一种稳定同位素标记胆固醇-3,4-13C2的合成方法 |
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| 申请号 | CN202410105583.8 | 申请日 | 2024-01-25 | 公开(公告)号 | CN117946196A | 公开(公告)日 | 2024-04-30 |
| 申请人 | 上海化工研究院有限公司; | 发明人 | 刘前; 白少飞; 雷雯; 孙雯; 范若宁; 赵诚; 喻静兰; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及一种稳定同位素标记胆固醇‑3,4‑13C2的合成方法，包括以下步骤：(1)取合环羰基中间体Ⅱ与13C双标记酯类化合物在 碱 与 溶剂 中，搅拌反应，得到乙酰化标记中间体Ⅲ；(2)乙酰化标记中间体Ⅲ与混合酸反应，得到 碳 环重构反应中间体Ⅳ；(3)碳环重构反应中间体Ⅳ在乙酸酐中，搅拌反应，得到酯化反应中间体Ⅴ；(4)酯化反应中间体Ⅴ与 硼 氢化钠在溶剂体系中反应，反应结束后调节体系pH为酸性，萃取，洗涤有机相，干燥，旋蒸除溶，提纯，得到胆固醇‑3,4‑13C2产品，即为目标产物。本发明打破国外对用于维生素检测、 肿瘤 筛查等所必需的类固醇检测核心标记 试剂 之一的胆固醇‑3,4‑13C2的垄断，填补国内相关领域空白等。 | ||||||
| 权利要求 | 13 |
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| 说明书全文 | 13一种稳定同位素标记胆固醇‑3,4‑ C2的合成方法 技术领域[0001] 本发明属于同位素合成技术领域，涉及一种稳定同位素标记胆固醇‑3,4‑13C2的合成方法。 背景技术[0002] 类固醇类激素是人体内由胆固醇通过不同的酶形成的一系列激素，包括孕激素、雄激素、雌激素、皮质激素等，对人体生长、发育、生殖、代谢等起着重要的调节作用。这类激素代谢紊乱是许多疾病的肇因，准确检测其变化情况在疾病的诊断中具有重要参考价值。 [0003] 胆固醇(Cholesterol)是类固醇激素中的一种，是一系列类固醇的“母本”，具有胆甾‑5‑烯‑醇的类固醇结构，广泛存在于动物体内，与细胞膜的形成密切相关，是胆汁酸、甾醇类激素、维生素D等合成所需的生物活性物质之一，是人类动物组织细胞所不可缺少的重要物质。大量的流行病学研究证实，胆固醇水平和冠心病的发病关系密切，其在人体中的含量的升高也是动脉粥样硬化性心血管病的衡量因素之一。近年来研究发现，人体内胆固醇含量与多种肿瘤相关，如乳腺癌、胃癌、结直肠癌、前列腺癌和肾癌；此外其含量还与胆结石、脂肪肝、以及糖尿病等多种疾病有关。 [0004] 传统临床医学上对胆固醇这类类固醇激素的检测最常用的方法是酶联免疫吸附法(ELISA)和放射免疫法(RIA)。由于在人体内含量差异很大(ng/mL～pg/mL)，传统ELISA和RIA检测方法所需样本量大、耗时长，且受限于抗体的交叉反应，时常出现定量不准确及假阳性的结果，进而影响相关疾病的诊断与治疗；另外胆固醇等类固醇激素的检测容易与人体内其他具有相似结构的物质混淆。因此，传统临床医学检测方法无法满足高灵敏度和高识别性的检测需求。相比之下，临床用稳定同位素稀释质谱法(临床质谱法)则更加的具有识别性和精确性，浓度精确性可以达到pg/mL，该灵敏度是传统临床医学检测方法无法达到的。国际上早在10年前就开始大力发展临床质谱医学，2014年Journal of Clinical endocrinology and Metabolism期刊就曾表示诸如胆固醇等类固醇激素的检测应由临床质谱检测代替传统检测方法，后续更是在2015年表示，只有临床质谱检测的相关数据才应该被认可。2018年后中国的临床质谱也进入了快速发展的时期，在多个临床检测领域已经替代或者部分替代了传统的生化诊断分析方法，显示出广阔的发展空间。 [0005] 稳定同位素标记的类固醇激素试剂是该类激素临床用稳定同位素稀释质谱法检13 测的核心，因此胆固醇‑3,4‑ C2是胆固醇临床质谱检测应用于冠心病、动脉粥样硬化、肿瘤、脂肪肝、胆结石以及糖尿病等多种疾病诊治的核心。 [0006] 目前以胆固醇‑3,4‑13C2为代表的用于维生素检测、肿瘤筛查所必需的类固醇类的检测试剂国内尚无法自主合成，其生产和供应被发达国家垄断，如美国的CIL(剑桥同位素)13 公司和Sigma‑Aldrich公司等，相关试剂价格昂贵而且供应受限，胆固醇‑3,4‑ C2的价格高达70000元/g。这对于我国胆固醇等类固醇激素的临床质谱的科研检测进展、新型检测方法的探索、试剂盒的生产、临床检测实际使用的扩展等都形成了严重制约。 [0007] 国内尚无胆固醇‑3,4‑13C2的合成报道，国外报道仅有Sun‑Shine和Yuan团队在13 1982年发表的采用 C双标记酰氯作为标记砌块并采用基团保护策略进行合成胆固醇‑3,4 13 13 ‑ C2的方法。该方法所采用的酰氯标记砌块稳定性差且产率较低，使得昂贵的 C原料利用率降低，成本较高；另外该合成方法采用基团保护策略，涉及两个基团的保护与去保护过程，导致整体合成步骤偏长，过程复杂。 [0008] 国外仅有一些与胆固醇‑3,4‑13C2具有相似结构化合物的13C标记引入策略的报道：13 ISA G.J.等于Tetrahedron在2000年报道了臭氧氧化降解策略，以 C‑叶立德为引入试剂，与α、β‑不饱和羰基双键氧化裂解中间体反应，制备孕酮。但该氧化过程副反应多，过程长，使用了贵金属催化，造成成本急剧上升；BERTHONNEAU C.等在2018年J.Org.Chem.上报道了 13 A环引入苯硫酚活化再氧化的策略，采用 C‑Wittig试剂作为碳源，类固醇骨架引入活化基团；但该方法实验步骤长、氧化操作复杂，羰基非对应选择性还原后产生复杂的混合物，造成提纯困难，制备效率低下。 发明内容[0009] 本发明的目的就是为了提供一种稳定同位素标记胆固醇‑3,4‑13C2的合成方法，以打破国外对用于维生素检测、肿瘤筛查等所必需的类固醇检测核心标记试剂之一的胆固13 醇‑3,4‑ C2的垄断，填补国内相关领域空白。 [0010] 本发明的目的可以通过以下技术方案来实现： [0011] 一种稳定同位素标记胆固醇‑3,4‑13C2的合成方法，包括以下步骤： [0013] (2)乙酰化标记中间体Ⅲ与混合酸反应，得到碳环重构反应中间体Ⅳ； [0014] (3)碳环重构反应中间体Ⅳ在乙酸酐中，搅拌反应，得到酯化反应中间体Ⅴ； [0016] 所述合环羰基中间体Ⅱ的结构式为： [0017] 其中，R为‑CH(CH3)CH2CH2CH2CH(CH3)2。 [0018] 进一步的，所述合环羰基中间体Ⅱ通过以下方法制备得到： [0020] (B)开环氧化羧酸中间体Ⅰ在醋酸钠存在、惰性气体保护下，于乙酸溶剂中进行合环反应得到合环羰基中间体Ⅱ。 [0021] 更进一步的，步骤(A)中，有机溶剂体系为异丙醇与水的混合溶剂，所述氧化剂为高锰酸钾与高碘酸钠的复配；4‑胆甾烯‑3‑酮、氧化剂的摩尔比为1:2～10；氧化反应温度为25～100℃；氧化反应时间为2～8小时。 [0022] 更进一步的，步骤(2)中，开环氧化羧酸中间体Ⅰ、醋酸钠的摩尔比为1:1～5，具体可以为1:1，1：5，或1:2等任意中间点值；合环反应的温度为100～150℃；合环反应时间为1～2天。 [0023] 进一步的，步骤(1)中，合环羰基中间体Ⅱ、13C双标记酯类化合物的摩尔比为1:1～10，添加量可以为1:1,1:10，或1:5等任意中间点值；合环羰基中间体Ⅱ、碱的摩尔比为1:1～10，添加量可以为1:1,1:10，或1:5等任意中间点值；合环羰基中间体Ⅱ、溶剂的质量体积比为1:10～20，可以为1:10,1:20，或1:15等中间点值。 [0025] 进一步的，步骤(1)中，所用溶剂为四氢呋喃、甲醇、乙醇、丙酮、乙醚、二氯甲烷、三氯甲烷、正己烷、石油醚、叔丁醇、环己烷、乙酸乙酯、二甲基亚砜的一种或几种组合的混合物。 [0026] 进一步的，步骤(1)中，搅拌反应的温度为‑20～200℃，时间为0.5～10.5天。 [0027] 进一步的，步骤(1)中，所述13C双标记酯类化合物结构为： [0028] [0029] 其中，X为烷基、环烷基或芳基。 [0030] 进一步的，步骤(2)中，所述混合酸为乙酸与盐酸的混合物。 [0031] 进一步的，步骤(2)中，乙酰化标记中间体Ⅲ与乙酸、盐酸的添加量之比为7g：(120～160)mL：(25‑35)mL，其中，盐酸的质量分数为36.5％。 [0032] 进一步的，步骤(2)中，反应的温度为40‑60℃，时间为1‑3天。 [0033] 进一步的，步骤(3)中，碳环重构反应中间体Ⅳ与乙酸酐的添加量之比为(4.0～4.2)g：70mL。 [0034] 进一步的，步骤(3)中，搅拌反应的温度为15～25℃，时间为18～30h。 [0035] 进一步的，步骤(4)中，所用溶剂体系为甲醇与四氢呋喃的混合溶剂体系。 [0036] 进一步的，步骤(4)中，酯化反应中间体Ⅴ、甲醇、四氢呋喃与硼氢化钠的添加量之比为(2.0～2.5)g：(25～35)mL：(25～35)mL：0.4g。 [0037] 进一步的，步骤(4)中，pH采用盐酸调节至3.0。 [0038] 与现有技术相比，本发明具有以下优点： [0039] (1)本发明采用13C双标记酯类化合物为标记引入砌块，该标记砌块化学性质稳定且标记合成产率较高；在较后步骤引入标记砌块，尽可能的减少了贵重原料的消耗，经济适用性更强且能更好的规避产品丰度稀释的风险. [0040] (2)采用半合成策略，原料丰富易得价格较低，减少了合成步骤，提高了合成效率；反应路线具有拓展性，可后续开发三碳标记胆固醇或“移植”于具有类似结构的其它标记类 13 固醇临床诊断试剂的研制，如 C标记的孕酮、孕烯醇酮、睾酮、17‑羟孕酮、雄烯二酮等，形成系列化合物。 [0041] (3)所得胆固醇‑3,4‑13C2产品纯度≥98％，丰度≥98atom％13C，未出现明显稀释，产品可用于临床及生物医药领域稳定同位素稀释质谱法检测用内标试剂以及临床质谱用疾病筛查试剂盒原料等。附图说明 [0042] 图1为本发明的合成工艺路线图。 具体实施方式[0043] 下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。 [0044] 本发明中，乙酸乙酯‑1,2‑13C2为Sigma‑Aldrich公司购买，丰度≥99atom％13C，产13 13 品编号283819；乙酰氯‑ C2为Sigma‑Aldrich公司购买，丰度≥99atom％ C，产品编号 13 13 13 293164；乙酸苯酯‑1,2‑ C2、乙酸环己酯‑1,2‑ C2由乙酰氯‑ C2制备而来，制备方法如下： [0045] [0046] 在500mL单口烧瓶中，加入(86mmol)苯酚或环己醇、(79mmol)乙酰氯、150mL环己13 烷，25℃下搅拌回流反应6h。反应结束后，旋蒸后得到乙酸苯酯‑1,2‑ C2或乙酸环己酯‑1, 13 2‑ C2。 [0047] 其余如无特别说明的原料或处理技术，则表明其均为本领域的常规市售原料或常规处理技术。 [0048] 实施例1： [0049] 本实施例提供一种稳定同位素标记胆固醇‑3,4‑13C2的合成方法，它包括以下步骤： [0050] 1、合环羰基中间体Ⅱ的制备 [0051] 在2L单口烧瓶中，加入(52mmol)4‑胆甾烯‑3‑酮、(62mmol)碳酸钠、800mL异丙醇，70℃下搅拌溶解后，滴入由(7.5mmol)高锰酸钾、(292mmol)高碘酸钠和400mL水配置的溶液，控制滴加温度在70℃±5℃，滴加速度20mL/min，滴加结束后继续保温反应5h。反应结束后，冷却，抽滤，滤饼用100mL 5％氢氧化钠溶液洗涤，再用200mL二氯甲烷洗涤，分液除去有机相，留取水相，旋蒸除去大部分异丙醇，调节水相pH至3.0，然后用250mL二氯甲烷萃取，有机相用300mL水洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤旋蒸除溶后得到开环氧化羧酸中间体Ⅰ；在500mL双口烧瓶中，加入(37mmol)开环氧化羧酸中间体Ⅰ、(91mmol)醋酸钠、150mL乙酸，氮气保护下，加热至135℃搅拌回流反应24h。反应结束后，旋蒸除溶剂得到合环羰基中间体Ⅱ。 [0052] 2、胆固醇‑3,4‑13C2的制备 [0053] 在250mL单口烧瓶中，加入摩尔比为1:1的10.5g(27mmol)中间体Ⅱ和3.7g13 (27mmol)乙酸苯酯‑1,2‑ C2，再加入4.3g(108mmol)钠氢(氢化钠)(60％)、100mL无水四氢呋喃，25℃下搅拌反应4d；反应结束后，旋蒸硅胶拌样，产品经硅胶过柱，流动相为乙酸乙酯：正己烷(5％‑15％梯度，时间为40min)，得中间体Ⅲ7.0g。 [0054] 另取250mL单口烧瓶，加入7.0g(16mmol)中间体Ⅲ、140mL乙酸、28mL盐酸(36.5％)，50℃下搅拌反应2d。反应结束后，加入200mL水，200mL乙酸乙酯萃取有机相，无水硫酸钠干燥，旋蒸硅胶拌样，产品经硅胶过柱，流动相为乙酸乙酯:正己烷为1:10，得中间体Ⅳ4.1g，收率66.3％。 [0055] 另取250mL单口烧瓶中，加入4.1g(11mmol)中间体Ⅳ、70mL乙酸酐，20℃下搅拌反应24h。反应结束后，旋蒸硅胶拌样，产品经硅胶过柱，流动相为乙酸乙酯:正己烷为1:10，得中间体Ⅴ2.3g，收率49.3％。 [0056] 另取250mL单口烧瓶，加入2.3g(5mmol)中间体Ⅴ、30mL甲醇、30mL四氢呋喃，60℃下搅拌反应，加入0.4g(10mmol)硼氢化钠，保持60℃下继续反应24h。反应结束后，加入20mL水，稀盐酸(5％)至pH为3.0，100mL二氯甲烷萃取，100mL饱和食盐水洗涤有机相，无水硫酸钠干燥，旋蒸硅胶拌样，产品经硅胶过柱，流动相为乙酸乙酯：正己烷为1:6(加2％异丙醇)，13 13 得胆固醇‑3,4‑ C2白色固体1.8g，纯度≥98％，丰度≥98atom％ C，收率80.3％。 [0057] 实施例2 [0058] 本实施例提供一种稳定同位素标记胆固醇‑3,4‑13C2的合成方法，它包括以下步骤： [0059] 1、合环羰基中间体Ⅱ的制备 [0060] 在2L单口烧瓶中，加入(52mmol)4‑胆甾烯‑3‑酮、(62mmol)碳酸钠、800mL异丙醇，70℃下搅拌溶解后，滴入由(7.5mmol)高锰酸钾、(292mmol)高碘酸钠和400mL水配置的溶液，控制滴加温度在70℃±5℃，滴加速度20mL/min，滴加结束后继续保温反应5h。反应结束后，冷却，抽滤，滤饼用100mL 5％氢氧化钠溶液洗涤，再用200mL二氯甲烷洗涤，分液除去有机相，留取水相，旋蒸除去大部分异丙醇，调节水相pH至3.0，然后用250mL二氯甲烷萃取，有机相用300mL水洗涤，无水NaSO4干燥，过滤旋蒸除溶后得到开环氧化羧酸中间体Ⅰ；在500mL双口烧瓶中，加入(37mmol)开环氧化羧酸中间体Ⅰ、(91mmol)醋酸钠、150mL乙酸，氮气保护下，加热至135℃搅拌回流反应24h。反应结束后，旋蒸除溶剂得到合环羰基中间体Ⅱ。 [0061] 2、胆固醇‑3,4‑13C2的制备 [0062] 在250mL单口烧瓶中，加入摩尔比为1:1的10.5g(27mmol)中间体Ⅱ和2.4g13 (27mmol)乙酸乙酯‑1,2‑ C2，再加入4.3g(108mmol)钠氢(60％)、100mL无水四氢呋喃，25℃下搅拌反应4d。反应结束后，旋蒸硅胶拌样，产品经硅胶过柱，流动相为乙酸乙酯：正己烷(5％‑15％梯度，时间为40min)，得中间体Ⅲ7.2g。 [0063] 另取250mL单口烧瓶，加入7.0g(16mmol)中间体Ⅲ、140mL乙酸、28mL盐酸(36.5％)，50℃下搅拌反应2d。反应结束后，加入200mL水，200mL乙酸乙酯萃取有机相，无水硫酸钠干燥，旋蒸硅胶拌样，产品经硅胶过柱，流动相为乙酸乙酯:正己烷为1:10，得中间体Ⅳ4.1g，收率66.3％。 [0064] 另取250mL单口烧瓶中，加入4.1g(11mmol)中间体Ⅳ、70mL乙酸酐，20℃下搅拌反应24h。反应结束后，旋蒸硅胶拌样，产品经硅胶过柱，流动相为乙酸乙酯:正己烷为1:10，得中间体Ⅴ2.3g，收率49.3％。 [0065] 另取250mL单口烧瓶，加入2.3g(5mmol)中间体Ⅴ、30mL甲醇、30mL四氢呋喃，60℃下搅拌反应，加入0.4g(10mmol)硼氢化钠，保持60℃下继续反应24h。反应结束后，加入20mL水，稀盐酸(5％)至pH为3.0，100mL二氯甲烷萃取，100mL饱和食盐水洗涤有机相，无水硫酸钠干燥，旋蒸硅胶拌样，产品经硅胶过柱，流动相为乙酸乙酯：正己烷为1:6(加2％异丙醇)，13 13 得胆固醇‑3,4‑ C2白色固体1.8g，纯度≥98％，丰度≥98atom％ C，收率80.3％。 [0066] 实施例3 [0067] 本实施例提供一种稳定同位素标记胆固醇‑3,4‑13C2的合成方法，它包括以下步骤： [0068] 1、合环羰基中间体Ⅱ的制备 [0069] 在2L单口烧瓶中，加入(52mmol)4‑胆甾烯‑3‑酮、(62mmol)碳酸钠、800mL异丙醇，70℃下搅拌溶解后，滴入由(7.5mmol)高锰酸钾、(292mmol)高碘酸钠和400mL水配置的溶液，控制滴加温度在70℃±5℃，滴加速度20mL/min，滴加结束后继续保温反应5h。反应结束后，冷却，抽滤，滤饼用100mL 5％氢氧化钠溶液洗涤，再用200mL二氯甲烷洗涤，分液除去有机相，留取水相，旋蒸除去大部分异丙醇，调节水相pH至3.0，然后用250mL二氯甲烷萃取，有机相用300mL水洗涤，无水NaSO4干燥，过滤旋蒸除溶后得到开环氧化羧酸中间体Ⅰ；在500mL双口烧瓶中，加入(37mmol)开环氧化羧酸中间体Ⅰ、(91mmol)醋酸钠、150mL乙酸，氮气保护下，加热至135℃搅拌回流反应24h。反应结束后，旋蒸除溶剂得到合环羰基中间体Ⅱ。 [0070] 2、胆固醇‑3,4‑13C2的制备 [0071] 在250mL单口烧瓶中，加入摩尔比为1:1的10.5g(27mmol)中间体Ⅱ和3.9g13 (27mmol)乙酸环己酯‑1,2‑ C2，再加入4.3g(108mmol)钠氢(60％)、100mL无水四氢呋喃，25℃下搅拌反应4d。反应结束后，旋蒸硅胶拌样，产品经硅胶过柱，流动相为乙酸乙酯：正己烷(5％‑15％梯度，时间为40min)，得中间体Ⅲ7.4g。 [0072] 另取250mL单口烧瓶，加入7.0g(16mmol)中间体Ⅲ、140mL乙酸、28mL盐酸(36.5％)，50℃下搅拌反应2d。反应结束后，加入200mL水，200mL乙酸乙酯萃取有机相，无水硫酸钠干燥，旋蒸硅胶拌样，产品经硅胶过柱，流动相为乙酸乙酯:正己烷为1:10，得中间体Ⅳ4.1g，收率66.3％。 [0073] 另取250mL单口烧瓶中，加入4.1g(11mmol)中间体Ⅳ、70mL乙酸酐，20℃下搅拌反应24h。反应结束后，旋蒸硅胶拌样，产品经硅胶过柱，流动相为乙酸乙酯:正己烷为1:10，得中间体Ⅴ2.3g，收率49.3％。 [0074] 另取250mL单口烧瓶，加入2.3g(5mmol)中间体Ⅴ、30mL甲醇、30mL四氢呋喃，60℃下搅拌反应，加入0.4g(10mmol)硼氢化钠，保持60℃下继续反应24h。反应结束后，加入20mL水，稀盐酸(5％)至pH为3.0，100mL二氯甲烷萃取，100mL饱和食盐水洗涤有机相，无水硫酸钠干燥，旋蒸硅胶拌样，产品经硅胶过柱，流动相为乙酸乙酯：正己烷为1:6(加2％异丙醇)，13 13 得胆固醇‑3,4‑ C2白色固体1.8g，纯度≥98％，丰度≥98atom％ C，收率80.3％。 [0075] 实施例4 [0076] 本实施例提供一种稳定同位素标记胆固醇‑3,4‑13C2的合成方法，它包括以下步骤： [0077] 1、合环羰基中间体Ⅱ的制备 [0078] 在2L单口烧瓶中，加入(52mmol)4‑胆甾烯‑3‑酮、(62mmol)碳酸钠、800mL异丙醇，70℃下搅拌溶解后，滴入由(7.5mmol)高锰酸钾、(292mmol)高碘酸钠和400mL水配置的溶液，控制滴加温度在70℃±5℃，滴加速度20mL/min，滴加结束后继续保温反应5h。反应结束后，冷却，抽滤，滤饼用100mL 5％氢氧化钠溶液洗涤，再用200mL二氯甲烷洗涤，分液除去有机相，留取水相，旋蒸除去大部分异丙醇，调节水相pH至3.0，然后用250mL二氯甲烷萃取，有机相用300mL水洗涤，无水NaSO4干燥，过滤旋蒸除溶后得到开环氧化羧酸中间体Ⅰ；在500mL双口烧瓶中，加入(37mmol)开环氧化羧酸中间体Ⅰ、(91mmol)醋酸钠、150mL乙酸，氮气保护下，加热至135℃搅拌回流反应24h。反应结束后，旋蒸除溶剂得到合环羰基中间体Ⅱ。 [0079] 2、胆固醇‑3,4‑13C2的制备 [0080] 在250mL单口烧瓶中，加入摩尔比为1:1的10.5g(27mmol)中间体Ⅱ和3.9g13 (27mmol)乙酸环己酯‑1,2‑ C2，再加入4.3g(108mmol)氢氧化钠、100mL无水四氢呋喃，25℃下搅拌反应4d。反应结束后，旋蒸硅胶拌样，产品经硅胶过柱，流动相为乙酸乙酯：正己烷(5％‑15％梯度，时间为40min)，得中间体Ⅲ7.5g。 [0081] 另取250mL单口烧瓶，加入7.0g(16mmol)中间体Ⅲ、140mL乙酸、28mL盐酸(36.5％)，50℃下搅拌反应2d。反应结束后，加入200mL水，200mL乙酸乙酯萃取有机相，无水硫酸钠干燥，旋蒸硅胶拌样，产品经硅胶过柱，流动相为乙酸乙酯:正己烷为1:10，得中间体Ⅳ4.1g，收率66.3％。 [0082] 另取250mL单口烧瓶中，加入4.1g(11mmol)中间体Ⅳ、70mL乙酸酐，20℃下搅拌反应24h。反应结束后，旋蒸硅胶拌样，产品经硅胶过柱，流动相为乙酸乙酯:正己烷为1:10，得中间体Ⅴ2.3g，收率49.3％。 [0083] 另取250mL单口烧瓶，加入2.3g(5mmol)中间体Ⅴ、30mL甲醇、30mL四氢呋喃，60℃下搅拌反应，加入0.4g(10mmol)硼氢化钠，保持60℃下继续反应24h。反应结束后，加入20mL水，稀盐酸(5％)至pH为3.0，100mL二氯甲烷萃取，100mL饱和食盐水洗涤有机相，无水硫酸钠干燥，旋蒸硅胶拌样，产品经硅胶过柱，流动相为乙酸乙酯：正己烷为1:6(加2％异丙醇)，13 13 得胆固醇‑3,4‑ C2白色固体1.8g，纯度≥98％，丰度≥98atom％ C，收率80.3％。 [0084] 实施例5 [0085] 与实施例1相比，绝大部分都相同，除了调整步骤2的中间体Ⅱ和13C双标记酯类化合物的摩尔比为1:10。 [0086] 实施例6 [0087] 与实施例1相比，绝大部分都相同，除了调整步骤2中所用溶剂种类，由无水四氢呋喃换为无水甲醇。 [0088] 实施例7 [0089] 与实施例1相比，绝大部分都相同，除了调整步骤2中所用溶剂种类和反应温度，溶剂由无水四氢呋喃换为DMSO，反应温度由25℃调整为200℃。 [0090] 实施例8 [0091] 与实施例1相比，绝大部分都相同，除了调整步骤2中反应时间，反应时间由4d调整为8d。 [0092] 实施例9 [0093] 与实施例1相比，绝大部分都相同，除了调整步骤2中中间体Ⅱ和碱的摩尔比为1:10。 [0094] 实施例10 [0095] 与实施例1相比，绝大部分都相同，除了调整步骤2中中间体Ⅱ和溶剂的质量体积比为1:20。 [0096] 对比例1： [0097] 参考Sun‑Shine和Yuan团队在1982年发表的采用13C双标记酰氯作为标记砌块并采13 用基团保护策略进行合成胆固醇‑3,4‑ C2的方法(SUN SHINE,YUAN.Synthesis of 3,4‑ 13 13C2 steroids[J].Steroids,1982,39(3):279‑289.)采用现有工艺制备胆固醇‑3,4‑ C2： [0098] 1、合环羰基中间体Ⅱ的制备 [0099] 在3L单口烧瓶中，加入(86mmol)4‑胆甾烯‑3‑酮、(102mmol)碳酸钠、1300mL异丙醇，70℃下搅拌溶解后，滴入由(12mmol)高锰酸钾、(483mmol)高碘酸钠和660mL水配置的溶液，控制滴加温度在70℃±5℃，滴加速度20mL/min，滴加结束后继续保温反应5h。反应结束后，冷却，抽滤，滤饼用165mL 5％氢氧化钠溶液洗涤，再用330mL二氯甲烷洗涤，分液除去有机相，留取水相，旋蒸除去大部分异丙醇，调节水相pH至3.0，然后用420mL二氯甲烷萃取，有机相用500mL水洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤旋蒸除溶后得到24.9g开环氧化羧酸中间体Ⅰ；在1L双口烧瓶中，加入(61mmol)开环氧化羧酸中间体Ⅰ、(150mmol)醋酸钠、247mL乙酸，氮气保护下，加热至135℃搅拌回流反应24h。反应结束后，旋蒸除溶剂得到17.3g合环羰基中间体Ⅱ，收率74.2％。 [0100] 2、乙酰化标记中间体Ⅲ的制备 [0101] 在500mL单口烧瓶中，氮气保护下加入摩尔比为1:1的(45mmol)中间体Ⅱ和N‑异丙基环己胺，降温至‑20℃搅拌1h，随后反应体系降温至‑70℃并缓慢滴入溶解有3.6g13 (45mmol)乙酰氯‑ C2的100mL无水四氢呋喃溶液，保持‑70℃下搅拌反应1h。反应结束后，加入溶解有45mmol HCl的100mL盐酸，缓慢恢复至室温后有机溶剂萃取、洗涤、干燥、旋干溶剂得到中间体Ⅲ7.1g，收率37％。 [0102] 3、胆固醇‑3,4‑13C2的制备 [0103] 取250mL单口烧瓶，加入7.0g(16mmol)乙酰化标记中间体Ⅲ、140mL乙酸、28mL盐酸(36.5％)，50℃下搅拌反应2d。反应结束后，加入200mL水，200mL乙酸乙酯萃取有机相，无水硫酸钠干燥，旋蒸硅胶拌样，产品经硅胶过柱，流动相为乙酸乙酯:正己烷为1:10，得中间体Ⅳ4.1g，收率66.3％。 [0104] 另取250mL单口烧瓶中，加入4.1g(11mmol)中间体Ⅳ、70mL乙酸酐，20℃下搅拌反应24h。反应结束后，旋蒸硅胶拌样，产品经硅胶过柱，流动相为乙酸乙酯:正己烷为1:10，得中间体Ⅴ2.3g，收率49.3％。 [0105] 另取250mL单口烧瓶，加入2.3g(5mmol)中间体Ⅴ、30mL甲醇、30mL四氢呋喃，60℃下搅拌反应，加入0.4g(10mmol)硼氢化钠，保持60℃下继续反应24h。反应结束后，加入20mL水，稀盐酸(5％)至pH为3.0，100mL二氯甲烷萃取，100mL饱和食盐水洗涤有机相，无水硫酸钠干燥，旋蒸硅胶拌样，产品经硅胶过柱，流动相为乙酸乙酯：正己烷为1:6(加2％异丙醇)，13 13 得胆固醇‑3,4‑ C2白色固体1.8g，纯度≥98％，丰度≥98atom％ C，收率80.3％。 [0106] 从对比例1的步骤2中可知，Sun‑Shine和Yuan团队在1982年发表的采用13C双标记13 酰氯作为标记砌块并采用基团保护策略进行合成胆固醇‑3,4‑ C2的方法在标记砌块的引 13 入方面有很多的不足：(1)首先其采用 C标记酰氯为标记引入试剂，化学性质非常不稳定，工艺稳定性差；(2)由于酰氯化学性质太活泼，因此导致整个标记引入反应在非常苛刻的条件下进行，如‑70℃等；(3)标记引入反应收率仅有37％，原子利用率较差。相比之下，与实施 13 例1中标记砌块引入采用乙酸苯酯‑1,2‑ C2，化学性质稳定，标记引入反应条件平和，工艺稳定性较好；标记引入反应收率高达66.3％，原子利用率高。 [0107] 上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。 |
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