一种基于静息细胞转化精制醋酸泼尼松的方法

申请号 CN202210502327.3 申请日 2022-05-10 公开(公告)号 CN114807286B 公开(公告)日 2023-09-15
申请人 华中药业股份有限公司; 发明人 徐明琴; 罗浩; 冯蕾; 王霜; 孙琼芳; 廖俊; 邹瑾霜;
摘要 本 发明 公开了一种基于静息细胞转化精制 醋酸 泼尼松的方法,包括以下步骤:制备节杆菌的静息细胞体系;在静息细胞体系中加入 表面活性剂 孵育,然后加入醋酸可的松和助 溶剂 进行转化;醋酸泼尼松的提取纯化。该方法能有效去除产品中杂质含量,尤其是未知最大单杂,有效提高了产品 质量 ,且操作步骤简单、成本低廉,有利于工业化生产。
权利要求

1.一种基于静息细胞转化精制醋酸泼尼松的方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1、制备节杆菌的静息细胞体系;
S2、在静息细胞体系中加入表面活性剂孵育,然后加入醋酸可的松和助溶剂进行转化;
S3、醋酸泼尼松的提取纯化;
所述表面活性剂为海藻糖脂且其添加量为0.05~0.2 g/L,孵育时间为0.5~1.5h。
2.根据权利要求1所述基于静息细胞转化精制醋酸泼尼松的方法,其特征在于,步骤S1具体为:
S11、先将节杆菌斜面培养,再将菌种转接入液体培养基中扩大培养;
S12、分离菌体和液体培养基,加入等体积的灭菌纯重悬菌体。
3.根据权利要求2所述基于静息细胞转化精制醋酸泼尼松的方法,其特征在于,所述液体培养基包括:葡萄糖1.0~1.2%、玉米浆1.0~1.5%、酵母膏0.3~0.6%、磷酸二氢0.2~
0.4% ;且其pH为7.0~7.5。
4.根据权利要求2所述基于静息细胞转化精制醋酸泼尼松的方法,其特征在于,所述扩大培养的培养温度为28~33℃。
5.根据权利要求1所述基于静息细胞转化精制醋酸泼尼松的方法,其特征在于,步骤S2所述助溶剂为乙醇或甲醇。
6.根据权利要求5所述基于静息细胞转化精制醋酸泼尼松的方法,其特征在于,所述乙醇的加入量为2~4%。
7.根据权利要求1所述基于静息细胞转化精制醋酸泼尼松的方法,其特征在于,步骤S2所述醋酸可的松的投料量为20~40g/L。
8.根据权利要求1所述基于静息细胞转化精制醋酸泼尼松的方法,其特征在于,步骤S2所述转化的工艺参数为:于30~34℃转化2~3d。
9.根据权利要求1所述基于静息细胞转化精制醋酸泼尼松的方法,其特征在于,步骤S3具体为:
S31、待转化结束后,离心收集固体物料,烘干碾碎后,用乙酸乙酯加热回流提取,保温过滤去沉淀,滤液减压蒸馏后抽滤,烘干即得得粗品;
S32、再向粗品中加入乙酸乙酯打浆精制,抽滤后烘干。

说明书全文

一种基于静息细胞转化精制醋酸泼尼松的方法

技术领域

[0001] 本发明属于醋酸泼尼松制备技术领域,具体涉及了一种基于静息细胞转化精制醋酸泼尼松的方法。

背景技术

[0002] 醋酸泼尼松是一种皮质激素类药物,作用于糖代谢,减轻机体组织对损害性刺激所产生的病理反应,用于肾上腺皮质机能减退症、活动性湿病、类风湿性关节炎、红斑性狼疮等胶原性病患、严重的支气管哮喘、严重皮炎等过敏性疾病及急性白血病等,亦用于某些感染的综合治疗
[0003] 目前醋酸泼尼松的主要生产工艺是以醋酸可的松为底物,利用节杆菌进行发酵脱氢制备,其技术路线如下:
[0004]
[0005] 在该工艺过程中,通常是将底物直接投料与节杆菌的发酵液中进行转化,但是发明人在生产过程中发现,精制产物中始终存在一个含量超过0.1%杂质峰(位于醋酸泼尼松大约两倍出峰时间),且不能通过优化提纯步骤去除,严重不利于产品质量的进一步提高。
[0006] 静息细胞法是近年来的研究热点,已经被应用于天然化合物的生物合成、药物前体化合物的转化、生物催化的有机化合物不对称合成、活性成分的筛选及新药开发等诸多领域。而且,静息细胞转化过程中,由于无外源性营养物质的存在,副产物少,有利于后续产品的提取精制。

发明内容

[0007] 有鉴于此,本发明的目的在于提供一种基于静息细胞转化精制醋酸泼尼松的方法,不仅转化率高且能有效去除产物中的杂质,提升产品质量。
[0008] 本发明的技术方案具体如下:
[0009] 一种基于静息细胞转化精制醋酸泼尼松的方法,包括以下步骤:
[0010] S1、制备节杆菌的静息细胞体系;
[0011] S2、在静息细胞体系中加入表面活性剂孵育,然后加入醋酸可的松和助溶剂进行转化;
[0012] S3、醋酸泼尼松的提取纯化。
[0013] 进一步地,在上述技术方案中,步骤S1具体为:
[0014] S11、先将节杆菌斜面培养,再将菌种转接入液体培养基中扩大培养;
[0015] S12、分离菌体和液体培养基,加入等体积的灭菌纯重悬菌体。
[0016] 更进一步地,液体培养基包括:葡萄糖1.0~1.2%、玉米浆1.0~1.5%、酵母膏0.3~0.6%、磷酸二氢0.2~0.4%;且其pH为7.0~7.5。
[0017] 更进一步地,所述扩大培养的培养温度为28~33℃。
[0018] 进一步地,在上述技术方案中,所述表面活性剂为海藻糖脂且其添加量为0.05~0.2g/L,孵育时间为0.5~1.5h。
[0019] 进一步地,在上述技术方案中,步骤S2中的助溶剂为乙醇或甲醇;更进一步地,乙醇的加入量为2~4%(体积比)。
[0020] 进一步地,在上述技术方案中,步骤S2中醋酸可的松的投料量为20~40g/L。
[0021] 进一步地,在上述技术方案中,步骤S2所述转化的工艺参数为:于30~34℃转化2~3d。
[0022] 进一步地,在上述技术方案中,步骤S3具体为:
[0023] S31、待转化结束后,离心收集固体物料,烘干碾碎后,用乙酸乙酯加热回流提取,保温过滤去沉淀,滤液减压蒸馏后抽滤,烘干即得得粗品;
[0024] S32、再向粗品中加入乙酸乙酯打浆精制,抽滤后烘干。
[0025] 在实际生产过程中,可根据产品需求多次重复步骤S32。
[0026] 本发明的有益效果为:本发明有效降低了产品中未知单杂的含量,并将其含量控制在0.1%以下,有效提高了产品质量。附图说明
[0027] 图1为实施例1制备的醋酸泼尼松产品的HPLC检测结果图;
[0028] 图2为对比例1制备的醋酸泼尼松产品的HPLC检测结果图。

具体实施方式

[0029] 以下结合实验实例对本发明进行详细地说明,应该说明的是,本发明的实施例仅限于对于本发明进行说明,而没有限制作用。
[0030] 实施例1
[0031] 醋酸泼尼松的制备过程如下:
[0032] (1)斜面菌种培养:取节杆菌保藏菌种,接种斜面扩大培养,培养温度为33℃,培养周期为3天。
[0033] (2)扩大培养:将上述斜面菌种转接入已灭菌的液体培养基(葡萄糖1.0%、玉米浆1.2%、酵母膏0.5%、磷酸二氢钾0.3%)摇瓶中,控制温度30℃,180rpm进行菌种扩培。
[0034] (3)静息细胞转化:分离菌体,加入与发酵液等体积的无菌水(煮沸灭菌)中;先加入0.1g/L的海藻糖脂,混合均匀后孵育30min;再加入4%乙醇和30g/L醋酸可的松进行转化,转化条件为:33℃,200rpm,转化周期2d。
[0035] (4)醋酸泼尼松提取:待转化结束后,离心收集固体物料,烘干碾碎,采用18倍乙酸乙酯(含3%水)加热回流2h提取,保温过滤去除菌体杂质,滤液减压蒸馏至适量,冷却至室温后抽滤、烘干,得醋酸泼尼松粗品。
[0036] (5)精制:在上述粗品中加入3倍乙酸乙酯(含3%水),打浆精制2h,抽滤,烘干;再加3倍乙酸乙酯(含3%水)打浆精制2h,抽滤,烘干,得最终产品。
[0037] HPLC检测结果如图1所示,泼尼松0.0740,醋酸泼尼松99.006,醋酸可的松0.7812,未知最大杂质0.0486。
[0038] 实施例2
[0039] 与实施例1不同的是:步骤(1)中培养温度为30℃,周期为3天;步骤(2)中温度为33℃,200rpm;步骤(3)中海藻糖脂添加量为0.12g/L,乙醇加入量为3%,醋酸可的松加入量为25g/L。
[0040] HPLC检测结果为:泼尼松0.112,醋酸泼尼松98.499,醋酸可的松1.276,未知最大杂0.041。
[0041] 实施例3
[0042] 与实施例1不同的是:步骤(3)中海藻糖脂添加量为0.07g/L,乙醇加入量为4%,醋酸可的松加入量为35g/L。
[0043] HPLC检测结果为:泼尼松0.116,醋酸泼尼松98.249,醋酸可的松1.329,未知最大杂0.053。
[0044] 对比例1
[0045] 与实施例1不同的是,步骤(3)具体为:直接向步骤(2)所得的发酵液中加入4%乙醇和30g/L醋酸可的松进行转化,转化条件为:33℃,200rpm,转化周期2d。
[0046] HPLC检测如图2所示:泼尼松0.1346,醋酸泼尼松98.443,醋酸可的松1.0405,未知最大杂质0.2582。
[0047] 对比例2
[0048] 与实施例1不同的是,步骤(3)具体为:分离菌体,加入与发酵液等体积的无菌水(煮沸灭菌)中;直接添加4%乙醇和30g/L醋酸可的松进行转化,转化条件为:33℃,200rpm,转化周期2d。
[0049] HPLC检测结果显示:虽然产品整体的杂质量有所降低,但未知最大杂质含量为0.1263,仍然保持在0.1以上。
[0050] 本发明所列举的各原料,各原料用量的上下限、区间取值,以及各参数的上下限、区间取值都能实现很好的降解效果,在此不一一列举实施例。
[0051] 综上所述,本发明提供的方法能有效降低产品中杂质含量,尤其是未知最大单杂含量;而且在此工艺中,转化介质—水只需做简单的煮沸处理,不需要像培养基灭菌那样高温高压,也不需要做任何PH等方面的调整,成本低廉。
[0052] 以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到的变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
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