一种抑制血管新生的雌甾硝酸酯药物

一种抑制血管新生的雌甾硝酸酯药物

技术领域：

本发明属于医药领域，特别涉及式（1)化合物及其合成方法。本发明也涉及该化合物在 药物上的用途和药用制剂，特别是针对血管新生疾病如肿瘤、眼部血管新生疾病的治疗。 背景技术：

血管新生包括两个概念：胚胎期的血管发生(vasculogenesls， VG)和出生后的血管生成 (anglogenesls， AG) 。 VG指的是在没有血管系统的情况下，由血管内皮祖细胞（endothelial progenitor, cells, EPCs)或成血管细胞（angloblasts)分化成内皮细胞，并形成血管网。AG 指的是在成体血管，由己经存在的成熟内皮细胞冲破管壁基质迁移，增殖和重构，以发芽方 式使血管树枝持续延长。本发明中的血管新生是指出生后的血管生成(anglogenesls， AG)。 血管新生(anglogenesls)不但是正常生理变化中（如生长、伤口愈合)所必需有的过程，近年 来科学家们也发现它和肿瘤、老年性黄斑变性、恶性血液病等许多疾病的发展有密切的关系。 抑制病理性的血管新生，可以治疗或减缓肿瘤、老年性黄斑变性、恶性血液病等许多疾病。

目前临床治疗肿瘤的方法大多是针对不同肿瘤采用不同的方法，并且绝大部分是针对肿 瘤细胞进行治疗。而肿瘤生长是一个复杂的过程，它受到多种因素的影响，其中包括肿瘤血 管网的建立。许多研究己经证明肿瘤生长必须依赖血管生成，通过抑制血管生成的某些环节 或整个过程，进而控制肿瘤的生长，对肿瘤治疗和防止肿瘤远处转移有重要意义。70年代初 随着肿瘤生长依赖于血管形成概念的提出，也相应提出了抗血管形成治疗的概念，即通过阻 止新生血管的发生和/或新生血管网的扩展和/或破坏新生血管来阻止小的实体瘤的产生或 建立，以阻止肿瘤生长、发展和转移。国外报道较多的肝素加氢化可的松.被公认为能有效 地抑制血管生成。实验证实，其二者联合应用能抑制鸡胚绒毛尿囊膜上血管的生成，井能使 肿瘤消退和阻止转移，还可抑制肿瘤引起的兔角膜血管新生。

而血管内皮生长因子（VEGF)是一类多功能的生长因子，具有促进内皮细胞增殖、诱导 血管形成的作用， 一般认为抑制血管内皮生长因子（VEGF)可以治疗或减缓病理性血管新生。

血管内皮生长因子（VEGF)与新生血管有关的疾病如肿瘤、眼部新生血管疾病、恶性血 液病、支气管哮喘等疾病有密切关系，通过抑制血管内皮生长因子（VEGF)，可以治疗或减缓 这些疾病，大量文献均有这方面的报道如《综述VEGF的结构特征及生物学功能》（中华临床医 学研究杂志，2007年13巻3期，388)、《血管内皮生长因子及其受体在妇科疾病中的研究进 展》（河北医药2006年28巻12期，1192-1194)、《血管内皮生长因子与肿瘤关系研究进展》 (广西医科大学学报，2006年23巻2期，333-335)、《VEGF相关抗肿瘤治疗的研究现状》（吉 林医学，2006年27巻5期，454-457)、《靶向VEGF治疗恶性肿瘤的研究进展》（现代肿瘤医学， 2006年14巻3期，370-372)、《VEGF和PEDF对眼底新生血管的共同调节作用》（国外医学：临 床生物化学与检验学分册，2005年26巻ll期，819-821)、《眼底新生血管防治的研究进展》 (眼科新进展，2000年20巻6期，449-451)、《血管内皮生长因子及其受体与眼内新生血管 性疾病》(眼科研究,2003年21巻l期,103-106)、《VEGF与恶性血液病的关系》(国外医学: 生理病理科学与临床分册，2004年24巻2期，183-185)、《脑白质疏松患者血清VEGF水平的 研究》（疑难病杂志，2007年6巻l期，10-11)、《血管内皮生长因子与支气管哮喘》（实用医 学杂志，2007年第23巻第3期，433)。

已知有多种药物可抑制新血管的形成（血管生成或新生血管形成）。例如，在Oum等人的"一类新的类固醇在肝素或肝素片段的存在下抑制血管生成"（A New Class of steroids Inhibits Anglogenesls In the Presence Of Heparin or a Heparin Fragment , Science , Vol . 230 : 1375-1378 ， 1985年12月20日） 一文中，公开了可在肝素或特定肝素片段的 存在下抑制血管生成的类固醇。作者将所述类固醇称为"血管抑制（anglostatlc )"类固 醇。此类被发现具有血管抑制作用的类固醇中所包括的有可的松和去氧可的松的二氢和四氢 代谢物。在测试有关所述机理的假说的后续研究中证明：肝素/血管抑制类固醇组合物导致 基底膜支架溶解，在所述支架上连接有贴壁依赖性内皮，从而导致毛细管萎縮（lnvokitlori); 其中所述机制是类固醇通过其来抑制血管生成的机制；参见lngber等人的"通过血管抑制类 固醇来抑制血管生成的可能机理：毛细管基底膜溶解的诱导"（A Possible Mechanism for Inhibition of Anglogenesls by Anglostatlc Steroids : Induction of Capillary Basement Membrane Dissolution , Endocrinology Vol . 119 : 1768-1775 , 1986 )。

在Arlstoff等人的美国专利US 4 ， 975 ， 537中公开了一组可用于抑制血管生成的四 氢类固醇.该专利公开所述化合物可用于治疗头部创伤、脊柱创伤、败血症性休克或创伤性 休克、中风和出血性休克。此外，该专利还讨论了这些化合物在胚胎植入以及在治疗癌症、 关节炎和动脉硬化中的作用。在美国专利us4771 ,042中公开了Arlstoff等人的专利中所公 开的某些类固醇与肝素或肝素片段组合来抑制温血动物的血管生成。LI等人，"通过硫酸化 环糊精而增强效力的血管抑制类固醇抑制角膜新生血管形成"（Anglostatlc Steroids Potentiated by Sulphated Cyclodextrln Inhibit Corneal Neovascularization, Investigative ophthalmology and Visual Science , Vol 32( 11 ):2898-2905, 1991年 10月）。类固醇单独使用可使新生血管形成多少减轻一些，但是仅单独使用不能有效消退新生 血管形成。

四氢可的松已经作为血管抑制类固醇，在Folkman等人的"血管抑制类固醇" (Anglostatlc steroids, Ann. Surg， Vol. 206( 3 ),1987) 一文中公开，其中该文献提出血管 抑制类固醇可能可用于治疗由新生血管形成异常所控制的疾病，包括糖尿病性视网膜病、新 生血管性青光眼以及晶状体后纤维组织形成。

CN03818826中介绍了乙酸阿奈可他是一种开发用于抑制眼睛新血管生成的血管抑制剂。 该发明涉及用于预防AMD相关性视力丧失、维持AMD患者的视力以及抑制AMD相关性损害发展 的制剂和方法。该制剂和方法涉及巩膜旁施用3-30mg的乙酸阿奈可他或其相应的醇以提供经 巩膜的药物释放。

发明内容：

一种如下通式的化合物1或其酯或盐：

T-(B-0-N02)tl， tl为l或2， T-H为甾体化合物，T为化合物T-H除去H的甾体残基，T与H 是以T上的氧原子与H相连，形成羟基即O-H的形式相连。TH

B与TH上的tl个羟基以酯键形式相连，即TH上的tl个取代基的-0H中的0分别与tl个B 上的-C=0-相连形成-0-C0-， tl为2时，TH上的两个羟基分别与两个-B-0-N02相连，这两个 -B-O-N02基团中的B在其定义的范围内可以相同或不同。

TH的取代通式中所示的CH基中的H或CH2基中的H2可以不存在取代基，也可以存在的取代 基，各位置的取代基可为：

在第3位：可以是0R3， R3是H或十个碳以内的碳氢化合物或含有l-2个杂原子的十个碳以 内的碳氢化合物，杂原子为N， 0， S中的一种或两种； 在9， 11位：可以是双键

在ll位：可以是羟基

在17位：可以是酮基、0H、或0-CO-R， R为十个碳以内的碳氢化合物或含有l-2个杂原子的 十个碳以内的碳氢化合物，杂原子为N， 0， S中的一种或两种 Rl可以为氢或具有1至4个碳原子的直链或支链烷基 X可为O， S中的一种或是不存在

R2可以不存在或为H、十个碳以内的碳氢化合物或含有l-2个杂原子的十个碳以内的碳氢化 合物，杂原子为N， 0， S中的一种或两种 B为-CO (0) a (CR4R5) b. D (CR4R5) b..-

a为O或l,b' ，b"可以相同或不同，并为0至6的整数，R4， R5相同或不同，并选自H， 1 至6碳的碳氢化合物，D可以不存在也可以为含有0至两个杂原子的1至8碳的碳氢化合物， 杂原子为N， 0， S中的一种或两种，

B中所述的任一R4取代基在其定义的范围内可以相同或不同。

B中所述的任一 R5取代基在其定义的范围内可以相同或不同。

优选：Rl为甲基。

优选：TH的17位为0H

优选：X可以为O

优选：TH的9， 11位为双键。

优选：tl为1时，TH上的17位为羟基，与-B-0-N02相连，B与T上的羟基以酯键形式相连， 即TH上-OH中的0分别与B上的-C^-相连形成-0C0-，formula see original document page 7

tl为1时的化合物1

优选：tl为2时，TH上的17位为羟基，与一个-B-0-N02相连，T上的另一个羟基与另一个 -B-0-N02相连，B分别与T上的羟基以酯键形式相连，即TH上-OH中的0分别与B上的-O0-相连形成-0C0-，这两个-B-0-N02基团中的B在其定义的范围内可以相同或不同。 优选：R2为十个碳以内的碳氢化合物 优选：R2为甲基 优选：R3是H

优选：tl为2时，TH上的17位为羟基，与一个-B-0-N02相连，TH上3位为羟基，与另一个 -B-0-N02相连，B分别与TH上的羟基以酯键形式相连，即TH上-OH中的0分别与B上的-C=0-相连形成-OCO-，这两个-B-0-N02基团中的B在其定义的范围内可以相同或不同。 优选：X为O， R2为甲基，R3是H， TH上的17位为羟基。

优选：X为O， R2为甲基，R3是H， TH上的17位为羟基，TH的9， 11位为双键。 优选：B为-C0(0)a(CR4R5)b. D(CR4R5)h..-

a为O时，R4， R5相同或不同，并选自H， 1至6碳的直链或支链烃类，D可以不存在也可以 为含有0至2个杂原子的1至8碳的烃。 优选：B为-C0(0)a(CR4R5)b. D(CR4R5)b..-

a为l时，R4， R5相同或不同，并选自H， l至6碳的碳氢化合物，D可以不存在也可以为含 有0至2个杂原子的1至8碳的五元或六元环碳氢化合物。 优选：B为-C0(0)a(CR4R5)b. D(CR4R5)h..-a为0或l时， b' ,b''为0， D为含有0至两个杂原子的1至8碳的五元或六元环烃，杂 原子在环上。

优选：B为-C0(0)a(CR4R5)b. D(CR4R5)b.. -

a为0时，D可以不存在也可以为含有1至两个杂原子的1至8碳的五元或六元环烃，杂原子 在环上。

式l化合物优选为：

3-羟基雌甾-1,3, 5 (10)， 9 (11)-四烯-2-甲氧基-17e-(3-硝基氧）丙酸酯

3-羟基雌甾-1,3， 5 (10)， 9 (11)-四烯-2-甲氧基-17 0- (3-甲基-4-硝基氧）-2-噻吩甲酸

酯3-羟基雌甾-1，3， 5 (10)， 9 (11)-四烯_2-甲氧基-17-酮-3-(2-硝基氧)醋酸酯 3-甲氧基雌甾-1，3， 5 (10)-三烯-17 P- (4-硝基氧甲基)苯甲酸酯

3-羟基雌甾-1,3， 5 (10)， 9 (11) -四烯-2-甲氧基-17P-羟基-3-(2-硝基氧)醋酸酯-17-(3-硝基氧)丙酸酯

3-轻基雌甾-1，3， 5 (10)-三烯-2-甲氧基-17e-羟基-17-醋酸酯-3-(2-硝基氧)醋酸酯 3-羟基雌甾-1,3， 5 (10)-三烯_2-甲氧基-17P-羟基-3-(2-硝基氧）醋酸酯 3-羟基雌甾-1,3, 5 (10)， 9 (11)-四烯-2-乙氧基-17P羟基-17-(2-硝基氧）醋酸酯 3-羟基雌甾-1，3， 5 (10)-三烯-2-乙氧基-17-酮-3-(2-硝基氧)醋酸酯

式1化合物或其生理学上可接受的盐或溶剂合物作为治疗哺乳动物疾病的药物中的应用，哺 乳动物优选是人类。

式1化合物或其生理学上可接受的盐或溶剂合物作为治疗哺乳动物疾病的药物为抑制哺乳类 动物血管内皮生长因子的药物，哺乳动物优选是人类。

式1化合物或其生理学上可接受的盐或溶剂合物作为治疗哺乳动物疾病的药物为血管生成抑 制剂的药物，哺乳动物优选是人类。

上述任一项的化合物在制备治疗肿瘤类疾病药物的应用。 上述任一项的化合物在制备治疗眼科眼部新生血管疾病的药物中的的应用。 上述任一项的化合物在制备治疗恶性血液病的药物中的应用。 上述任一项的化合物在制备治疗支气管哮喘的药物中的应用。 上述任一项的化合物在制备治疗脑白质疏松疾病的药物中的应用。

一种药用组合物，该组合物包含上述任一项定义的式1化合物或其生理学上可接受的盐或溶 剂合物。上述任一项定义的式1化合物或其生理学上可接受的盐或溶剂合物与一种或多种生 理学上可接受的药物辅料混合。上述药用组合物可以配制成液体制剂、灭菌制剂与无菌制剂、 固体制剂、半固体制剂、气雾剂。

上述药用组合物，该组合物还包含另一种治疗肿瘤的药物。 上述组合物还包含另一种治疗眼部新生血管疾病的药物。

上述组合物还包含另一种治疗恶性血液病疾病的药物。

上述组合物还包含另一种治疗支气管哮喘的药物。

一种眼用制剂，该制剂含有上述任一项定义的式1化合物或其生理学上可接受的盐或溶剂合 物，以及作为载体的药用辅料。

一种口服制剂，该制剂含有上述任一项定义的式1化合物或其生理学上可接受的盐或溶剂合 物，以及作为载体的药用辅料。

药用组合物，该组合物还包含另一种治疗肿瘤的药物。 一种制备上述的式1化合物方法，其包括：(1) 将TH在碱性有机溶媒存在下与YBOH的酸酐YBOBY、羧酰氯YBCl或羧酰溴YBBr反应形成TBY; Y为溴或氯原子，然后

(2) 将上述反应中得到的产物TBY通过与硝酸的无机盐在有机溶媒中反应得到T-B-0-N02。 一种制备上述B与TH的3位羟基相连的式1化合物方法，其包括：

(1) 将TH在碱性有机溶媒存在下与YBOH的酸酐YBOBY、羧酰氯YBCl或羧酰溴YBBr反应形成TBY; 催化剂可以存在或不存在，Y为溴或氯原子，然后

(2) 将上述反应中得到的产物TBY通过与硝酸的无机盐在有机溶媒中反应得到T-B-0-N02。 当TH的17位取代基中为羟基时，可以先对相应羟基进行酯化保护，再形成3位取代硝酸酯 后脱去酯基保护，产生化合物l。

一种制备上述的B与TH的17位的羟基相连的式1化合物方法，其包括：

(1) 将TH在碱性有机溶媒存在下与YBOH的酸酐YBOBY、羧酰氯YBCl或羧酰溴YBBr反应形成TBY; Y为溴或氯原子，然后

(2) 将上述反应中得到的产物TBY通过与硝酸的无机盐在有机溶媒中反应得到T-B-0-N02。 上述制备方法，其特征在于第（1)步反应中的碱性有机溶媒为三烷基胺或吡啶等，催化剂为 DMAP，第（2)步反应中的硝酸的无机盐为硝酸银，有机溶媒为乙腈。

上述tl为2的式1化合物，相同或不同的B分别与TH的17位和3位的羟基相连的，其包

括：

(1) 将TH在碱性有机溶媒存在下与YBOH的酸酐Y， B' 0B， Y'、羧酰氯Y' B' Cl或羧酰溴

Y' B' Br反应形成TB' Y';催化剂可以存在或不存在，Y'为溴或氯原子，其中B'与17 位取代基上的羟基相连，然后

(2) 将上述化合物TBY在碱性有机溶媒存在下与Y' ' B' ' OH的酸酐

Y， ， B， ， 0B' ， Y，，、羧酰氯Y' ， B， ， C1或羧酰溴Y' ， B' ， Br反应形成

Y， ' B， ， TB' Y，；催化剂可以存在或不存在，Y，，为溴或氯原子，其中B'，与3位取

代基上的羟基相连，然后

(3) 将上述反应中得到的产物Y' B' TB' ' Y''通过与硝酸的无机盐在有机溶媒中反应得 到02N- 0 -B， TB' ' - 0- N02, B， ， 、 B'的定义范围同B。

其中上述（1)至（3)步中的B' ， 、 B'可以相同或不同。

上述制备方法，其特征在于第（1)、 （2)步反应中的碱性有机溶媒为三垸基胺或吡啶等，催 化剂为DMAP，第（3)步反应中的硝酸的无机盐为硝酸银，有机溶媒为乙腈。

血管新生性疾病，主要涉及肿瘤、眼部新生血管、恶性血液病、支气管哮喘、脑白质疏 松疾病。

肿瘤主要是各种实体肿瘤如胃部肿瘤、肺部肿瘤、肝部肿瘤、各种腺体肿瘤、鼻部肿瘤、 眼部肿瘤、咽部肿瘤、喉部肿瘤等；恶性血液病是指血液系统的恶性肿瘤，主要包括白血病、 淋巴瘤、多发性骨髓瘤及恶性组织细胞病等。

本化合物还可在眼部新生血管生成造成的疾病中应用：

眼部新生血管生成造成的疾病涉及角膜、虹膜、脉络膜及视网膜等，其造成的渗出、出 血和增生等病理改变对眼部结构和功能的损害，是引起视力障碍的重要原因。大部分眼疾病均存在炎症、缺血、缺氧等病理过程：因此，眼病与眼部新生血管形成有密切的关系。其中 眼部新生血管生成造成的疾病包括：

角膜新生血管性眼病：在与角膜新生血管相关的眼部疾病中，最常见的是配戴角膜接触 镜所致的角膜新生血管性疾病，其他引起角膜新生血管的眼部疾病有角膜外伤，碱及其他化 学物质烧伤，角膜手术，各种感染包括细菌感染、衣原体感染、病毒感染(单疱病毒和带状疱 疹病毒等)、原虫感染(利什曼原虫)等。

虹膜新生血管性眼病：常见有新生血管性青光眼，而视网膜脱离、创伤、糖尿病视网膜 病变、肿瘤(视网膜母细胞瘤）、视网膜中央静脉栓塞等是其常见的诱因。

视网膜新生血管性眼病：糖尿病、肿瘤、视网膜脱离、视网膜中央静脉阻塞、视网膜静 脉周围炎、全身性红斑狼疮、Eales病、Coat病、Takavas病等均可引起。

脉络膜新生血管性眼病：老年性黄斑变性、高度近视、中心性渗出性视网膜脉络膜炎、 创伤、肿瘤、眼组织胞浆菌病综合征、匍行性脉络膜病变等均可引起该种眼病。

本领域的技术人员可以认为，本文所涉及的"治疗"可以延伸为疾病的预防和以确定疾 病为目的的治疗。

式（1)化合物在治疗哺乳动物的疾病中的剂量以TH的计为0. OOlmg-5mg/kg/天，优选 0. 005mg-2mg/kg/天。式（1)化合物在治疗抑制哺乳类动物血管内皮生长因子的药物剂量以 TH的计为0. OOlmg-5mg/kg/天，优选0. 005mg-2rag/kg/天。式（1)化合物在治疗哺乳类动物 血管新生性疾病药物的剂量以TH的计为0. 001mg-5mg/kg/天，优选0. 005mg-2mg/kg/天。作 为治疗人的疾病时，人的体重一般按照50Kg计算，所以本发明中所述人用剂量可以按照人的 实际体重计算，也可以按照上述剂量X 50计算。

本发明化合物可配制成任何便于用药的制剂，因此本发明在其范围内也包含本发明化合 物，可与一种或多种生理学上可接受的稀释剂或载体混合的药物组合物。

本发明化合物可配制成任何便于人用药的制剂，该制剂治疗疾病中其活性成分的用量为 以TH的计为0. 001mg-5mg/kg/天，优选0. 005mg-2mg/kg/天。作为治疗人的疾病时，人的体 重一般按照50Kg计算，所以本发明中所述人用量可以按照人的实际体重计算，也可以按照上 述用量X 50计算。

一种药用组合物，该组合物包含任一项定义的式1化合物或其生理学上可接受的盐或溶 剂合物。上述药用组合物包含式1化合物或其生理学上可接受的盐或溶剂合物与一种或多种 生理学上可接受的药物辅料混合。上述药用组合物可以配制成液体制剂、灭菌制剂与无菌制 剂、固体制剂、半固体制剂、气雾剂，上述制剂类型可以按照药剂学（第五版，人民卫生出 版社，崔福德主编）中的相关定义理解。

式1化合物或其生理学上可接受的盐或溶剂合物可以作为治疗眼部新生血管生成造成的 疾病的药物。

一种注射制剂，该制剂含有权利要求卜2中任一项定义的式1化合物或其生理学上可接 受的盐或溶剂合物，以及作为载体的药用辅料。

注射制剂中的非活性成分含有注射用水或注射用油。

一种口服制剂，该制剂含有式1化合物或其生理学上可接受的盐或溶剂合物，以及作为 载体的药用辅料。该口服制剂可以按照药剂学（第五版，人民卫生出版社，崔福德主编）中 的相关制剂的方法配制。本发明进一步提供制备这样的药物组合物的方法，该方法包括将各种组分混合。 本发明化合物可安常规方法（例如）配制成口服、口腔、舌下、非肠道、注射、埋植、 局部用药或直肠给药的制剂，尤其是口服或注射的制剂。其中口服制剂包括而不仅限于片剂、 胶囊剂、散剂、颗粒剂等口服的固体及口服液等可口服的液体；注射剂包括而不仅限于针剂、 混悬剂、输液剂等可注射的液体或粉针剂等可用于注射的固体。

口服制剂中的非活性成分含有淀粉、乳糖、水中的一种或几种。

本发明的化合物和药物制剂可以与一种或多种选自以下的其他治疗剂联合使用或是包含 一种或几种这样的治疗剂：抑制肿瘤的药物、治疗眼部新生血管生成造成的疾病的药物、治 疗哮喘的药物。

抑制肿瘤的药物包括而不限于作用于DNA化学结构的药物(包括烷化剂、蒽环类和铂类化 合物）；影响核酸合成的药物(主要是抗代谢物）；作用于DNA模板影响DNA转录或抑制DNA依赖 RNA聚合酶而抑制RNA合成的药物；影响蛋白质合成的药物(如高三尖杉酯碱、紫杉类、长春花 碱和鬼臼碱类等）；紫杉醇类化合物；其他类型的药物(如激素、门冬酰胺酶、维甲类化合物 等)。

抑制肿瘤的药物优选顺铂。

治疗眼部新生血管生成造成的疾病的药物包括而不限于内皮抑素(Endostatln)、血管生 成抑制因子、阿奈可他等。

治疗哮喘的药物包括而不仅限于糖皮质激素，白三烯抑制剂、受体激动剂、黄嘌呤 类药物、抗胆碱药、抗过敏药。

式（1)化合物的盐是指TH上的0H与之相连接形成的药用盐，药用盐优选磷酸、琥珀酸、 马来酸、硫酸的盐，更优选指磷酸、琥珀酸、马来酸、硫酸的钠、钾、镁、钙盐。

化合物TH的制法可以参见中国专利申请200710058413. 5，"一种治疗肿瘤的雌甾药物"中 的方法。

DMAP为4-二甲氨基吡啶。 具体实施方式： 本发明中柱层析方法：

层析柱的长度最少70cm，内部装填254-硅胶，并将需要分离的有机物全溶于最少量的氯仿： 甲醇=1: 1中，用最少量254-硅胶将该溶液吸收后置于层析柱内硅胶的上部，使用流动相洗 脱，层析柱下用若干个10ml试管接经过柱层析得到的溶液，控制流速为10ml/3min，将每个 试管的溶液用HPLC进行分析,将保留时间相同的试管溶液合并，取主点的化合物进行重结晶， 得到相应的产物。

确定主点的方法：将需要分离的有机物用HPLC进行分析，除原料点外峰面积最大的点确定为 主点，其保留时间为主点的保留时间。

HPLC可以按照T- (C0CH3) " (T和C0CH3相连的方式与T和B相连的方式相同）的相应方法 测定，也可以通过以下条件测定，以主点含量最低的方法为准：

设备：HP 1084B液相色谱仪，HP 79850 BLC终端和UV检测器

柱材料：Hypersll C18, 5um， 125X4.6咖

检测波长：242nm流动相：甲醇：水=5.8: 4.2

柱温：45 °C

流速：约1.2ml/分

实施例l 3-羟基雌甾-1，3， 5 (10) ， 9 (11)-四烯_2-甲氧基-17P羟基-17-(3-硝基氧 丙酸酯

formula see original document page 12

1. 3-羟基雌甾-1，3， 5 (10)， 9 (11) _四烯-2-甲氧基-17p-羟基-17-(3-氯）丙酸酯

方法1:

将40ml的三乙胺和0.015mol的3-氯丙酰氯在反应并内搅拌并降温至-20度，缓慢加入 0.01mo13-羟基雌甾-1，3， 5 (10)， 9 (11)-四烯-2_甲氧基-17 P -羟基并保持温度-20至-15 度，该反应为放热反应，所以加入速度和温度都需要小心控制，将上述反应液温度保持在-io 'C以下，加毕后于1小时内缓慢升至0-5度，与该温度保温10小时后，稀释到50mlPH为1-2 温度为0度的水中，缓慢加入盐酸调节PH为中性，该液体使用二氯甲烷90ml提取三次 (30mlX3)，再用水90ml三次（30mlX3)洗涤二氯甲烷层，pH值调到中性，二氯甲烷层浓縮， 冲入甲醇进行重结晶，得到标题化合物粗品0.0053mol。

方法2:

将0.01mol3-羟基雌甾-l,3， 5 (10)， 9 (11)-四烯-2-甲氧基-17 e-羟基加入601111吡啶 中在，-20。C加入搅拌均匀，在-20至-15。C慢慢加入3-氯丙酰氯0.0015mo1，该反应为放热反 应，所以加入速度和温度都需要小心控制，将上述反应液温度保持在-1(TC以下，加完后在-5 度下保温10小时，然后将反应液冷却到0—5。C，稀释到50mlPH为1-2温度为0度的水中，并在冷 却和搅拌下慢慢加入HCl,上述反应为放热反应，但是温度不能超过1(TC， 一定量的HC1是用来 将pH值调到中性。该液体使用二氯甲垸90ml提取三次（30mlX3)，再用水90ml三次（30mlX3)洗 涤二氯甲烷层，pH值调到中性，二氯甲烷层浓縮，冲入甲醇进行重结晶，得到标题化合物粗 品O. 0051mo1。

反应方法1和2中也可以使用DMAP，相应的含量会降低40%，反应产生的产物会明显增加3-羟基-(3-氯）丙酸酯和3， 17-双羟基-双(3-氯)丙酸酯的杂质。

2. 3-羟基雌甾-1，3， 5 (10)， 9 (11) _四烯-2-甲氧基-羟基-17-(3-硝基氧）丙酸酯

3-羟基雌甾-1, 3， 5 (10)， 9 (11)-四烯_2-甲氧基-17 3 -羟基-17_(3-氯）丙酸酯O. 005rao1 在乙腈40ml的溶液中，将AgN030. 14克加入并回流10小时，后将溶液于减压下除去溶剂进行柱层析，用甲醇和氯仿（l: l)为流动相洗脱，取其中主点化合物进行减压浓縮，冲入甲醇进行 重结晶，得标题化合物0.0031mo1。

元素分析计算值OO: C， 63.30; H， 6.52; N， 3.36; 0， 26.83 元素分析测定值（％): C22H27丽 C, 63.35; H， 6.57; N, 3.33; 0, 26.75 '3C-MR(CDC13) :1位至22位碳的数值：

13C-醒R(CDC1》：1位至22位碳的数值：

实施例2 3-羟基雌甾-1，3， 5 (10)， 9 (11)-四烯_2-甲氧基-(3-甲基-4-硝基氧） -2-噻吩甲酸酯

formula see original document page 13

以3-羟基雌甾-1,3， 5 (10)， 9 (11)-四烯-2-甲氧基-17e-羟基为原料，按照实施例l 的方法与4-溴-3-甲基-2-噻吩甲酰氯、AgN03反应得到标题化合物0. 0030mol。 1. 3-羟基雌甾-1，3， 5 (10)， 9 (11)-四烯-2-甲氧基-17e-羟基-17- (3_甲基-4-溴）-2-噻吩甲酸酯

方法l:

将40ml的三乙胺、0.015mol的4-溴-3-甲基-2-噻吩甲酰氯在反应并内搅拌并降温至0 度，缓慢加入0.01mol3-羟基雌甾-l,3， 5 (10)， 9 (11) _四烯-2-甲氧基-17 P-羟基并保持 温度0-5度，该反应为放热反应，所以加入速度和温度都需要小心控制，将上述反应液温度 保持在-l(TC以下，加完后在-5度下保温10小时，然后将反应液冷却到0—5X:，稀释到50mlPH 为1-2温度为0度的水中，缓慢加入盐酸调节PH为中性,该液体使用二氯甲烷90ml提取三次 (30mlX3)，再用水90ml三次（30mlX3)洗涤二氯甲垸层，pH值调到中性，后将二氯甲烷层于 减压下除去溶剂进行柱层析，用甲醇和乙酸乙酯（l: l)为流动相洗脱，取其中主点化合物进 行减压浓縮，冲入甲醇进行重结晶，得标题化合物0.0057mo1。方法2:

将0.01mo13-羟基雌甾-1,3， 5 (10)， 9 (11)-四烯_2-甲氧基-17 e-羟基加入6(^1吡啶 中在，0—1(TC加入搅拌均匀，在-15'C慢慢加入4-溴-3-甲基-2-噻吩甲酰氯0. 0015mol，该反应 为放热反应，所以加入速度和温度都需要小心控制，将上述反应液温度保持在-l(TC以下，力口 完后在-5度下保温10小时，然后将反应液冷却到0—5'C，稀释到50mlPH为l-2温度为0度的水中, 并在冷却和搅拌下慢慢加入HCl,上述反应为放热反应，但是温度不能超过2(TC， 一定量的HC1 是用来将pH值调到中性。该液体使用二氯甲垸90ml提取三次（30mlX3)，再用水90ml三次 (30mlX3)洗涤二氯甲烷层，pH值调到中性，后将二氯甲烷层于减压下除去溶剂进行柱层析， 用甲醇和乙酸乙酯（l: l)为流动相洗脱，取其中主点化合物进行减压浓縮，冲入甲醇进行重 结晶，得标题化合物O. 0054mol 。

反应方法1和2中也可以使用DMAP，相应的含量会降低30%，反应产生的产物会明显增 加3-酯和3， 17-双酯的杂质。

2. 3-羟基雌甾-1,3， 5 (10)， 9 (11)-四烯-2-甲氧基-17P- (3-甲基-4-硝基氧）-2-噻吩 甲酸酯

3-羟基雌甾-1,3， 5 (10)， 9 (11)-四烯_2-甲氧基-17&-羟基-17- (3-甲基-4-溴）-2-噻吩甲酸酯0.005mol在乙腈40ml的溶液中，将AgN030. 12克加入并回流20小时，后将溶液于减 压下除去溶剂进行柱层析，用甲醇和乙酸乙酯（l: l)为流动相洗脱，取其中主点化合物进行 减压浓縮，冲入甲醇进行重结晶，得标题化合物0.0029mo1。 元素分析计算值（％): C， 61.84; H， 5.60; N, 2.88; 0, 23.07; S, 6.60 元素分析测定值(°/。）: C25H27N07S C， 61.80; H， 5.59; N， 2.90;S, 6.62， 0, 23.09 13C-NMR(CDC13) :1位至25位碳的数值：

13C-NMR(CDC13) : 1位至25位碳的数值：

实施例3 3-羟基雌甾-1,3， 5 (10)， 9 (11)-四烯-2-甲氧基-17-酮-3-(2-硝基氧)醋酸圃

方法l:

将40ml的三乙胺、0. 05g的DMAP和0. 015mol的3-氯丙酰氯在反应并内搅拌并降温至0 度，缓慢加入0.01mol3-羟基雌甾-1，3， 5 (10)， 9 (11) _四烯-2-甲氧基-17-酮并保持温度 0-5度，该反应为放热反应，所以加入速度和温度都需要小心控制，将上述反应液温度保持 在IO'C以下，加毕后于1小时内缓慢升至10-15度，与该温度保温15小时后，稀释到50mlPH 为1-2温度为0度的水中，缓慢加入盐酸调节中性，该液体使用二氯甲垸90ml提取三次 (30mlX3)，再用水90ml三次（30mlX3)洗涤二氯甲烷层，pH值调到中性，二氯甲垸层浓縮， 冲入甲醇进行重结晶，得到上述化合物粗品0. 0060mo1。

方法2:

将0.01mo13-羟基雌甾-1,3， 5 (10)， 9 (11)-四烯-2-甲氧基-17-酮、0. 05g的服AP加入 60ml吡啶中在，0—l(TC加入搅拌均匀，在0—1(TC慢慢加入3-氯丙酰氯0. 0015mol，该反应为放 热反应，所以加入速度和温度都需要小心控制，将上述反应液温度保持在1(TC以下,加完后在 这个温度下保温15小时，然后将反应液冷却到0—5'C，稀释到50mlPH为1-2温度为0度的水中， 并在冷却和搅拌下慢慢加入HCl,上述反应为放热反应，但是温度不能超过2(TC, —定量的HC1 是用来将pH值调到中性。该液体使用二氯甲烷90ml提取三次(30mlX3)，再用水90ral三次 (30mlX3)洗涤二氯甲垸层，pH值调到中性，二氯甲烷层浓缩，冲入甲醇进行重结晶，得到上 述化合物粗品O. 0054mol。

反应方法1和2中也可以不使用DMAP，上述化合物的含量会降低35%,未反应的原料会增加。

2. 3-羟基雌甾-1,3， 5 (10)， 9 (11)-四烯-2-甲氧基-17-酮-3-(2-硝基氧)醋酸酯 3-羟基雌甾-1,3， 5 (10)， 9 (11)-四烯-2-甲氧基-17-酮-（2-氯）乙酸酯0. 005mol在乙腈 40ml的溶液中，将AgN030. 12克加入并回流20小时，后将溶液于减压下除去溶剂进行柱层析， 用甲醇和乙酸乙酯（l: l)为流动相洗脱，取其中主点化合物进行减压浓縮，冲入甲醇进行重 结晶，得标题化合物0. 003mol 。

元素分析计算值（％): C， 62.83; H， 5.78; N, 3.49; 0, 27.90 元素分析测定值（％): C21H23丽 C, 62.91; H, 5.73; N, 3.44; 0, 27.92 l3C-NMR(CDCl3) : 1位至21位碳的数值：

w c,

2

-:三IH

H画c的位置 9 10 11 12 13 14 15 16

13CR 128.0 136.7 117.2 34.8 48.5 47.9 22.8 35.9

c的位置 17 18 19 20 21 22 23 24

"C-醒R 221.4 14. 9 180. 4 76. 7 55.9

c的位置 1 2 3 4 5 6 7 8

126. 5 111. 7 158. 3 114. 2 138. 1 30. 0 28.2 38.9

c的位置 9 10 11 12 13 14 15 16

】3C_NMR 44. 7 133.2 27. 1 36.7 42.9 51.7 23.7 27.9

c的位置 17 18 19 20 21 22 23 24

"C-陋R 83.0 12.4 166.8 130.4 131.8 130.5 142.6 130.5

c的位置 25 26 27 28 29 30 31 32

"C-丽R 131.8 79.3 56. 1

实施例5 3-羟基雌甾-1,3， 5 (10)， 9 (11)-四烯-2-甲氧基-17 0-羟基-3-(2-硝基氧）醋 酸酯-17-(3-硝基氧)丙酸酯

实施例4 3-甲氧基雌甾-1,3, 5 (10)-三烯-17 3-羟基-17- (4-硝基氧甲基）苯甲酸酉l

27

以为3-甲氧基雌甾-1，3， 5 (10)-三烯-17e-羟基为原料，按照实施例1的方法与（4-氯

甲基)苯甲酰氯、AgNO:,反应得到标题化合物。

元素分析计算值(％): C， 69.66; H， 6.71; N, 3.01; 0, 20.62

元素分析测定值(％): C27H31N06 C, 69.67; H, 6.73; N， 3.02; 0, 20.58

13C-丽R(CDC1》：1位至27位碳的数值：

13C-NMR(CDC13) : 1位至27位碳的数值：

三l一：

s《 ：Bformula see original document page 17

以3-羟基雌甾-1,3， 5 (10)， 9 (11)-四烯-2-甲氧基-17 0_羟基为原料，按照实施例1的 方法l与（3-氯）丙酰氯反应，得到3-羟基雌甾-1,3， 5(10)， 9 (11)-四烯-2-甲氧基-17e-羟基-17-(3-氯）丙酸酯， 再根据实施例3的方法1与（2-氯）乙酰氯得到3-羟基雌甾-1,3， 5 (10)， 9 (11)-四烯-2-甲氧基-17P-羟基-3-(2-氯）醋酸酯-17-(3-氯）丙酸酯，最后根据实 施例1中的方法与AgN(U用量是原方法的两倍）反应得到标题化合物3-羟基雌甾-1, 3,5(10)， 9 (11)-四烯-2-甲氧基-羟基-3-(2-硝基氧)醋酸酯-17-(3-硝基氧）丙酸酯。 元素分析计算值(％): C， 55.38; H， 5.42; N, 5.38; 0， 33.81 元素分析测定值（％): C24H28N2011 C, 55.44; H， 5.44; N, 5.35; 0, 33.77 13C-NMR(CDC13) :1位至24位碳的数值：

13C-丽R(CDC1》：1位至24位碳的数值：

元素分析计算值(％): C， 62.21; H, 6.71; N， 3.45; 0, 27.62 元素分析测定值（％): C21H27N07 C， 62.24; H, 6.67; N, 3.42; 0， 27.67 13C-NMR(CDC13) :1位至21位碳的数值：

13C-腿(CDCU :1位至21位碳的数值：

c的位置 1 2 3 4 5 6 7 8

13C-醒R 109.4 149.0 137.3 122. 7 129.8 30.0 27.9 38.9

c的位置 9 10 11 12 13 14 15 16

以3-羟基雌甾-1,3， 5 (10)-三烯-2-甲氧基-羟基-17-醋酸酯为原料，按照实施例3 的方法与（2-氯）乙酰氯反应得到3-羟基雌甾-1,3， 5 (10)-三烯-2-甲氧基-羟基-17-醋酸酯-3-(2-氯)醋酸酯，再根据实施例3中的方法与AgN03反应得到标题化合物3-羟基雌甾 -1,3, 5 (10)-三烯_2-甲氧基-羟基-17-醋酸酯-3-(2-硝基氧)醋酸酯。 元素分析计算值（％): C, 61.73; H' 6.53; N, 3.13; 0， 28.60 元素分析测定值（％): C23H29N08 C, 61.70; H, 6.55; N, 3.11; 0， 28.64 "C-國R(CDCl3) :1位至23位碳的数值：

13C-醒R(CDC1》:1位至23位碳的数值：

c的位置 1 2 3 4 5 6 7 8

't-羅 109. 4 149. 0 137. 3 122. 7 129.8 30. 0 27. 9 38.9

c的位置 9 10 11 12 13 14 15 16

13C,MR 44. 7 139.2 26.9 36. 7 42, 9 51.9 23.7 31.8

c的位置 17 18 19 20 21 22 23 24

^C-丽R 83.2 12.2 179.8 76.9 56. 1 171. 5 21.9

实施例7 3-羟基雌甾-1，3， 5 (10)-三烯-2-甲氧基-17 3-羟基-3-(2-硝基氧)醋酸酯

以为3-羟基雌甾-1,3, 5 (10)， 9 (11)-四烯_2-乙氧基-17P-羟基为原料，按照实施例1 的方法与(2-氯)乙酰氯反应得到3-羟基雌甾-1, 3， 5 (10)， 9 (11)-四烯-2-乙氧基-17 P — (2-氯)醋酸酯，后根据实施例1种的方法与AgN03反应得到标题化合物3-羟基雌甾-1, 3， 5 (10)， 9 (11) _四烯-2-乙氧基-17e-(2-硝基氧）醋酸酯。 元素分析计算值(％): C, 63.30; H, 6.52; N, 3.36: 0, 26.83 元素分析测定值(。/。）： C22H27N07 C, 63.27; H, 6.55; N, 3.38; 0， 26.80 "C-薩R(CDCl3) :1位至22位碳的数值：

13C-NMR(CDC13) :1位至22位碳的数值：

formula see original document page 19以3-羟基雌甾-1，3， 5 (10) _三烯-2-乙氧基-17-酮为原料，按照实施例3的方法与（2-氯）乙酰氯、AgN03反应得到3-羟基雌甾-1，3， 5 (10)-三烯-2-乙氧基-17-酮-3-(2-硝基氧) 醋酸酯。

元素分析计算值（％): C, 63.30; H， 6.52; N， 3.36; 0, 26.83 元素分析测定值（％): C22H27N07 C, 63.29: H, 6.53; N， 3.34; 0， 26.85 '3C-醒R(CDC1》：1位至22位碳的数值：

l3C-醒R(CDC1》：1位至22位碳的数值：

主药：

3-甲氧基雌甾-1,3， 5 (10)-三烯-17 0-羟基-17- (4-硝基氧甲基）苯甲酸酯 5g 辅料：

烟酰胺 70g 苯甲醇 7.5ml

注射用水 加至 1000ml

【制备】将3-羟基雌甾-1,3， 5 (10)-三烯_2-甲氧基-17t3-醇-3, 17-二(2-硝基氧)醋 酸酯先用少量注射用水调匀待用，再将烟酰胺溶于适量注射用水中，加入活性炭0.1g，搅拌 均匀后放置15mln，粗滤脱碳，加注射用水至约900ml ，水浴上加热至8(T90'C，慢慢加入 己用注射用水调好的孕甾-4， 9 (11)-双烯-3， 20-双酮-17， 21-双羟基-21-(2-硝基氧）醋酸 酯，保温2(T30 rnln,完全溶解后冷却至室温。加入苯甲醇，调节pH至6. 5~6. 0，调整体积 至1000ml，然后在10'C以下放置8h，过滤至澄明、灌封，10(TC流通蒸气灭菌15min即可。 实施例ll: 口服胶囊

用细碎的淀粉将20mg3-羟基雌甾-1，3， 5 (10) _三烯-2-甲氧基-17 P -羟基-17-醋酸酯-3-(2-硝基氧)醋酸酯稀释混合成200mg的药物组合物，装入4号硬胶囊中。 药理实施例l:体外实验

采用生长因子诱导的鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管增生模型观察式（1)化合物对血管增生的影

响，了解式（1)化合物对血管生成的作用。

实验材料：

受精3日龄鸡胚

玻璃纤维滤纸

血管内皮细胞生长因子（VEGF) Chemlcon公司产品

将实施例1-9所制成的化合物先用DMS0溶解，再用PBS稀释至所需要的浓度（DMSO浓度〈0. 1%)实验方法

1. CAM模型的建立：

75%乙醇清洗鸡胚卵壳于超净台中吹干，水平放置5 min后，在100 mm培养皿边缘小心 将卵壳敲碎，卵内容物置于培养皿中（培养皿中预先加有IO ral DMEM培养基）。将此培养皿放 入150 mm大培养皿中（大培养皿中加少许水），盖上皿盖，置于37。C 、 5%0)2的细胞培养箱中 培养。

2. 对CAM血管增生的影响

用打孔机将玻璃纤维滤纸制成直径3mm的小圆片，湿热灭菌,将试剂各10y l滴于玻璃纤维 滤纸上，制成药膜，吹干备用。鸡胚培养3d后，随机分成13组，每组8个，将实施例l-9所得 的化合物设为9个给药组（lg/L)，同时给予生长因子（2yg/L)，以及生长因子(VEGF)单独刺 激组（阳性对照组)和PBS (磷酸盐缓冲液，PH 7.4)刺激组（阴性对照组）。将药膜贴于CAM和 卵黄囊膜（yolk sacmembrane， YSM)外2 / 3处血管较少的部位。加药48 h后，显微镜下观察， 计数药膜周围5mm内大、中、小血管数。

表l对CAM血管增生的影响表（元土 s， n=8)

3.结果

l式（1)化合物对VEGF诱导的CAM

血管增生的影响结果表l， PBS组血管生长良好.VEGF组小血管增生明显，式（1)化合物 的各组血管增生明显受到抑制.小血管显著减少，基本回到正常水平。

CAM是经典的血管生成评价模型，具有方法简便、易观察、价廉等优点.是目前最常用的 在体模型。VEGF是重要的促血管生成因子，能刺激内皮细胞的增生和迁移，促进血管生成， 且在多种肿瘤组织中发现过度表达。本研究表明：式（1)化合物抑制VEGF诱导的CAM血管增 生，表明式（1)化合物具有抑制VEGF的促血管生成作用。

式（1)化合物对血管生成有抑制作用，进一步证实了具有抑制肿瘤血管生成的潜力。 药理实施例2:体内实验1. 实验动物及瘤株

实验选用昆明种小鼠，雄性，体重(20土2)g， 160只，分16组，每组10只。 小鼠肉瘤瘤株S180

2. 药品

顺铂（DDP)注射液：20ml:20mg /支。

3. 方法

3. 1瘤鼠模型的建立：小鼠肉瘤S180瘤株，腹腔传代接种。待腹水生长良好时，抽出腹水， 细胞计数，调整细胞浓度为2X107个细胞/ml，在小鼠腋下皮下注射S180肉瘤细胞，每只接 种0.25 ml，于第ll天观察局部肿瘤生长情况。

3. 2治疗及分组：160只小鼠于接种当天随机分为16组，每组10只。按下列表格给与药物

试验分组情况表

组号 活性成分 给药方式 给药量

对照组 生理盐水 每日口服一次 0. 4ml

DDP组 顺铂 隔日腹腔注射一次 0. 5mg/kg

1 实施例l 每日口服一次 lmg/kg

2 实施例2 每日口服一次 lmg/kg

3 实施例3 每日口服一次 lmg/kg

4 实施例4 每日口服一次 lmg/kg

5 实施例5 每曰口服一次 lmg/kg

6 实施例6 每日口服一次 lmg/kg

7 实施例7 每日口服一次 lmg/kg

8 实施例8 每日口服一次 lrag/kg

9 实施例9 每日口服一次 lmg/kg

10 实施例5 每日口服一次 0.01rag/kg

11 实施例5 每日口服一次 0.lmg/kg

12 实施例5 每日口服一次 10mg/kg

13 实施例5 每日口服一次 20mg/kg

DDP联合组 实施例5 实施例5每日口服一次， 实施例5， lmg/kg

和DDP DDP隔日腹腔注射一次 DDP， 0.5mg/kg

注：实施例试验组中给药量按活性成分计。

根据文献"顺铂对小鼠骨髓遗传毒性的研究"（《癌变.畸变.突变》，1996年8巻6期， 362-365)中的介绍，对小鼠采用0.5mg/kg的给药量。

用药10d，末次灌胃后60min，处死各组小鼠，剥取瘤块、称重，瘤块作病理组织切片。 按公式计算抑瘤率：抑瘤率=(对照组平均瘤重-实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重Xl(K)c/。。 3. 3微血管染色：免疫组化SABC法染色血管，即用型微血管染色试剂盒(CD31)为武汉博士德 生物公司产品。各组瘤体剥离后，切取标本，固定，包埋，切片。经染色后的切片，内皮细 胞褐染，血管呈黄褐色，易于辨认。

MVD的测定：MVD按照Weldner等人（Weldner N， Semple JP, Welch WR。 et al. Tumor anglogeneslsand Metastastasls correlation In Invasive breast carclnonma, N Engl J Med， 1991， 324， 1-8)的方法及判断标准进行，计算肿瘤内着色的毛细血管和微小血管，即在低倍镜视 野下扫视整个肿瘤组织切片，选择最密集的微血管标记区，凡呈现黄褐色标记清晰的单个内 皮细胞或内皮细胞串均作为一个可计数的微血管，有较厚肌壁的大血管及管腔面积大于8个红 细胞直径的血管不计数。计数方法：先在低倍镜（10X10)视野下扫视整个组织切片，在肿瘤 浸润区选择最密集的3个微血管标记区视野，即所谓的"新生血管热点区"，然后在相同的背 底、背体条件下，以高倍镜(20X20)视野(0. 72 ,2)为标准计数所有染色的微血管数，取 其平均值作为该样本的测定值。

3. 4VEGF免疫组化：VEGF免疫组化检测试剂盒（即用型），光学显微镜下观察：VEGF阳性染色 以肿瘤细胞及其附近的血管内皮细胞浆或胞膜出现棕黄色颗粒为阳性表达。然后每张染色切 片通过MP1AS—1000高清晰度彩色病理图像分析系统进行吸光度（面密度)和强度(灰度)测定。

3. 5统计方法：运用SPSS统计软件，采用q检验。P<0. 05为差异有统计学意义。

4. 结果

4. 1 S180各组小鼠移植瘤重变化比较

瘤重的变化：各治疗组瘤重均显著低于对照组，与对照组比较，差异均有统计学意义，实验 结果表明各种式（1)化合物对S180移植瘤有明显抑制作用，与DDP合用具有增效作用，而不 同剂量的式（1)化合物对S180移植瘤也具有剂量正相关的抑制作用，具体情况见表2。

表2式（1)化合物对S180移植瘤的抑制作用Ui"D

各组肿瘤病理标本经CD31染色，肿瘤组织间质血管均有着色，以内皮细胞被染成黄褐色为阳性表达，微血管的大小、形态差异较大，有的仅为单个内皮细胞和内皮细胞族，有的管 腔不明显或形态不规则，肿瘤边缘组织的MVD高于中央。对照组肿瘤内见大量的新生毛细胞血 管，阳性目标为位于肿瘤组织及间质成片状或团块状分布的黄褐色颗粒，各用药组阳性表达 细胞颗粒减少，见表3。

表3 S180瘤体平均微血管密度（i4"弥》

免疫组化结果显示，光学显微镜下观察对照组肿瘤组织及其间质见大量呈片状或团块状 分布的棕黄色颗粒，各用药组阳性表达细胞明显减少。对VEGF表达平均面积密度和平均灰度 结果见表4。

表4 S180肉瘤组织VEGF表达数据表（i土"银）

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