140] 按照相同的合成方法进行S4‑2及S5‑2的合成。 [0141] S4‑2的核磁表征数据：1HNMR(400MHz,Chloroform)δ5.27(s,1H),4.74(s,1H),2.55(s,1H),2.19(s,1H),2.04‑1.83(m,4H),1.77‑1.45(m,9H),1.45‑1.15(m,11H),1.14‑ 1.01(m,3H),1.01(s,1H),0.94(d,J＝5.0Hz,6H),0.88(s,3H),0.86(s,3H),0.83(s,3H), 0.82(s,3H). [0142] S5‑2的核磁表征数据：1HNMR(400MHz,Chloroform)δ5.27(s,1H),4.82(s,1H),4.23(s,2H),3.63(s,2H),2.32(s,1H),2.13(d,J＝58.6Hz,2H),2.02‑1.84(m,4H),1.79‑ 1.50(m,11H),1.48‑1.35(m,3H),1.30(dd,J＝11.7,6.1Hz,5H),1.24‑1.20(m,3H),1.19‑ 0.99(m,5H),0.94(d,J＝5.0Hz,6H),0.88(s,3H),0.86(s,3H),0.85(s,3H),0.83(s,3H). [0143] [0144] 在含有胆固醇(1.95g，5mmol)和丁二酸酐(0.81g，8mmol)的反应瓶瓶口放置橡胶隔膜，并通过注射器添加甲苯(50mL)作为溶剂。向该搅拌良好的混合物中，通过注射器添加 三乙胺(0.82g，8mmol)，将反应瓶置于60℃油浴中，并继续搅拌，直到反应完成，薄层层析方 法检测反应进程。反应液用2M HCl(3×50mL)、水(3×50mL)和饱和食盐水(80mL)洗涤并收 集有机相，进一步用DCM萃取。然后用无水Na2SO4干燥。在减压下浓缩溶剂，用硅胶柱层析方 法(洗脱剂：二氯甲烷：甲醇＝5:1,v/v)纯化得到S6，收率89％。 [0145] 1H NMR(400MHz,Chloroform)δ5.27(s,1H),4.74(s,1H),2.78(d,J＝46.6Hz,4H),2.37(s,1H),2.19(s,1H),2.02‑1.86(m,4H),1.79(s,1H),1.72‑1.44(m,7H),1.44‑1.20(m, 10H),1.20‑0.96(m,4H),0.96‑0.83(m,12H),0.78(s,3H). [0146] 实施例2：化合物ABn‑1的制备 [0147] [0148] 步骤1：取1,1,1‑三(羟甲基)乙烷(12.1g，0.1mol)、对甲苯磺酰氯(TsCl,57.0g，0.3mol)、三乙胺(100g，1mol)溶于200mL的无水二氯甲烷，在0℃下搅拌2小时。使用有机试 剂乙酸乙酯和饱和食盐水进行萃取，并用硅胶柱层析方法(洗脱剂：二氯甲烷：甲醇＝30:1, v/v)纯化得到中间体B2,产率75％。 [0149] 步骤2：取N‑甲基‑2‑羟基乙胺(7.5g,0.1mol)、B2(13.7g,0.05mol)、碳酸钾(138.0g，1mol)，溶于500mL的无水N,N‑二甲基甲酰胺，在50℃下搅拌2小时，反应结束后，减压除去有机溶剂。随后使用有机试剂乙酸乙酯和饱和食盐水进行萃取，并用硅胶柱层析方 法(洗脱剂：二氯甲烷：甲醇＝5:1,v/v)纯化得到B3，产率89％。 [0150] 步骤3：取B3(15.52g，0.04mol)、三乙胺(40.4g，0.4mol)，溶于500mL的二氯甲烷中，随后将溶解于100mL二氯甲烷中的碳酸酐二叔丁酯Boc2O(34.88g，0.16mol)逐滴缓慢滴 加至上述混合液中，滴加完毕后，在0℃环境中继续反应1h。随后转移至室温，继续反应6h。 粗产物旋蒸除去二氯甲烷后，使用有机试剂乙酸乙酯和饱和食盐水进行萃取，并用硅胶柱 层析方法(洗脱剂：二氯甲烷：甲醇＝20:1,v/v)纯化得到中间体B4产率73％。 [0151] 步骤4：取B4(0.58g，1mmol)、胆固醇衍生物S1(0.49g，1mmol)，碳酸钾(0.28g，2mmol)，溶于200mL的无水N,N‑二甲基甲酰胺，在50℃下搅拌2小时，反应结束后，减压除去 有机溶剂。随后使用有机试剂乙酸乙酯和饱和食盐水进行萃取，并用硅胶柱层析方法(洗脱 剂：二氯甲烷：甲醇＝10:1，v/v)纯化得到B5，产率82％。 [0152] 步骤5：取B5溶于含有20％(v/v)TFA的DCM中，在室温下搅拌2小时，反应结束后，减压除去有机溶剂。随后使用有机试剂乙酸乙酯和饱和食盐水进行萃取，纯化得到ABn‑1，产 率47％。 [0153] 核磁数据表征如下：1H NMR(400MHz,Chloroform)δ5.27(s,1H),3.79(s,2H),3.42(s,4H),3.39‑3.28(m,5H),2.53(s,4H),2.27(s,2H),2.26‑2.12(m,10H),2.08‑1.76(m, 5H),1.72‑1.40(m,16H),1.38‑1.18(m,11H),1.16‑0.96(m,7H),0.95‑0.82(m,12H),0.78 (s,3H). [0154] 实施例3：化合物ABn‑2的制备 [0155] [0156] 步骤1：将二乙醇胺(2.13g，2mmol)、胆固醇衍生物S3(1.13g，2mmol)，碳酸钾(0.28g，2mmol)，溶于200mL的无水N,N‑二甲基甲酰胺中，在50℃下搅拌2小时，反应结束后，减压除去有机溶剂。随后使用有机试剂乙酸乙酯和饱和食盐水进行萃取，并用硅胶柱层析 方法(洗脱剂：二氯甲烷：甲醇＝10:1，v/v)纯化得到C2，产率61％。 [0157] 步骤2：取C2(0.59g，1mmol)、对甲苯磺酰氯(0.76g，4mmol)、三乙胺(1.04g，10mmol)溶于200mL的无水二氯甲烷中，在0℃下搅拌0.5小时。使用有机试剂乙酸乙酯和饱 和食盐水进行萃取，并用硅胶柱层析方法(洗脱剂：二氯甲烷：甲醇＝20:1，v/v)纯化得到中 间体C3,产率72％。 [0158] 步骤3：Boc羟乙基乙基胺(0.284g，1.5mmol)、C3(0.45g，0.5mmol)，碳酸钾(0.28g，2mmol)，溶于100mL的无水N,N‑二甲基甲酰胺中，在50℃下搅拌2小时，反应结束后，减压除 去有机溶剂。随后使用有机试剂乙酸乙酯和饱和食盐水进行萃取，并用硅胶柱层析方法(洗 脱剂：二氯甲烷：甲醇＝20:1，v/v)纯化得到C4。 [0159] 步骤4：将C4溶于含有20％(v/v)TFA的DCM中，在室温下搅拌2小时，反应结束后，减压除去有机溶剂。随后使用有机试剂乙酸乙酯和饱和食盐水进行萃取，并用硅胶柱层析方 法(洗脱剂：二氯甲烷：甲醇＝10:1，v/v)纯化得到ABn‑2，产率51％。 [0160] 核磁数据表征如下：1H NMR(400MHz,Chloroform)δ5.26(s,1H),4.75(s,1H),3.41(s,4H),3.05(s,1H),2.78(s,4H),2.69(s,2H),2.56(s,4H),2.36(dd,J＝3.0,2.0Hz,11H), 2.18(s,1H),1.95(dd,J＝36.7,35.2Hz,5H),1.74‑1.47(m,11H),1.47‑1.29(m,7H),1.29‑ 1.20(m,7H),1.17‑0.96(m,11H),0.95‑0.83(m,12H),0.76(s,3H). [0161] 实施例4：化合物ABn‑3的制备 [0162] [0163] 步骤1：将1,3‑二氯丙醇(0.26g，2mmol)，Boc羟乙基乙基胺(0.38g，2mmol)，碳酸钾(0.28g，2mmol)，溶于200mL的无水N,N‑二甲基甲酰胺中，在50℃下搅拌2小时，反应结束后，减压除去有机溶剂。随后使用有机试剂乙酸乙酯和饱和食盐水进行萃取，并用硅胶柱层析 方法(洗脱剂：乙酸乙酯：石油醚＝1:5，v/v)纯化得到D2，产率62％。 [0164] 步骤2：将D2(0.44g，1mmol)，S3(0.57g，1mmol)，碳酸钾(0.28g，2mmol)，溶于100mL的无水N,N‑二甲基甲酰胺中，在50℃下搅拌2小时，反应结束后，减压除去有机溶剂。随后使用有机试剂乙酸乙酯和饱和食盐水进行萃取，并用硅胶柱层析方法(洗脱剂：二氯甲烷：甲 醇＝20:1，v/v)纯化得到D3，产率58％。 [0165] 步骤3：将D3溶于含有20％(v/v)TFA的DCM中，在室温下搅拌2小时，反应结束后，减压除去有机溶剂。随后使用有机试剂乙酸乙酯和饱和食盐水进行萃取，并用硅胶柱层析方 法(洗脱剂：二氯甲烷：甲醇＝10:1，v/v)纯化得到ABn‑3，产率64％。 [0166] 核磁表征数据如下：1H NMR(400MHz,Chloroform)δ5.27(s,1H),4.81(s,1H),3.76(s,1H),3.42(s,4H),3.34(s,2H),2.79(d,J＝0.6Hz,6H),2.55(d,J＝19.7Hz,6H),2.35(d, J＝14.4Hz,3H),2.19(s,1H),2.02‑1.81(m,5H),1.73‑1.47(m,10H),1.47‑1.18(m,14H), 1.17‑0.97(m,9H),0.96‑0.83(m,12H)0.77(s,3H). [0167] 实施例5：化合物ABn‑4的制备 [0168] [0169] 步骤1：将二乙醇胺(0.32g，3mmol)、胆固醇衍生物S3‑2(1.78g，3mmol)，碳酸钾(0.69g，5mmol)，溶于100mL的无水N,N‑二甲基甲酰胺，在50℃下搅拌2小时，反应结束后，减压除去有机溶剂。随后使用有机试剂乙酸乙酯和饱和食盐水进行萃取，并用硅胶柱层析方 法(洗脱剂：二氯甲烷：甲醇＝10:1，v/v)纯化得到E2，产率85％。 [0170] 步骤2：取E2(1.23g，2mmol)、对甲苯磺酰氯(0.95g，5mmol)、三乙胺(0.51g，5mmol)溶于100mL的无水二氯甲烷中，在0℃下搅拌0.5小时。使用有机试剂乙酸乙酯和饱和食盐水 进行萃取，并用硅胶柱层析方法(洗脱剂：二氯甲烷：甲醇＝20:1，v/v)纯化得到中间体E3, 产率79％。 [0171] 步骤3：将1,5‑双‑Boc‑3‑氮戊烷(0.92g，3mmol)、E3(0.93g，1mmol)，碳酸钾(0.69g，5mmol)，溶于150mL的无水N,N‑二甲基甲酰胺中，在50℃下搅拌2小时，反应结束后，减压除去有机溶剂。随后使用有机试剂乙酸乙酯和饱和食盐水进行萃取，并用硅胶柱层析 方法(洗脱剂：二氯甲烷：甲醇＝20:1，v/v)纯化得到E4，产率50％。 [0172] 步骤4：将E4溶于含有20％(v/v)TFA的DCM中，在室温下搅拌2小时，反应结束后，减压除去有机溶剂。随后使用有机试剂乙酸乙酯和饱和食盐水进行萃取，并用硅胶柱层析方 法(洗脱剂：二氯甲烷：甲醇＝10:1，v/v)纯化得到ABn‑4，产率46％。 [0173] 1H NMR(400MHz,Chloroform)δ5.27(s,1H),4.61(s,1H),3.42(s,8H),2.70(s,2H),2.57(s,8H),2.38(d,J＝13.0Hz,10H),2.27‑2.04(m,3H),1.72‑1.49(m,10H),1.48‑ 1.30(m,8H),1.30‑1.21(m,8H),1.18‑1.03(m,4H),0.94(t,J＝6.6Hz,7H),0.88(s,4H), 0.86(s,3H),0.84(s,3H),0.82(s,3H). [0174] 实施例6：化合物ABn‑5的制备 [0175] [0176] 步骤1：取1,1,1‑三(羟甲基)乙烷(12.1g，0.1mol)、对甲苯磺酰氯(57.0g，0.3mol)、三乙胺(100g，1mol)溶于200mL的无水二氯甲烷，在0℃下搅拌2小时。使用有机试 剂乙酸乙酯和饱和食盐水进行萃取，并用硅胶柱层析方法(洗脱剂：二氯甲烷：甲醇＝30:1, v/v)纯化得到中间体F2,产率75％。 [0177] 步骤2：取N‑乙基‑4‑羟基丁胺(22.81g，195mmol)、F2(17.81g，65mmol)、碳酸钾(27.8g，200mmol)，溶于500mL的无水N,N‑二甲基甲酰胺中，在50℃下搅拌2小时，反应结束 后，减压除去有机溶剂。随后使用有机试剂乙酸乙酯和饱和食盐水进行萃取，并用硅胶柱层 析方法(洗脱剂：乙酸乙酯：石油醚＝1:5，v/v)纯化得到F3，产率48％。 [0178] 步骤3：取F3(14.16g，30mmol)、三乙胺(3.03g，30mmol)，溶于200mL的二氯甲烷中，随后将碳酸酐二叔丁酯Boc2O(13.08g，60mmol)溶解于300mL的二氯甲烷中逐滴缓慢滴加至 上述混合液中，滴加完毕后，在0℃环境中继续反应1小时。随后转移至室温，继续反应6小 时。粗产物旋蒸除去二氯甲烷后，使用有机试剂乙酸乙酯和饱和食盐水进行萃取，并用硅胶 柱层析方法(洗脱剂：乙酸乙酯：石油醚＝1:5，v/v)纯化得到中间体F4,产率71％。 [0179] 步骤4：将F4(0.68g，1mmol)、β‑谷甾醇衍生物S5‑2(0.53g，1mmol)，碳酸钾(1.4g，10mmol)，溶于100mL的无水N,N‑二甲基甲酰胺中，在50℃下搅拌2小时，反应结束后，减压除 去有机溶剂。随后使用有机试剂乙酸乙酯和饱和食盐水进行萃取，并用硅胶柱层析方法(洗 脱剂：二氯甲烷：甲醇＝20:1,，v/v)纯化得到F5，产率40％。 [0180] 步骤5：将F5溶于含有20％(v/v)TFA的DCM中，在室温下搅拌2小时，反应结束后，减压除去有机溶剂。随后使用有机试剂乙酸乙酯和饱和食盐水进行萃取，并用硅胶柱层析方 法(洗脱剂：二氯甲烷：甲醇＝10:1，v/v)纯化得到ABn‑5，产率33％。 [0181] 核磁数据表征如下：1H NMR(400MHz,Chloroform)δ5.27(s,1H),4.83(s,1H),4.23(s,2H),3.79(s,2H),3.46(s,4H),3.33(s,2H),2.79(s,4H),2.70(s,4H),2.25(t,J＝ 8.5Hz,5H),2.15(d,J＝39.6Hz,2H),1.96(t,J＝32.9Hz,4H),1.75‑1.47(m,16H),1.47‑ 1.19(m,16H),1.18‑1.04(m,12H),1.02‑0.91(m,7H),0.88(s,3H),0.86(s,3H),0.84(s, 3H),0.82(s,3H). [0182] 实施例7：化合物ABn‑6的制备 [0183] [0184] 步骤1：将二乙醇胺(0.21g，2mmol)、胆固醇衍生物S3(1.13g，2mmol)，碳酸钾(0.69g，5mmol)，溶于100mL的无水N,N‑二甲基甲酰胺中，在50℃下搅拌2小时，反应结束后，减压除去有机溶剂。随后使用有机试剂乙酸乙酯和饱和食盐水进行萃取，并用硅胶柱层析 方法(洗脱剂：二氯甲烷：甲醇＝10:1,v/v)纯化得到G2，产率52％。 [0185] 步骤2：取G2(0.59g，1mmol)、对甲苯磺酰氯(0.76g，4mmol)、三乙胺(1.0g，10mmol)溶于100mL的无水二氯甲烷中，在0℃下搅拌0.5小时。使用有机试剂乙酸乙酯和饱和食盐水 进行萃取，并用硅胶柱层析方法(洗脱剂：二氯甲烷：甲醇＝20:1,v/v)纯化得到中间体G3, 产率69％。 [0186] 步骤3：将N‑BOC‑2‑(2‑甲基氨基‑乙氧基)‑乙胺盐酸盐(0.66g，3mmol)、胆固醇衍生物G3(0.49g，0.5mmol)，碳酸钾(0.28g，2mmol)，溶于100mL的无水N,N‑二甲基甲酰胺中，在50℃下搅拌2小时，反应结束后，减压除去有机溶剂。随后使用有机试剂乙酸乙酯和饱和 食盐水进行萃取，并用硅胶柱层析方法(洗脱剂：二氯甲烷：甲醇＝10:1，v/v)纯化得到G4, 产率67％。 [0187] 步骤4：将G4溶于含有20％(v/v)TFA的DCM中，在室温下搅拌2小时，反应结束后，减压除去有机溶剂。随后使用有机试剂乙酸乙酯和饱和食盐水进行萃取纯化得到ABn‑6，产率 61％。 [0188] 1H NMR(400MHz,Chloroform)δ5.27(s,1H),4.58(s,1H),3.70(s,4H),3.52(d,J＝15.0Hz,8H),2.70(s,2H),2.51(s,4H),2.39(d,J＝15.8Hz,10H),2.32‑2.12(m,8H),1.92 (dd,J＝13.7,6.4Hz,5H),1.66(t,J＝6.8Hz,5H),1.55(dd,J＝30.7,16.7Hz,4H),1.46‑ 1.18(m,19H),1.17‑0.98(m,4H),0.95‑0.83(m,12H),0.77(s,3H). [0189] 实施例8：化合物ABn‑7的制备 [0190] [0191] 步骤1：将β‑谷甾醇甲酰氯S4‑2(0.95g，2mmol)，三乙胺(0.2g，2mmol)溶于200mL的无水二氯甲烷中，在0℃下搅拌0.5小时。将2‑[2‑(2‑溴乙氧基)乙氧基]乙胺(H1，10mmol)溶解于100mL的无水二氯甲烷中逐滴缓慢滴加至上述混合液中，滴加完毕后，在0℃环境中继续反应1小时。随后转移至室温，继续反应过夜。随后使用有机试剂乙酸乙酯和饱和食盐水 进行萃取，并用硅胶柱层析方法(洗脱剂：二氯甲烷：甲醇＝10:1，v/v)纯化得到H2，产率 85％。 [0192] 步骤2：将1,3‑二氯丙醇(H3,0.26g，2mmol)，Boc羟乙基甲基胺(0.35g，2mmol)，碳酸钾(0.28g，2mmol)溶于200mL的无水N,N‑二甲基甲酰胺，在50℃下搅拌2小时，反应结束 后，减压除去有机溶剂。随后使用有机试剂乙酸乙酯和饱和食盐水进行萃取，并用硅胶柱层 析方法(洗脱剂：乙酸乙酯：石油醚＝1:5，v/v)纯化得到H4，产率80％。 [0193] 步骤3：将H4(406mg，1mmol)，H2(652mg，1mmol)，碳酸钾(280mg，2mmol)，溶于200mL的无水N,N‑二甲基甲酰胺，在50℃下搅拌2小时，反应结束后，减压除去有机溶剂。随后使用有机试剂乙酸乙酯和饱和食盐水进行萃取，并用硅胶柱层析方法(洗脱剂：二氯甲烷：甲醇 ＝20:1，v/v)。纯化得到粗产品，将粗产品溶于含有20％(v/v)TFA的DCM中，在室温下搅拌2 小时，反应结束后，减压除去有机溶剂。随后使用有机试剂乙酸乙酯和饱和食盐水进行萃 取，并用硅胶柱层析方法(洗脱剂：二氯甲烷：甲醇＝10:1，v/v)纯化得到ABn‑7，产率48％。 [0194] 1H NMR(400MHz,Chloroform)δ5.26(s,1H),4.86(s,1H),4.18(s,1H),3.66(s,2H),3.51(s,8H),3.42(d,J＝2.9Hz,5H),3.04(s,2H),2.53(s,4H),2.44(s,4H),2.30‑2.08 (m,9H),2.06‑1.83(m,4H),1.70‑1.48(m,11H),1.47‑1.33(m,4H),1.33‑1.19(m,8H),1.18‑ 0.97(m,5H),0.93(d,J＝5.0Hz,6H),0.88(s,3H),0.86(s,3H),0.84(s,3H),0.82(s,3H). [0195] 实施例9：化合物ABn‑8的制备 [0196] [0197] 步骤1：将溴代‑四聚乙二醇‑溴代(I1，9.6g，30mmol)、β‑谷甾醇(7.74g，20mmol)，碳酸钾(2.8g，20mmol)溶于500mL的无水N,N‑二甲基甲酰胺中，在50℃下搅拌2小时，反应结束后，减压除去有机溶剂。随后使用有机试剂乙酸乙酯和饱和食盐水进行萃取，并用硅胶柱 层析方法(洗脱剂：二氯甲烷：甲醇＝15:1，v/v)纯化得到I2，产率71％。 [0198] 步骤2：将1,3‑二氯丙醇(I3,5.08g，4mmol)，Boc羟乙基丁胺(2.2g，10mmol)，碳酸钾(1.4g，10mmol)溶于200mL的无水N,N‑二甲基甲酰胺中，在50℃下搅拌2小时，反应结束 后，减压除去有机溶剂。随后使用有机试剂乙酸乙酯和饱和食盐水进行萃取，并用硅胶柱层 析方法(洗脱剂：乙酸乙酯：石油醚＝1:5，v/v)纯化得到I4，产率68％。 [0199] 步骤3：将I4(1.0g，2mmol)，I2(1.31g，2mmol)，碳酸钾(0.28g，2mmol)，溶于200mL的无水N,N‑二甲基甲酰胺中，在50℃下搅拌2小时，反应结束后，减压除去有机溶剂。随后使 用有机试剂乙酸乙酯和饱和食盐水进行萃取，并用硅胶柱层析方法(洗脱剂：二氯甲烷：甲 醇＝20:1，v/v)纯化。纯化得到粗产品溶于含有20％(v/v)TFA的DCM中，在室温下搅拌2小 时，反应结束后，减压除去有机溶剂。随后使用有机试剂乙酸乙酯和饱和食盐水进行萃取， 浓缩减压得到ABn‑8，产率57％。 [0200] 1H NMR(400MHz,Chloroform)δ5.27(s,1H),3.87(s,1H),3.55(d,J＝9.5Hz,4H),3.52(s,12H),3.38(d,J＝38.0Hz,5H),2.71(d,J＝9.3Hz,6H),2.56(d,J＝11.1Hz,6H), 1.92(dd,J＝54.3,34.3Hz,5H),1.73‑1.48(m,8H),1.47‑1.35(m,7H),1.35‑1.19(m,12H), 1.07(dd,J＝26.2,21.8Hz,4H),0.92(dd,J＝15.3,5.3Hz,13H),0.88(s,3H),0.86(s,3H), 0.84(s,3H),0.82(d,3H). [0201] 实施例10：化合物ABn‑9的制备 [0202] [0203] 步骤1：2‑(双(2‑氨基乙基)氨基)乙基氨基甲酸叔丁酯(J1,24.6g，10mmol)溶于300mL无水DMF中，低温下加入环氧乙烷(4.45g,100mmol)。密封条件下加热至90℃，反应7 天。粗产品用硅胶柱分离纯化，收集目标洗脱液，浓缩得到产物J2。产品J2溶于含有20％(v/ v)TFA的DCM中，在室温下搅拌2小时，反应结束后，减压除去有机溶剂。随后使用有机试剂乙 酸乙酯与饱和食盐水进行萃取，得到J3，产率32％。 [0204] 步骤2：将S2‑2(2.56g，4mmol)、三乙胺(0.44g，4mmol)溶于200mL的无水二氯甲烷，在0℃下搅拌0.5小时。将J3(0.97g，3mmol)溶解于100mL的无水二氯甲烷中逐滴缓慢滴加至 上述混合液中，滴加完毕后，在0℃环境中继续反应1小时。随后转移至室温，继续反应过夜。 随后使用有机试剂乙酸乙酯和饱和食盐水进行萃取，并用硅胶柱层析方法(洗脱剂：二氯甲 烷：甲醇＝2:1,，v/v)纯化得到ABn‑9，产率68％。 [0205] 1H NMR(400MHz,Chloroform)δ5.26(s,1H),4.60(s,1H),3.89(s,2H),3.56‑3.33(m,11H),3.25(s,2H),2.56(s,8H),2.46(s,2H),2.37(s,8H),2.20(d,J＝12.6Hz,2H),1.90 (dd,J＝23.2,20.3Hz,5H),1.75‑1.48(m,13H),1.47(s,3H),1.44‑1.34(m,7H),1.33‑1.19 (m,7H),1.08(dd,J＝26.0,17.9Hz,4H),0.93(d,J＝5.0Hz,5H),0.88(s,3H),0.86(s,3H), 0.84(s,3H),0.82(s,3H). [0206] 实施例11：化合物ABn‑10的制备 [0207] [0208] 将K1(1.82g，5mmol)、胆固醇衍生物K2(2.9g，4.5mmol)和碳酸钾(0.69g，5mmol)溶于300mL的无水N,N‑二甲基甲酰胺中，在50℃下搅拌2小时，反应结束后，减压除去有机溶 剂。随后使用有机试剂乙酸乙酯和饱和食盐水进行萃取，并用硅胶柱层析方法(洗脱剂：二 氯甲烷：甲醇＝2:1，v/v)纯化得到ABn‑10，产率54％。 [0209] 1H NMR(400MHz,Chloroform)δ5.27(s,1H),3.55(d,J＝9.6Hz,4H),3.52(s,8H),3.42(s,8H),3.33(d,J＝9.7Hz,3H),2.57(d,J＝1.3Hz,10H),2.36(s,10H),2.19(d,J＝ 4.7Hz,2H),2.07‑1.78(m,5H),1.72‑1.46(m,16H),1.44‑1.17(m,13H),1.15‑0.97(m,5H), 0.96‑0.92(m,6H),0.88(s,4H),0.86(s,3H),0.84(s,3H),0.82(s,3H). [0210] 实施例12微流控制备三组分甾类阳离子脂质纳米颗粒 [0211] 分别将上述实施例2‑11制备得到的甾类阳离子脂质化合物，以及二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二肉豆蔻酰甘油‑聚乙二醇2000(DMG‑PEG2000)均配制成10mg/mL的乙醇储备 溶液；firefly luciferase(luc)mRNA配成100‑150μg/ml水溶液。随后按照表1所示摩尔比 将甾类阳离子脂质、DSPC和DMG‑PEG2000作为脂质，和firefly luciferase(luc)mRNA，(其 用量根据表1中的N/P定量)通过微流控制备系统制备含有核酸药物的甾类阳离子脂质纳米 颗粒。脂质溶液(甾类阳离子脂质、DSPC和DMG‑PEG2000三种脂质按表1所示摩尔比混合后的 混合溶液)经微流控芯片的流速为4ml/min，mRNA溶液经微流控芯片的流速为12ml/min。制 备过程使用注射用水以3倍流速在线稀释3.5倍，边稀释边搅拌，制备完毕后用超纯水再稀 释10倍，得到100mL混合溶液。超滤，去除乙醇，得到含有核酸药物的甾类阳离子脂质纳米颗 粒组合物制剂。 [0212] 另外，以阳离子脂质CCK‑E12为对照，按表1组成和配比以本实施例的制备方法制备对照组的阳离子脂质纳米颗粒。 [0213] 表1阳离子脂质纳米颗粒的组成 [0214] [0215] [0216] 注：“N/P”为阳离子脂质的三级胺基团与核酸分子中的磷酸根单元的摩尔比，由以下公式获得：N/P＝CN/CP；CN＝C*n*V；CP＝C核酸*V核酸/M碱基平均； [0217] 其中，C、V、n分别为本发明阳离子脂质化合物的摩尔浓度、体积和包含三级胺基团的个数； [0218] C核酸为核酸的质量浓度、M碱基平均为330g/mol、V核酸为核酸的体积。 [0219] 实施例13甾类阳离子脂质纳米颗粒粒径、包封率及稳定性的相关表征 [0220] 对实施例12制备得到的含有核酸药物的甾类阳离子脂质纳米颗粒进行下述几个方面的检测： [0221] 1.甾类阳离子脂质纳米颗粒组合物的粒径测定：将该甾类阳离子脂质纳米颗粒组合物按照(1:50)的比例稀释在MiliQ超纯水中，使用纳米粒度分析仪(DLS)检测其纳米粒径 以及PDI粒径分散度。 TM [0222] 2.甾类阳离子脂质纳米颗粒的mRNA包封率测定：参照试剂盒Quant‑iTRNAAssay Kit*2000assays*(LotNumber：2397779，Thermo Fisher)说明书(或者标准规程) 进行测定。包封率＝(C总‑C外)/C总*100％。 [0223] 3.甾类阳离子脂质纳米颗粒组合物的稳定性测试：将该甾类阳离子脂质纳米颗粒组合物在21℃±3℃条件下放置，于0小时，2小时，6小时，12小时，24小时，48小时，72小时， 108小时，132小时取样，按照(1:50)的比例稀释在MiliQ超纯水中，使用纳米粒度分析仪 (DLS)检测不同时间点的纳米粒径以及PDI粒径分散度。 [0224] 检测结果： [0225] 1、粒径分布结果如图1所示：本发明制备的甾类阳离子脂质纳米颗粒粒径均较小，均在200nm以内，并且大部分纳米颗粒的平均纳米粒径在150nm以内。150nm以内的颗粒可以 避免肾脏清除及肝脏清除，从而延长药物在体内的循环时间，这有助于避免药物在早期被 清除，提高药物靶向输送的效率。并且，较小的纳米颗粒有助于制备过程中的除菌操作，可 以更容易经过微孔滤器和微孔膜，使得除菌操作更加有效，这对于确保药物输送系统的无 菌性和质量控制至关重要。另外，小尺寸的纳米颗粒有助于更好地实现靶向输送，将药物精 确送达到病变组织或细胞，这有助于减少对健康组织的不必要影响。 [0226] 2、PDI分布结果如图2所示：本发明制备的甾类阳离子脂质纳米颗的PDI较小，说明其粒径分布均一，尤其是M2、M3、M5、M11、M13、M16、M20、M21、M22、M23、M30等甾类阳离子脂质纳米颗粒的PDI在0.2以内，这些纳米颗粒的尺寸分布很窄，颗粒之间的尺寸差异很小，能够 在应用中稳定分散并具有一致性。 [0227] 3、mRNA包封率结果如图3所示：各甾类阳离子脂质纳米颗粒组合物的包封率均大于60％。其中，包封率大于80％的组合物有：M1、M2、M3、M4、M5、M7、M8、M9、M11、M12、M13、M14、M15、M16、M18、M19、M20、M21、M22、M23等。 [0228] 4、稳定性结果如表2所示：将132小时内纳米粒径变化不超过20nm定义为纳米颗粒稳定性良好，变化范围在20‑50nm的定义为稳定性一般，变化范围超过50nm定义为稳定性 差。据表2的数据可知，有15组稳定性良好，分别是M1、M2、M3、M5、M6、M7、M8、M11、M14、M16、M17、M21、M26、M27、M28、M30；LNP、M4、M10、M12、M13、M15、M18、M20、M22、M25、M29稳定性一般； M9、M14、M19、M23、M24稳定性较差。 [0229] 表2、甾类阳离子脂质纳米颗粒的稳定性 [0230] [0231] [0232] 实施例14：细胞水平mRNA转运效率 [0233] 本实验以人胚肾细胞293T细胞作为细胞模型，以firefly luciferase(luc)mRNA为模型核酸药物，考察N/P为6/1的各组含有核酸药物的甾类阳离子脂质纳米颗粒组合物制 剂(实施例12所述)的核酸转运率。 [0234] S1、在96孔板中，细胞培养到细胞密度达到80％时，将各组含有核酸药物的甾类阳离子脂质纳米颗粒组合物制剂加入培养基中，去除原培养基，每孔加入规定量Optim‑MEM (低血清培养基)培养，在37℃、5％CO2的细胞培养箱中孵育培养24h，然后吸弃旧培养基，换 上新鲜培养基继续培养24h。 [0235] S2、加入底物荧光素钾(15mg/mL，分装)，使用无菌PBS配置，使得在培养基中的终浓度是15μg/mL。在10‑30min内使用多功能酶标仪检测荧光素酶Luc的强度确定转染效果。 [0236] 实验结果如图4所示：与阳性对照组相比，实验组均有相当的的荧光素酶表达效果，即有很好的基因表达效果，说明了本发明的甾类阳离子脂质及以本发明的甾类阳离子 脂质制备的阳离子脂质纳米颗粒能进一步提高mRNA核酸的转染率。 [0237] 实施例15：细胞水平mRNA内涵体逃逸效果 [0238] 本实验以人胚肾细胞293T细胞作为细胞模型，以Cy5‑eGFP‑mRNA为模型核酸药物，考察N/P为6/1的各组含有核酸药物的甾类阳离子脂质纳米颗粒组合物制剂(制备方法同实 施例12)的核酸转运率。具体步骤如下： [0239] 1)将圆形盖玻片用无水酒精清洗后，置于24孔板中，紫外消毒15min。 [0240] 2)以每孔8×104个细胞的密度将293T细胞种植于上述培养板中，置于培养箱中过夜。 [0241] 3)分别换入新的含有甾类阳离子脂质纳米颗粒的培养基中孵育6h。 [0242] 4)吸除旧培养液，PBS轻微清洗细胞。 [0243] 5)加入Lyso‑Tracker Red(溶酶体红色荧光探针，10μM)，37℃孵育30min,PBS轻微清洗细胞。 [0244] 6)加入1mL4％多聚甲醛固定，室温下固定15min；PBS轻微清洗细胞三遍。 [0245] 7)PBS轻微清洗细胞三遍，室温下DAPI(1:1000稀释)染色3min。 [0246] 8)PBS轻微清洗细胞三遍，封片。 [0247] 9)使用激光扫描共聚焦显微镜观察eGFP蛋白与溶酶体的共定位情况。使用imagej软件计算Cy5‑mRNA与溶酶体的皮尔森共定位系数(Pearson Correlation Coefficient)。 [0248] 实验结果如图5所示：通过内涵体与Cy5‑mRNA的共定位系数反应了内涵体逃逸效果。共定位系数越大，代表内涵体逃逸效果越差，反之亦然。如图所示，对照组中Cy5标记的 mRNA与溶酶体有明显的共定位，实验组的Cy5标记的mRNA与溶酶体的共定位比例明显降低。 说明了本发明的甾类阳离子脂质及以本发明的甾类阳离子脂质制备的阳离子脂质纳米颗 粒能够促进内涵体逃逸，并能进一步提高mRNA的表达量。其中，各组合LNP表达内涵体逃逸 效果较好的组是：M6、M14、M16、M22、M26。 [0249] 以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以下实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存 在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。 |
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