[0001] 本发明属于肿瘤生物学技术，特别是涉及一种靶向APE1的小分子化合物抑 制剂在制备抑制非小细胞肺癌增殖和迁移等方面药物中的应用。

[0002] 根据世界卫生组织国际癌症研究机构在2018年对185个国家36种癌症的统 计分析发现，肺癌是发病率和死亡率最高的一种癌症。肺癌在二十世纪以前非常 少见。但现在已经成为全世界男性癌症死亡的主要原因，也是女性癌症死亡(仅 次于乳腺癌)的第二大原因。其中在高收入国家中，如欧洲、北美和大洋洲等吸 烟最早的国家，尽管这些国家的吸烟率正在下降，但肺癌的发病率和死亡率依然 是最高的。肺癌的组织学亚型可以分为非小细胞肺癌和小细胞肺癌，其中非小细 胞肺癌约占肺癌总数的20％，它的特点是癌细胞无分化，恶性程度高，增殖和侵 袭能力强。非小细胞肺癌约占肺癌总数的80％，它包括肺腺癌、肺鳞癌和大细胞 肺癌。

[0003] 目前对于肺癌的治疗，已经由细胞毒性疗法发展到了靶向治疗的新纪元。有 研究表明，与未经靶向治疗的患者相比，64％的肺腺癌患者生存率的提高与基因 型导向治疗有关。肺癌的治疗有外科治疗、放射治疗、化学疗法和免疫疗法等， 肺癌早期确诊意味着相当部分患者可以治愈及提高生存率，综合性、差异化治疗 可以达到较好的治疗效果。与传统化疗药物相比，DNA损伤应答途径关键蛋白 相关的小分子抑制剂的靶向治疗更有助于癌症的精确治疗。这些小分子抑制剂可 以靶向肿瘤细胞中异常高表达的蛋白，具有良好的治疗效果。例如，PARP1/2的 抑制剂Veliparib联合吉西他滨和放疗治疗晚期胰腺癌，已经用于临床Ⅰ期研究。 另一种PARP抑制剂Olaparib可延长III期试验中具有生殖系BRCA突变的转移 性胰腺癌患者的无进展生存期。其次，与传统的化疗药物相比，小分子抑制剂对 肿瘤细胞具有良好的杀伤效果，但对正常细胞几乎没有杀伤作用。这样，相对于 放化疗治疗，小分子抑制剂减少了药物的毒副作用，提高了治疗的安全性。

[0004] AP位点核酸内切酶1(AP site endonuclease 1,APE1)是DNA碱基切除修复 BER途径的关键酶。APE1高表达、胞质异位表达及活性增加与DNA损伤药物 的耐药、肿瘤侵袭性和预后不良相关。低表达APE1的NSCLC患者总体生存率 和无病生存率明显高于高表达APE1的非小细胞肺癌患者。顺铂能够导致A549 细胞APE1蛋白表达呈剂量依赖性增加。APE1 siRNA在有效抑制APE1表达的 前提下，显著增强A549对顺铂的敏感性，增加细胞凋亡。APE1作为一个有效 的靶点用于抗肿瘤药物的开发，以增加细胞对化疗药物的敏感性或者降低化疗药 物的耐药性，受到了广泛的关注。目前报道的APE1小分子抑制剂有百余种。 CRT0044876是第一个报道的特异性APE1抑制剂，生化水平抑制效果显著，研 究中对结合位点也进行了预测，可以提高细胞对多种化合物如MMS和TMZ的 敏感性，但缺乏动物水平的研究，并且由于它的细胞毒性问题未能取得进一步的 成功。E3330研究成果很多，比较成熟，在体外能够促进细胞内源性活性氧的形 成抑制癌细胞生长和迁移，已经进入了临床研究，但E3330抑制的是APE1的氧 化还原活性，抑癌效果也有待进一步改善。

[0005] 总的来说，通过对小分子抑制剂的概括分析，APE1小分子抑制剂不同程度 得在有效性、特异性、安全性等方面存在问题。如：细胞水平抑制效果不显著， 靶点特异性不好，未确定结合位点，细胞毒性强，动物实验难以开展，未能转化 进入临床应用阶段等问题。因此，开发一种新型有效的特异性强毒性小的APE1 小分子抑制剂成为目前亟待解决的问题。

[0006] 发明目的：针对上述现有技术，本申请提供了一种APE1抑制剂的制药应用。

[0007] 技术方案：本申请所述的一种APE1抑制剂，序号NO.0449‑0145，其结构如 下式所示：

[0008]

[0009] 该APE1抑制剂为利用计算机虚拟筛选技术从ChemDiv化合物库中，采用 DOCK软件进行分子对接筛选获得。

[0010] 本申请还公开了所述APE1抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。

[0011] 本申请还进一步公开了所述APE1抑制剂在制备预防和治疗肺癌的药物中的 应用。

[0012] 本申请还进一步公开了所述APE1抑制剂在制备预防和治疗非小细胞肺癌的 药物中的应用。

[0013] 进一步的，所述药物能够诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤生长速度，加剧肺癌 细胞DNA单链及双链断裂损伤。

[0014] 有益效果：本申请利用计算机虚拟筛选技术从ChemDiv化合物库中，采用 DOCK软件进行分子对接筛选，进而利用生物化学和细胞生物学的方法，获得了 一种特异性抑制APE1的小分子化合物。本申请进而利用生物化学和细胞生物学 的方法，证明该小分子抑制剂能够诱导A549和NCI‑H460细胞凋亡，加剧这肺 癌细胞的DNA单链及双链断裂损伤。在动物水平，发现该抑制剂能够有效抑制 肿瘤块的生长，是一种新型的以APE1为靶点的潜在抗肿瘤药物。附图说明

[0015] 图1是APE1在NSCLC中表达量分析图；其中，(A)使用“UALCAN”在 线分析网站在TCGA数据库中，对肺腺癌样本及正常样品的APE1的mRNA水 平表达量进行分析；(B)使用“UALCAN”在线分析网站在TCGA数据库中， 对肺鳞癌样本及正常样品的APE1的mRNA水平表达量进行分析；(C)通过 western blot检测HELF、A549、NCI‑H460及NCI‑H1299细胞中APE1蛋白的表 达量；(D)对组织芯片(含肺癌组织和正常组织)进行免疫组化染色，通过组 织阵列各点APE1的染色强度反映APE1的表达量；

[0016] 图2是敲降APE1抑制A549、NCI‑H460细胞的克隆形成；其中，(A)克隆 形成实验检测稳定低表达APE1的A549和NCI‑H460细胞株的克隆形成能力； (B)采用western blot实验检测稳定低表达APE1的A549和NCI‑H460细胞株 中的APE1蛋白表达量及三次重复实验的统计学分析；

[0017] 图3是APE1小分子抑制剂的筛选；其中，(A)采用不同浓度的小分子抑制  剂NO.0449‑0145同时处理HELF、A549、NCI‑H460及NCI‑H1299细胞48h，并 用CCK8检测细胞存活率；(B)通过Prism软件计算在NO.0449‑0145的处理48h 的条件下不同细胞的IC50；

[0018] 图4是APE1小分子抑制剂在生化水平上对APE1的抑制作用；其中，(A) NO.0449‑0145的结构；(B)圆二色谱实验检测NO.0449‑0145对APE1蛋白三维 结构的影响；(C)NO.0449‑0145与APE1的结合模拟；(D)NO.0449‑0145与 APE1的结合位点模拟；

[0019] 图5是APE1小分子抑制剂诱导A549及NCI‑H460细胞发生凋亡；其中，(A) 设置NO.0449‑0145浓度梯度分别处理A549及NCI‑H460细胞24h，处理后线粒 体膜电位检测试剂盒说明书收样，并用流式细胞仪检测各组样品线粒体膜电位变 化，以及三次重复实验的统计学分析；(B)设置相同的浓度梯度相同时间，根 据细胞凋亡检测试剂盒说明书对样品分别进行PI和FITC的染色，并用流式细胞 仪检测各组样品细胞凋亡情况；(C)设置相同的浓度梯度分别处理A549及 NCI‑H460细胞24h后收样，并用western blot检测凋亡蛋白的表达情况；

[0020] 图6是APE1小分子抑制剂诱导A549及NCI‑H460细胞DNA损伤；其中， (A)设置NO.0449‑0145浓度梯度分别处理A549及NCI‑H460细胞24h，碱性 彗星实验检测A549及NCI‑H460细胞DNA单链断裂情况；(B)采取同样的处 理浓度和处理时间，细胞收样后，western blot检测γH2AX的蛋白表达量；(C) 及(D)采取同样的处理浓度和处理时间，免疫荧光实验检测γH2AX和53BP1 的foci点；

[0021] 图7是APE1小分子抑制剂抑制NCI‑H460移植瘤裸鼠生长；其中，(A)对 照组及不同浓度处理组裸鼠体重的记录；(B)对照组及不同浓度处理组裸鼠皮 下瘤块观察；(C)对照组与实验组肿瘤块体积的连续记录；(D)各组中小鼠瘤重 的统计分析；(E)对图(B)中的瘤块切片进行免疫组化的实验，H&E、γ‑H2AX 及53BP1的染色强度及foci点。

[0022] 下面结合具体实施例对本申请作出详细说明。

[0023] 1实验材料

[0024] 1.1细胞系、载体与序列

[0025] 本申请中所用到的细胞系人胚肺成纤维细胞HELF、人腺癌肺泡基底上皮细 胞A549、人大细胞肺癌细胞NCI‑H460、人非小细胞肺癌细胞(淋巴结转移) NCI‑H1299均购于American Tissue Culture Collection(ATCC)细胞库。其中HELF 的细胞培养液为DMEM，其它均为1640培养液。DMEM培养液购自Wisent公 司，1640培养液购自Gibco公司。实验中所用菌株为大肠杆菌BL21。

[0026] 本申请研究中所用到的过表达APE1蛋白的载体为pET‑14b原核表达载体， 抗性为+Amp 抗性。敲降APE1蛋白的shRNA载体为pLent‑U6‑Puro，病毒包装 为慢病毒，稳转细胞系筛选标记为嘌呤霉素即puro。

[0027] 本申请中所用到的底物序列如下表：

[0028]

[0029] 1.2所需溶液和缓冲液配制

[0030] (1)LB培养基:氯化钠5g，酵母提取物2.5g，蛋白胨5g，ddH2O定容至500mL。

[0031] (2)200×PMSF：储存液浓度为100或200mM，溶于异丙醇(或无水乙醇) 中。样品处理超过1h，补加一次，见水易分解，使用前加入。

[0032] (3)APE1核酸内切酶活性检测底物退火体系

[0033]

[0034] (4)10×APE1 reaction buffer

[0035]

[0036] (5)8×LEW buffer(pH＝8.0)

[0037]

[0038] (6)4×Elution buffer(pH＝8.0)

[0039]

[0040] 1.3主要试剂及厂家

[0041]

[0042]

[0043] 1.3英文缩略词表

[0044]

[0045]

[0046] 2实验方法

[0047] 2.1细胞的培养与传代

[0048] 本课题研究中所用到的细胞均采用含10％血清及青霉素和链霉素各1％的 培养液，培养于5％CO2的37℃恒温培养箱中，培养箱底部放置托盘，盛放无 菌水并定期更换，以维持培养箱内适度的空气湿度及清洁的培养环境。

[0049] 细胞复苏：原则是慢冻速融，在超净工作台中取出大皿(10cm)或中皿(6 cm)，依据待复苏细胞数目或状态决定，并加入适量培养液，从液氮罐或者‑80℃ 冰箱中取出细胞立即放入37℃恒温水浴锅中，待冻存管中冻存液融化后，将细 胞放入培养皿中培养6‑12h，待细胞贴壁后，及时换液，以防DMSO损伤细胞； 或待冻存液融化后，将细胞移至离心管中，1000‑2000rpm离心2mins，弃上清 (洗净DMSO)并用新鲜的培养液吹悬细胞，转移到皿中进行培养，显微镜观 察细胞是否分匀，此种方法6‑12h待细胞贴壁后无需换液。

[0050] 细胞冻存(以大皿为例)：提前取出冻存盒置于室温或37℃水浴锅中升温， 并按照培养液：血清：DMSO 7:2:1或6:3:1的比例配制冻存液。将待冻存的细胞 弃掉旧培养基，用PBS清洗，加2mL胰酶消化至细胞变圆亮，吸走胰酶，用培 养液轻轻地将皿底细胞吹下来，放入15mL离心管中1000‑2000rpm离心2mins， 弃掉培养液，用1‑2mL细胞冻存液吹悬，将此悬液放于冻存管中，每支冻存管 1‑2mL，冻存管上标记细胞名称、培养液、日期、冻存人、细胞代数等，将标记 好的冻存管放入冻存盒，冻存盒的填充液是异丙醇，如不够时及时补充。将冻存 盒直接放入‑80冰箱进行梯度降温，12‑24h后取出放‑80冰箱可保存3个月或液 氮中长期保存。

[0051] 细胞传代或分盘(以大皿为例)：待细胞生长密度达到80％‑90％时，取出 待传代或分盘的细胞，将皿倾斜，吸走旧培养基，加入2mL胰酶，轻晃使其分 布均匀后放入培养箱2mins左右，显微镜下观察将细胞消化至圆亮，吸走胰酶, 加入2mL培养液中止消化，轻轻地将皿底细胞吹下来，放入15mL离心管中 1000‑2000rpm离心2mins，弃掉上清培养液，细胞沉淀用新鲜培养液吹悬后， 取适量放入细胞培养皿中继续培养；或者取适量细胞悬液放入细胞培养板如六孔 板中，待细胞贴壁后可进行加药转染等处理。

[0052] 细胞计数：吸取消化离心吹悬后的细胞悬液20μL，与台盼蓝染液等体积混 匀放入计数板孔中，进行细胞计数仪读数。每个样品取三个不同的视野分别计算 细胞密度，细胞密度取以上三个视野的细胞密度的平均值。

[0053] 细胞分96孔板：将细胞按上述方法消化离心吹悬并计数，96孔板每孔分 3000‑5000个细胞，以3000个/孔为例，96孔板周围一圈易干且易染菌，用PBS 填充，只有内侧60个孔可用，按照65个孔，每孔100μL培养基，故取6.5mL 培养液放入15mL离心管中，按照细胞悬液的密度和所需细胞个数为195000个， 计算所需细胞悬液的体积与上述离心管中的细胞培养液混匀，将混匀的细胞悬液 置于V型槽，用排枪加入96孔板中然后在培养箱中培养待细胞贴壁。

[0054] 2.2小分子化合物的计算机虚拟筛选

[0055] 在本课题中，我们根据PDB数据库中APE1蛋白的三维结构，选取了 Chemdiv化合物库，采用DOCK软件进行分子对接，最终选取了得分高的前52 个小分子化合物去合成，进行APE1核酸内切酶活性抑制效果检测。

[0056] 2.3APE1核酸内切酶活性检测

[0057] 该实验在参考文献(Madhusudan,S.,et al.,Isolation of a small molecule inhibitor of DNA base excision repair.Nucleic Acids Res,2005.33(15):p.4711‑24.)的基础上开展并进 行了条件优化。

[0058] (1)按上述2.1.3(5)中底物的体系配制混合液并退火结合即：95℃水浴10mins， 关掉水浴锅，自然降至室温，取出后做好标记“APE1‑sub”保存于‑20℃。

[0059] (2)APE1蛋白纯化

[0060] 1)菌株的活化

[0061] 在超净工作台中，吸取3mL无菌LB培养液至15mL离心管中，按照1:1000 的比例加+入Amp和按照1:100的比例接高表达APE1的大肠杆菌，37℃摇菌过 夜。

[0062] 2)扩大培养

[0063] 取1.5mL过夜培养的菌液至150mL培养液中，按照1:1000的比例加入Amp+， 按照1:100的比例接菌，37℃恒温培养。

[0064] 3)诱导

[0065] 恒温培养2.5h后，菌液的OD600值会达到0.5‑0.8，按照诱导剂和菌液1:1000 的比例加入IPTG诱导3h。

[0066] 4)细胞收集

[0067] 将上述诱导好的菌液，4℃、6000g离心15mins，离心后小心弃上清。

[0068] 5)细胞裂解

[0069] 每50mL菌液加1mL的1×LEW Buffer将上步离心过后的菌体吹悬，加入 溶菌酶和PMSF放入4℃摇床裂解30mins。将裂解好的菌液取出超声，超声条 件为超4s歇2s超15mins，将超声好的菌液4℃，12000rpm离心15mins。

[0070] 6)镍柱的平衡

[0071] 用1×LEW Buffer平衡镍柱并在重力作用下排干。

[0072] 7)过柱

[0073] 取离心后的上清贴着柱子侧壁缓慢加入柱子中，弃滤液。

[0074] 8)洗柱

[0075] 用1×LEW Buffer洗柱子，可多洗几次以防杂蛋白停留。

[0076] 9)洗脱

[0077] 用1mL的1×Elution Buffer洗脱带组氨酸标签的APE1，让柱子在重力作用 下排干，收集滤液。

[0078] 10)透析

[0079] 把洗脱下来的蛋白放入透析袋中用夹子夹紧，4℃透析过夜。‑80℃冻存。

[0080] 11)浓度测量与考马斯亮蓝染色

[0081] 取少量蛋白用分光光度计测量浓度。此外，取5‑10μL蛋白进行聚丙烯酰胺 凝胶电泳，电泳后将分离胶浸入考马斯亮蓝染液中染色30mins，回收染色液， 用脱色液脱色至可以看到清晰的蛋白质条带分析蛋白纯度。

[0082] (3)冰上配制核酸内切酶活性反应体系：

[0083]

[0084]

[0085] (4)将上述体系每孔80μL加入到酶标板中，一边37℃孵育一边在激发波长 495nm发射波长530nm下捕获荧光并记录每孔荧光强度变化，检测时间为20 mins。

[0086] (5)使用prism 5软件进行数据分析。

[0087] 2.4免疫印迹法检测蛋白表达水平

[0088] (1)制备样品：

[0089] 液体蛋白样品按照样品与6×Pro Loading Buffer以5：1的比例混合(使6×Pro Loading Buffer最终变为1×)，于沸水中煮样5‑10mins即可；如果用细胞制备全 细胞蛋白样品，则按照以下方法进行，如单独需要核内核外或线粒体等部分蛋白 组分，还需相应试剂盒进行提取。

[0090] 1)待细胞处理时间适宜之后，弃去旧培养液，斜置培养板，用200μL移液枪吸 净剩余培养液，PBS清洗细胞2‑3次，弃去PBS并吸净。

[0091] 2)取适量细胞裂解液(按200：1的比例加入蛋白酶抑制剂即200×PMSF)加入 到细胞培养皿中裂解细胞(10cm的培养皿加入1mL，6cm的培养皿加入500μL， 六孔板每孔加200μL，其它细胞培养板按比例增加或减少细胞培养液的体积)， 将细胞培养皿置于4℃摇床孵育30mins，或室温孵育5‑10mins使细胞充分裂 解。

[0092] 3)用细胞刮或枪头将培养皿中的细胞裂解液全部刮下来，移至1.5mL离心管中。 冰上超声，超声条件是超声5s间隔2s超3次。

[0093] 4)将细胞裂解液与6×Pro Loading Buffer为5：1的比例混合(使6×Pro Loading Buffer最终变为1×)，沸水煮样5‑10mins；煮样后将蛋白样品置于冰上降温。制 备好的蛋白样品放入‑20冰箱，可保存3‑6个月。用前注意离心振荡混匀。

[0094] (2)聚丙烯酰胺凝胶电泳：

[0095] 1)根据待检测蛋白的分子量，制备相应的SDS‑PAGE凝胶。一般使用浓度为 12％的凝胶，当蛋白分子量特别小时可采用15％的凝胶，当蛋白分子量特别大 时可采用10％甚至8％的凝胶进行电泳。制胶时可让胶多凝一会，以防电泳时 漏胶。

[0096] 2)将上述制备好的胶清洗干净，拔去梳子，放入电泳槽安装好，加入适量1× Running buffer，缓冲液可重复使用2‑3次。

[0097] 3)将上述蛋白样品低速离心，点样，样品上样量可根据样品蛋白浓度及内参情 况进行适当调整，在凝胶适当位置加入蛋白Marker 2‑5μL。

[0098] 4)先调至恒压80‑85V，电泳约30mins，压样使所有蛋白样品在同一起跑线， 待蛋白Marker条带分开，换恒压120‑130V电泳，直至待测蛋白电泳至合适位 置并与蛋白Marker分开，停止电泳。

[0099] (3)转膜

[0100] 1)按照10×Trans buffer：甲醇：dH2O为1：2：7的比例，提前配制1L 1×Trans buffer置于4℃预冷，用于PVDF膜进行转膜，大蛋白转膜可用NC膜，1×Trans buffer不需加入甲醇。

[0101] 2)取出水盘，加入适量1×Trans buffer，浸润转膜夹、海绵、滤纸，打开转膜夹， 向转膜夹的两面各放置一层海绵及4‑5张滤纸，赶走气泡。

[0102] 3)用启胶板将胶从玻璃板中剥离出来并置于转膜夹黑色一侧的滤纸上，根据胶 的大小剪取NC膜或PVDF膜，在膜的右上角可以剪一个小角以区分样品顺序及 上下，使用前PVDF膜需用甲醇激活，而NC膜不需要用甲醇激活。

[0103] 4)将剪好并激活过的PVDF膜覆到胶上，缺口放于右上角，赶走膜与胶之间的 气泡，合上转膜夹(注意黑胶白膜)，放入转移电泳槽中，注意转膜夹的黑面贴 近电泳槽的黑面，以保证电极方向正确。加入提前预冷的1×Trans buffer至缓冲 液液面没过转膜夹。

[0104] 5)采用恒流350mA电压调至300V，电泳80mins或100V 300mA 100mins 的条件转膜，电压电流及转膜时间，可依据蛋白质的分子量进行适当调整。转膜 易产热，需将转膜槽放于冰水中转膜，若转膜时间太久，中间可补充或更换冰水。

[0105] (4)封闭：

[0106] 1)提前配制25‑50mL 5％脱脂奶粉或者3％BSA作为封闭液，使其溶解充分。 转膜结束后可放置10mins进行冷却，此时可洗净润洗烘干抗体孵育盒。再用镊 子取出PVDF膜或NC膜，置于丽春红染液中进行染色，并用dH2O脱色，在染 色和脱色过程中观察蛋白条带有没有转花，注意丽春红染色前不可将膜放于封闭 液中，否则膜会不着色。若蛋白条带正常，可脱色后按目标蛋白及内参蛋白大小 剪膜(左上角剪一个小角方便区分样品顺序和上下)，正面朝上分别放到抗体孵 育盒做好标记，抗体孵育盒提前加入封闭液。

[0107] 2)室温封闭1‑2h或4℃封闭过夜，封闭时注意放于摇床上并缓慢晃动。

[0108] 3)封闭结束后，回收封闭液，并用PBS清洗2‑3次。

[0109] (5)孵育一抗/内参

[0110] 1)用2‑3mL脱脂奶粉或PBS按抗体说明书的比例(通常为1：1000)稀释一抗/ 内参，将抗体加入到抗体孵育盒中，盒侧壁标记抗体名称及二抗种属，室温孵育 1‑2h或4℃孵育过夜，孵育时注意放于摇床上并缓慢晃动，孵育时间一般不超 过18h。

[0111] 2)一抗/内参孵育结束后，回收一抗/内参，用PBST(PBS按照1：1000的比例 加入Tween‑20)水平摇床上洗膜2‑3次，每次10mins。

[0112] (6)孵育二抗

[0113] 1)用2‑3mL PBS按相应比例稀释二抗(一般按照抗体与稀释液的比例为1： 10000)，加到抗体孵育盒中，室温孵育1.5h。

[0114] 2)二抗孵育结束后，回收二抗，可重复使用2‑3次，再用PBST水平摇床上洗 膜2‑3次，每次10mins。若不显色可用PBS浸泡放于4℃冰箱保存。

[0115] (7)显色

[0116] 1)提前打开扫膜仪，预冷5‑10mins至‑20℃。

[0117] 2)配制显色液：显色液的定影液和显影液按1：1比例混合，每张膜200μL， 注意避光,现配现用。

[0118] 3)显色：将膜正面朝上放于载物台，均匀滴加显色液，显色并拍照保存。

[0119] 2.5克隆形成实验

[0120] (1)从培养箱中取出生长状态良好的细胞在超净工作台中，消化并计数，按照 每孔约500个细胞的密度接种到六孔板中，六孔板每孔加入2mL细胞培养液， 轻轻摇晃使细胞分布均匀，将分好的六孔板放入细胞培养箱中培养过夜待细胞贴 壁；

[0121] (2)待细胞贴壁后，对细胞进行加药或者转染处理，处理合适的时间后可换液， 继续培养；

[0122] (3)培养2周左右，待显微镜下观察到或在皿底有肉眼轻微可见的克隆细胞团 时，弃掉培养液，用PBS清洗2‑3次，加入0.05％结晶紫染液染色30mins，回 收染液，用PBS小心清洗干净皿底，但注意不要洗掉细胞团，弃去PBS，皿底 拍照保存。

[0123] 2.6细胞活率检测

[0124] (1)细胞接种：按2.2.1中的方法接种96孔板，培养过夜待细胞贴壁。

[0125] (2)加药处理：待细胞贴壁，细胞接种后24h内，及时用排枪吸掉旧培养液， 加入含不同浓度药物的新鲜培养液进行处理，若超过24h每孔细胞数目会有细 微的差异。以仅加入药物溶剂作为对照组。

[0126] (3)收样：待处理时间足够后，一般处理24h、48h或72h，弃去旧培养液， 每孔加入含10μL CCK8的细胞培养液100μL，继续在细胞培养箱中孵育约4h。

[0127] (4)读数与计算：取出处理好的96孔板，打开盖子，放入酶标仪中，读取450 nm处各孔的OD值。以对照组的OD值作为100％，计算实验组的细胞存活率。

[0128] 2.7圆二色谱

[0129] (1)按照2.2.3中的体系配制反应液约300μL，37℃孵育20‑30mins，以DMSO 孵育的APE1蛋白作为阴性对照。

[0130] (2)在0.1cm的石英比色皿中加入200μL的1×APE1 reaction buffer，用圆二 色谱仪扫基线，并设定仪器自动扣除背景。

[0131] (3)将实验组及对照组样品溶液依次放入比色皿中，并在180‑280nm波长下扫 描光谱。

[0132] (4)对所得数据进行分析处理。

[0133] 2.8细胞凋亡的检测

[0134] (1)将处理好的细胞取出，在超净工作台中向细胞培养板中加入适量胰酶小心 消化细胞，防止消化过度，弃去胰酶，用培养液小心将细胞吹悬并离心。

[0135] (2)弃去旧培养液，用PBS清洗1次。

[0136] (3)离心，弃去PBS，用凋亡试剂盒(凯基KGA108‑2)中的1×binding buffer 重悬5
细胞，每孔500μL，凋亡实验细胞密度应不低于1.0×10个，仅用溶剂处理 的细胞作为对照组，对照组可做3个平行样品，其中2个平行样品用PBS重悬 后65℃处理5mins，分别加入FITC或PI作为单染组，用于后续流式测试中画 门，其余每组均加入FITC和PI染液进行双染，37℃避光孵育15‑20mins。

[0137] (4)孵育后1h内使用流式细胞仪上机检测。上机前为防止细胞悬液中的细胞 团块堵塞仪器，需要用200目滤网过滤细胞悬液。

[0138] 2.9线粒体膜电位检测

[0139] (1)本文中细胞线粒体膜电位的检测根据试剂盒说明书(碧云天C2006)进行。 (2)向未处理的样品中按照1:1000的比例加入CCCP(10mM)，37℃孵育20 mins。

[0140] (3)将处理好的细胞取出，加入适量胰酶小心消化，消化后弃去胰酶，用培养 液小心将细胞吹悬并离心。

[0141] (4)弃去旧培养液，用PBS清洗1次。

[0142] (5)离心，弃去PBS，用500μL细胞培养液重悬细胞。

[0143] (6)每个样品加入500μL JC‑1染色工作液混合均匀，37℃孵育20mins。

[0144] (7)孵育后，1500rpm离心3‑4mins，弃上清。

[0145] (8)按照说明书配制1×JC‑1染色缓冲液，重悬细胞。

[0146] (9)流式细胞仪上机检测并分析JC‑1染色情况。

[0147] 2.10免疫荧光

[0148] (1)细胞培养板接种细胞前，需将大小合适的盖玻片作为细胞爬片，提前用75％ 酒精浸泡并在酒精灯上炙烤灭菌，放于细胞培养板中。

[0149] (2)取生长状态良好的细胞，胰酶消化离心吹悬，接种到细胞培养板中，摇晃 使细胞分布均匀，过夜培养待细胞贴壁。

[0150] (3)细胞贴壁后，根据实验需要进行处理。

[0151] (4)细胞处理后，弃去旧培养液，用PBS清洗。弃去PBS，加入4％PFA，室 温孵育30mins固定细胞。

[0152] (5)弃去4％PFA，用PBS在水平摇床上低转速清洗2‑3次，每次10mins。

[0153] (6)弃去PBS，加入0.5％Triton‑X100打孔，室温孵育15mins。

[0154] (7)弃去Triton‑X100，用PBS在水平摇床上低转速清洗2‑3次，每次10mins。

[0155] (8)弃去PBS，加入5％BSA作为封闭液，室温孵育1h。

[0156] (9)弃去封闭液，加入一抗，4℃孵育过夜。

[0157] (10)回收一抗，用PBST在水平摇床上低转速清洗2‑3次，每次10mins。

[0158] (11)在细胞爬片上滴加荧光二抗，37℃孵育1‑2h，注意避光。

[0159] (12)回收二抗，用PBST在水平摇床上低转速清洗2‑3次，每次10mins。

[0160] (13)弃去PBST，每个细胞爬片上滴加100μL DAPI，37℃孵育15mins。

[0161] (14)回收DAPI，用PBST在水平摇床上低转速清洗2‑3次，每次10mins。

[0162] (15)在爬片上方滴加抗荧光猝灭封片剂2‑3μL,盖上盖玻片，在玻片上方覆盖 一层吸水纸，轻轻按压，吸掉多余抗荧光猝灭封片剂，用指甲油作为封片剂在盖 玻片周围及载玻片上画一圈封片。

[0163] (16)上述爬片应置于4℃避光保存。为防止荧光淬灭，应及时用荧光显微镜拍 照并分析。

[0164] 2.11彗星法检测DNA断裂

[0165] (1)本文中彗星法检测DNA断裂根据试剂盒说明书(凯基KGA240)进行。

[0166] (2)将处理好的细胞取出，加入适量胰酶小心消化，消化后弃去胰酶，用培养 液小心将细胞吹悬并离心。

[0167] (3)弃去旧培养液，用PBS清洗1次。

[0168] (4)离心，弃去PBS，用100μL细胞培养液重悬细胞，取出20μL测量细胞密 度。

[0169] (5)每个样品需要2000‑4000个细胞，根据细胞密度计算所需细胞悬液体积， 与事先融好的低熔点胶混匀，混匀后胶体积约为40‑50μL，尽量减少加入胶内的 细胞悬液的体积，将细胞悬液滴在平皿上。

[0170] (6)将玻片置于平皿中，倒入Lysis Bufer(含DMSO)，4℃裂解2h。

[0171] (7)将玻片置于水平电泳槽中，缓慢用5mL移液枪逐枪向电泳槽中加入新配 制的碱性电泳缓冲液(1mmol/L EDTA,300mmol/L Na0H)，以免冲掉皿上的凝胶， 室温孵育60mins，使DNA在碱性条件下解螺旋和产生碱易变性区段易于迁移， 碱性电泳缓冲液为强碱，小心操作。

[0172] (8)设置电压25V，电泳30mins。

[0173] (9)缓慢用5mL移液枪逐枪从电泳槽中回收碱性电泳缓冲液，小心取出载玻 片置于平皿内，加入0.4mmol/L的Tris‑HCl(pH 7.5)缓冲液中和，完成此步若 不拍照可放于4℃保存，但凝胶易位移。

[0174] (10)弃去Tris‑HCl中和液，每个载玻片加10‑20μL的PI染液，避光染色10mins。

[0175] (11)荧光显微镜拍照分析，拍照时应降低室温，以免凝胶会干掉。

[0176] 2.12裸鼠成瘤实验

[0177] (1)提前购买周龄为3周的雌性BALB/c裸鼠，放于鼠房中饲养一周，使之提 前适应环境。

[0178] (2)同时选取代数较少且生长状态良好无污染的NCI‑H460细胞在大皿中大量 扩增。

[0179] (3)待小鼠刚好长至4周，并培养得到大量NCI‑H460细胞后，胰酶消化收集 至同一个15mL离心管中离心，弃去旧培养液，用2‑3mL新鲜无血清培养液吹 悬沉淀。将所得细胞悬7
液混匀，取出20μL计数，测得细胞密度后将待注射15 mL离心管中的细胞密度调至1×10个/mL，为保持细胞活力，此时不应将细胞 置于冰上，室温即可。

[0180] (4)为保持细胞活力，及时进行皮下注射，每只裸鼠注射体积为100μL。

[0181] (5)密切关注小鼠皮下成瘤情况，一般2‑3天，因注射鼓起的皮肤会消下去， 并逐3
步长出瘤块。待肿瘤长至50‑100cm后，将小鼠随机分为4组，做好标记， 分别进行药物腹腔注射。

[0182] (6)药物注射每隔2天注射一次，注射时间为3周。

[0183] (7)同时，用体重计称量小鼠体重，用游标卡尺测量瘤块肿瘤的长宽，并记录。 计2
算肿瘤体积，计算公式为：长×宽/2。

[0184] (8)3周后，将小鼠处死并小心剖出皮下的瘤块，称量拍照并记录。将取出的 瘤块浸泡于4％PFA置于4℃保存，用于后续免疫组化实验。

[0185] 2.13免疫组化

[0186] (1)将组织芯片(购西安艾丽娜生物科技有限公司)或瘤块制成的石蜡切片从 4℃冰箱中取出置于60℃烘箱中4‑6h。

[0187] (2)及时将烘好的切片放于抗体孵育盒，在通风橱中加入2mL二甲苯，盖上 抗体孵育盒的盖子放在摇床上，每10mins换一次二甲苯，换洗2‑3次；之后连 续转移至100％、90％、80％、70％、50％的乙醇溶液中，每种溶液清洗2‑3 次，每次10mins；最后用ddH2O浸泡
2‑3次，每次10mins。

[0188] (3)沿着组织块的外缘用阻水笔画出一个闭合的圆圈，加入3％H2O2，室温避 光孵育10‑15mins。

[0189] (4)向抗体孵育盒中加入2‑3mL的PBS洗片3次，每次10mins。

[0190] (5)在切片上方向闭合的圆圈中小心滴加抗原修复液覆盖组织块，37℃孵育 15mins。

[0191] (6)向抗体孵育盒中加入2‑3mL PBS洗片3次，每次10mins。

[0192] (7)向抗体孵育盒中加入2‑3mL 3％BSA封闭液，在摇床上室温封闭1h。

[0193] (8)弃去封闭液，在切片上方向闭合的圆圈中小心滴加一抗覆盖组织块，4℃ 孵育过夜。

[0194] (9)一抗孵育后，向抗体孵育盒中加入2‑3mL PBST清洗2‑3次，每次10mins。

[0195] (10)弃去PBST，在切片上方向闭合的圆圈中，小心滴加荧光二抗，37℃孵 育15‑20mins或者室温孵育1.5h。

[0196] (11)二抗孵育后，向抗体孵育盒中加入2‑3mL PBST清洗2‑3次，每次10mins。

[0197] (12)在组织上方滴加抗荧光猝灭封片剂2‑3μL，盖上盖玻片，封片剂封片。

[0198] (13)将制备好的片子4℃避光保存，显微镜下观察并拍照。

[0199] 2.14数据处理与统计

[0200] 本文的数据采用Excel计算结合GraphPad Prism软件作图及统计学分析。本 文的免疫荧光和western blot等图片使用Photoshop进行处理结合GraphPad Prism 软件进行统计学分析。所有实验均进行三次独立重复。。所有实验数据都来自三 次独立重复实验，用Mean±SD表示；P<0.05即表示组别之间具有显著差异。组 间的差异采用t检验进行分析。*p＜0.05表示差异显著，**p＜0.01表示差异非 常显著，***p＜0.001表示差异极其显著。

[0201] 3、实验结果与分析

[0202] 3.1APE1在NSCLC中高表达

[0203] 通过在线数据分析网站“UALCAN”在The Cancer Genome Atlas(TCGA)数据 库中对APE1在NSCLC中的表达量进行分析，如图1A和1B所示，在肺腺癌 (Lung adenocarcinoma,LUAD)和肺鳞癌(Lung squamous cell carcinoma,LUSC) 样本中APE1的mRNA水平表达量显著高于正常样本。同时通过western blot 检测不同NSCLC细胞株及相应正常肺细胞中APE1蛋白的表达量，发现与正常 肺细胞HELF相比，APE1蛋白在不同类型的肺癌细胞A549、NCI‑H460和 NCI‑H1299中高表达(图1C)。为了揭示在组织水平非小细胞肺癌(NSCLC) 组织样本与正常组织样本之间APE1表达水平的差异，选取含肺癌组织和正常组 织共100例的组织芯片进行了免疫组化实验。通过对APE1在组织阵列各点的染 色强度进行统计学分析，如图1D所示，与正常肺组织及邻近的正常肺组织相比， APE1在NSCLC组织中高表达，包括腺癌、鳞状细胞癌、大细胞癌、转移性鳞 状细胞癌、转移性腺癌组织。以上数据表明，APE1在NSCLC中表达上调。

[0204] 3.2敲降APE1抑制A549、NCI‑H460细胞的克隆形成

[0205] APE1在NSCLC中表达上调，为了进一步确定APE1表达上调是否影响 NSCLC的进程。用慢病毒构建了稳定低表达APE1的A549和NCI‑H460细胞株。 通过克隆形成实验发现，敲降APE1能够抑制A549和NCI‑H460的克隆形成(图 2A)。结果提示APE1在NSCLC中高表达促进NSCLC的克隆形成并影响NSCLC 病人的存活率。

[0206] 3.3APE1小分子抑制剂的筛选

[0207] 由于APE1在NSCLC中表达上调并与NSCLC细胞的增殖有关，且影响 NSCLC患者的生存，目前已有多项研究将APE1作为恶性肿瘤的重要标志物之 一，因此APE1可以作为抗肿瘤药物开发的合理靶点。于是，根据APE1蛋白 DNA修复活性区域的三维结构，在Chendiv化合物库中将小分子化合物与APE1 蛋白AP位点核酸内切酶活性口袋进行分子对接，通过这种计算机虚拟筛选，得 到与APE1蛋白的DNA修复活性口袋结合得分较高的52种候选小分子抑制剂 (如表1)。

[0208] 表1计算机虚拟筛选得分较高的小分子化合物编号及名称

[0209]

[0210]

[0211] 接下来采用APE1蛋白AP位点核酸内切酶活性体外检测系统，对上述候选 小分子抑制剂进行生化水平的筛选，得到了对APE1的AP位点核酸内切酶活性 抑制效果比对照药物CRT0044876抑制效果好的的8种潜在的小分子抑制剂(如 表2所示)。

[0212] 表2活性筛选实验中候选小分子抑制剂及酶活

[0213]

[0214] 接下来将上述8种小分子抑制剂分别设置浓度梯度处理A549细胞，用CCK8 检测细胞存活率，如表3所示，NO.0449‑0145在细胞水平表现出了对APE1的 AP位点核酸内切酶活性具有良好的抑制效果。

[0215] 表3不同候选小分子抑制剂的IC50

[0216]

[0217]

[0218] 为进一步探究NO.0449‑0145对除A549外其它肺癌细胞及正常肺细胞的杀伤效 果，采用不同浓度梯度处理A549、NCI‑H460、NCI‑H1299及相应正常肺细胞 HELF，CCK8检测细胞存活率，如图3A所示，该小分子抑制剂对正常肺细胞 HELF没有杀伤作用，但对肺癌细胞A549、NCI‑H460、NCI‑H1299有不同的杀 伤效果，且IC50分别为0.09μM，0.07μM，0.21μM(图3B)。

[0219] 3.4NO.0449‑0145在生化水平上对APE1的抑制作用

[0220] 由于NO.0449‑0145在体外及细胞水平的筛选过程中抑制效果显著，于是将 该小分子抑制剂作为研究对象进行进一步的研究。该小分子抑制剂的结构如图 4A所示。通过圆二色谱实验发现，该小分子抑制剂能够直接与APE1蛋白相结 合并改变了APE1蛋白的二级结构，减少了APE1蛋白的β折叠(图4B)。此外， 根据APE1和NO.0449‑0145的结构对他们之间的结合进行分子模拟，如图4C 所示，NO.0449‑0145可以直接与APE1结合，这与CD光谱分析结果一致。通过 对他们结合的位点进行模拟，确定了9个潜在的结合位点(图4D)，其中位点 4Arg、31Lys、177Arg和280Trp对于与APE1的结合更为重要。

[0221] 3.5NO.0449‑0145能够诱导A549及NCI‑H460发生细胞凋亡

[0222] 由于NO.0449‑0145对NCI‑H460和A549有明显的杀伤作用，为进一步探究 NO.0449‑0145是否诱导了A549及NCI‑H460细胞凋亡。由于细胞凋亡的早期变 化是细胞线粒体膜电位(MMP)的下降，用流式细胞仪检测线粒体膜电位的变 化，发现NO.0449‑0145处理的NCI‑H460在24h内MMP降低(图5A)。在细 胞凋亡的过程中，MMP下降之后是磷脂酰丝氨酸外翻，于是，用 Annexin‑V‑FITC/PI染色法进行了检测。如图5B所示，与对照组相比，该小分子 化合物可诱导NCI‑H460细胞发生凋亡，且呈浓度依赖性，0.3μM的 NO.0449‑0145可使凋亡细胞增加约3倍。在A549细胞中也观察到了类似的结果。 由促凋亡蛋白(如BAD、BAK)和抗凋亡蛋白(如Mcl‑1、Bcl‑XL)组成的Bcl‑2 家族在细胞凋亡调控中起着重要作用。为了揭示该小分子抑制剂诱导细胞凋亡的 机制，采用western blot方法检测其是否改变了NCI‑H460和A549细胞中抗凋亡 和促凋亡蛋白的表达水平。如图5C所示，抗凋亡蛋白(Bcl‑XL和Mcl‑1)的表 达下调，同时促凋亡蛋白(Bad和Bak)的表达上调，且呈浓度依赖性。在A549 细胞中也观察到类似的结果。以上数据表明，NO.0449‑0145能够诱导A549及NCI‑H460发生细胞凋亡。

[0223] 3.6NO.0449‑0145诱导A549及NCI‑H460细胞DNA损伤

[0224] 碱性彗星实验常用于检测DNA单链断裂(SSB)，在碱性彗星实验中，彗星 尾巴的长度表征了该细胞DNA损伤的程度，长度越长，代表DNA损伤越严 重。如图6A所示，NO.0449‑0145能够增加A549及NCI‑H460细胞DNA单链 断裂损伤。DNA单链断裂损伤如果不能被及时修复则会产生DNA双链断裂 (DSB)。γ‑H2AX和53BP1是两种公认的DNA双链断裂蛋白标记。
如图6B所 示，在NO.0449‑0145的处理下，γ‑H2AX在NCI‑H460和A549细胞中的表达水 平升高。同时，免疫荧光实验发现，NO.0449‑0145可以增加NCI‑H460和A549 细胞中γ‑H2AX和
53BP1的foci点(图6C和D)，加剧DNA双链断裂损伤。以 上结果表明，NO.0449‑0145可诱导A549及NCI‑H460细胞DNA单链和双链损 伤。

[0225] 3.7NO.0449‑0145抑制裸鼠NCI‑H460移植瘤生长

[0226] 上述生化及细胞水平的实验数据表明，NO.0449‑0145能够直接与APE1蛋 白进行结合并改变APE1蛋白的三维结构，且对A549、NCI‑H460及NCI‑H1299 细胞有显著的杀伤能力，并能诱导A549和NCI‑H460细胞凋亡及加剧细胞DNA 损伤。为进一步探究NO.0449‑0145的体内抗肿瘤活性，用NCI‑H460细胞进行 了裸鼠皮下移植瘤实验。

[0227] 取周龄为4周的雌鼠进行皮下注射，每只裸鼠注射体积为100μL，细胞密 度为1×7 3
10个/mL。待裸鼠皮下的瘤块长至50‑100cm 后，将这些裸鼠随机分成 4组并开始药物腹腔注射，实验组每组注射NO.0449‑0145浓度分别为：3.125 mg/kg、6.25mg/kg及12.5mg/kg,并以注射12.5mg/kg CRT0044876作为对照组。 每隔2天注射一次同时测量并记录裸鼠体重及瘤块的体积大小，注射时间为3 周。根据对裸鼠体重的连续监测与统计发现，与对照组相比，除12.5mg/kg的 NO.0449‑0145组小鼠体重较轻但并未引起体重的危险下降外，其余各组均无明 显毒性反应(图7A)。图7B为瘤块大小形状的观察。如图7C所示，发现 NO.0449‑
0145以剂量依赖和时间依赖的方式抑制肿瘤生长。与上述结果一致， 与对照组相比，NO.0449‑0145也抑制了瘤块重量的增加(图7D)。

[0228] 为了揭示NO.0449‑0145在体内抑制异种移植瘤生长的机制，采用免疫组化 方法检测各组肿瘤样本的蛋白表达水平。如图7E所示，NO.0449‑0145增加了 γ‑H2AX和53BP1的foci点，在体内能够增加NCI‑H460细胞的DNA损伤。以 上结果表明，NO.0449‑0145在体内能够抑制异种移植瘤的生长并增加NCI‑H460 的DNA损伤。