[0001] 本发明属于药物制备领域，具体涉及一种新型三萜类化合物及其制备治疗心血管疾病药物的用途。

[0002] 近17年来，冠心病是最常见的心血管疾病之一，严重威胁人类健康。目前冠心病的治疗药物存在种种局限，冠心病药物研发方兴未艾。在寻找新型药物的过程中，天然产物备受关注。据《开宝本草》记载，传统中药盐肤木(Rhus chinensis Mill.)，其树白皮主破血止血，根茎能活血化瘀。以盐肤木为原药材的闽产单味制剂——舒冠通糖浆(国药准字Z35020635)，治疗冠心病临床疗效确凿。1973至1978年，全国十余个单位对舒冠通糖浆的临床作用进行验证，共治疗冠心病346例，临床总有效率达80％以上。药理研究表明，盐肤木提取物可明显改善冠心病动物模型的血液流变性，采用盐肤木提取物静脉注射实验犬，可使其冠状血流量增加59.7％，血管阻力降低51％，心肌耗氧量减少24.2％。

[0003] 然而，盐肤木根治疗冠心病的药效物质基础至今未明。迄今为止，国内外学者对盐肤木根的化学成分亦研究不足，除了黄酮、酚酸、鞣质外，已报道的三萜仅12个(比如Kim GS,Jeong TS,Kim YO,Baek NI,Cha SW,Lee JW,Song KS.Human acyl‑CoA:Cholesterol acyltransferase‑inhibiting dammarane triterpenes from Rhus chinensis.J Korean Soc for Appl Biol Chem 2010；53:417–21)。

[0004] 因此，研究盐肤木根中的化学成分，寻找能够有效治疗冠心病的药物，具有非常重要的意义。

[0005] 本发明的目的在于提供一种能够有效治疗心血管疾病的新的化合物。

[0006] 本发明提供了式I所示化合物、或其药学上可接受的盐、或其光学异构体、或其立体异构体、或其溶剂合物：

[0007]

[0008] 其中，R1选自被0～4个R1x取代的烷基、被0～4个R1x取代的烯基、被0～4个R1x取代的炔基、卤素、羟基、羧基、H；

[0009] R1x选自卤素，‑L‑OH，羧基，H，被0～4个Ra取代的饱和或不饱和环烷基，被0～4个Ra取代的饱和或不饱和杂环基，被0～4个Ra取代的、含0～4个杂原子的、饱和或不饱和环酮基，被0～4个Ra取代的C1‑5烷基，被0～4个Ra取代的C2‑5烯基，被0～4个Ra取代的C2‑5炔基；Ra选自H、‑L‑OH、羧基、卤素、C1‑5烷基、C1‑5烷氧基；L为0～5个亚甲基；

[0010] R2、R3、R4、R5、R6、Ra1、Ra2、Ra3各自独立地选自H、C1‑10烷基、C1‑10烷氧基、C2‑10烯基、C2‑10炔基、羟基、羧基、氨基、卤素；

[0011] 表示为单键或者双键。

[0012] 进一步地，所述化合物的结构如式II所示：

[0013]

[0014] 其中，R2、R3、R4、R5、R6各自独立地选自H、羟基、羧基、卤素、C1‑3烷基；

[0015] R1选自被0～3个R1x取代的烷基、被0～3个R1x取代的烯基、卤素、羟基、羧基、H；

[0016] R1x选自卤素，‑L‑OH，羧基，H，被0～3个Ra取代的、含1～2个杂原子的、不饱和环酮基，被0～3个Ra取代的C1‑5烷基，被0～3个Ra取代的C2‑5烯基；Ra选自H、‑L‑OH、羧基、卤素、C1‑5烷基、C1‑5烷氧基；L为0～3个亚甲基；

[0017] 表示为单键或者双键。

[0018] 进一步地，所述化合物的结构如式III‑1所示：

[0019]

[0020] 其中，R7选自

[0021] m、n、a各自独立地选自0～2的整数；

[0022] R13、R14、n个Ra4各自独立地选自H、‑L‑OH、羧基、卤素、C1‑5烷基、C1‑5烷氧基，L为0～1个亚甲基；

[0023] M选自O、S、CY2、NY，Y选自H、羟基、羧基、卤素、C1‑5烷基、C1‑5烷氧基；

[0024] 或，所述化合物的结构如式III‑2所示：

[0025]

[0026] 其中，R8选自 a选自0～2的整数；

[0027] R13、R14、R9各自独立地选自H、‑L‑OH、羧基、卤素、C1‑5烷基、C1‑5烷氧基，L为0～1个亚甲基；

[0028] 或，所述化合物的结构如式III‑3所示：

[0029]

[0030] 其中，R10选自 a选自0～2的整数；

[0031] R13、R14、R11、R12各自独立地选自H、‑L‑OH、羧基、卤素、C1‑5烷基、C1‑5烷氧基，L为0～1个亚甲基。

[0032] 进一步地，所述式III‑1的结构如式III‑1a或III‑1b所示：

[0033]

[0034] 其中，R13、R14、Ra4各自独立地选自H、‑L‑OH、C1‑3烷基，L为0～1个亚甲基。

[0035] 进一步地，所述R13、R14、Ra4、R11、R12各自独立地选自H、羟基、‑CH2OH、甲基。

[0036] 进一步地，所述化合物的结构为以下结构之一：

[0037]

[0038] 进一步地，所述化合物的结构为以下结构之一：

[0039]

[0040] 本发明还提供了上述化合物在制备预防和/或治疗心血管疾病药物上的用途。

[0041] 进一步地，所述心血管疾病选自心衰、血栓、冠心病。

[0042] 本发明中，Fr.表示fraction，意为组分。

[0043] 前缀C x‑y表示任何含“示任至““任个碳原子的基团。因此，例如，C1‑5烷基是指包含任何含1～5个碳原子的直链或支链的烷基。

[0044] “取代”是指分子中的1个、2个或多个氢原子被其它不同的原子或分子所替换，包括该分子中同位原子或异位原子上的1个、2个或多个取代。

[0045] “环酮基”是指具有 结构的环状基团，包括取代或未取代的、含或不含杂原子的、饱和或不饱和的环酮基。

[0046] “环烷基”是指构成该环的骨架原子均为碳原子；“杂环基”是指构成该环的骨架原子中至少包含一个杂原子。

[0047] 杂原子是指除碳、氢以外的原子，包括O、S、N等。

[0048] 本文采用质谱引导分离，并应用现代波谱技术(NMR、MS)结合ECD、DFT密度泛函数计算法等方法，制得了具有罕见结构的新化合物。不同于常规的达玛烷型三萜，本发明的化合物为独特带17α‑侧链的达玛烷型三萜。

[0049] 本发明所用混合溶剂的比例均为体积比。

[0050] 实验结果表明，本发明化合物能明显改善心衰斑马鱼的心衰指标和血栓指标，并且其改善作用明显优于对照药物。本发明化合物可以作为改善结构性心脏病变和心脏前负荷和后负荷的先导化合物，在制备预防和/或治疗心衰和血栓的药物上，具有非常良好的应用前景。

[0051] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

[0052] 以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。附图说明

[0053] 图1.化合物1的空间距离实验值(根据NOE积分强度计算而得，绿色)以及理论值(由DFT计算而得，红色)。

[0054] 图2.A:rhuslactone(1)的实验ECD谱图(蓝色),(3S,5S,8R,9S,10R,13R,14R,17R,22S)‑1a及(3S,5S,8R,9S,10R,13R,14R,17R,22R)‑1b的计算ECD谱图(红色，灰色)；B:化合物1和7的实验ECD谱图。

[0055] 图3.供试品处理4.5小时后斑马鱼心脏扩大和静脉窦淤血面积改善表型图(心脏和静脉窦瘀血部位分别以红色和黄色虚线框标记)：(A)空白对照；(B)模型对照组；(C)阳性对照组(0.8μg/mL)；(I–L)给药组[化合物7–10在浓度为其最大耐受浓度(MTC)处理斑马鱼]；以及供试品在浓度为其MTC时处理后，斑马鱼的心脏面积(N)以及静脉窦瘀血面积(O)；与模型对照组比较：*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

[0056] 图4.各实验组在浓度为其MTC时处理后，斑马鱼心输出量(A),血流速度(B)和心率(C)；与模型对照组比较：*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

[0057] 图5.各实验组处理斑马鱼18小时后，心脏红细胞染色强度定量评价图(黄色标记的为斑马鱼心脏)：(A)空白对照；(B)模型对照组；(C)阳性对照组(45μg/mL)；(I–L)给药组。(N)各实验组处理斑马鱼18小时后心脏红细胞染色强度定量评价；与模型对照组比较：*P<
0.05,**P<0.01,***P<0.001。

[0058] 图6.本发明化合物7高分辨质谱。

[0059] 图7.本发明化合物7紫外光谱。

[0060] 图8.本发明化合物7红外光谱。

[0061] 图9.本发明化合物7 1H‑NMR(500MHz,CDCl3)。

[0062] 图10.本发明化合物7 13C‑NMR(125MHz,CDCl3)。

[0063] 图11.本发明化合物7 DEPT135(125MHz,CDCl3)。

[0064] 图12.本发明化合物7 1H‑1H COSY(500MHz,CDCl3)。

[0065] 图13.本发明化合物7 HSQC(500MHz,CDCl3)。

[0066] 图14.本发明化合物7 HMBC(500MHz,CDCl3)。

[0067] 图15.本发明化合物7 NOESY(500MHz,CDCl3)。

[0068] 图16.A:H‑21b/Me‑30的NOE交叉峰体积是指本发明化合物7中H‑12β/H‑13β的体积；B:由NOE强度(红色)计算本发明化合物7的H‑21b/Me‑30的实验动态距离。

[0069] 图17.本发明化合物8高分辨质谱。

[0070] 图18.本发明化合物8红外光谱。

[0071] 图19.本发明化合物8 1H‑NMR(500MHz,CDCl3)。

[0072] 图20.本发明化合物8 13C‑NMR(125MHz,CDCl3)。

[0073] 图21.本发明化合物8 DEPT135(125MHz,CDCl3)。

[0074] 图22.本发明化合物8 HSQC(500MHz,CDCl3)。

[0075] 图23.本发明化合物8 HMBC(500MHz,CDCl3)。

[0076] 图24.本发明化合物8 NOESY(500MHz,CDCl3)。

[0077] 图25.A:H‑21b/Me‑30的NOE交叉峰体积是指本发明化合物8中H‑12β/H‑13β的体积；B:由NOE强度(红色)计算本发明化合物8的H‑21b/Me‑30的实验动态距离。

[0078] 图26.本发明化合物9高分辨质谱。

[0079] 图27.本发明化合物9红外光谱。

[0080] 图28.本发明化合物9 1H‑NMR(500MHz,CDCl3)。

[0081] 图29.本发明化合物9 13C‑NMR(125MHz,CDCl3)。

[0082] 图30.本发明化合物9 DEPT135(125MHz,CDCl3)。

[0083] 图31.本发明化合物9 HSQC(500MHz,CDCl3)。

[0084] 图32.本发明化合物9 HMBC(500MHz,CDCl3)。

[0085] 图33.本发明化合物9 NOESY(500MHz,CDCl3)。

[0086] 图34.本发明化合物10高分辨质谱。

[0087] 图35.本发明化合物10红外光谱。

[0088] 图36.本发明化合物10 1H‑NMR(500MHz,CDCl3)。

[0089] 图37.本发明化合物10 13C‑NMR(125MHz,CDCl3)。

[0090] 图38.本发明化合物10 DEPT135(125MHz,CDCl3)。

[0091] 图39.本发明化合物10 1H‑1H COSY(500MHz,CDCl3)。

[0092] 图40.本发明化合物10 HSQC(500MHz,CDCl3)。

[0093] 图41.本发明化合物10 HMBC(500MHz,CDCl3)。

[0094] 图42.本发明化合物10 NOESY(500MHz,CDCl3)。

[0095] 本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。

[0096] 1实验试剂

[0097] 柱色谱硅胶(100–200目、200–300目，青岛海洋化工厂)；MCI填料(75–150μm,日本三菱化工有限公司)；ODS反相硅胶(50μm,加拿大Silicycle公司)；薄层色谱板(GF254，0.20–0.25mm，青岛海洋化工厂)；甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；乙腈、甲醇(色谱纯，德国MERCK公司)；Milli‑Q超纯水(美国Millipore公司)。

[0098] 2实验仪器

[0099] 高分辨三重四极杆液质联用仪(美国waters公司)；LC‑20A分析兼具半制备高效液相色谱仪(日本岛津公司)；ELSD‑LTⅡ蒸发光散射检测器(日本岛津公司)；安捷伦XDB C18色谱柱(250×4.6mm,5μm)；2545AutoPurification自动纯化系统(美国waters公司)；WFH‑203B三用紫外分析仪(上海精科实业有限公司)；Autopol IV自动旋光仪；Hitachi U‑2900E紫外可见分光光度计；Avatar 360ESP FTIR红外光谱仪；JASCO‑810分光偏振仪；DRX‑
500MHz核磁共振仪(德国Bruker公司)；Daltonics micrOTOF‑QII高分辨质谱仪(德国Bruker公司)；DBS‑160F电脑自动部份收集器(上海精科实业有限公司)；多功能提取浓缩设备(上海顺仪科技有限公司)；RE‑2000A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；RV 10旋转蒸发仪(德国IKA公司)；中型旋转蒸发仪(南京贝帝实验仪器有限公司)；万分之一电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；KQ‑500E台式超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

[0100] 3实验药材

[0101] 盐肤木药材于2017年3月采集自云南省腾冲市，经云南省农业科学院方波博士鉴定为漆树科盐肤木属盐肤木(Rhus  chinensis  Mill)的干燥根，其凭证标本(No.20170310002)存放于福建中医药大学药学院标本室。

[0102] 4量子化学计算方法

[0103] Confab用于搜索低能构象。进一步用PM7(MOPAC2016)]方法进行优化。选取4kcal/mol的能量窗,进一步使用密度泛函理论法(DFT)进行优化，其方法为B3LYP方法结合6‑31G*13
基组。碳谱数据基于 C NMR was calculated on B97x‑D方法结合6‑31G*基组以及气态下。ECD计算基于B3LYP理论结合/6‑311G*基组,用SpecDis v1.71软件处理。所得的碳谱，ECD以及原子空间距离的计算值均为基于吉布斯自由能的玻尔兹曼平均值。所有的DFT计算均使用Gaussian09软件处理。

[0104] 实施例1、本发明化合物7‑10的制备

[0105] 取盐肤木根(43.03kg)，经干燥、粉碎，用95％甲醇于70℃回流提取4次，每次6小时，减压浓缩，得甲醇总浸膏(6.61kg)。用水悬浮甲醇浸膏，用水悬浮甲醇浸膏，用石油醚进行萃取，选取石油醚部位浸膏(1.62kg)，采用硅胶柱(100–200目，120cm*15cm)，用二氯甲烷/甲醇(70:1–0:1)进行梯度洗脱。根据TLC展开系统的结果进行综合分析与判断，对收集液进行合并，最终得到13个亚组分(Fr.1–13)。基于我们构建的TLC联合HPLC‑DAD/ELSD/MS化合物检测方法以及对各亚组分进行LC‑MS化学轮廓分析，根据测定结果确定所需要分离的目标组分。

[0106] (1)化合物7、8、9的制备

[0107] 取Fr.5(35.65g,硅胶柱二氯甲烷/甲醇15:1洗脱部位)首先采用硅胶柱，选用二氯甲烷/甲醇(70:1‑0:1)进行梯度洗脱，获得4个亚组分(Fr.5A–Fr.5D)。取Fr.5B(18.2g,硅胶柱二氯甲烷/甲醇30:1洗脱部位)采用硅胶柱(200–300目)进行分离纯化，选择石油醚/丙酮系统(5:1–2:1)进行梯度洗脱，获得14个组分(Fr.5B‑1–Fr.5B‑14)。取Fr.5B‑8(570.0mg，硅胶柱石油醚/丙酮3：1洗脱部位)经过MCI柱(即小孔树脂凝胶柱)进一步进行精细分离，选择甲醇/水系统(70:30–100:0)进行梯度洗脱，得到13个馏分(Fr.5B‑8‑1–Fr.5B‑8‑13)。

[0108] 取Fr.5B‑8‑1(50.3mg，MCI柱70％甲醇/水洗脱部位)通过半制备型HPLC(色谱条件：84％甲醇/水系统)进行快速制备，即得本发明化合物9(44.2mg,tR 34.8min)

[0109] 取Fr.5B‑8‑9(46.7mg，MCI柱100％甲醇/水洗脱部位)通过半制备型HPLC(色谱条件：83％甲醇/水系统)进行快速制备，即得本发明化合物、化合物8(37.20mg，tR 37.0min)。

[0110] 取Fr.5B‑8‑10(18.6mg，MCI柱100％甲醇/水洗脱部位)通过半制备型HPLC(色谱条件：83％甲醇/水系统)进行快速制备，即得本发明化合物7(5.2mg,tR 37.6min)。

[0111] (3)化合物10的制备

[0112] 取Fr.5B‑7(2.3g，硅胶柱石油醚/丙酮3.5：1洗脱部位)，进一步采用硅胶柱(200–300目)进行分离纯化，选择石油醚/丙酮系统(5:1–2:1)进行梯度洗脱，得到14个组分(Fr.5G‑1–Fr.5G‑14)。取Fr.5G‑10(863.0mg，硅胶柱石油醚/丙酮3：1洗脱部位)，通过反相SPE柱(即反相固相萃取柱)进行分离，选择甲醇/水体系(50:50–100:0)进行梯度洗脱，最终得到5个馏分(Fr.5G‑10‑1–Fr.5G‑10‑5)。取Fr.5G‑10‑2(245.2mg，SPE柱95％甲醇/水洗脱部位)，最后通过半制备型HPLC，以甲醇/水(82:18)等度条件进行快速制备，得到化合物10(36.02mg，tR 41.3min)。

[0113] 本发明化合物的结构确认：

[0114] 化合物7：白色无定固体。

[0115] 根据HRESIMS的[M+Na]+峰：m/z 475.3176，推导出其分子式为C30H44O3，不饱和度为3 3
9。化合物7的碳谱和DEPT谱显示化合物7的结构中含有5个sp单峰和1个sp的与双键相连的
2 3 2 3
甲基，1个sp 和9个sp杂化的亚甲基，1个sp 和5个sp杂化的次甲基(包括1个连氧次甲基)，
8个季碳(包括1个酮羰基，1个酯羰基和1个烯碳)。通过综合分析7的氢谱、碳谱和DEPT谱(表
1，2)，可以推出，本发明化合物的结构中含1个酮基(δ218.2)；1个α，β‑不饱和‑δ‑内酯环(δ
81.1，29.1,139.3,128.6,17.2,166.2)，1个环外双键(δ113.7,149.3)以及5个单峰和1个烯甲基。依据C‑3与H2‑1/H2‑2/H‑5/H3‑28/H3‑29的HMBC相关，可以确定酮羰基位于C‑3上；由HMBC谱中H‑23a/C‑22,C‑24,C‑25；H‑24/C‑22,23,25,26,27以及H3‑26/C‑24,25,27的相关峰证实了α，β‑不饱和‑δ‑内酯环的存在；由H‑17与C‑13/C‑20/C‑21；H2‑21与C‑20的HMBC相关确定了环外双键位于C20(21)位；以上所有基团满足5个不饱和度，从而表明化合物为1个侧链成环的四环三萜。对照文献(Kim GS等，J Korean Soc for Appl Biol Chem 2010；53:
417–21；Sung CK,等，Chem Soc Chem Commun 1980；19:909–10.)发现，除了半缩醛结构被酮基取代外，化合物7的氢谱和碳谱数据与已报道的盐肤木中所分离得到的semialactone和rhuslactone很相似。然而两者C‑17相对构型相反，semialactone为17β侧链，rhuslactone为17α侧链。化合物7的绝对构型的确定是通过与本课题组从本植物中同时分离得到的化合物1进行对照而得以解析的。化合物1的NOESY谱显示了一个明显的H‑21/H3‑
30相关峰。因此，我们可以根据H‑21/H3‑30的NOE相关峰的积分面积来计算H‑21b/H3‑30的空间距离(Wang WX等，J Nat Prod,2016；79:704–10.)。基于B3LYP/6‑31G*理论的构象优化，我们计算了化合物1分别为17α和17β侧链两种构型(1a，1c)时H‑21/H3‑30的波尔兹曼平均距离，分别为2.05和 (表3)。以位于刚性结构环内H‑1β(δ2.18)/H‑19b(δ3.72)的NOE相
1/6 1/6
关峰积分以及其原子距离 为参照，依据公式：[rH‑21/Me‑30＝rref(aref/aH‑21/Me‑30) ](Wang WX等，J Nat Prod,2016；79:704–10.)，计算出H‑21/H3‑30的实验距离为 (图
1)。由此得出结论，H‑21/Me‑30空间距离的实验值与(3S,5S,8R,9S,10R,13R,14R,17R,
22S)‑1a，即17α侧链构型的理论值一致，而与1c，即17β侧链构型偏差较大。因此，证实连接在C‑17的侧链的相对构型为α。为了进一步确定C‑17的绝对构型，基于 B97x‑D/6‑31G*//B3LPY/6‑31G*方法，采用文献报道的参数(Kutateladze AG等,J Org Chem 2017；82:3368–
81)，计算了化合物1的4个C‑17和C‑22非对映异构体碳谱数据(1a‑1d)。计算四种C‑17和C‑+
22非对映异构体(1a‑1d)的sDP4 概率(表4)。结果发现17R的sDP4+概率远大于17S。因此，C‑+
17的绝对构型被确定为R。然而，1a与其22R差向异构体1b的sDP4概率差值很小，无法据此判断C‑22的绝对构型。为了进一步确认C‑22的绝对构型，对1a和1b进行了ECD计算。如图2所示，计算出的(3S,5S,8R,9S,10R,13R,14R,17R,22S)‑1a的ECD曲线与实验曲线高度匹配，证明了C‑22的绝对构型为S。最终将化合物1鉴定为rhuslactone(1)(Sung CK,等，Chem Soc Chem Commun 1980；19:909–10.)，与1a的结构一致。

[0116]

[0117] 根据图16可知化合物7的H‑21与Me‑30的空间距离为 由此确定了17R绝对构型。根据图2所示化合物7的ECD谱图与化合物1的高度相似，故可确定化合物7的C‑22的绝对构型为S。所以，本发明化合物7为(17R,22S)‑3‑oxodammar‑20,24‑dien‑27,22‑lactone，结构如下：

[0118]

[0119] 化合物8：白色无定形固体。

[0120] 根据化合物8的HRESIMS(m/z 479.3495[M+Na]+)，计算值为479.3501(C30H48O3Na)，推出其分子式为C30H48O3，不饱和度为7。8的碳谱和DEPT谱(表1，2)，显示化合物8的结构中含3 2 3 2 3
有5个sp甲基，1个sp 和12个sp 杂化的亚甲基(包括2个连氧亚甲基)，1个sp 和4个sp 杂化的次甲基，7个季碳(包括1个酮羰基)。通过综合分析7的氢谱、碳谱和DEPT谱(表1，2)，可以推出，8的结构中含1个酮羰基(δ218.4)，1个三取代双键，1个环外双键，2个连氧亚甲基以及
5个单峰甲基。根据8的不饱和度，可确定8为1个四环三萜。依据C‑3与H2‑1/H2‑2/H‑5/H3‑28/H3‑29的HMBC相关，可以确定酮羰基位于C‑3上；据HMBC谱中H‑17与C‑13/C‑20，H2‑21/C‑20之间的相关峰，可推断C‑20上连接双键；同时，HMBC谱显示了明显的H2‑21/C‑22；H2‑22/C‑20；
H‑24/C‑22,23,26,27；H2‑26/C‑24,25,27；H2‑27/C‑25,26相关，由此推导出，8的平面结构为
26,27‑dihydroxy‑dammara‑20,24‑diene‑3‑one。NOESY谱显示了一个明显的H‑21b/H3‑30相关峰，因此我们可以根据H‑21b/H3‑30的NOE相关峰的积分面积来计算H‑21/H3‑30的空间距离(Wang WX等，J Nat Prod,2016；79:704–10.)。基于B3LYP/6‑31G*理论的构象优化，我们计算了化合物8分别为17α和17β侧链两种构型时H‑21/H3‑30的波尔兹曼平均距离，分别为2.26和 (表5)。以位于刚性结构环内H‑12β/H‑13β的NOE相关峰积分以及其原子距
1/6 1/6
离 为参照，依据公式：[rH‑21/Me‑30＝rref(aref/aH‑21/Me‑30) ] ，计算出H‑21/H3‑30的实验距离为 (图25)，与17α侧链构型的理论值一致，而与17β侧链构型偏差较大。因此，证实连接在C‑17的侧链的相对构型为α。

[0121] 基于以上数据分析，确定本发明化合物8为(17R)‑26,27‑dihydroxy‑dammara‑20,24‑diene‑3‑one，结构如下：

[0122]

[0123] 化合物9：白色无定形粉末。

[0124] HRESIMS显示其分子离子峰为m/z 479.3495[M+Na]+，计算值为479.35011 13
(C30H48O3Na)，化合物9与8为一对同分异构体。通过分析H‑NMR、C‑NMR、DEPT 135(表1，2)的结果，表明化合物9含有1个酮羰基(δ218.2)，1个三取代双键，1个四取代双键，5个单峰甲基，1个与烯基相连的次甲基以及2个连氧亚甲基。与此同时，将9的碳谱数据和8相比较，发现两者A～C环高度相似，而D环与侧链存在差异。表明很有可能两者的侧链结构存在差异。
通过H‑13,H2‑16,H2‑21,H2‑22与C‑17；H2‑21,H2‑22与C‑20以及H‑13,H2‑21与C‑22的HMBC相关，可确定四取代双键位于C‑17和C‑20，同时通过H2‑23/C‑22,C‑24；H‑24/C‑26,C‑27以及H3‑26,H2‑27/C‑25的HMBC相关推断三取代双键位于C‑24上，且C‑26或C‑27与羟基相连。再根据H‑24/H3‑26之间的NOE相关，确定C‑24上为顺式双键。因此，确定本发明化合物9为21,27‑dihydroxydammar‑17(20),24(Z)‑dien‑3‑one，结构如下：

[0125]

[0126] 化合物10：白色粉末。

[0127] 依据HRESIMS谱中的分子离子峰(m/z 481.3688[M+Na]+)，将化合物10的分子式确定为C30H50O3，不饱和度为6。其氢谱、碳谱和DEPT谱(表1，2)显示化合物10和9的结构高度相似。两者的区别在于，10中的环外双键消失，且只有一个连氧亚甲基，同时，与9比较，10中多1 1
了1个连氧的季碳，以及1个单峰甲基。根据H2‑11/H2‑12/H‑13/H‑17的H‑ H COSY相关以及H‑17与C‑13，C‑16，C‑20，C‑22以及H3‑21和H2‑22与C‑20的HMBC相关证明了羟基与C‑20相连。
此外，由H2‑23/C‑22,C‑24；H‑24/C‑26,C‑27以及H3‑26,H2‑27/C‑25的HMBC相关推断三取代双键位于C‑24上，且C‑26或C‑27与羟基相连，由H‑24/H3‑26的NOE相关确定了该双键为顺式。和化合物8不同，化合物10的NOESY谱显示了明显的H‑17/H3‑30α相关，从而确定H‑17的相对构型为α。故化合物10为常见的β‑侧链取代的达玛烷型三萜。而C‑20绝对构型的的确定是通过文献(Asakawa J等，Tetrahedron 1977；33:1935–9.)比对所得出的，化合物10的C‑
17、C‑21、C‑22的化学位移分别是50.76、26.60、42.64，与文献中C‑20绝对构型为S时的达玛烷型三萜的化学位移高度符合，从而确定C‑20绝对构型的为S。因此，确定本发明化合物10为20,27‑dihydroxy‑24(Z)‑dammaren‑3‑one，结构如下：

[0128]

[0129] 表1本发明化合物的氢谱数据(500MHz)

[0130]

[0131]

[0132] 表2本发明化合物的的碳谱数据(125MHz)

[0133]

[0134] 表3.(3S,5S,8R,9S,10R,13R,14R,17R,22S)‑1a及其17S‑差向异构体(1c)中H‑21与H3‑30的玻尔兹曼平均距离计算值。

[0135]

[0136] 表4.化合物1的碳谱实验值以及化合物1的4个C‑17，C‑22非对映体(1a–1d)的碳谱计算值

[0137]

[0138]

[0139] 表5.化合物8的17位侧链分别为α和β两种情况下，H‑21与H3‑30的玻尔兹曼平均距离计算值。

[0140]

[0141]

[0142] 以下通过实验例证明本发明化合物的有益效果。

[0143] 1实验仪器解剖显微镜(SZX7,OLYMPUS,Japan)；与显微镜相连的相机(TK‑C1481EC)；精密电子天平(CP214,OHAUS,America)；六孔微板(Nest Biotech,Shanghai,China)；心跳血流分析系统(Zebralab3.3(PB2084C)。

[0144] 2实验试剂与药物甲基纤维素(Aladdin,Shanghai,China)；二甲基亚砜(DMSO,Sigma,批号：BCBN0845V)；盐酸维拉帕米(批号：L1303078，上海晶纯实业有限公司)；地高辛(批号：K1417048，上海晶纯实业有限公司)；邻联茴香胺(Sigma，批号：MKBG4648V)；普纳替尼(批号：13771，MedChemExpress)；阿司匹林(批号：059K0199，上海晶纯实业有限公司)化合物用DMSO配制成50mg/mL的母液备用，‑20℃储存；临用时用DMSO按需稀释，最终工作液中DMSO浓度为0.1％。

[0145] 其中，LCZ696是一种双效血管紧张素受体‑脑啡肽酶抑制剂(ARNI)，在增强心脏的保护性神经内分泌系统(NP系统，钠尿肽系统)的同时，抑制有害系统(RAAS系统，肾素‑血管紧张素‑醛固酮系统)。在史上最大型PARADIGM‑HF研究中，LCZ696被证明在临床研究中疗效显著超越标准治疗药物依那普利。2015年获美国FDA批准，2017年获中国NMPA批准上市。依+ +那普利是血管紧张素转换酶抑制药；地高辛是Na/KATP酶抑制剂，是心脏正性肌力药物；氢氯噻嗪是一种利尿药；美托洛尔是一个选择性β1肾上腺素受体拮抗剂(Yang BF等，Pharmacology：People’s Medical Publishing House，2018,p.232–5)。厄贝沙坦是血管收缩素受体拮抗剂(Yang BF等，Pharmacology：People’s Medical Publishing House，2018,p.207)。以上药物都是目前治疗心力衰竭的一线药物。

[0146] 3实验动物

[0147] 斑马鱼与人的基因具有超过71％的同源性。斑马鱼在信号通路和对药物的反应上，与人类有极高的相似度。此外，斑马鱼的其他特征，如：体外受精、繁殖能力强、发育快速等，使之成为一个广受欢迎的心脑血管药物筛选模型。经200μM维拉帕米诱导0.5小时后，斑马鱼出现了心包水肿、静脉瘀血、心动过缓以及血液循环受阻等症状；而经4μg/mL普纳替尼处理18小时后，斑马鱼出现了血栓。这些症状与冠心病病人的临床症状几乎一致，可以很好的模拟冠心病发病状态。

[0148] 本发明采用的野生型AB系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行。共1500尾，年龄为受精后2天。以上斑马鱼均饲养于28℃的养鱼用水中(水质：每1L反渗透水中加入200mg速溶海盐，电导率为480～510μS/cm；pH为6.9～7.2；硬度为53.7～71.6mg/L CaCO3)，实验动物使用许可证号为：SYXK(浙)2012‑0171。饲养管理符合国际AAALAC认证的要求。

[0149] 4实验方法

[0150] 成年AB品系斑马鱼由杭州环特生物科技股份有限公司提供。将所选化合物溶解在100％DMSO中配置成母液，给药时将母液用养鱼用水稀释，最终工作液中DMSO浓度为0.1％w/v。200μM盐酸维拉帕米处理斑马鱼0.5小时，诱导斑马鱼心衰模型；4μg/mL普纳替尼处理斑马鱼18小时，诱导斑马鱼血栓模型。0.1％DMSO处理的实验组作为正常对照组。采用临床常规治疗心衰药物地高辛(0.8μg/mL)、抗血栓药物阿司匹林(45μg/mL)作为阳性对照药。再采用其它文献报道的六个临床常用心衰药物LCZ696、依那普利、地高辛、氢氯噻嗪、厄贝沙坦、美托洛尔作为对照药。

[0151] 预防斑马鱼心衰的评价实验方法完全参照之前文献(Zhu XY,Wu SQ,Guo SY,Yang H,Xia B,Li P,Li CQ.A zebrafish heart failure model for assessing therapeutic agents.Zebrafish 2018；15:243–53.)。首先，测定化合物的MTC。接下来，评价所测化合物浓度在其MTC时对斑马鱼心衰的预防作用。各实验组按照文献方法给药处理后，分析统计心脏扩张面积(A1)和静脉窦瘀血面积(A2)，心输出量(CO)，血流速度(BFV)和心率(HR)。预防斑马鱼心衰的评价实验方法在文献方法(Zhu XY,Liu HC,Guo SY,Xia B,Song RS,Lao QC,Xuan YX,Li CQ.A zebrafish thrombosis model for assessing antithrombotic drugs.Zebrafish 2016；13:335–44)基础上进行了一些修改。

[0152] 随机选取30条受精后5天的AB品系斑马鱼于六孔板中，用4μg/mL普纳替尼及化合物共处理18小时后，用文献方法(专利号：201110126427)对各实验斑马鱼的血栓形成进行定量分析。以心脏红细胞染色强度(在计算中描述为S)的统计学意义定量评价供试品对于血栓形成的预防作用。每个实验重复三次，使用单因素方差分析，然后进行Ttest检验。p<0.05代表具有统计学意义。

[0153] 供试品对于心脏扩大、静脉窦瘀血、心输出量、血流速度、心率的改善作用，以及对于血栓形成的预防作用分别采用formula‑1～formula‑6进行计算。formula‑1(2):心脏扩大改善作用(％)＝[A1(2)(模型组)‑A1(2)(化合物组)]/[A1(2)(模型组)–A1(2)(空白组)]×100％；formula‑3:心输出量增加作用(％)＝[CO(化合物组)‑CO(模型组)]/[CO(空白组)‑CO(模型组)]×100％；formula‑4:血流速度增加作用(％)＝[BFV(化合物组)‑BFV(模型组)]/[BFV(空白组)‑BFV(模型组)]×100％；formula‑5:心率增加作用(％)＝[HR(化合物组)‑HR(模型组)]/[HR(空白组)‑HR(模型组)]×100％；formula‑6:预防血栓形成作用(％)＝[S(化合物组)‑S(模型组)]/[S(空白组)‑S(模型组)]×100％。

[0154] 实验例1、本发明化合物对斑马鱼心力衰竭的预防作用

[0155] 首先，测试了本发明化合物在斑马鱼心衰以及血栓两种模型中的最大耐受浓度(MTC)，化合物7、10为0.5μg/mL，8为25μg/mL，9为5μg/mL。随后，评价各化合物浓度为其MTC时对斑马鱼心力衰竭和血栓形成的预防作用。

[0156] 从表3可以看出，化合物7–10在其MTC时均表现了显著的对斑马鱼心衰的预防作用(P<0.05，P<0.01，P<0.001)。具体表现在：对心脏扩大及静脉窦瘀血面积有改善作用(图2)，对心输出量(CO，图3中A)、斑马鱼背部主动脉血流速度(BFV，图3中B)和心率(HR，图3中C)有增加作用。特别地，与模型组比较，本发明化合物均能极显著的改善以上五个心衰指标，特别是化合物7(p<0.001)。而CO作为评估心脏射血功能的重要指标，会受到结构性心脏病变和心脏超载前负荷和后负荷的影响。这表明本发明化合物很可能成为改善结构性心脏病变和心脏前负荷和后负荷的先导化合物。

[0157] 为了更好的评价本发明的化合物对斑马鱼心衰的改善作用，我们将临床常规治疗心衰的阳性对照药物地高辛(0.8μg/mL)，以及文献报道的六个临床常用心衰药物LCZ696、依那普利、地高辛、氢氯噻嗪、厄贝沙坦、美托洛尔在同浓度(0.5μg/mL)或更高浓度(10μg/mL)下对斑马鱼心衰的改善作用与本实验化合物进行比较(表3)。

[0158] 结果表明，本发明化合物，特别是化合物7在对BFV的增加作用上，明显优于对照药依那普利(10μg/mL)、美托洛尔及厄贝沙坦(0.5μg/mL)、阳性对照药物地高辛。说明本发明化合物能够对斑马鱼心力衰竭形成起到显著的预防和/或治疗作用。

[0159] 表6各化合物、阳性对照药物、抗心衰的临床常规药物对于斑马鱼心衰以及血栓的预防作用比较

[0160]

[0161] 与模型组比较:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.

[0162] 实验例2、本发明化合物对斑马鱼血栓形成的预防作用

[0163] 根据杭州环特生物科技股份有限公司专利(专利号：201110126427)，心脏红细胞染色强度(RBC)与血栓形成的严重性呈负相关，故可用RBC定量评价供试品对普纳替尼诱导的血栓形成的预防作用。按照上文“实验方法”中所述的方法，对各化合物处理后的心脏红细胞染色强度进行统计。

[0164] 结果如表3和图4所示，本发明化合物7–9在浓度为MTC时，RBC明显增加，斑马鱼血栓形成减少。其中，化合物7(0.5μg/mL)预防血栓形成的效果最强，为62％(p<0.001)。说明本发明化合物能够对斑马鱼血栓形成起到显著的预防和/或治疗作用。

[0165] 综上，本发明提供了一种结构新颖的三萜类化合物，该化合物能明显改善心衰斑马鱼的心衰指标和本发明化合物7–9能明显改善斑马鱼血栓指标，本发明化合物可以作为改善结构性心脏病变和心脏前负荷和后负荷的先导化合物，在制备预防和/或治疗心衰和血栓的药物上，具有非常良好的应用前景。