一种泼尼松龙的制备方法 |
|||||||
| 申请号 | CN202211051808.3 | 申请日 | 2022-08-30 | 公开(公告)号 | CN115433756A | 公开(公告)日 | 2022-12-06 |
| 申请人 | 山东新华制药股份有限公司; 青岛科技大学; | 发明人 | 徐文辉; 鹿永华; 夏丙堃; 贾健波; 李伟; 陈华云; 王俊伟; 崔培哲; 朱兆友; 王英龙; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供了一种泼尼松龙的制备方法，属于药物合成技术领域。本发明先制备节杆菌 发酵 菌液，再以氢化可的松作为底物，将氢化可的松、聚醚、 乙醇 、 水 与所述发酵菌液混合，进行 微 生物 发酵转化，得到泼尼松龙发酵粗品，经历四次提取、结晶过程，对泼尼松龙发酵粗品进行充分纯化，最终提高泼尼松龙的纯度。 实施例 结果表明，本发明提供的制备方法所得泼尼松龙的纯度为99.4～99.8％。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种泼尼松龙的制备方法，包括以下步骤： |
||||||
| 说明书全文 | 一种泼尼松龙的制备方法技术领域[0001] 本发明涉及药物合成技术领域，特别涉及一种泼尼松龙的制备方法。 背景技术[0002] 泼尼松龙是一种肾上腺糖皮质激素炎药物。超生理量的糖皮质激素具有抗炎、抗过敏和抑制免疫等多种药理作用。 [0003] 目前有很多泼尼松龙的制备方法。但这些方法普遍存在副产物多，环境不友好等问题。例如专利CN105384790A公开了一种泼尼松龙的制备方法，以醋酸泼尼松为原料，依次经3、20‑位酮基保护反应和11‑位酮基还原反应、21‑位羟基酯化反应、3、20‑位酮基脱保护反应、21‑位乙酸酯水解反应得到泼尼松龙。此方法工艺路线长，存在酮羰基的选择性保护、副产物不易分离等缺点，导致生产成本高，并会产生大量废水，治理较为困难。 [0004] 近几年，生物发酵法高效生产泼尼松龙成为热点，该工艺所用底物为醋酸氢化可的松粗品，以植物甾醇9‑羟酯化物为起始原料，经氧化、除杂、生成的醋酸氢化可的松粗品，而后经发酵、精制生产泼尼松龙，能够大幅度缩短了艺周期，实现环境友好发展，并且采用的是生物发酵，无污染，符合可发展理念。例如，专利CN106893753 A公开了一种通过生物发酵一步制备泼尼松龙的方法，采用简单节杆菌Arthrobacter Simple ATCC21032经过生物发酵一步直接生成泼尼松龙，但此法存在副产物不易分离、所得泼尼松龙纯度低(仅为78～85％)的问题。 发明内容[0005] 有鉴于此，本发明目的在于提供一种泼尼松龙的制备方法，本发明提供的方法能够有效去除生物发酵法制备泼尼松龙过程中的副产物，所得泼尼松龙的纯度高。 [0006] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案： [0007] 本发明提供了一种泼尼松龙的制备方法，包括以下步骤： [0009] 将所述培养菌液接种至发酵培养基中，进行发酵培养，得到发酵菌液； [0011] 将所述泼尼松龙发酵粗品与第一提取剂混合，依次进行第一提取、第一浓缩和第一结晶，得到泼尼松龙发酵精品；所述第一提取剂为甲醇； [0013] 将所述泼尼松龙第一粗品与第三提取剂混合，依次进行第三提取和第三结晶，得到泼尼松龙第二粗品；所述第三提取剂包括甲醇、二氯甲烷和水； [0014] 将所述泼尼松龙第二粗品与第四提取剂混合，依次进行第四提取和第四结晶，得到泼尼松龙纯品；所述第四提取剂为甲醇和活性炭。 [0017] 所述种子培养的空气流量为5～15m3/h。 [0018] 优选的，所述发酵培养基的原料包括葡萄糖、玉米浆干粉、蛋白胨、磷酸二氢钾、聚醚和水； [0019] 所述发酵培养的温度为30～40℃，压力为0～1MPa，时间为30～40h； [0020] 所述发酵培养的空气流量为200～300m3/h。 [0021] 优选的，所述氢化可的松、聚醚与乙醇的质量比为200～300:1:80～200； [0022] 所述发酵菌液与氢化可的松的质量比为20～40:1。 [0023] 优选的，所述微生物发酵转化的温度为25～30℃，压力为0～1MPa，时间为24～48h； [0024] 所述微生物发酵转化的空气流量为100～200m3/h。 [0025] 优选的，所述第一提取的温度为70～90℃，时间≥0.5h。 [0026] 优选的，所述第二提取剂中，甲醇、二氯甲烷、吉拉尔特试剂T和冰醋酸的质量比为2～4:1～2:0.1～0.3:0.02～0.04。 [0027] 优选的，所述第二提取的温度为40～42℃，时间≥2h。 [0028] 优选的，所述第三提取的温度为40～42℃，时间≥2h。 [0029] 优选的，所述第四提取的温度为70～80℃，时间≥2h。 [0030] 本发明提供了一种泼尼松龙的制备方法，本发明先制备节杆菌发酵菌液，再以氢化可的松作为底物，将氢化可的松、聚醚、乙醇、水与所述发酵菌液混合，进行微生物发酵转化，得到泼尼松龙发酵粗品，经历四次提取、结晶过程，对泼尼松龙发酵粗品进行充分纯化，最终提高泼尼松龙的纯度。具体的，本发明使用甲醇作为第一提取剂对泼尼松龙发酵粗品进行第一提取，能够充分去除泼尼松龙发酵粗品中的残留菌体，得到泼尼松龙发酵精品；本发明使用包括甲醇、二氯甲烷、吉拉尔特试剂T和冰醋酸的第二提取剂对泼尼松龙发酵精品进行第二提取，在提取过程中，吉拉尔特试剂T与未反应的氢化可的松进行反应生成络合物，得到泼尼松龙第一粗品；本发明使用包括甲醇、二氯甲烷和水的第三提取剂对泼尼松龙第一粗品进行第三提取，去除吉拉尔特试剂T与氢化可的松的络合物，得到泼尼松龙第二粗品；本发明使用包括甲醇和活性炭的第四提取剂对泼尼松龙第二粗品进行第四提取，去除机械杂质并脱色，得到泼尼松龙纯品。实施例结果表明，本发明提供的制备方法所得泼尼松龙的纯度为99.4～99.8％。附图说明 [0031] 图1为泼尼松龙的制备方法的流程图； [0032] 图2为泼尼松龙在甲醇的紫外吸收光谱图； [0033] 图3为泼尼松龙在水中的紫外吸收光谱图； [0034] 图4为泼尼松龙在0.1mol/L HCl溶液中的紫外吸收光谱图； [0035] 图5为泼尼松龙在0.1mol/L NaOH溶液中的紫外吸收光谱； [0036] 图6为泼尼松龙的红外图谱； [0037] 图7为泼尼松龙的1H NMR谱图； [0038] 图8为泼尼松龙的1H‑1H相关谱； [0039] 图9为泼尼松龙13C NMR谱； [0040] 图10为泼尼松龙DEPT135谱； [0041] 图11为泼尼松龙13C‑1H相关谱； [0042] 图12为泼尼松龙远程13C‑1H相关谱； [0043] 图13为泼尼松龙的ESI质谱图； [0044] 图14为泼尼松龙的X‑射线粉末衍射图； [0045] 图15为泼尼松龙的热分析图； [0046] 图16为泼尼松龙的热重分析图。 具体实施方式[0047] 本发明提供了一种泼尼松龙的制备方法，包括以下步骤： [0048] 将节杆菌菌液接种至种子培养基中，进行种子培养，得到培养菌液； [0049] 将所述培养菌液接种至发酵培养基中，进行发酵培养，得到发酵菌液； [0050] 将氢化可的松、聚醚、乙醇、水与所述发酵菌液混合，进行微生物发酵转化，得到泼尼松龙发酵粗品； [0051] 将所述泼尼松龙发酵粗品与第一提取剂混合，依次进行第一提取、第一浓缩和第一结晶，得到泼尼松龙发酵精品；所述第一提取剂为甲醇； [0052] 将所述泼尼松龙发酵精品与第二提取剂混合，依次进行第二提取和第二结晶，得到泼尼松龙第一粗品；所述第二提取剂包括甲醇、二氯甲烷、吉拉尔特试剂T和冰醋酸； [0053] 将所述泼尼松龙第一粗品与第三提取剂混合，依次进行第三提取和第三结晶，得到泼尼松龙第二粗品；所述第三提取剂包括甲醇、二氯甲烷和水； [0054] 将所述泼尼松龙第二粗品与第四提取剂混合，依次进行第四提取和第四结晶，得到泼尼松龙纯品；所述第四提取剂为甲醇和活性炭。 [0055] 本发明将节杆菌菌液接种至种子培养基中，进行种子培养，得到培养菌液。在本发明中，所述节杆菌为本领域常规市售的节杆菌。在本发明中，所述种子培养基的原料优选包括葡萄糖、玉米浆干粉、蛋白胨、磷酸二氢钾、聚醚和水，所述聚醚优选为聚氧乙烯甘油醚。在本发明中，所述葡萄糖、玉米浆干粉、蛋白胨、磷酸二氢钾、聚醚和水的质量比优选为5～ 10:3～6:5～10:2～4:80～160:200～400，更优选为5:3:5:2:80:200。在本发明中，所述种子培养基的pH值优选为7～9，更优选为8。 [0056] 本发明优选在种子罐内进行所述种子培养。本发明优选先将种子培养基加至种子罐内，再接种节杆菌菌液。本发明将种子培养基加至种子罐后，优选对种子培养基进行灭菌。在本发明中，所述接种的方式优选为：调节无菌空气流量，升高种子罐罐压，调节种子罐排气阀，使罐压下降，利用压差使茄子瓶内节杆菌菌液接入种子罐，完成接种。 [0057] 在本发明中，所述种子培养的温度优选为30～40℃，更优选为25℃；压力优选为0～1MPa，更优选为0.02～0.08MPa；时间优选为30～40h，更优选为35h。在本发明中，所述种3 3 子培养的空气流量优选为5～15m/h，更优选为8～12m/h。 [0058] 在本发明中，所述培养菌液的pH值优选为8～8.5，菌体浓度优选为12～15mg/mL，更优选为13～14mg/mL。 [0059] 本发明将所述培养菌液接种至发酵培养基中，进行发酵培养，得到发酵菌液。在本发明中，所述发酵培养基的原料优选包括葡萄糖、玉米浆干粉、蛋白胨、磷酸二氢钾、聚醚和水，所述聚醚优选为聚氧乙烯甘油醚。在本发明中，所述葡萄糖、玉米浆干粉、蛋白胨、磷酸二氢钾、聚醚和水的质量比优选为5～10:3～6:5～10:2～4:80～160:200～400，更优选为5:3:5:2:80:200。在本发明中，所述发酵培养基的pH值优选为7～9，更优选为8。 [0060] 本发明优选在发酵罐内进行所述发酵培养。本发明优选先将发酵培养基加至发酵罐内，再接种培养菌液。本发明将发酵培养基加至发酵罐后，优选对发酵培养基进行灭菌。 [0061] 在本发明中，所述发酵培养的温度优选为30～40℃，更优选为35℃；压力优选为0～1MPa，更优选为0.02～0.08MPa；时间优选为30～40h，更优选为35h。在本发明中，所述发3 3 酵培养的空气流量优选为200～300m/h，更优选为220～280m/h。 [0062] 在本发明中，所述发酵菌液的pH值优选为8～8.2，菌体浓度优选为15～20mg/mL，更优选为16～18mg/mL。 [0063] 本发明将将氢化可的松、聚醚、乙醇、水与所述发酵菌液混合，进行微生物发酵转化，得到泼尼松龙发酵粗品。 [0064] 在本发明中，所述聚醚优选为聚氧乙烯甘油醚。在本发明中，所述氢化可的松、聚醚、乙醇的来源优选为市售。在本发明中，所述氢化可的松、聚醚与乙醇的质量比优选为200～300:1:80～200，更优选为200:1:8；在本发明中，所述氢化可的松与水的质量比优选为1～3:3～8，更优选为1:3。在本发明中，所述发酵菌液与氢化可的松的质量比为20～40:1，更优选为30:1。 [0065] 本发明优选在搅拌罐中进行所述微生物发酵转化。在本发明中，所述混合的方式优选为搅拌混合。在本发明中，所述微生物发酵转化的温度优选为25～30℃，更优选为26～28℃；压力优选为0～1MPa，更优选为0.2～0.8MPa；时间优选为24～48h，更优选为30～40h； 3 3 所述微生物发酵转化的空气流量优选为100～200m/h，更优选为120～180m/h。 [0066] 所述微生物发酵转化后，本发明优选对所得微生物发酵转化液进行后处理，所述后处理优选包括依次进行的升温灭活、固液分离、所得固体依次进行水洗、干燥，得到泼尼松龙发酵粗品。 [0067] 在本发明中，所述升温灭活的温度优选≥65℃，更优选为65～80℃。在本发明中，所述固液分离优选为过滤。本发明优选使用三合一过滤机进行所述过滤。本发明对所述水洗和干燥的方式没有特殊的要求，使用本领域技术人员熟知的水洗和干燥方式即可。 [0068] 本发明将所述泼尼松龙发酵粗品与第一提取剂混合，依次进行第一提取、第一浓缩和第一结晶，得到泼尼松龙发酵精品。在本发明中，所述第一提取剂为甲醇。在本发明中，所述泼尼松龙发酵粗品与第一提取剂的质量比优选为1～3:5～10，更优选为2:6～8。 [0069] 在本发明中，所述第一提取的温度优选为70～90℃，更优选为80℃；时间优选≥0.5h，更优选为0.5～1h。本发明优选在回流的条件下进行所述第一提取。在本发明中，所述第一浓缩的方式优选为减压浓缩。在本发明中，所述第一浓缩的压力优选≤‑0.15MPa；所述第一浓缩的温度优选为40～50℃，更优选为45℃，时间优选为12～20h，更优选为14～18h。 [0070] 在本发明中，所述第一结晶的方式优选为降温结晶。在本发明中，所述第一结晶的温度优选为0～20℃，更优选为5～10℃。 [0071] 所述第一结晶后，本发明优选对所得第一结晶液进行过滤，所得固体进行水洗和干燥，得到泼尼松龙发酵精品。 [0072] 本发明将所述泼尼松龙发酵精品与第二提取剂混合，依次进行第二提取和第二结晶，得到泼尼松龙第一粗品。在本发明中，所述第二提取剂包括甲醇、二氯甲烷、吉拉尔特试剂T和冰醋酸。在本发明中，所述甲醇、二氯甲烷、吉拉尔特试剂T和冰醋酸的质量比优选为2:1:0.1～0.3:0.02。在本发明中，所述泼尼松龙发酵精品与第二提取剂的质量比优选为1～3:5～10，更优选为2:6～8。 [0073] 在本发明中，所述第二提取的温度优选为40～42℃，更优选为41℃；时间优选≥2h，更优选为2～4h。 [0074] 在本发明中，所述第二提取后，本发明优选向所得第二提取液中加入碱液调节第二提取液的pH值至7～9，更优选为8。在本发明中，所述碱液优选为碳酸钠溶液。在本发明中，所述第二结晶的方式优选为加水降温结晶。在本发明中，所述第二结晶的温度优选为0～20℃，更优选为5～10℃。 [0075] 所述第二结晶后，本发明优选对所得第二结晶液依次进行过滤，所得固体进行水洗和干燥，得到泼尼松龙第一粗品。 [0076] 本发明将所述泼尼松龙第一粗品与第三提取剂混合，依次进行第三提取和第三结晶，得到泼尼松龙第二粗品。在本发明中，所述第三提取剂包括甲醇、二氯甲烷和水。在本发明中，所述甲醇、二氯甲烷和水的质量比优选为2:1:0.02。在本发明中，所述泼尼松龙第一粗品与第三提取剂的质量比优选为1～3:5～10，更优选为2:6～8。 [0077] 在本发明中，所述第三提取的温度优选为40～42℃，更优选为41℃；时间优选≥2h，更优选为2～4h。 [0078] 在本发明中，所述第三结晶的方式优选为加水降温结晶。在本发明中，所述第三结晶的温度优选为0～20℃，更优选为5～10℃。 [0079] 所述第三结晶后，本发明优选对所得第三结晶液依次进行过滤，所得固体进行水洗和干燥，得到泼尼松龙第二粗品。 [0080] 本发明将所述泼尼松龙第二粗品与第四提取剂混合，依次进行第四提取和第四结晶，得到泼尼松龙纯品。在本发明中，所述第四提取剂为甲醇和活性炭。在本发明中，所述甲醇和活性炭的质量比优选为1:0.005～0.05，更优选为1:0.01～0.03；所述泼尼松龙第二粗品与第四提取剂的质量比优选为1～3:5～10。 [0081] 在本发明中，所述第四提取的温度优选为70～80℃，更优选为74～78℃；时间优选≥2h，更优选为2～4h。在本发明中，所述第四结晶的方式优选为加水降温结晶。在本发明中，所述第四结晶的温度优选为0～20℃，更优选为5～10℃。 [0082] 所述第四结晶后，本发明优选对所得第四结晶液依次进行过滤，所得固体进行水洗和干燥，得到泼尼松龙纯品。 [0083] 本发明泼尼松龙的制备方法的流程图如图1所示。 [0084] 下面结合实施例对本发明提供的泼尼松龙的制备方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。 [0085] 实施例1 [0086] (1)泼尼松龙发酵粗品的制备： [0087] 1)向种子罐加入200kg培养基原料，培养基原料为葡萄糖、玉米浆干粉、蛋白胨、磷酸二氢钾、聚醚和水，质量比比为5:3:5:2:80:200，调节pH值至8；对种子罐进行灭菌；灭菌结束降温，待接种。 [0088] 2)调节无菌空气流量，缓慢升高种子罐罐压，调节种子罐排气阀，使罐压快速下降，利用压差使茄子瓶内节杆菌菌液接入种子罐，完成接种。 [0089] 3)接种完成后，进行种子罐培养，种子罐培养的空气流量为5～15m3/h，罐压为0～1MPa，罐温为30～40℃，当种子罐pH值为8.0～8.5，菌体浓度为12～15mg/mL时，完成培养，得到培养菌液； [0090] 4)向发酵罐加入培养基原料搅拌，培养基原料为葡萄糖、玉米浆干粉、蛋白胨、磷酸二氢钾、聚醚和水，质量比比为5:3:5:2:80:200，调节pH至8，对发酵罐进行灭菌，灭菌结束降温，接种培养菌液。 [0091] 5)接种完成后，进行发酵罐培养，发酵罐培养的空气流量为200～300m3/h，罐压为0～1MPa，罐温为30～40℃，当发酵罐pH值为8.0～8.2，菌体浓度为15～20mg/mL时，完成发酵，得到发酵菌液。 [0092] 6)向转化罐内加入质量比比为200:1:600的氢化可的松粗品、聚醚和水，搅拌待用，控制转化罐灭菌，灭菌结束通压缩空气降温待用。 [0093] 7)对乙醇管路进行灭菌，灭菌结束后，转化罐压入配量乙醇，将发酵菌液压入转化3 罐，进行微生物发酵转化，转化罐的空气流量为100～200m /h，罐压为0～1MPa，罐温为25～ 30℃。 [0094] 8)微生物发酵转化达到终点后，升温灭活。三合一过滤机过滤，水洗滤饼，压干，减压干燥，得泼尼松龙发酵粗品。 [0095] 不同批次下泼尼松龙发酵粗品的数据统计如表1所示。 [0096] 表1不同批次下泼尼松龙发酵粗品的数据统计 [0097] [0098] (2)泼尼松龙发酵精品的制备 [0099] 1)向泼尼松龙发酵粗品中加入甲醇，升温回流，回流温度为63～70℃，过滤，得提取液。 [0101] 3)浓缩结束，降温结晶。 [0102] 4)三合一过滤机过滤，水洗滤饼，压干，减压干燥，得泼尼松龙发酵精品。 [0103] 不同批次下泼尼松龙发酵精品的数据统计如表2所示。 [0104] 表2不同批次下泼尼松龙发酵精品 [0105] [0106] [0107] (3)泼尼松龙粗品的制备 [0108] 1)将配量的甲醇、二氯甲烷、泼尼松龙发酵精品、吉拉尔特试剂T和冰醋酸依次加至反应釜内，质量比为2:1:0.5:0.1:0.02，pH值为8，升温回流反应，回流温度为37～43℃。 [0109] 2)反应结束后。用碳酸钠水溶液调节反应液pH值7.0～9.0； [0110] 3)控制温度向料液中缓慢滴加水，降温结晶。 [0111] 4)三合一过滤机过滤，水洗滤饼，压干，减压干燥，得泼尼松龙粗品。 [0112] 不同批次下泼尼松龙粗品的数据统计如表3所示。 [0113] 表3不同批次下泼尼松龙粗品的数据统计 [0114] [0115] (4)泼尼松龙二次粗品的制备 [0116] 1)将2:1:0.1:0.5的甲醇、二氯甲烷、泼尼松龙粗品和水依次加至反应釜内，开搅拌，升温回流，回流温度为37～43℃。 [0117] 2)降温，控制温度向罐内滴加水，滴加结束搅拌结晶。 [0118] 3)三合一过滤机过滤，水洗滤饼，压干，减压干燥，得泼尼松龙二次粗品。 [0119] 不同批次下泼尼松龙二次粗品的数据统计如表4所示。 [0120] 表4不同批次下泼尼松龙二次粗品的数据统计 [0121] [0122] (5)泼尼松龙成品的制备 [0123] 1)将甲醇，泼尼松龙二次粗品和活性炭依次加至反应釜，开搅拌，升温回流，回流温度为63～70℃。 [0125] 3)浓缩结束，降温结晶。 [0126] 4)三合一过滤机过滤，压干，减压干燥，得泼尼松龙成品。 [0127] 不同批次下泼尼松龙成品的数据统计如表5所示。 [0128] 表5不同批次下泼尼松龙成品的数据统计 [0129] [0130] [0131] 结构表征与性质 [0132] 实施例1所得泼尼松龙成品的结构表征如下： [0133] 泼尼松龙在甲醇的紫外吸收光谱图如图2所示； [0134] 泼尼松龙在水中的紫外吸收光谱图如图3所示； [0135] 泼尼松龙在0.1mol/L HCl溶液中的紫外吸收光谱图如图4所示； [0136] 泼尼松龙在0.1mol/L NaOH溶液中的紫外吸收光谱如图5所示； [0137] 泼尼松龙的红外图谱如图6所示； [0138] 泼尼松龙的1H NMR谱图如图7所示； [0139] 泼尼松龙的1H‑1H相关谱如图8所示； [0140] 泼尼松龙13C NMR谱如图9所示； [0141] 泼尼松龙DEPT135谱如图10所示； [0142] 泼尼松龙13C‑1H相关谱如图11所示； [0143] 泼尼松龙远程13C‑1H相关谱如图12所示； [0144] 泼尼松龙的ESI质谱图如图13所示； [0145] 泼尼松龙的X‑射线粉末衍射图如图14所示； [0146] 泼尼松龙的热分析图(DSC)如图15所示； [0147] 泼尼松龙的热重分析图(TGA)如图16所示。 [0148] 泼尼松龙成品(生产批)CP现行版质量对比数据如表6所示。 [0149] 表6泼尼松龙成品(生产批)CP现行版质量对比数据 [0150] [0151] [0152] 泼尼松龙成品(生产批)EP现行版质量对比数据如表7所示。 [0153] 表7泼尼松龙成品(生产批)EP现行版质量对比数据 [0154] [0155] [0156] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。 |
||||||
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈