[0001] 本申请是“乙酰蟾毒灵在制备抗肿瘤药物中的应用”的分案申请，原申请的申请日为2018年01月22日，申请号为201810059055.8。

[0002] 本发明属于生物医药领域，具体涉及一种乙酰蟾毒灵在制备抗肿瘤药物中的应用。

[0003] 肿瘤是引起人类死亡的主要原因之一，其发病率和致死率总体呈每年上升的趋势。统计显示，自2010年起，恶性肿瘤己成为城乡居民死亡首要原因。可见肿瘤的预防和治疗十分迫切。药物治疗是肿瘤治疗的主要手段之一。虽然目前已经开发出众多抗肿瘤药物，能够有效地延长患者的生命或提高患者的生存质量，但肿瘤的药物研究和开发还面临巨大挑战，如抗肿瘤药物多为细胞毒药物，其副作用明显，限制了这些药物的临床应用。近二十年来，肿瘤的靶向治疗得到了飞速的发展，诸如伊马替尼、曲妥珠单抗等靶向肿瘤信号蛋白的药物在临床研究中展现出极具前景的治疗效果以及较低的毒副作用。然而，获得性耐药的出现及肿瘤基因组的多变性，使得靶向治疗同样面临着巨大的挑战。

[0004] 蟾毒灵，属强心甙类物质，分子式为C24H34O4，来源于中华大蟾蜍和黑眶蟾蜍耳后腺及皮肤分泌之浆液，是中药蟾酥(浆)中提取的一种活性最强的毒性配基。研究表明，蟾毒灵主要具有强心、麻醉止痛等作用，同时对神经系统也有一定作用。

[0005] 目前，也有一些研究报道了蟾毒灵具有一定的抗癌作用，然而其抗癌效果欠佳，并且其抗癌机制和靶点也不明确。

[0006] 本发明提供了一种乙酰蟾毒灵在制备抗肿瘤药物中的应用，该乙酰蟾毒灵具有更高的疗效。

[0007] 一种乙酰蟾毒灵在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的乙酰蟾毒灵的结构如式(I)所示：

[0008]

[0009] 本发明中，所述的乙酰蟾毒灵是蟾毒灵的衍生物，试验结果表明，通过该衍生物提高抗肿瘤疗效。

[0010] 作为优选，所述的抗肿瘤药物用于治疗肺癌。

[0011] 本发明选取了三株人非小细胞肺癌(NSCLC)细胞株PC-9，A549，H460，通过MTT实验，观察乙酰蟾毒灵对NSCLC细胞增殖的影响。结果显示：作用48h后能够剂量依赖性的抑制NSCLC细胞株的增殖，其中H460 IC50最低，药物最敏感。作为优选，所述的抗肿瘤药物用于抑制人非小细胞肺癌细胞株PC-9，A549或H460的增殖。

[0012] 试验结果表明，乙酰蟾毒灵能浓度依赖性上调抑癌蛋白Bax，下调促癌蛋白Bcl-2的表达，从而诱导NSCLC的凋亡。作为优选，所述的乙酰蟾毒灵用于上调抑癌蛋白Bax，下调促癌蛋白Bcl-2的表达。

[0013] 试验结果表明，乙酰蟾毒灵能浓度依赖性抑制G2/M相关蛋白表达。作为优选，所述的乙酰蟾毒灵用于诱导细胞G2/M期阻滞。

[0014] 试验结果表明，乙酰蟾毒灵能浓度依赖性的抑制STAT3的磷酸化，400nM能明显抑制STAT3的磷酸化。作为优选，所述的乙酰蟾毒灵用于抑制STAT3磷酸化。

[0015] 同现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

[0016] 本发明通过对蟾毒灵进行进一步的衍生化，得到的乙酰蟾毒灵对肿瘤细胞具有更好的抑制效果。附图说明

[0017] 图1为实施例2中乙酰蟾毒灵对NSCLC细胞增殖的抑制作用，其中，A.蟾毒灵(Bu)和乙酰蟾毒灵(Ac-Bu)对PC-9细胞增殖的影响。B.乙酰蟾毒灵对PC-9、A549、H460细胞增殖的抑制作用。

[0018] 图2为实施例3中Hochest试剂盒染细胞核检测PC-9凋亡结果图。

[0019] 图3为实施例3中流式细胞仪检测乙酰蟾毒灵诱导PC-9、A549细胞凋亡的效果图。

[0020] 图4为实施例3中WB分析调亡相关蛋白Bcl-2和Bax的结果示意图。

[0021] 图5为实施例4中乙酰蟾毒灵抑制NSCLC细胞集落形成结果示意图。

[0022] 图6为实施例5中乙酰蟾毒灵作用PC-9细胞16h后发生细胞周期阻滞的结果示意图。

[0023] 图7为实施例5中乙酰蟾毒灵抑制NSCLC细胞周期相关蛋白表达的结果示意图。

[0024] 图8为实施例6中乙酰蟾毒灵在PC-9、H460、A549细胞中抑制STAT3磷酸化的结果示意图。

[0025] 实施例1乙酰蟾毒灵的合成

[0026] 将蟾毒灵(15mg,0.0388mmol)和三乙胺(0.39mmol)溶解于干燥的二氯乙烷(1mL)中，然后加入乙酰氯(0.39mmol)，反应混合物在室温下搅拌19小时。旋干溶剂，然后用硅胶柱进行柱层析(DCM/MeOH＝50:1to20:1)，得到产物(17mg,100％yield)，产物为淡黄色固体。

[0027] 反应式如下：

[0028]

[0029] 产物表征数据如下：

[0030] 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.82(dd,J＝9.6,4.0Hz,1H),7.22(s,1H),6.26(d,J＝9.6Hz,1H),5.07(s,1H),2.49-2.40(m,1H),2.26-2.15(m,1H),2.09-1.99(m,4H),1.94-
1.81(m,2H),1.80-1.35(m,18H),1.27(s,3H),0.69(s,3H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ170.7,
162.3,148.6,146.7,122.6,115.3,85.4,70.4,51.3,48.4,42.4,40.9,36.8,35.9,35.2,
32.8,30.5,30.5,28.7,26.4,25.1,23.7,21.5,21.4,21.3,16.5；ESI-HRMS:calcd.for C26H37O5+(M+H)+429.2636,found 429.2637.

[0031] 实施例2乙酰蟾毒灵抑制NSCLC细胞增殖

[0032] 选取了三株人非小细胞肺癌细胞株PC-9，A549，H460，通过MTT实验观察蟾毒灵(Bu)乙酰蟾毒灵(Ac-Bu)对这些细胞增殖的影响。将NSCLC细胞接种于96孔板中(细胞浓度为5000/孔)，每孔加入100ulRPMI1640培养液培养过夜，细胞贴壁后换液，加入不同浓度梯度的蟾毒灵和乙酰蟾毒灵，对照组加入等量DMSO。培养48h后加入MTT液，继续培养4h，弃去上清，加入DMSO溶解，检测吸光值，测定IC50。结果如图1所示：乙酰蟾毒灵对PC-9细胞增殖的抑制效果比蟾毒灵提高了5倍左右(图1A)，乙酰蟾毒灵能够剂量依赖性抑制NSCLC细胞株的增殖(图1B)。

[0033] 实施例3乙酰蟾毒灵诱导NSCLC细胞凋亡。

[0034] 我们利用Hoechst 33258凋亡染色试剂盒染细胞核，通过观察细胞核的颜色判断细胞凋亡情况，结果如图2所示，发现不同浓度的乙酰蟾毒灵(100nM，200nM，400nM)作用PC-9细胞24h后其细胞核颜色由正常的蓝色变为亮蓝色，表明细胞发生凋亡，且随着浓度升高凋亡越明显。

[0035] 我们利用Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞仪检测乙酰蟾毒灵诱导NSCLC细胞凋亡的效果。将NSCLC细胞接种于6孔板中，培养18h后实验组加入不同浓度的乙酰蟾毒灵(终浓度为100nM，200nM，400nM)，对照组加入等量DMSO，发现乙酰蟾毒灵作用30h后能够剂量依赖性诱导NSCLC细胞产生凋亡结果如图3所示。

[0036] 我们用不同浓度的乙酰蟾毒灵(100nM，200nM，400nM)处理PC-9、A549、H460，对照组加入等量DMSO，作用24h后提取蛋白，用免疫印迹检测总细胞蛋白质提取物(70mg)中凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax，GAPDH作为内参，结果如图4所示。发现乙酰蟾毒灵能浓度依赖性上调抑癌蛋白Bax，下调促癌蛋白Bcl-2的表达，从而诱导NSCLC的凋亡。

[0037] 实施例4乙酰蟾毒灵抑制NSCLC细胞集落形成

[0038] 肿瘤细胞能够无限增殖形成细胞集落，通过集落形成实验，我们可以了解化合物对细胞增殖的影响。将NSCLC细胞接种于6孔板中(细胞浓度为1×103/孔)，反复吹打细胞悬液，使细胞充分扩散。预培养18h后实验组加入不同浓度的乙酰蟾毒灵(终浓度为100nM，200nM，400nM，溶剂为DMSO)，对照组加入等量DMSO。继续培养24h，更换新鲜RPMI1640培养液继续培养一周以形成单个细胞集落。结果如图5所示，由图5可知，乙酰蟾毒灵能剂量依赖性地抑制这三株NSCLC细胞集落形成。

[0039] 实施例5乙酰蟾毒灵诱导NSCLC细胞周期阻滞

[0040] 我们利用核酸染料PI标记DNA，由流式细胞仪检测细胞周期阻滞。将PC-9细胞接种于6孔板中，培养18h后实验组加入不同浓度的乙酰蟾毒灵(终浓度为100nM，200nM，400nM)，对照组加入等量DMSO，发现乙酰蟾毒灵作用16h后能够剂量依赖性阻滞细胞周期，阻滞于G2/M期，结果如图6所示。

[0041] 同时，用免疫印迹检测总细胞蛋白质提取物(70mg)中各种靶蛋白水平，分析周期相关蛋白MDM2、CyclinB1、CDC2和P53，GAPDH作为内参，结果如图7所示，发现乙酰蟾毒灵能浓度依赖性抑制周期相关蛋白表达。

[0042] 实施例6乙酰蟾毒灵通过抑制STAT3发挥抗肿瘤作用

[0043] 我们进一步探索了乙酰蟾毒灵发挥抗肿瘤作用的机制和直接作用靶点。我们用不同浓度的乙酰蟾毒灵(终浓度为100nM，200nM，400nM)分别处理人肺癌细胞PC-9、A549、H460，用免疫印迹检测总细胞蛋白质提取物(70mg)中STAT3和p-STAT3蛋白水平，GAPDH作为内参，结果如图8所示。发现乙酰蟾毒灵能浓度依赖性的抑制STAT3的磷酸化，400nM能明显抑制STAT3的磷酸化。因此，乙酰蟾毒灵可能是通过抑制STAT3发挥抗肿瘤作用，STAT3可能是其直接作用靶点。