一种21,24-环化的羊毛脂烷型三萜类化合物及其制备方法和用途专利检索-含有碳氢卤素或氧的正系甾族化合物在17β位上被1个碳原子取代专利检索查询-专利查询网

一种21,24-环化的羊毛脂烷型三萜类化合物及其制备方法和用途
申请号	CN202310676496.3	申请日	2023-06-08	公开(公告)号	CN116813681B	公开(公告)日	2024-01-30
申请人	中南民族大学;			发明人	杨光忠; 熊慧; 陈玉; 曾文丽; 王梦玲;
摘要	本发明属于天然药物技术领域，具体涉及一种桦褐孔菌中的21,24‑环化的羊毛脂烷型三萜类化合物及其制备方法和用途。体外抗炎活性实验表明该化合物对炎症因子NO具有显著的抑制作用，并且能有效抑制RAW264.7细胞中升高的炎症介质的基因表达水平。本发明为开发新的抗炎药物提供了备选化合物，这对桦褐孔菌的综合开发利用具有非常重要的意义。
权利要求	1.一种21,24‑环化的羊毛脂烷型三萜类化合物，其结构式为： 2.根据权利要求1所述的21,24‑环化的羊毛脂烷型三萜类化合物，其特征在于，所述化合物的结构式为： 3.一种权利要求1或2所述的化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： S1、称取干燥的桦褐孔菌，粉碎，利用乙醇浸提，然后将提取液减压浓缩，得乙醇浸膏； S2、用甲醇溶解乙醇浸膏，然后加入石油醚萃取，将甲醇部分减压浓缩，得甲醇提取物； S3、将甲醇提取物用体积比为9:1的水和甲醇混合液再次溶解，然后加入乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酯部分减压浓缩，得乙酸乙酯提取物； S4、对乙酸乙酯提取物实施正相硅胶柱层析，梯度洗脱，得到A～N 14个组分； S5、对得到的K组分实施中压反相柱层析，梯度洗脱，最终得到K‑1～K‑1414个组分； S6、K‑10组分通过半制备高效液相色谱分离后，得到该化合物；所述对乙酸乙酯提取物梯度洗脱的条件为：以石油醚‑乙酸乙酯为洗脱剂，按照体积比 20:1、10:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、0:1进行梯度洗脱，利用TLC检测合并相似组分，其中展开剂为三氯甲烷‑甲苯‑乙酸乙酯‑甲醇的混合液；所述对组分K梯度洗脱的条件为：以水‑甲醇为洗脱剂，按照体积比90:10、70:30、50: 50、30:70、0:100进行梯度洗脱，利用TLC检测合并相似组分，其中展开剂为三氯甲烷‑甲苯‑乙酸乙酯‑甲醇的混合液；所述K‑10组分的半制备高效液相色谱条件为：以乙腈和水的混合溶剂为洗脱液，按照乙腈：水体积比45:55进行等度洗脱，流速为3mL/min。 4.权利要求1或2所述的21,24‑环化的羊毛脂烷型三萜类化合物在制备抑制NO生成的药物中的应用。 5.权利要求1或2所述的21,24‑环化的羊毛脂烷型三萜类化合物在制备抑制炎性因子mRNA表达水平的药物中的应用。 6.权利要求1或2所述的21,24‑环化的羊毛脂烷型三萜类化合物在制备抗炎药物中的应用。
说明书全文	一种21,24‑环化的羊毛脂烷型三萜类化合物及其制备方法和用途技术领域 [0001] 本发明涉及天然产物和药物技术领域，尤其涉及一种从桦褐孔菌中提取到的21,24‑环化的羊毛脂烷型三萜类化合物及其制备方法和用途。背景技术 [0002] 桦褐孔菌(Inonotus obliquus)是锈革孔菌目(Hymenochaetales)锈革孔菌科(Hymenochaetaceae)褐卧孔菌属(Fuscoporia)的药食两用真菌。在民间桦褐孔菌可用于防治心脏病、糖尿病和各种癌症(胃癌、肝癌、肠癌等)。对桦褐孔菌植物化学的研究表明，其化学成分以四环三萜类化合物中的羊毛脂烷型为主，还有少量的五环三萜类、甾类、糖类、酚类等化合物。现代药理学研究发现桦褐孔菌具有良好的调节血糖、抗肿瘤、抗炎、抗氧化作用，还具有抗血小板凝聚和降血压作用。 [0003] 因此，从天然的桦褐孔菌中提取分离并开发成有药用价值的新化合物，对桦褐孔菌的综合开发利用具有非常重要的意义。发明内容 [0004] 有鉴于此，本发明提供了一种从桦褐孔菌中分离纯化得到的21,24‑环化的羊毛脂烷型三萜类化合物及其制备方法和应用。 [0005] 本发明提供一种21,24‑环化的羊毛脂烷型三萜类新化合物，所述化合物从桦褐孔菌中分离纯化得到，其结构式如式(I)所示： [0006] [0007] 本发明还提供了上述21,24‑环化的羊毛脂烷型三萜类化合物的制备方法，包括以下步骤： [0008] S1、称取干燥的桦褐孔菌，粉碎，利用乙醇浸提，然后将提取液减压浓缩，得乙醇浸膏； [0009] S2、用甲醇溶解乙醇浸膏，然后加入石油醚萃取，将甲醇部分减压浓缩，得甲醇提取物； [0010] S3、甲醇提取物用9:1(v/v)的水和甲醇混合液再次溶解，然后加入乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酯部分减压浓缩，得乙酸乙酯提取物； [0011] S4、对乙酸乙酯提取物实施正相硅胶柱层析，梯度洗脱，利用TLC检测合并相似组分，得到(A～N)14个组分； [0012] S5、对得到的K组分实施中压反相柱层析，梯度洗脱，利用TLC检测合并相似组分，最终得到(K‑1～K‑14)14个组分； [0013] S6、组分K‑10通过半制备高效液相色谱分离后，得到式(I)所示的化合物。 [0014] 进一步地，步骤S4中，对乙酸乙酯提取物梯度洗脱的条件为：利用石油醚和乙酸乙酯按照两者体积比20:1、10:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、0:1进行梯度洗脱。 [0015] 进一步地，步骤S5中，对组分K梯度洗脱的条件为：利用水和甲醇按照两者体积90:10、70:30、50:50、30:70、0:100进行梯度洗脱。 [0016] 进一步地，步骤S6中，组分K‑10的高效液相色谱条件为：利用乙腈和水按照两者体积比45:55以3mL/min的流速进行等度洗脱。 [0017] 上述21,24‑环化的羊毛脂烷型三萜类化合物能够应用于制备抗炎药物。 [0018] 本发明提供的技术方案带来的有益效果是：本发明通过对药用真菌桦褐孔菌的乙醇提取物进行分离纯化，得到1种新化合物，综合应用多种波谱分析手段，确定其为21,24‑环化的羊毛脂烷型三萜类化合物；通过对得到的化合物进行体外抗炎活性实验，发现其对炎症因子NO有显著的抑制作用，且能下调炎性介质TNF‑α、IL‑1β、IL‑6、iNOS和COX‑2mRNA的表达水平；本发明为开发新的抗炎药物提供了备选化合物，对桦褐孔菌的综合开发利用具有非常重要的意义。附图说明 [0019] 图1为本发明实施例1制备21,24‑环化的羊毛脂烷型三萜类化合物的提取分离流程图； [0020] 图2为本发明实施例1制得的化合物的1H‑NMR(500MHz,CD3OD)谱图； [0021] 图3为本发明实施例1制得的化合物的13C‑NMR(125MHz,CD3OD)谱图； [0022] 图4为本发明实施例1制得的化合物的DEPT(Distortionless Enhancement by Polarization Transfer，无畸变极化转移技术)(θ＝90°)谱图； [0023] 图5为本发明实施例1制得的化合物的DEPT(θ＝135°)谱图； [0024] 图6为本发明实施例1制得的化合物的HSQC(Heteronuclear Singular Qantum Correlation,异核单量子关系)谱图； [0025] 图7为本发明实施例1制得的化合物的HMBC(1H detected heteronuclear multiple bond correlation,1H的异核多碳相关谱)谱图； [0026] 图8为本发明实施例1制得的化合物的1H‑1H COSY(Correlation spectroscopy,相关谱)谱图； [0027] 图9为本发明实施例1制得的化合物的ROESY(Rotating Frame Overhauser Effect Spectroscopy,旋转坐标系NOE谱)谱图； [0028] 图10为本发明实施例1制得的化合物的UV谱图； [0029] 图11为本发明实施例1制得的化合物的HR‑ESI‑MS谱图； [0030] 图12为不同浓度的实施例1的化合物对RAW264.7细胞活力的影响； [0031] 图13为实施例1的化合物对NO释放的影响，其中，CON：对照组；LPS：模型组；统计数###据以平均值±SEM表示， p<0.001，#号表示对照组vs模型组；*p<0.001，p<0.01，p< 0.05，号表示模型组vs给药组； [0032] 图14为实施例1的化合物对炎性介质mRNA表达的影响，其中，CON：对照组；LPS：模###型组；DEX：地塞米松；统计数据以平均值±SEM表示， p<0.001，#号表示对照组vs模型组；*p<0.001，p<0.01，p<0.05，号表示模型组vs给药组。具体实施方式 [0033] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本发明实施方式作进一步描述。 [0034] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 [0035] 下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 [0036] 实施例1 [0037] 本实施例提供了一种从桦褐孔菌中提取到21,24‑环化的羊毛脂烷型三萜类化合物的制备过程，具体步骤为： [0038] 步骤S1、称取干燥的桦褐孔菌10.25kg，粉碎后用95％(v/v)的乙醇浸提3次，每次室温下浸泡24小时，每次浸泡后抽滤，将3次抽滤后的提取液合并，减压浓缩后得到总浸膏(170g)；本实施例中使用的桦褐孔菌购于湖北省宜昌市，经中南民族大学药学院刘新桥副教授鉴定为锈革孔菌目锈革孔菌科褐卧孔菌属桦褐孔菌(Inonotus obliquus)。 [0039] 步骤S2、用甲醇溶解上述总浸膏，然后加入石油醚萃取，将甲醇部分减压浓缩，得甲醇提取物(160g)。 [0040] 步骤S3、将甲醇提取物用9:1(v/v)的水和甲醇混合液再次溶解，然后加入乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酯部分减压浓缩，得乙酸乙酯提取物(80g)。 [0041] 步骤S4、对乙酸乙酯提取物实施正相硅胶柱层析，石油醚‑乙酸乙酯梯度洗脱(石油醚:乙酸乙酯＝20:1、10:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、0:1，v/v)，利用TLC(展开剂为三氯甲烷:甲苯:乙酸乙酯:甲醇＝10:4:1:(0.5～1.5)，v/v；甲醇的用量随化合物极性的增大而增加)检测合并相似组分，得到14个组分，按照极性由小到大依次标记为A‑N，收集石油醚‑乙酸乙酯体积比6:4的洗脱液，编号为K，经减压浓缩至干，备用。 [0042] 步骤S5、对K组分(3.50g)干法上样，利用中压反相柱层析法，用甲醇和水(水:甲醇＝90:10、70:30、50:50、30:70、0:100，v/v)进行梯度洗脱，通过TLC(thin‑layer chromatography，薄层色谱法，展开剂为三氯甲烷:甲苯:乙酸乙酯:甲醇＝10:4:1:(0.5～1.5)，v/v；甲醇的用量随化合物极性的增大而增加)检测合并相似的组分，最终得到14个组分，按照极性由小到大依次标记为K‑1～K‑14，收集水‑甲醇体积比30:70的洗脱液，编号为K‑10，经减压浓缩至干，备用。 [0043] 步骤S6、对得到的K‑10组分(27.48mg)利用半制备柱YMC‑Pack ODS‑A(250×10mm,5μm)进行HPLC(High Performance Liquid Chromatography，高效液相色谱)纯化，利用乙腈和水按照两者体积比45:55以3mL/min的流速进行等度洗脱，取保留时间tR＝31.53min的物质，即为本发明的21,24‑环化的羊毛脂烷型三萜类化合物，其重量为0.80mg。 [0044] 上述步骤的流程图见图1。 [0045] 对本实施例制得的化合物进行高分辨质谱、紫外光谱、旋光、核磁共振分析，从而确定化合物的结构。 [0046] 化合物的理化数据及波谱数据如下： [0047] 白色无定形粉末；HR‑ESI‑MS m/z 473.36261[M+H]+(calcd for C30H49O4,473.36254)； (c 0.05,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε):240(3.50)；化合物的核磁 1 13 共振数据如表(2)所示。H NMR(500MHz,CD3OD)谱图见图2，C‑NMR(125MHz,CD3OD)谱图见图 3，DEPT(θ＝90°)谱图见图4，DEPT(θ＝135°)谱图见图5，HSQC谱图见图6，HMBC谱图见图7， 1 1 H‑H COSY谱图见图8，ROESY谱图见图9，UV谱图见图10，HR‑ESI‑MS谱图见图11。 [0048] 表1：化合物的中英文命名 [0049] [0050] 表2：化合物的NMR数据(Record in CD3OD) [0051] [0052] [0053] Measured at a)CD3OD [0054] 实施例2：体外抗炎活性测试 [0055] 对实施例1制得的化合物进行体外抗炎活性实验： [0056] 材料与试剂：脂多糖(LPS)、地塞米松和二甲亚砜购自美国Sigma公司；高糖DMEM培养基购自美国Gibco公司；青霉素‑链霉素溶液购自美国GE公司；胎牛血清购自美国GE公司；CCK‑8试剂盒购自广州Biosharp公司；一氧化氮检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。 [0057] 供试肿瘤细胞株：巨噬细胞RAW264.7，购自武汉普诺赛生命科技有限公司(Cat NO：CL‑0190)。 [0058] (一)CCK‑8检测细胞活力 [0059] 实验方法： [0060] 取RAW264.7细胞于含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基(含青霉素、链霉素双抗)中4 培育至生长约80％传代，然后将RAW264.7细胞(1×10/孔)接种到96孔板，终体积为100μL，并在37℃细胞培养箱终培养12h。将实施例1的化合物用DMSO配制，母液浓度为10mM，然后用DMEM培养基稀释成不同浓度(50、100μM)，加入到上述96孔板中，终体积为200μL。实验同时设置空白组(无细胞，仅加入DMEM培养基)和对照组(加入DMEM培养基，有细胞)。于培养箱中孵育24h后，加入10μL的CCK‑8溶液，继续在培养箱中避光孵育1h，然后在450nm 波长处测定各孔OD值。计算细胞存活率(见图12)，细胞存活率的计算公式为(OD实验组‑OD空白组)/(OD对照组‑OD空白组)×100％。 [0061] 实验结论： [0062] 从图12可知，细胞毒性筛选结果显示该化合物在50、100μM浓度下对细胞没有明显的毒性作用。 [0063] (二)NO活性测定 [0064] 实验方法： [0065] 取RAW264.7细胞于含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基(含青霉素、链霉素双抗)中4 培育至生长约80％传代，然后将1×10个/孔的RAW264.7细胞接种于96孔板，在5％CO2、37℃细胞培养箱中培养6h。用DMEM培养基配置不同浓度(5、10、20、40μM)的实施例1的化合物和1μg/mL的脂多糖(LPS)。弃孔内旧培养基，空白组仅加入DMEM培养基(无细胞)、对照组加入DMEM培养基(有细胞)、模型组加入1μg/mL的LPS、给药组加入1μg/mL的LPS和不同浓度实施例1的化合物，每孔均加100μL，在培养箱中孵育12h。然后取50μL的上清液，按照Griess法检测上清液中一氧化氮的含量，求其IC50值，实验结果见图13。 [0066] 实验结论： [0067] 通过CCK‑8实验，设定抗炎活性的浓度为5、10、20、40μM。与对照组相比，使用LPS刺激炎性细胞后，模型组NO的释放量显著增加。同时，与模型组相比，随着化合物的浓度增加其NO的释放量减少，说明本发明的化合物对NO有抑制作用，计算IC50值为20.3μM。 [0068] (三)抗炎活性测定 [0069] 实验方法： [0070] 取RAW264.7细胞于含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基(含青霉素、链霉素双抗)中4 培育至生长约80％传代，然后将RAW 264.7巨噬细胞(3×10个/mL)接种于12孔板，在5％CO2、37℃细胞培养箱中孵育24h后，加入不同浓度(10、20、40μM)的实施例1的化合物，继续孵育1h后加入1μg/mL脂多糖，接着孵育3h，实施例1的化合物和脂多糖均用DMEM培养基配制溶液。去除培养基，收集细胞，使用RNAiso Plus从RAW264.7中提取总RNA，然后使用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，采用实时荧光定量PCR方法，检测供试化合物对炎性因子mRNA‑ΔΔCt 表达水平的影响。通过2 计算相对RNA的表达水平，并标准化为β‑Actin，用于qPCR的基因特异性引物如表(3)所示。实验同时设置空白组(仅加入DMEM培养基，无细胞)，对照组(加入DMEM培养基，有细胞)，模型组(加入1μg/mL的LPS)和阳性组(加入20μM地塞米松)。 [0071] 表3用于qPCR的基因特异性引物序列 [0072] [0073] 实验结论：与对照组相比，模型组炎症性细胞因子TNF‑α、IL‑1β、IL‑6、COX‑2和###iNOS的mRNA水平均显著性上调( p<0.001)。与模型组相比，化合物低、中、高剂量组可下调模型组中升高的TNF‑α、IL‑1β、IL‑6和iNOS的mRNA水平，因此本发明的化合物可有效抑制RAW264.7细胞中升高的炎症介质的基因表达水平(图14)。 [0074] 在不冲突的情况下，本文中上述实施例及实施例中的特征可以相互结合。 [0075] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

意见反馈