[0001] 以电子方式提交的序列表的引用

[0002] 文件名为“5914‑PCT_seq_list.txt”的序列表创建于2015年11月19日，大小为542千字节，以计算机可读形式，同时与本说明书一起提交。该序列表是本说明书的一部分并且以其全文通过引用结合在此。

[0003] 政府支持

[0004] 根据协议号LB09005376，政府享有本发明的一定的权利。发明领域

[0005] 本披露涉及分子生物学领域。提供了编码杀有害生物蛋白的新颖基因。这些杀有害生物蛋白和编码它们的核酸序列可用于制备杀有害生物配制品并且可用于生产转基因
抗有害生物植物。

[0006] 发明背景

[0007] 使用微生物剂(如真菌、细菌或其他昆虫物种)对具有农业意义的昆虫有害生物进行生物防治，为合成型化学杀有害生物剂提供了环境友好且有商业吸引力的替代方案。一
般来说，使用生物杀有害生物剂造成污染和环境危害的风险较低，并且生物杀有害生物剂
提供比传统广谱化学杀昆虫剂所特有的靶特异性更强。此外，生物杀有害生物剂往往生产
成本较低，并且因此能提高各种作物的经济产量。

[0008] 已知芽孢杆菌属微生物的某些物种对一系列昆虫有害生物具有杀有害生物活性，该一系列昆虫有害生物包括鳞翅目、双翅目、鞘翅目、半翅目等。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)和日本金龟子芽孢杆菌(Bacillus popilliae)是迄今发现的最成功的
生物防治剂之一。昆虫致病性还归因于幼虫芽孢杆菌(B.larvae)、缓病芽孢杆菌
(B.lentimorbus)、球形芽孢杆菌(B.sphaericus)和蜡样芽孢杆菌(B.cereus)的菌株。微生物杀昆虫剂，特别是从芽孢杆菌属菌株获得的那些微生物杀昆虫剂，在农业上作为有害生
物化学防治的替代方案起着重要作用。

[0009] 通过将作物植物进行遗传工程改造以生产来自芽孢杆菌属的杀有害生物蛋白，已经开发出昆虫抗性增强的作物植物。例如，已经对玉米和棉花植物进行遗传工程改造以产
生从Bt株分离的杀有害生物蛋白。现在，这些遗传工程化作物广泛应用于农业中，并且为农民提供了取代传统昆虫防治方法的环境友好型替代方案。虽然它们已被证明在商业上非常
成功，但是这些遗传工程化抗昆虫作物植物仅针对窄范围的经济上重要的昆虫有害生物提
供抗性。在某些情况下，昆虫可以对不同杀昆虫化合物产生抗性，这就导致需要鉴别用于有害生物防治的替代性生物防治剂。

[0010] 因此，仍然需要对昆虫有害生物具有不同范围的杀昆虫活性的新型杀有害生物蛋白，例如，针对鳞翅目和鞘翅目的各种昆虫具有活性的杀昆虫蛋白，这些昆虫包括但不限于对现有杀昆虫剂已产生抗性的昆虫有害生物。

[0011] 概述

[0012] 提供了用于对细菌、植物、植物细胞、组织以及种子赋予杀有害生物活性的组合物和方法。组合物包含杀有害生物和杀昆虫多肽的核酸分子编码序列、包含那些核酸分子的载体、以及包含这些载体的宿主细胞。组合物还包括这些杀有害生物多肽序列以及针对那
些多肽的抗体。这些核酸序列可以在DNA构建体或表达盒中使用，以用于在多种生物体(包
括微生物和植物)中进行转化和表达。这些核苷酸或氨基酸序列可以是合成序列，这些合成序列已经被设计用于在生物体中表达，该生物体包括但不限于：微生物或植物。组合物还包含转化的细菌、植物、植物细胞、组织、以及种子。

[0013] 特别地，提供了编码假单孢菌属杀昆虫蛋白‑45‑1(PIP‑45‑1)多肽的分离的或重组的核酸分子，这些多肽包括氨基酸取代、缺失、插入、及其片段、及其组合。此外，涵盖了与这些PIP‑45‑1多肽相应的氨基酸序列。提供了能够编码SEQ ID NO：1的PIP‑45‑1多肽的分离或重组的核酸分子以及氨基酸取代、缺失、插入、其片段及其组合。还涵盖了与实施例的核酸序列互补或与实施例的序列杂交的核酸序列。还提供了SEQ ID NO：1的分离或重组的PIP‑45‑1多肽以及氨基酸取代、缺失、插入、其片段及其组合。

[0014] 特别地，提供了编码假单孢菌属杀昆虫蛋白‑45‑2(PIP‑45‑2)多肽的分离的或重组的核酸分子，这些多肽包括氨基酸取代、缺失、插入、及其片段、及其组合。此外，涵盖了与这些PIP‑45‑2多肽相应的氨基酸序列。提供了能够编码SEQ ID NO：2的PIP‑45‑2多肽的分离或重组的核酸分子以及氨基酸取代、缺失、插入、其片段及其组合。还涵盖了与实施例的核酸序列互补或与实施例的序列杂交的核酸序列。还提供了SEQ ID NO：2的分离或重组的PIP‑45‑2多肽以及氨基酸取代、缺失、插入、其片段及其组合。

[0015] 特别地，提供了编码假单孢菌属杀昆虫蛋白‑64‑1(PIP‑64‑1)多肽的分离的或重组的核酸分子，这些多肽包括氨基酸取代、缺失、插入、及其片段、及其组合。此外，涵盖了与这些PIP‑64‑1多肽相应的氨基酸序列。提供了能够编码SEQ ID NO：53的PIP‑64‑1多肽的分离或重组的核酸分子以及氨基酸取代、缺失、插入、其片段及其组合。还涵盖了与实施例的核酸序列互补或与实施例的序列杂交的核酸序列。还提供了SEQ ID NO：53的分离或重组的PIP‑64‑1多肽以及氨基酸取代、缺失、插入、其片段及其组合。

[0016] 特别地，提供了编码假单孢菌属杀昆虫蛋白‑64‑2(PIP‑64‑2)多肽的分离的或重组的核酸分子，这些多肽包括氨基酸取代、缺失、插入、及其片段、及其组合。此外，涵盖了与这些PIP‑64‑2多肽相应的氨基酸序列。提供了能够编码SEQ ID NO：54的PIP‑64‑2多肽的分离或重组的核酸分子以及氨基酸取代、缺失、插入、其片段及其组合。还涵盖了与实施例的核酸序列互补或与实施例的序列杂交的核酸序列。还提供了SEQ ID NO：54的分离或重组的PIP‑64‑2多肽以及氨基酸取代、缺失、插入、其片段及其组合。

[0017] 特别地，提供了编码假单孢菌属杀昆虫蛋白‑74‑1(PIP‑74‑1)多肽的分离的或重组的核酸分子，这些多肽包括氨基酸取代、缺失、插入、及其片段、及其组合。此外，涵盖了与这些PIP‑74‑1多肽相应的氨基酸序列。提供了能够编码SEQ ID NO：73的PIP‑74‑1多肽的分离或重组的核酸分子以及氨基酸取代、缺失、插入、其片段及其组合。还涵盖了与实施例的核酸序列互补或与实施例的序列杂交的核酸序列。还提供了SEQ ID NO：73的分离或重组的PIP‑74‑1多肽以及氨基酸取代、缺失、插入、其片段及其组合。

[0018] 特别地，提供了编码假单孢菌属杀昆虫蛋白‑74‑2(PIP‑74‑2)多肽的分离的或重组的核酸分子，这些多肽包括氨基酸取代、缺失、插入、及其片段、及其组合。此外，涵盖了与这些PIP‑74‑2多肽相应的氨基酸序列。提供了能够编码SEQ ID NO：74的PIP‑74‑2多肽的分离或重组的核酸分子以及氨基酸取代、缺失、插入、其片段及其组合。还涵盖了与实施例的核酸序列互补或与实施例的序列杂交的核酸序列。还提供了SEQ ID NO：74的分离或重组的PIP‑74‑2多肽以及氨基酸取代、缺失、插入、其片段及其组合。

[0019] 特别地，提供了编码假单孢菌属杀昆虫蛋白‑75(PIP‑75)多肽的分离的或重组的核酸分子，这些多肽包括氨基酸取代、缺失、插入、及其片段、及其组合。此外，涵盖了与这些PIP‑75多肽相应的氨基酸序列。提供了能够编码SEQ ID NO：79的PIP‑75多肽的分离或重组的核酸分子以及氨基酸取代、缺失、插入、其片段及其组合。还涵盖了与实施例的核酸序列互补或与实施例的序列杂交的核酸序列。还提供了SEQ ID NO：79的分离或重组的PIP‑75多肽以及氨基酸取代、缺失、插入、其片段及其组合。

[0020] 特别地，提供了编码假单孢菌属杀昆虫蛋白‑77(PIP‑77)多肽的分离的或重组的核酸分子，这些多肽包括氨基酸取代、缺失、插入、及其片段、及其组合。此外，涵盖了与这些PIP‑77多肽相应的氨基酸序列。提供了能够编码SEQ ID NO：88的PIP‑77多肽的分离或重组的核酸分子以及氨基酸取代、缺失、插入、其片段及其组合。还涵盖了与实施例的核酸序列互补或与实施例的序列杂交的核酸序列。还提供了SEQ ID NO：88的分离或重组的PIP‑77多肽以及氨基酸取代、缺失、插入、其片段及其组合。

[0021] 提供了用于产生杀昆虫多肽，以及使用这些多肽来控制或杀灭鳞翅目、鞘翅目、线虫、真菌、和/或双翅目有害生物的方法。实施例的转基因植物表达在此披露的一种或多种杀有害生物序列。在不同的实施例中，该转基因植物进一步包含一种或多种另外的昆虫抗性基因，例如，用于控制鞘翅目、鳞翅目、半翅目或线虫有害生物的一种或多种另外的基因。
本领域的技术人员将会理解的是，该转基因植物可以包含赋予感兴趣的农艺性状的任何基
因。

[0022] 还包括用于检测在样品中的实施例的这些核酸和多肽的方法。提供了用于在样品中检测本披露的杀昆虫多肽的存在或检测编码本披露的杀昆虫多肽的核苷酸序列的存在
的试剂盒。该试剂盒可以与执行检测预期试剂的方法所必需的所有试剂和对照样品，以及
使用说明书一起提供。

[0023] 实施例的这些组合物和方法可用于产生具有增强的有害生物抗性或耐受性的生物体。这些生物体以及包含这些生物体的组合物对于农业目的是所希望的。实施例的组合
物还可用于产生改变或改进的具有杀有害生物活性的蛋白质，或可用于在产物或生物体中
检测本披露的杀昆虫多肽或编码其的核酸的存在。

[0024] 附图简要说明

[0025] 图1a‑1m示出了以下各项的氨基酸序列比对：PIP‑45Aa‑1(SEQ ID NO：1)、PIP‑45Ab‑1(SEQ ID NO：3)、PIP‑45Ac‑1(SEQ ID NO：5)、PIP‑45Ad‑1(SEQ ID NO：7)、PIP‑45Ae‑
1(SEQ ID NO：9)、PIP‑45Af‑1(SEQ ID NO：11)、PIP‑45Ba‑1(SEQ ID NO：13)、PIP‑45Bb‑1(SEQ ID NO：15)、PIP‑45Bc‑1(SEQ ID NO：17)、PIP‑45Bd‑1(SEQ ID NO：19)、PIP‑45Be‑1(SEQ ID NO：21)、PIP‑45Bf‑1(SEQ ID NO：23)、PIP‑45Bg‑1(SEQ ID NO：25)、PIP‑45Bh‑1(SEQ ID NO：27)、PIP‑45Bi‑1(SEQ ID NO：29)、PIP‑45Bj‑1(SEQ ID NO：31)、PIP‑45Bk‑1(SEQ ID NO：33)、PIP‑45Bl‑1(SEQ ID NO：232)、PIP‑45Bm‑1(SEQ ID NO：234)、PIP‑45Ca‑1(SEQ ID NO：35)、PIP‑45Cb‑1(SEQ ID NO：37)、PIP‑45Cc‑1(SEQ ID NO：39)、PIP‑45Cd‑1(SEQ ID NO：41)、PIP‑45Ce‑1(SEQ ID NO：43)、PIP‑45Cf‑1(SEQ ID NO：236)、PIP‑45Da‑1(SEQ ID NO：45)、PIP‑45Db‑1(SEQ ID NO：47)、PIP‑45Ea‑1(SEQ ID NO：49)、和PIP‑45Ga‑1(SEQ ID NO：51)。PIP‑45‑1多肽同源物之间的氨基酸多样性用阴影表示。

[0026] 图2a‑2l示出了以下各项的氨基酸序列的比对：PIP‑45Aa‑2(SEQ ID NO：2)、PIP‑45Ab‑2(SEQ ID NO：4)、PIP‑45Ac‑2(SEQ ID NO：6)、PIP‑45Ad‑2(SEQ ID NO：8)、PIP‑45Ae‑
2(SEQ ID NO：10)、PIP‑45Af‑2(SEQ ID NO：12)、PIP‑45Ba‑2(SEQ ID NO：14)、PIP‑45Bb‑2(SEQ ID NO：16)、PIP‑45Bc‑2(SEQ ID NO：18)、PIP‑45Bd‑2(SEQ ID NO：20)、PIP‑45Be‑2(SEQ ID NO：22)、PIP‑45Bf‑2(SEQ ID NO：24)、PIP‑45Bg‑2(SEQ ID NO：26)、PIP‑45Bh‑2(SEQ ID NO：28)、PIP‑45Bi‑2(SEQ ID NO：30)、PIP‑45Bj‑2(SEQ ID NO：32)、PIP‑45Bk‑2(SEQ ID NO：34)、PIP‑45Bl‑2(SEQ ID NO：233)、PIP‑45Bm‑2(SEQ ID NO：235)、PIP‑45Ca‑2(SEQ ID NO：36)、PIP‑45Cb‑2(SEQ ID NO：38)、PIP‑45Cc‑2(SEQ ID NO：40)、PIP‑45Cd‑2(SEQ ID NO：42)、PIP‑45Ce‑2(SEQ ID NO：44)、PIP‑45Cf‑2(SEQ ID NO：237)、PIP‑45Da‑2(SEQ ID NO：46)、PIP‑45Db‑2(SEQ ID NO：48)、PIP‑45Ea‑2(SEQ ID NO：50)、和PIP‑45Ga‑2(SEQ ID NO：52)。PIP‑45‑2多肽同源物之间的氨基酸多样性用阴影表示。

[0027] 图3a‑3b示出了以下各项的氨基酸序列的比对：PIP‑64Aa‑1(SEQ ID NO：53)、PIP‑64Ba‑1(SEQ ID NO：238)、PIP‑64Ca‑1(SEQ ID NO：56)、PIP‑64Ea‑1(SEQ ID NO：58)、PIP‑
64Eb‑1(SEQ ID NO：60)、PIP‑64Ec‑1(SEQ ID NO：62)、PIP‑64Ga‑1(SEQ ID NO：64)、PIP‑
64Ha‑1(SEQ ID NO：65)、PIP‑64Hb‑1(SEQ ID NO：67)、PIP‑64Hc‑1(SEQ ID NO：69)、和PIP‑
64Hd‑1(SEQ ID NO：71)。PIP‑64‑1多肽同源物之间的氨基酸多样性用阴影表示。

[0028] 图4a‑4b示出了以下各项的氨基酸序列的比对：PIP‑64Aa‑2(SEQ ID NO：54)、PIP‑64Ab‑2(SEQ ID NO：55)、PIP‑64Ba‑2(SEQ ID NO：239)、PIP‑64Ca‑2(SEQ ID NO：57)、PIP‑
64Ea‑2(SEQ ID NO：59)、PIP‑64Eb‑2(SEQ ID NO：61)、PIP‑64Ec‑2(SEQ ID NO：63)、PIP‑
64Ha‑2(SEQ ID NO：66)、PIP‑64Hb‑2(SEQ ID NO：68)、PIP‑64Hc‑2(SEQ ID NO：70)、和PIP‑
64Hd‑2(SEQ ID NO：72)。PIP‑64‑2多肽同源物之间的氨基酸多样性用阴影表示。

[0029] 图5a‑5b示出了以下各项的氨基酸序列的比对：PIP‑74Aa‑1(SEQ ID NO：73)、PIP‑74Ab‑1(SEQ ID NO：75)、和PIP‑74Ca‑1(SEQ ID NO：77)。PIP‑74‑1多肽同源物之间的氨基酸多样性用阴影表示。

[0030] 图6示出了以下各项的氨基酸序列的比对：PIP‑74Aa‑2(SEQ ID NO：74)、PIP‑74Ab‑2(SEQ ID NO：76)、和PIP‑74Ca‑2(SEQ ID NO：78)。PIP‑74‑2多肽同源物之间的氨基酸多样性用阴影表示。

[0031] 图7示出了以下各项的氨基酸序列的比对：PIP‑75Aa(SEQ ID NO：79)、PIP‑75Ba(SEQ ID NO：80)、PIP‑75Da(SEQ ID NO：81)、PIP‑75Ea(SEQ ID NO：82)、PIP‑75Ga(SEQ ID NO：83)、PIP‑75Gb(SEQ ID NO：84)、PIP‑75Gc(SEQ ID NO：85)、PIP‑75Gd(SEQ ID NO：86)、PIP‑75Ge(SEQ ID NO：87)。PIP‑75多肽同源物之间的氨基酸多样性用阴影表示。

[0032] 图8a‑8b示出了以下各项的氨基酸序列的比对：PIP‑77Aa(SEQ ID NO：88)、PIP‑77Ab(SEQ ID NO：89)、PIP‑77Ac(SEQ ID NO：90)、PIP‑77Ad(SEQ ID NO：91)、PIP‑77Ae(SEQ ID NO：92)、PIP‑77Af(SEQ ID NO：240)、PIP‑77Ba(SEQ ID NO：93)、PIP‑77Bb(SEQ ID NO：
94)、PIP‑77Bc(SEQ ID NO：95)、PIP‑77Bd(SEQ ID NO：96)、PIP‑77Be(SEQ ID NO：97)、PIP‑
77Bf(SEQ ID NO：98)、PIP‑77Bg(SEQ ID NO：99)、PIP‑77Bh(SEQ ID NO：241)、PIP‑77Bi(SEQ ID NO：242)、PIP‑77Ca(SEQ ID NO：100)、PIP‑77Ea(SEQ ID NO：101)、PIP‑77Eb(SEQ ID NO：102)、PIP‑77Ec(SEQ ID NO：103)、PIP‑77Ed(SEQ ID NO：104)、PIP‑77Ee(SEQ ID NO：105)、PIP‑77Ef(SEQ ID NO：106)、PIP‑77Eg(SEQ ID NO：107)、PIP‑77Eh(SEQ ID NO：
243)、PIP‑77Ei(SEQ ID NO：244)、和PIP‑77Ej(SEQ ID NO：245)。PIP‑77多肽同源物之间的氨基酸多样性用阴影表示。

[0033] 发明详细说明

[0034] 应理解，本披露不局限于所描述的特定方法、方案、细胞系、属、以及试剂，因此可以变化。还应当理解的是在此使用的术语是仅为了描述具体实施例的目的，并且不旨在限制本披露的范围。

[0035] 如在此使用的，单数形式“一种(a)”、“一种(an)”以及“该”包括复数个指示物，除非上下文中另外明确指明。因此，例如，提及“细胞”包括多个这样的细胞，并且提及“蛋白质”包括本领域技术人员已知的一种或多种蛋白质及其等效物等。在此所使用的所有技术和科学术语具有与本披露所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义，除非另有明确
说明。

[0036] 本披露涉及用于控制有害生物的组合物和方法。这些方法涉及用编码本披露的杀昆虫多肽的核酸序列转化生物体。特别地，实施例的核酸序列可用于制备具有杀有害生物
活性的植物和微生物。因此，提供了转化的细菌、植物、植物细胞、植物组织以及种子。组合物是细菌物种的杀有害生物核酸和蛋白。这些核酸序列可用于构建表达载体，用于随后转
化到感兴趣的生物体中，作为用于分离其他同源(或部分同源)基因的探针，并且通过本领
域已知的方法(如定位诱变、结构域交换或DNA改组)用于生产改变的杀昆虫多肽。本披露的杀昆虫多肽可用于控制或杀灭鳞翅目、鞘翅目、双翅目、真菌、半翅目和线虫有害生物群体并且可用于生产具有杀有害生物活性的组合物。感兴趣的昆虫有害生物包括但不限于：鳞
翅目物种，这些鳞翅目物种包括但不限于：小菜蛾，例如，玉米穗虫(Helicoverpa zea 
Boddie)；大豆夜蛾，例如，大豆尺夜蛾(Pseudoplusia includens Walker)；和黎豆夜蛾
(velvet bean caterpillar)，例如，梨豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis Hübner)和鞘翅目物种，这些鞘翅目物种包括但不限于西方玉米根虫(玉米根萤叶甲(Diabrotica 
virgifera))‑WCRW、南方玉米根虫(斑点黄瓜甲虫(Diabrotica undecimpunctata 
howardi))‑SCRW和北方玉米根虫(北方玉米根虫(Diabrotica barberi))‑NCRW。

[0037] “杀有害生物毒素”或“杀有害生物蛋白”在此用于是指毒素或与这种蛋白质具有同源性的蛋白质，该毒素具有针对以下一种或多种有害生物的毒性活性，这些有害生物包括但不局限于：鳞翅目、双翅目、半翅目以及鞘翅目或线虫门的成员。已经从生物体中分离出杀有害生物蛋白，这些生物体包括例如，芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)、假单孢菌属物种(Pseudomonas sp.)、发光杆菌属物种(Photorhabdus sp.)、致病杆菌属物种
(Xenorhabdus sp.)、双酶梭菌(Clostridium bifermentans)以及鲍比氏类芽孢杆菌
(Paenibacillus popilliae)。杀有害生物蛋白包括但不限于：来自以下各项的杀昆虫蛋
白：假单孢菌属物种，如PSEEN3174(Monalysin；(2011)PLoS Pathogens 7：1‑13
[Monalysin；(2011)，PLoS病原体，7：1‑13])；假单胞菌(Pseudomonas protegens)菌株CHA0和Pf‑5(之前为荧光假单孢菌(fluorescens))(Pechy‑Tarr，(2008)Environmental 
Microbiology 10：2368‑2386；GenBank Accession No.EU400157[Pechy‑Tarr，(2008)，环境微生物学，10：2368‑2386；GenBank登录号EU400157])；台湾假单孢菌(Pseudomonas 
Taiwanensis)(Liu，et al.，(2010)J.Agric.Food Chem.，58：12343‑12349[Liu等人，
(2010)，农业与食品化学杂志，58：12343‑12349])和假产碱假单孢菌(Pseudomonas 
psendoalcligenes)(Zhang，et al.，(2009)Annals of Microbiology 59：45‑50 and Li，et al.，(2007)Plant Cell Tiss.Organ Cult.89：159‑168[Zhang等人，(2009)，微生物学年鉴，59：45‑50和Li等人，(2007)，植物细胞、组织和器官培养，89：159‑168])；来自发光杆菌属物种(Photorhabdus sp.)和致病杆菌属物种(Xenorhabdus sp.)的杀昆虫蛋白
(Hinchliffe，et al.，(2010)The Open Toxicology Journal，3：101‑118and Morgan，et al.，(2001)Appliedand Envir.Micro.67：2062‑2069[Hinchliffe等人，(2010)，开放的毒理学杂志，3：101‑118和Morgan等人，(2001)，应用与环境微生物学，67：2062‑2069])；美国专利号6,048,838和美国专利号6,379,946；美国专利号US 2014‑0007292 A1的PIP‑1多肽；
美国专利公开号US 2014‑0033361的AfIP‑1A和/或AfIP‑1B多肽；美国序列号13/839702的PHI‑4多肽；PCT序列号PCT/US 14/51063的PIP‑47多肽；美国专利公开US 20140274885或PCT专利公开WO 2014/150914的PHI‑4多肽；PCT序列号PCT/US 14/55128的PIP‑72多肽；美国序列号61/863761和61/863763的杀昆虫蛋白；以及δ‑内毒素，包括但不限于：Cry1、Cry2、Cry3、Cry4、Cry5、Cry6、Cry7、Cry8、Cry9、Cry10、Cry11、Cry12、Cry13、Cry14、Cry15、Cry16、Cry17、Cry18、Cry19、Cry20、Cry21、Cry22、Cry23、Cry24、Cry25、Cry26、Cry27、Cry28、Cry29、Cry30、Cry31、Cry32、Cry33、Cry34、Cry35、Cry36、Cry37、Cry38、Cry39、Cry40、Cry41、Cry42、Cry43、Cry44、Cry45、Cry46、Cry47、Cry49、Cry51、Cry52、Cry53、Cry54、Cry55、Cry56、Cry57、Cry58、Cry59、Cry60、Cry61、Cry62、Cry63、Cry64、Cry65、Cry66、Cry67、Cry68、Cry69、Cry70、Cry71和Cry72类的δ‑内毒素基因和苏云金芽孢杆菌细胞溶解性cyt1和cyt2基因。苏云金芽孢杆菌杀昆虫蛋白的这些类别的成员包括但不限于Cry1Aa1
(登录号AAA22353)；Cry1Aa2(登录号AAA22552)；Cry1Aa3(登录号BAA00257)；Cry1Aa4(登录号CAA31886)；Cry1Aa5(登录号BAA04468)；Cry1Aa6(登录号AAA86265)；Cry1Aa7(登录号
AAD46139)；Cry1Aa8(登录号I26149)；Cry1Aa9(登录号BAA77213)；Cry1Aa10(登录号
AAD55382)；Cry1Aa11(登录号CAA70856)；Cry1Aa12(登录号AAP80146)；Cry1Aa13(登录号
AAM44305)；Cry1Aa14(登录号AAP40639)；Cry1Aa15(登录号AAY66993)；Cry1Aa16(登录号
HQ439776)；Cry1Aa17(登录号HQ439788)；Cry1Aa18(登录号HQ439790)；Cry1Aa19(登录号
HQ685121)；Cry1Aa20(登录号JF340156)；Cry1Aa21(登录号JN651496)；Cry1Aa22(登录号
KC158223)；Cry1Ab1(登录号AAA22330)；Cry1Ab2(登录号AAA22613)；Cry1Ab3(登录号
AAA22561)；Cry1Ab4(登录号BAA00071)；Cry1Ab5(登录号CAA28405)；Cry1Ab6(登录号
AAA22420)；Cry1Ab7(登录号CAA31620)；Cry1Ab8(登录号AAA22551)；Cry1Ab9(登录号
CAA38701)；Cry1Ab10(登录号A29125)；Cry1Ab11(登录号I12419)；Cry1Ab12(登录号
AAC64003)；Cry1Ab13(登录号AAN76494)；Cry1Ab14(登录号AAG16877)；Cry1Ab15(登录号
AAO13302)；Cry1Ab16(登录号AAK55546)；Cry1Ab17(登录号AAT46415)；Cry1Ab18(登录号
AAQ88259)；Cry1Ab19(登录号AAW31761)；Cry1Ab20(登录号ABB72460)；Cry1Ab21(登录号
ABS18384)；Cry1Ab22(登录号ABW87320)；Cry1Ab23(登录号HQ439777)；Cry1Ab24(登录号
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(登录号HQ401006)；Cry69Aa2(登录号JQ821388)；Cry69Ab1(登录号JN209957)；Cry70Aa1
(登录号JN646781)；Cry70Ba1(登录号ADO51070)；Cry70Bb1(登录号EEL67276)；Cry71Aa1
(登录号JX025568)；Cry72Aa1(登录号JX025569)；Cyt1Aa(GenBank登录号X03182)；Cyt1Ab(GenBank登录号X98793)；Cyt1B(GenBank登录号U37196)；Cyt2A(GenBank登录号Z14147)；
和Cyt2B(GenBank登录号U52043)。

[0038] δ‑内毒素的实例还包括但不限于：美国专利号5,880,275和7,858,849的Cry1A蛋白；美国专利号8,304,604、8,304,605和8,476,226的DIG‑3或DIG‑11毒素(cry蛋白(如
Cry1A、Cry3A)的α螺旋1和/或α螺旋2变体的N末端缺失)；美国专利申请序列号10/525,318的Cry1B；美国专利号6,033,874的Cry1C；美国专利号5,188,960和6,218,188的Cry1F；美国专利号7,070,982、6,962,705和6,713,063的Cry1A/F嵌合体；美国专利号7,064,249的Cry2蛋白如Cry2Ab蛋白；Cry3A蛋白，包括但不限于：通过融合至少两种不同Cry蛋白的可变区和保守区的独特组合产生的工程化杂合杀昆虫蛋白(eHIP)(美国专利申请公开号2010/
0017914)；Cry4蛋白；Cry5蛋白；Cry6蛋白；美国专利号7,329,736、7,449,552、7,803,943、
7,476,781、7,105,332、7,378,499和7,462,760的Cry8蛋白；Cry9蛋白如Cry9A、Cry9B、
Cry9C、Cry9D、Cry9E和Cry9F家族的成员；Naimov，et al.，(2008)Applied and 
Environmental Microbiology，74：7145‑7151[Naimov等人，(2008)，应用与环境微生物学，
74：7145‑7151]的Cry15蛋白；美国专利号6,127,180、6,624,145和6,340,593的Cry22、
Cry34Ab1蛋白；美国专利号6,248,535、6,326,351、6,399,330、6,949,626、7,385,107和7,
504,229的CryET33和cryET34蛋白；美国专利公开号2006/0191034、2012/0278954，和PCT公开号WO 2012/139004的CryET33和CryET34同源物；美国专利号6,083,499、6,548,291和6,
340,593的Cry35Ab1蛋白；Cry46蛋白、Cry51蛋白、Cry二元毒素；TIC901或相关毒素；美国专利申请公开号2008/0295207的TIC807；PCT US 2006/033867的ET29、ET37、TIC809、TIC810、TIC812、TIC127、TIC128；美国专利8,513,494的TIC853毒素，美国专利号8,236,757的AXMI‑
027、AXMI‑036、和AXMI‑038；美国专利号7,923,602的AXMI‑031、AXMI‑039、AXMI‑040、AXMI‑
049；WO 2006/083891的AXMI‑018、AXMI‑020和AXMI‑021；WO 2005/038032的AXMI‑010；WO 
2005/021585的AXMI‑003；美国专利申请公开号2004/0250311的AXMI‑008；美国专利申请公开号2004/0216186的AXMI‑006；美国专利申请公开号2004/0210965的AXMI‑007；美国专利申请号2004/0210964的AXMI‑009；美国专利申请公开号2004/0197917的AXMI‑014；美国专利申请公开号2004/0197916的AXMI‑004；WO 2006/119457的AXMI‑028和AXMI‑029；WO 
2004/074462的AXMI‑007、AXMI‑008、AXMI‑0080rf2、AXMI‑009、AXMI‑014和AXMI‑004；美国专利号8,084,416的AXMI‑150；美国专利申请公开号2011/0023184的AXMI‑205；美国专利申请公开号2011/0263488的AXMI‑011、AXMI‑012、AXMI‑013、AXMI‑015、AXMI‑019、AXMI‑044、AXMI‑037、AXMI‑043、AXMI‑033、AXMI‑034、AXMI‑022、AXMI‑023、AXMI‑041、AXMI‑063和AXMI‑064；美国专利申请公开号2010/0197592的AXMI‑R1和相关蛋白；WO 2011/103248的AXMI221Z、AXMI222z、AXMI223z、AXMI224z和AXMI225z；WO 2011/103247的AXMI218、
AXMI219、AXMI220、AXMI226、AXMI227、AXMI228、AXMI229、AXMI230和AXMI231；美国专利号8,
334,431的AXMI‑115、AXMI‑113、AXMI‑005、AXMI‑163和AXMI‑184；美国专利申请公开号
2010/0298211的AXMI‑001、AXMI‑002、AXMI‑030、AXMI‑035和AXMI‑045；美国专利申请公开号2009/0144852的AXMI‑066和AXMI‑076；美国专利号8，318，900的AXMI128、AXMI130、AXMI131、AXMI133、AXMI140、AXMI141、AXMI142、AXMI143、AXMI144、AXMI146、AXMI148、AXMI149、AXMI152、AXMI153、AXMI154、AXMI155、AXMI156、AXMI157、AXMI158、AXMI162、AXMI165、AXMI166、AXMI167、AXMI168、AXMI169、AXMI170、AXMI171、AXMI172、AXMI173、AXMI174、AXMI175、AXMI176、AXMI177、AXMI178、AXMI179、AXMI180、AXMI181、AXMI182、AXMI185、AXMI186、AXMI187、AXMI188、AXMI189；美国专利申请公开号2010/0005543的
AXMI079、AXMI080、AXMI081、AXMI082、AXMI091、AXMI092、AXMI096、AXMI097、AXMI098、AXMI099、AXMI100、AXMI101、AXMI102、AXMI103、AXMI104、AXMI107、AXMI108、AXMI109、AXMI110、AXMI111、AXMI112、AXMI114、AXMI116、AXMI117、AXMI118、AXMI119、AXMI120、AXMI121、AXMI122、AXMI123、AXMI124、AXMI1257、AXMI1268、AXMI127、AXMI129、AXMI164、AXMI151、AXMI161、AXMI183、AXMI132、AXMI138、AXMI137，具有美国专利号8,319,019的修饰的蛋白水解位点的Cry蛋白如Cry1A和Cry3A；美国专利申请公开号2011/0064710的来自苏
芸金芽孢杆菌菌株VBTS 2528的Cry1Ac、Cry2Aa和Cry1Ca毒素蛋白。其他Cry蛋白是本领域
技术人员熟知的(参见，Crickmore，et al.，“Bacillus  thuringiensis  toxin 
nomenclature”(2011)[Crickmore等人，“苏云金芽孢杆菌毒素命名法”(2011)]在
lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/上，其可以使用“www”前缀在万维网上访问)。Cry蛋白的杀昆虫活性是本领域技术人员熟知的(综述参见，van Frannkenhuyzen，(2009)J.Invert.Path.101：1‑16[van Frannkenhuyzen，(2009)，无脊椎动物病理学杂志，
101：1‑16])。使用Cry蛋白作为转基因植物性状是本领域技术人员熟知的，并且Cry转基因植物(包括但不限于表达以下各项的植物：Cry1Ac、Cry1Ac+Cry2Ab、Cry1Ab、Cry1A.105、Cry1F、Cry1Fa2、Cry1F+Cry1Ac、Cry2Ab、Cry3A、mCry3A、Cry3Bb1、Cry34Ab1、Cry35Ab1、Vip3A、mCry3A、Cry9c和CBI‑Bt)已获得法规性审批(参见，Sanahuja，(2011)Plant Biotech Journal9：283‑300and the CERA(2010)GM Crop Database Center for Environmental 
Risk Assessment(CERA)，ILSI Research Foundation，Washington D.C.[Sanahuja，
(2011)，植物生物技术杂志，9：283‑300和CERA，(2010)，环境风险评估的转基因作物数据库中心(CERA)，ILSI研究基金会，华盛顿])。本领域技术人员熟知的多于一种杀有害生物蛋白也可以在植物如Vip3Ab和Cry1Fa(US 2012/0317682)；Cry1BE和Cry1F(US 2012/0311746)；
Cry1CA和Cry1AB(US 2012/0311745)；Cry1F和CryCa(US 2012/0317681)；Cry1DA和Cry1BE
(US 2012/0331590)；Cry1DA和Cry1Fa(US 2012/0331589)；Cry1AB和Cry1BE(US 2012/
0324606)；Cry1Fa和Cry2Aa以及Cry1I和Cry1E(US 2012/0324605)；Cry34Ab/35Ab以及
Cry6Aa(US 20130167269)；Cry34Ab/VCry35Ab和Cry3Aa(US 20130167268)；以及Cry3A和
Cry1Ab或Vip3Aa(US20130116170)中表达。杀有害生物蛋白还包括杀昆虫脂肪酶，这些杀昆虫脂肪酶包括美国专利号7,491,869的脂质酰基水解酶，和胆固醇氧化酶，如来自链霉菌属(Streptomyces)(Purcell et al.(1993)Biochem Biophys Res Commun 15：1406‑1413
[Purcell等人，(1993)，生物化学与生物物理学研究通讯15：1406‑1413])。杀有害生物蛋白还包括美国专利号5,877,012、6,107,2796,137,033、7,244,820、7,615,686、和8,237,020等的VIP(营养期杀昆虫蛋白)毒素。其他VIP蛋白质是本领域技术人员熟知的(参见，
lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html，其可以使用“www”前缀在万维网上访问)。杀有害生物蛋白还包括可从如下生物体获得的毒素复合物(TC)蛋白质：致病杆菌、发光杆菌和类芽孢杆菌(参见，美国专利号7,491,698和8,084,418)。一些TC蛋白具有“独立”杀昆虫活性并且其他TC蛋白增强由相同给定生物体产生的独立毒素的活性。可以通过源自不同属的来源生物体的一种或多种TC蛋白“增效剂”来增强“独立”TC蛋白(例如来自发光杆菌属、致病杆菌属或类芽孢杆菌属)的毒性。有三种主要类型的TC蛋白。如在此所述，A类蛋白(“蛋白A”)是独立的毒素。B类蛋白(“蛋白B”)和C类蛋白(“蛋白C”)提高了A类蛋白的毒性。A类蛋白的实例是TcbA、TcdA、XptA1和XptA2。B类蛋白的实例是TcaC、TcdB、XptB1Xb和XptC1Wi。C类蛋白的实例是TccC、XptC1Xb和XptB1Wi。杀有害生物蛋白还包括蜘蛛、蛇和蝎毒蛋白。蜘蛛肽的实例包括但不限于莱科毒素‑1肽及其突变体(美国专利号8,334,366)。

[0039] 在一些实施例中，本披露的杀昆虫多肽包括从在此披露的全长核酸序列推导出的氨基酸序列和短于全长序列的氨基酸序列，这是由于使用替代的下游起始位点或由于产生
具有杀有害生物活性的较短蛋白质的加工。加工可以在表达该蛋白的生物体内或在摄取蛋
白后的有害生物中发生。

[0040] 因此，在此提供了新颖的分离的或重组的核苷酸序列，这些序列赋予了杀有害生物活性。还提供了本披露的杀有害生物多肽的氨基酸序列。由这些杀昆虫多肽基因的翻译
而产生的蛋白质允许细胞控制或杀灭摄取了该蛋白质的有害生物。

[0041] 核酸分子、及其变体和片段

[0042] 本披露的一方面涉及了分离的或重组的核酸分子，这些核酸分子包含编码本披露的杀昆虫多肽或其生物活性部分的核酸序列；连同足以用作杂交探针来鉴定编码了具有序
列同源性的区域的蛋白质的核酸分子的核酸分子。如在此使用的，术语“核酸分子”是指DNA分子(例如，重组DNA、cDNA、基因组DNA、质粒DNA、线粒体DNA)和RNA分子(例如，mRNA)以及使用核苷酸类似物而产生的DNA或RNA的类似物。该核酸分子可以是单链的或双链的，但优选
地是双链的DNA。

[0043] “分离的”核酸分子(或DNA)在此用于是指不再在其自然环境中的核酸序列(或DNA)，例如体外的。“重组”核酸分子(或DNA)在此用于是指在重组细菌或植物宿主细胞中的核酸序列(或DNA)。在一些实施例中，“分离的”或“重组的”核酸不含有天然地位于在衍生出该核酸的生物体的基因组DNA中的该核酸侧翼的序列(即，位于该核酸的5’和3’末端的序
列)(优选蛋白质编码序列)。出于本披露的目的，“分离的”或“重组的”当用于指核酸分子时不包括分离的染色体。例如，在各种实施例中，编码杀昆虫多肽的重组核酸分子可以包含小于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核酸序列，这些核酸序天然地位于衍生出该核酸的细胞的基因组DNA中的核酸分子的侧翼。

[0044] 在一些实施例中，编码本披露的杀昆虫多肽的分离核酸分子与天然或基因组核酸序列相比具有核酸序列的一个或多个变化。在一些实施例中，天然或基因组核酸序列的变
化包括但不限于：由于遗传密码的简并性造成的核酸序列的变化；与天然或基因组序列相
比，由于氨基酸取代、插入、缺失和/或添加造成的核酸序列的变化；一个或多个内含子的去除；一个或多个上游或下游调节区域的缺失；和与基因组核酸序列相关的5’和/或3’非翻译区域的缺失。在一些实施例中，编码杀昆虫多肽的核酸分子是非基因组序列。

[0045] 本披露涵盖了编码PIP‑45‑1多肽的多核苷酸。考虑了编码PIP‑45‑1多肽的多种多核苷酸。编码PIP‑45‑1多肽或相关蛋白的多核苷酸的一种来源是细菌菌株，该细菌菌株包含分别编码SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：234和SEQ ID NO：236的PIP‑45‑1多肽的SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：
150、SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：220或SEQ ID NO：222的多核苷酸。编码PIP‑45‑1多肽或相关蛋白的多核苷酸的一种来源来自假单孢菌属、Thalassuspira、副球菌属或纤维弧菌属菌株。编码PIP‑45‑1多肽或相关蛋白的多核苷酸的一种来源来自假单孢菌属菌株，该假单孢菌属菌株选自但不限于：布式假单孢菌(Pseudomonas  brenneri)、蒙氏假单孢菌
(Pseudomonas monteilii)、盖氏假单孢菌(Pseudomonas gessardii)、变形假单孢菌
(Pseudomonas plecoglossicida)、恶臭假单孢菌(Pseudomonas putida)、草假单孢菌
(Pseudomonas poae)、平凡假单孢菌(Pseudomonas trivialis)、黎巴嫩假单孢菌
(Pseudomonas libanensis)、荧光假单孢菌(Pseudomonas fluoreseens)和铁角蕨假单孢
菌(Pseudomonas asplenii)。

[0046] 在一些实施例中，编码PIP‑45‑1多肽的核酸分子是非基因组核酸序列。如在此使用的，“非基因组核酸序列”或“非基因组核酸分子”或“非基因组多核苷酸”是指与天然或基因组核酸序列相比，具有核酸序列的一个或多个变化的核酸分子。在一些实施例中，天然或基因组核酸分子的变化包括但不限于：由于遗传密码的简并性造成的核酸序列的变化；用于在植物中表达的核酸序列的密码子优化；与天然或基因组序列相比，将至少一个氨基酸
取代、插入、缺失和/或添加引入的核酸序列的变化；与基因组核酸序列相关的一个或多个内含子的去除；一个或多个异源内含子的插入；与基因组核酸序列相关的一个或多个上游
或下游调节区域的去除；一个或多个异源上游或下游调节区域的插入；与基因组核酸序列
相关的5’和/或3’非翻译区域的缺失；异源5’和/或3’非翻译区域的插入；和聚腺苷酸化位点的修饰。在一些实施例中，非基因组核酸分子是cDNA。在一些实施例中，非基因组核酸分子是合成的核酸序列。

[0047] 在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：234或SEQ ID NO：236的氨基酸序列足够同源并且具有杀昆虫活性的PIP‑45‑1多肽。“足够同源的”在此用于是指使用在此所述的这些比对程序中的一个，使用标准参数，与参比序列相比，具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、
81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、99％或更大序列同源性的氨基酸序列。本领域技术人员将认识到，考虑到氨基酸相似性等，可以适当地调整这些值以确定的蛋白质的相应同源性。如在此使用的，术语“约”，当与序列同一性一起使用时，意指±0.5％。在一些实施例中，序列同源性针对PIP‑
45‑1多肽的全长序列。

[0048] 在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：234或SEQ ID NO：236相比具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、
77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的PIP‑45‑1多肽。

[0049] 在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：1相比具有至少99.1％或更高序列同一性的PIP‑45‑1多肽。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：17相比具有至少99.4％或更高序列同一性的PIP‑45‑1多肽。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：19相比具有至少99.6％或更高序列同一性的PIP‑45‑1多肽。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：21相比具有至少87％或更高序列同一性的PIP‑45‑1多肽。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：23相比具有至少88％或更高序列同一性的PIP‑45‑1多肽。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：27相比具有至少99.1％或更高序列同一性的PIP‑45‑1多肽。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：29相比具有至少
99.8％或更高序列同一性的PIP‑45‑1多肽。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：31相比具有至少92.3％或更高序列同一性的PIP‑45‑1多肽。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：33相比具有至少91.1％或更高序列同一性的PIP‑45‑1多肽。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：35相比具有至少95.4％或更高序列同一性的PIP‑
45‑1多肽。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：39相比具有至少93％或更高序列同一性的PIP‑45‑1多肽。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：43相比具有至少97.5％或更高序列同一性的PIP‑45‑1多肽。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：45相比具有至少70％或更高序列同一性的PIP‑45‑1多肽。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：234相比具有至少94％或更高序列同一性的PIP‑45‑1多肽。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：236相比具有至少96％或更高序列同一性的PIP‑45‑1多肽。

[0050] 本披露涵盖了编码PIP‑45‑2多肽的多核苷酸。考虑了编码PIP‑45‑2多肽的多种多核苷酸。编码PIP‑45‑2多肽或相关蛋白的多核苷酸的一种来源是细菌菌株，该细菌菌株包含分别编码SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：235和SEQ ID NO：237的PIP‑45‑2多肽的SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：
151、SEQ ID NO：153、SEQ ID NO：221或SEQ ID NO：223的多核苷酸。编码PIP‑45‑2多肽或相关蛋白的多核苷酸的一种来源来自假单孢菌属、Thalassuspira、副球菌属或纤维弧菌属菌株。编码PIP‑45‑2多肽或相关蛋白的多核苷酸的一种来源来自假单孢菌属菌株，该假单孢菌属菌株选自但不限于：布式假单孢菌、蒙氏假单孢菌、盖氏假单孢菌、变形假单孢菌、恶臭假单孢菌、草假单孢菌、平凡假单孢菌、黎巴嫩假单孢菌、荧光假单孢菌和铁角蕨假单孢菌。

[0051] 在一些实施例中，编码PIP‑45‑2多肽的核酸分子是非基因组核酸序列。在一些实施例中，非基因组核酸分子是cDNA。在一些实施例中，非基因组核酸分子是合成的核酸序列。

[0052] 在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：235或SEQ ID NO：237的氨基酸序列足够同源并且具有杀昆虫活性的PIP‑45‑2多肽。“足够同源的”在此用于是指使用在此所述的这些比对程序中的一个，使用标准参数，与参比序列相比，具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、
81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、99％或更大序列同源性的氨基酸序列。本领域技术人员将认识到，考虑到氨基酸相似性等，可以适当地调整这些值以确定的蛋白质的相应同源性。在一些实施例中，序列同源性针对PIP‑45‑2多肽的全长序列。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：235或SEQ ID NO：237相比具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、
71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、
86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的PIP‑45‑2多肽。

[0053] 在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：2相比具有至少99.2％或更高序列同一性的PIP‑45‑2多肽。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：18相比具有至少98.5％或更高序列同一性的PIP‑45‑2多肽。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：20相比具有至少96％或更高序列同一性的PIP‑45‑2多肽。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：22相比具有至少80％或更高序列同一性的PIP‑45‑2多肽。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：24相比具有至少81％或更高序列同一性的PIP‑45‑2多肽。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：28相比具有至少99.5％或更高序列同一性的PIP‑45‑2多肽。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：30相比具有至少
98.5％或更高序列同一性的PIP‑45‑2多肽。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：32相比具有至少92％或更高序列同一性的PIP‑45‑2多肽。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：34相比具有至少91.5％或更高序列同一性的PIP‑45‑2多肽。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：36相比具有至少70％或更高序列同一性的PIP‑45‑2多肽。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：40相比具有至少90％或更高序列同一性的PIP‑45‑2多肽。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：44相比具有至少94％或更高序列同一性的PIP‑45‑2多肽。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：46相比具有至少70％或更高序列同一性的PIP‑45‑2多肽。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：235相比具有至少91％或更高序列同一性的PIP‑45‑2多肽。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：237相比具有至少93.5％或更高序列同一性的PIP‑45‑2多肽。

[0054] 本披露涵盖了编码PIP‑64‑1多肽的多核苷酸。考虑了编码PIP‑64‑1多肽的多种多核苷酸。编码PIP‑64‑1多肽或相关蛋白的多核苷酸的一种来源是细菌菌株，该细菌菌株包含编码SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：238的PIP‑64‑1多肽的SEQ ID NO：160、SEQ ID NO：165或SEQ ID NO：224的多核苷酸。编码PIP‑64‑1多肽或相关蛋白的多核苷酸的一种来源来自假单孢菌属、肠杆菌属或产碱菌属菌株。编码PIP‑64‑1多肽或相关蛋白的多核苷酸的一种来源来自假单孢菌属或产碱菌属菌株，该假单孢菌属或产碱菌属菌株选自但不限于：布式假单孢菌、盖氏假单孢菌、荧光假单孢菌、芸苔假单孢菌(Pseudomonas 
brassicacearum)、虫媒假单孢菌、和粪产碱菌。

[0055] 在一些实施例中，编码PIP‑64‑1多肽的核酸分子是非基因组核酸序列。在一些实施例中，非基因组核酸分子是cDNA。在一些实施例中，非基因组核酸分子是合成的核酸序列。

[0056] 在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：238的氨基酸序列足够同源并且具有杀昆虫活性的PIP‑64‑1多肽。“足够同源的”在此用于是指使用在此所述的这些比对程序中的一个，使用标准参数，与参比序列相比，具有至少约
50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、
81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、99％或更大序列同源性的氨基酸序列。本领域技术人员将认识到，考虑到氨基酸相似性等，可以适当地调整这些值以确定的蛋白质的相应同源性。在一些实施例中，序列同源性针对PIP‑64‑1多肽的全长序列。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：238相比具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、71％、
72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、
87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的PIP‑64‑1多肽。

[0057] 在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：53相比具有至少75％或更高序列同一性的PIP‑64‑1多肽。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：58相比具有至少
99.7％或更高序列同一性的PIP‑64‑1多肽。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：238相比具有至少75％或更高序列同一性的PIP‑64‑1多肽。

[0058] 本披露涵盖了编码PIP‑64‑2多肽的多核苷酸。考虑了编码PIP‑64‑2多肽的多种多核苷酸。编码PIP‑64‑2多肽或相关蛋白的多核苷酸的一种来源是细菌菌株，该细菌菌株包含分别编码SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：239的PIP‑64‑2多肽的SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：166或SEQ ID NO：225的多核苷酸。编码PIP‑64‑2多肽或相关蛋白的多核苷酸的一种来源来自假单孢菌属、肠杆菌属或产碱菌属菌株。
编码PIP‑64‑2多肽或相关蛋白的多核苷酸的一种来源来自假单孢菌属或产碱菌属菌株，该假单孢菌属或产碱菌属菌株选自但不限于：布式假单孢菌、盖氏假单孢菌、荧光假单孢菌、芸苔假单孢菌、虫媒假单孢菌、和粪产碱菌。

[0059] 在一些实施例中，编码PIP‑64‑2多肽的核酸分子是非基因组核酸序列。在一些实施例中，非基因组核酸分子是cDNA。在一些实施例中，非基因组核酸分子是合成的核酸序列。

[0060] 在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：59或SEQ ID NO：239的氨基酸序列足够同源并且具有杀昆虫活性的PIP‑64‑2多肽。“足够同源的”在此用于是指使用在此所述的这些比对程序中的一个，使用标准参数，与参比序列相比，具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、
78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同源性的氨基酸序列。本领域技术人员将认识到，考虑到氨基酸相似性等，可以适当地调整这些值以确定的蛋白质的相应同源性。
在一些实施例中，序列同源性针对PIP‑64‑2多肽的全长序列。在一些实施例中，该PIP‑64‑2多肽与SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：59或SEQ ID NO：239相比具有至少约
50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、
81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、99％或更高序列同一性。

[0061] 在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：54相比具有至少70％或更高序列同一性的PIP‑64‑2多肽。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：55相比具有至少
70％或更高序列同一性的PIP‑64‑2多肽。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：
59相比具有至少91％或更高序列同一性的PIP‑64‑2多肽。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：239相比具有至少70％或更高序列同一性的PIP‑64‑2多肽。

[0062] 本披露涵盖了编码PIP‑74‑1多肽的多核苷酸。考虑了编码PIP‑74‑1多肽的多种多核苷酸。编码PIP‑74‑1多肽或相关蛋白的多核苷酸的一种来源是细菌菌株，该细菌菌株包含分别编码SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75和SEQ ID NO：77的PIP‑74‑1多肽的SEQ ID NO：180、SEQ ID NO：182或SEQ ID NO：184的多核苷酸。编码PIP‑74‑1多肽或相关蛋白的多核苷酸的一种来源来自假单孢菌属菌株。编码PIP‑74‑1多肽或相关蛋白的多核苷酸的一种来源来自假单孢菌属菌株，该假单孢菌属菌株选自但不限于：罗氏假单孢菌(Pseudomonas 
rhodesiae)和东方假单孢菌(Pseudomonas orientalis)。

[0063] 在一些实施例中，编码PIP‑74‑1多肽的核酸分子是非基因组核酸序列。在一些实施例中，非基因组核酸分子是cDNA。在一些实施例中，非基因组核酸分子是合成的核酸序列。

[0064] 在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75或SEQ ID NO：77的氨基酸序列足够同源并且具有杀昆虫活性的PIP‑74‑1多肽。“足够同源的”在此用于是指使用在此所述的这些比对程序中的一个，使用标准参数，与参比序列相比，具有至少约
50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、
81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、99％或更大序列同源性的氨基酸序列。本领域技术人员将认识到，考虑到氨基酸相似性等，可以适当地调整这些值以确定的蛋白质的相应同源性。在一些实施例中，序列同源性针对PIP‑74‑1多肽的全长序列。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75或SEQ ID NO：77相比具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、71％、
72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、
87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的PIP‑74‑1多肽。

[0065] 在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：73相比具有至少75％或更高序列同一性的PIP‑74‑1多肽。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：75相比具有至少
75％或更高序列同一性的PIP‑74‑1多肽。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：
77相比具有至少75％或更高序列同一性的PIP‑74‑1多肽。

[0066] 本披露涵盖了编码PIP‑74‑2多肽的多核苷酸。考虑了编码PIP‑74‑2多肽的多种多核苷酸。编码PIP‑74‑2多肽或相关蛋白的多核苷酸的一种来源是细菌菌株，该细菌菌株包含分别编码SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：76和SEQ ID NO：78的PIP‑74‑2多肽的SEQ ID NO：181、SEQ ID NO：183、SEQ ID NO：185的多核苷酸。编码PIP‑74‑2多肽或相关蛋白的多核苷酸的一种来源来自假单孢菌属菌株。PIP‑74‑2多肽或相关蛋白的一种来源来自假单孢菌属菌株，该假单孢菌属菌株选自但不限于：罗氏假单孢菌和东方假单孢菌。

[0067] 在一些实施例中，编码PIP‑74‑2多肽的核酸分子是非基因组核酸序列。在一些实施例中，非基因组核酸分子是cDNA。在一些实施例中，非基因组核酸分子是合成的核酸序列。

[0068] 在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：76或SEQ ID NO：78的氨基酸序列足够同源并且具有杀昆虫活性的PIP‑74‑2多肽。“足够同源的”在此用于是指使用在此所述的这些比对程序中的一个，使用标准参数，与参比序列相比，具有至少约
50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、
81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、99％或更大序列同源性的氨基酸序列。本领域技术人员将认识到，考虑到氨基酸相似性等，可以适当地调整这些值以确定的蛋白质的相应同源性。在一些实施例中，序列同源性针对PIP‑74‑2多肽的全长序列。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：76或SEQ ID NO：78相比具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、71％、
72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、
87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的PIP‑74‑2多肽。

[0069] 在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：74相比具有至少75％或更高序列同一性的PIP‑74‑2多肽。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：76相比具有至少
75％或更高序列同一性的PIP‑74‑2多肽。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：
78相比具有至少75％或更高序列同一性的PIP‑74‑2多肽。

[0070] 本披露涵盖了编码PIP‑75多肽的多核苷酸。考虑了编码PIP‑75多肽的多种多核苷酸。编码PIP‑75多肽或相关蛋白的多核苷酸的一种来源是细菌菌株，该细菌菌株包含编码SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86和SEQ ID NO：87的PIP‑75多肽的SEQ ID NO：186、SEQ ID NO：187、SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：191、SEQ ID NO：192、SEQ ID NO：193或SEQ ID NO：194的多核苷酸。编码PIP‑75多肽或相关蛋白的多核苷酸的一种来源来自假单孢菌属、肠杆菌属或沙雷氏菌属菌株。PIP‑75多肽或相关蛋白的一种来源来自假单孢菌属、肠杆菌属或沙雷氏菌属菌株，该菌株选自但不限于：南极假单孢菌、东方假单孢菌、阿氏肠杆菌、普城沙雷氏菌、和液化沙雷氏菌。

[0071] 在一些实施例中，编码PIP‑75多肽的核酸分子是非基因组核酸序列。在一些实施例中，非基因组核酸分子是cDNA。在一些实施例中，非基因组核酸分子是合成的核酸序列。

[0072] 在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86或SEQ ID NO：87的氨基酸序列足够同源并且具有杀昆虫活性的PIP‑75多肽。“足够同源的”在此用于是指使用在此所述的这些比对程序中的一个，使用标准参数，与参比序列相比，具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、
71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、
86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同源性的氨基酸序列。本领域技术人员将认识到，考虑到氨基酸相似性等，可以适当地调整这些值以确定的蛋白质的相应同源性。在一些实施例中，序列同源性针对PIP‑75多肽的全长序列。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：
81、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86或SEQ ID NO：87相比具有至少约50％、
55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或更高序列同一性的PIP‑75多肽。

[0073] 在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：79相比具有至少75％或更高序列同一性的PIP‑75多肽。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：80相比具有至少
75％或更高序列同一性的PIP‑75多肽。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：81相比具有至少86％或更高序列同一性的PIP‑75多肽。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：84相比具有至少75％或更高序列同一性的PIP‑75多肽。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：85相比具有至少75％或更高序列同一性的PIP‑75多肽。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：86相比具有至少75％或更高序列同一性的PIP‑75多肽。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：87相比具有至少75％或更高序列同一性的PIP‑75多肽。

[0074] 本披露涵盖了编码PIP‑77多肽的多核苷酸。考虑了编码PIP‑77多肽的多种多核苷酸。编码PIP‑77多肽或相关蛋白的多核苷酸的一种来源是细菌菌株，该细菌菌株包含分别编码SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：241、SEQ ID NO：242和SEQ ID NO：245的PIP‑77多肽的SEQ ID NO：195、SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：200、SEQ ID NO：201、SEQ ID NO：202、SEQ ID NO：203、SEQ ID NO：204、SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：207、SEQ ID NO：
227、SEQ ID NO：228或SEQ ID NO：231的多核苷酸。编码PIP‑77多肽或相关蛋白的多核苷酸的一种来源来自假单孢菌属、肠杆菌属、希瓦氏菌属、嗜血杆菌属或气单孢菌属菌株。PIP‑
77多肽或相关蛋白的一种来源来自假单孢菌属菌株，该假单孢菌属菌株选自但不限于：绿
针假单孢菌(Pseudomonas chlororaphis)、芸苔假单孢菌、荧光假单孢菌和罗氏假单孢菌。

[0075] 在一些实施例中，编码PIP‑77多肽的核酸分子是非基因组核酸序列。在一些实施例中，非基因组核酸分子是cDNA。在一些实施例中，非基因组核酸分子是合成的核酸序列。

[0076] 在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：241、SEQ ID NO：242或SEQ ID NO：245的氨基酸序列足够同源并且具有杀昆虫活性的PIP‑77多肽。“足够同源的”在此用于是指使用在此所述的这些比对程序中的一个，使用标准参数，与参比序列相比，具有至少约50％、
55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或更大序列同源性的氨基酸序列。本领域技术人员将认识到，考虑到氨基酸相似性等，可以适当地调整这些值以确定的蛋白质的相应同源性。在一些实施例中，序列同源性针对PIP‑77多肽的全长序列。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：
95、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：241、SEQ ID NO：242或SEQ ID NO：245相比具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、
74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、
89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的PIP‑
77多肽。

[0077] 在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：88相比具有至少93％或更高序列同一性的PIP‑77多肽。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：89相比具有至少
97％或更高序列同一性的PIP‑77多肽。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：90相比具有至少99％或更高序列同一性的PIP‑77多肽。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：92相比具有至少97％或更高序列同一性的PIP‑77多肽。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：93相比具有至少87％或更高序列同一性的PIP‑77多肽。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：94相比具有至少86％或更高序列同一性的PIP‑77多肽。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：95相比具有至少85％或更高序列同一性的PIP‑77多肽。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：96相比具有至少84％或更高序列同一性的PIP‑77多肽。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：97相比具有至少85％或更高序列同一性的PIP‑77多肽。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：98相比具有至少83％或更高序列同一性的PIP‑77多肽。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：100相比具有至少79％或更高序列同一性的PIP‑77多肽。

[0078] 这些多核苷酸序列从假单孢菌属或其他细菌宿主中分离出来，并且因此适用于在其他细菌宿主中表达编码的杀昆虫多肽，这些其他细菌宿主包括但不限于：农杆菌属、芽孢杆菌属、埃希氏杆菌属、沙门氏菌属、假单孢菌属和根瘤菌属细菌宿主细胞。多核苷酸还可用作用于分离编码本披露的杀昆虫多肽或相关蛋白的同源或基本上同源的多核苷酸的探
针。这样的探针可用于鉴定源自假单孢菌属或其他相关细菌的同源或基本上同源的多核苷
酸。

[0079] 编码杀昆虫多肽的多核苷酸也可以从多肽序列中重新合成。多核苷酸基因的序列TM
可以通过使用遗传密码从多肽序列推导出来。计算机程序如“BackTranslate”(GCG 包，
Acclerys公司，圣迭哥，加利福尼亚州)可用于将肽序列转换成编码该肽的相应核苷酸序
列。此外，本披露的合成的多核苷酸序列可以被设计成使得它们在植物中表达。美国专利号
5,500,365描述了用于合成植物基因以改进由所合成的基因编码的蛋白质的表达水平的方
法。该方法涉及对外源转基因的结构基因序列的修饰，使其更有效地由植物转录、加工、翻译和表达。在植物中表达良好的基因的特征包括消除可能在基因转录物的编码区域中引起
不希望的内含子剪接或聚腺苷酸化的序列，同时基本上保留杀昆虫蛋白的有毒部分的氨基
酸序列。美国专利号5,689,052中披露了用于获得单子叶植物中转基因表达增强的相似方
法。

[0080] “互补序列”在此用于是指与给定核酸序列足够互补的核酸序列，使得其可以与给定的核酸序列杂交从而形成稳定的双链体。“多核苷酸序列变体”在此用于是指除了编码相同多肽的遗传密码的简并性之外的核酸序列。

[0081] 在一些实施例中，编码本披露的杀昆虫多肽的核酸分子是非基因组核酸序列。如在此使用的，“非基因组核酸序列”或“非基因组核酸分子”是指与天然或基因组核酸序列相比，具有核酸序列的一个或多个变化的核酸分子。在一些实施例中，天然或基因组核酸分子的变化包括但不限于：由于遗传密码的简并性造成的核酸序列的变化；用于在植物中表达
的核酸序列的密码子优化；与天然或基因组序列相比，将至少一个氨基酸取代、插入、缺失和/或添加引入的核酸序列的变化；与基因组核酸序列相关的一个或多个内含子的去除；一个或多个异源内含子的插入；与基因组核酸序列相关的一个或多个上游或下游调节区域的
去除；一个或多个异源上游或下游调节区域的插入；与基因组核酸序列相关的5’和/或3’非翻译区域的缺失；异源5’和/或3’非翻译区域的插入；和聚腺苷酸化位点的修饰。在一些实施例中，非基因组核酸分子是cDNA。

[0082] 还提供了编码随后被剪接以最终产生功能性杀昆虫多肽的转录和/或翻译产物的核酸分子。剪接可以在体外或体内完成，并且可以涉及顺式或反式剪接。用于剪接的底物可以是多核苷酸(例如，RNA转录物)或多肽。多核苷酸的顺式剪接的实例是其中插入到编码序列中的内含子被去除并且两个侧翼的外显子区域被剪接以产生本披露的杀昆虫多肽编码
序列。反式剪接的实例是其中通过将编码序列分离成两个或更多个片段对多核苷酸进行编
码，这些片段可以单独转录，并且然后剪接形成全长杀有害生物编码序列。可以引入到构建体中的剪接增强子序列的使用可以促进多肽的顺式或反式剪接中的剪接(美国专利号6,
365,377和6,531,316)。因此，在一些实施例中，多核苷酸不直接编码本披露的全长杀昆虫多肽，而是编码本披露的杀昆虫多肽的一个或多个片段。这些多核苷酸可用于通过涉及剪
接的机制来表达本披露的功能性杀昆虫多肽，其中剪接可以在多核苷酸(例如，内含子/外
显子)和/或多肽(例如，内含肽/外显子)的水平上发生。这可以用于，例如，控制杀有害生物活性的表达，因为如果在允许剪接过程以产生功能性产物的环境中表达所有必需的片段，
则仅表达功能性杀有害生物多肽。在另一个实例中，将一个或多个插入序列引入多核苷酸
可促进与低同源多核苷酸的重组；使用插入序列的内含子或内含肽促进去除间插序列，从
而恢复所编码变体的功能。

[0083] 这些实施例还涵盖了作为编码杀昆虫多肽的这些核酸序列的片段的核酸分子。如在此使用的“片段”是指编码本披露的杀昆虫多肽的核酸序列的部分。核酸序列的片段可以编码本披露的杀昆虫多肽的生物活性部分，或者它可以是可以用作使用以下披露的方法的
杂交探针或PCR引物的片段。作为编码本披露的杀昆虫多肽的核酸序列的片段的核酸分子
包含至少约130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250或260个连续核苷酸或高达编码在此所披露的本披露的杀昆虫多肽的全长核酸序列中存在的数量的核苷酸，
这取决于所预期的用途。“连续核苷酸”在此用于时指彼此紧邻的核苷酸残基。实施例的核酸序列的片段将编码保留本披露的杀昆虫多肽的生物活性并因此保留杀昆虫活性的蛋白
片段。“保留杀昆虫活性”在此用于是指具有全长天然多肽的至少约10％、至少约30％、至少约50％、至少约70％、80％、90％、95％或更高的杀昆虫活性。在一个实施例中，该杀昆虫活性是鳞翅目活性。在一个实施例中，该杀昆虫活性针对鞘翅目物种。在一个实施例中，该杀昆虫活性针对叶甲属物种。在一个实施例中，该杀昆虫活性针对玉米根虫复合物的一种或
多种昆虫有害生物：西方玉米根虫，玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera virgifera)；北方玉米根虫(northern corn rootworm，D.barberi)；南方玉米根虫或斑点黄瓜甲虫；斑点黄瓜甲虫，和墨西哥玉米根虫(Mexican corn rootworm，D.virgifera zeae)。在一个实施例中，杀昆虫活性针对西方玉米根虫，玉米根萤叶甲。

[0084] 在一些实施例中，编码本披露的杀昆虫多肽或编码蛋白的生物学活性部分的核酸序列的片段将编码至少约15、20、30、40、50、60、70、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84或85个连续氨基酸或高达这些实施例的全长杀昆虫多肽中存在的总数量的氨基酸。在一些实施
例中，该片段是通过以下各项来自N末端和/或C末端的至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、
12、13、14或更多氨基酸的N末端和/或C末端截短：蛋白水解、起始密码子的插入、编码缺失的氨基酸的密码子的缺失并伴随终止密码子插入，或在编码序列中插入终止密码子。

[0085] 本披露提供编码在此披露的任何杀昆虫多肽的分离或重组多核苷酸。本领域普通技术人员将容易理解，由于遗传密码的简并性，存在编码本披露的杀昆虫多肽的许多核苷
酸序列。表1是提供每个氨基酸的同义密码子的密码子表。例如，密码子AGA、AGG、CGA、CGC、CGG和CGU都编码氨基酸精氨酸。因此，在本披露的核酸的每个位置处，其中精氨酸由密码子指定，密码子可以改变为任何上述相应的密码子而不改变所编码的多肽。应当理解，RNA序列中的U对应于DNA序列中的T。

[0086] 表1

[0087]

[0088] 技术人员将进一步了解，可以通过核酸序列的突变引入变化，从而导致编码的杀昆虫多肽的氨基酸序列的变化，而不改变蛋白质的生物活性。因此，变体核酸分子可以通过以下方式产生：将一个或多个核苷酸取代、添加和/或缺失引入到在此所披露的相应的核酸序列中，这样使得将一个或多个氨基酸取代、添加或缺失引入到所编码的蛋白质中。通过标准技术可以引入突变，如定向诱变和PCR介导的诱变。本披露还涵盖了这样的变体核酸序
列。

[0089] 可替代地，可以通过沿着该编码序列的全部或部分随机地引入突变(如通过饱和诱变)来制备变体核酸序列，并且可以针对赋予杀有害生物活性的能力来筛选得到的突变
体以鉴定保留活性的突变体。在诱变之后，这种经编码的蛋白质可以进行重组地表达，并且这种蛋白质的活性可以使用标准的测定技术来确定。

[0090] 本披露的多核苷酸及其片段任选用作各种重组和递归重组反应的底物，除了例如Ausubel、Berger和Sambrook所述的标准克隆方法之外，即，以产生具有所需性质的另外的杀有害生物多肽同源物及其片段。各种这样的反应是已知的，包括由诸位发明人及其同事
开发的那些反应。用于生产在此列出的任何核酸的变体的方法(这些方法包括将此多核苷
酸与第二(或更多)多核苷酸递归重组，从而形成变体多核苷酸文库)也是本披露的实施例，所产生的文库、包括这些文库的细胞和通过这些方法产生的任何重组多核苷酸也是如此。
另外，这样的方法任选地包括基于杀有害生物活性从这些文库中选择变体多核苷酸，正如
其中这样的递归重组在体外或体内进行。

[0091] 各种多样性产生方案，包括核酸递归重组方案是可获得的并且在本领域中被充分描述。该程序可以单独和/或组合使用以产生核酸或核酸组的一种或多种变体，以及所编码蛋白质的变体。单独地或整体地，这些程序提供了产生多样化核酸和核酸集合(包括例如核酸文库)的稳健且广泛适用的方式，这些方式可用于，例如，具有新的和/或改进的特征的核酸、蛋白质、途径、细胞和/或生物体的工程化或快速进化。

[0092] 虽然在随后的讨论过程中作出明确的区分和分类，但是应当理解，这些技术通常不是相互排斥的。实际上，各种方法可以单独使用或组合、平行或串联使用，以便取得不同的序列变体。

[0093] 在此描述的任何多样性产生程序的结果可以是一种或多种核酸的产生，其可以选择或筛选具有或赋予所需性质的核酸或编码具有或者赋予所需性质的蛋白的核酸。通过本
领域技术人员可以在此或以其他方式获得的一种或多种方法进行多样化之后，可以针对所
需活性或性质，例如，杀有害生物活性或，在所需pH下的这种活性等选择所产生的任何核
酸。这可以包括通过本领域任何测定来鉴定可以例如以自动化或可自动化形式检测的任何
活性，参见例如以下的杀昆虫活性筛选的讨论。各种相关(或甚至不相关)的性质可以由执
业者酌情串联或平行评估。

[0094] 用于产生修饰的核酸序列的各种多样性产生程序的描述，例如编码具有杀有害生物活性的多肽或其片段的那些可以在以下出版物和其中引用的参考文献中找到：Soong，et al.，(2000)Nat Genet 25(4)：436‑439[Soong等人，(2000)，自然遗传学，25(4)：436‑439]；
Stemmer，et al.，(1999)Tumor Targeting 4：1‑4[Stemmer等人，(1999)，肿瘤靶向，4：1‑
4]；Ness，et al.，(1999)Nat Biotechnol 17：893‑896[Ness等人，(1999)，自然生物技术，
17：893‑896]；Chang，et al.，(1999)Nat Biotechnol 17：793‑797[Chang等人，(1999)，自然生物技术，17：793‑797]；Minshull and Stemmer，(1999)Curr Opin Chem Biol 3：284‑
290[Minshull和Stemmer，(1999)，生物化学当代观点，3：284‑290]；Christians，et al.，(1999)Nat Biotechnol 17：259‑264[Christians等人，(1999)，自然生物技术，17：259‑
264]；Crameri，et al.，(1998)Nature 391：288‑291[Crameri等人，(1998)，自然，391：288‑
291]；Crameri，et al.，(1997)Nat Biotechnol 15：436‑438[Crameri等人，(1997)，自然生物技术，15：436‑438]；Zhang，et al.，(1997)PNAS USA 94：4504‑4509[Zhang等人，(1997)，美国国家科学院院刊，94：4504‑4509]；Patten，et al.，(1997)Curr Opin Biotechnol 8：
724‑733[Patten等人，(1997)，当前生物技术的观点，8：724‑733]；Crameri，et al.，(1996)Nat Med 2：100‑103[Crameri等人，(1996)，自然医学，2：100‑103]；Crameri，et al.，(1996)Nat Biotechnol 14：315‑319[Crameri等人，(1996)，自然生物技术，14：315‑319]；
Gates，et al.，(1996)J Mol Biol 255：373‑386[Gates等人，(1996)，分子生物学杂志，
255：373‑386]；Stemmer，(1996)“Sexual PCR and Assembly PCR”In：7he Encyclopedia of Molecular Biology.VCH Publishers，New York.pp.447‑457[Stemmer，(1996)，“有性PCR和装配PCR”，在：分子生物百科全书，VCH出版社，纽约，第447‑457页]；Crameri and Stemmer，(1995)BioTechniques 18：194‑195[Crameri和Stemmer，(1995)，生物技术，18：
194‑195]；Stemmer，et al.，(1995)Gene，164：49‑53[Stemmer等人，(1995)，基因，164：49‑
53]；Stemmer，(1995)Science 270：1510[Stemmer，(1995)，科学，270：1510]；Stemmer，(1995)Bio/Technology 13：549‑553[Stemmer，(1995)，生物/技术，13：549‑553]；Stemmer，(1994)Nature 370：389‑391 and Stemmer，(1994)PNAS USA 91：10747‑10751[Stemmer，(1994)，自然，370：389‑391和Stemmer，(1994)，美国国家科学院院刊，91：10747‑10751]。

[0095] 产生多样性的突变方法包括例如定点诱变(Ling，et  al.，(1997)Anal Biochem254(2)：157‑178[Ling等人，(1997)，分析生物化学，254(2)：157‑178]；Dale，et al.，(1996)Methods Mol Biol 57：369‑374[Dale等人，(1996)，分子生物学方法，57：369‑
374]；Smith，(1985)Ann Rev Genet 19：423‑462[Smith，(1985)，遗传学年评，19：423‑
462]；Botstein and Shortle，(1985)Science 229：1193‑1201[Botstein和Shortle，
(1985)，科学，229：1193‑1201]；Carter，(1986)Biochem J 237：1‑7 and Kunkel，(1987)“The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis”in Nucleic Acids&
Molecular Biology(Eckstein and Lilley，eds.，Springer Verlag，Berlin)[Carter，
(1986)，生物化学杂志，237：1‑7和Kunkel，(1987)，“寡核苷酸定向诱变的效率”，在：核酸与分子生物学(Eckstein和Lilley主编，施普林格出版公司，柏林]))；使用包含模板的尿嘧啶的诱变(Kunkel，(1985)PNAS USA 82：488‑492；Kunkel，et al.，(1987)Methods Enzymol 
154：367‑382 and Bass，et al.，(1988)Science 242：240‑245[Kunkel，(1985)，美国国家科学院院刊，82：488‑492；Kunkel等人，(1987)酶学方法，154：367‑382和Bass等人，(1988)，科学，242：240‑245])；寡核苷酸定向诱变(Zoller and Smith，(1983)Methods Enzymol 
100：468‑500；Zoller and Smith，(1987)Methods .Enzymol 154：329‑350(1987)；Zoller and Smith，(1982)Nucleic Acids Res 10：6487‑6500[Zoller和Smith，(1983)，酶学方法，
100：468‑500；Zoller和Smith，(1987)，酶学方法，154：329‑350(1987)；Zoller和Smith，(1982)，核酸研究，10：6487‑6500])；硫代磷酸酯修饰的DNA诱变(Taylor，et al.，(1985)Nucl Acids Res 13：8749‑8764；Taylor，et al.，(1985)Nucl Acids Res 13：8765‑8787(1985)；Nakamaye and Eckstein，(1986)Nucl Acids Res 14：9679‑9698；Sayers，et al.，(1988)Nucl Acids Res 16：791‑802 and Sayers，et al.，(1988)Nucl Acids Res 16：
803‑814[Taylor等人，(1985)，核酸研究，13：8749‑8764；Taylor等人，(1985)，核酸研究，
13：8765‑8787(1985)；Nakamaye和Eckstein，(1986)，核酸研究，14：9679‑9698；Sayers等人，(1988)，核酸研究，16：791‑802和Sayers等人，(1988)，核酸研究，16：803‑814])；使用有空位的双链DNA的诱变(Kramer，et al.，(1984)Nucl Acids Res 12：9441‑9456；Kramer and Fritz，(1987)Methods Enzymol 154：350‑367；Kramer，et al.，(1988)Nucl Acids Res 16：7207 and Fritz，et al.，(1988)Nucl Acids Res 16：6987‑6999[Kramer等人，(1984)，核酸研究，12：9441‑9456；Kramer和Fritz，(1987)，酶学方法，154：350‑367；Kramer等人，(1988)，核酸研究，16：7207和Fritz等人，(1988)，核酸研究，16：6987‑6999])。

[0096] 另外合适的方法包括点错配修复(Kramer，et al.，(1984)Cell 38：879‑887[Kramer等人，(1984)，细胞，38：879‑887])、使用修复缺陷宿主菌株的诱变(Carter，et al.，(1985)Nucl Acids Res 13：4431‑4443 and Carter，(1987)Methods in Enzymol 
154：382‑403[Carter等人，(1985)，核酸研究，13：4431‑4443和Carter，(1987)，酶学方法，
154：382‑403])、缺失诱变(Eghtedarzadeh and Henikoff，(1986)Nucl Acids Res 14：
5115[Eghtedarzadeh和Henikoff，(1986)，核酸研究，14：5115])、限制性选择和限制性纯化(Wells，et al.，(1986)Phil Trans R Soc Lond A 317：415‑423[Wells等人，(1986)，伦敦皇家学会哲学学报A，317：415‑423])、通过全基因合成的诱变(Nambiar，et al.，(1984)Science 223：1299‑1301；Sakamar and Khorana，(1988)Nucl Acids Res l4：6361‑6372；
Wells，et al.，(1985)Gene 34：315‑323and et al.，(1985)Nucl Acids Res 
13：3305‑3316[Nambiar等人，(1984)，科学，223：1299‑1301；Sakamar和Khorana，(1988)，核酸研究，14：6361‑6372；Wells等人，(1985)，基因，34：315‑323和 等人，
(1985)，核酸研究，13：3305‑3316])、双链断裂修复(Mandecki，(1986)PNAS USA，83：7177‑
7181 and Arnold，(1993)Curr Opin Biotech 4：450‑455[Mandecki，(1986)，美国国家科学院院刊，83：7177‑7181和Arnold，(1993)，当前生物技术的观点，4：450‑455])。许多上述方法的另外的细节可以在酶学方法第154卷中找到，其还描述了用各种诱变方法故障查找
问题的有用对照。

[0097] 关于各种多样性产生方法的另外的细节可以在以下美国专利、PCT公开物和申请和EPO公开物中找到：美国专利号5,723,323、美国专利号5,763,192、美国专利号5,814,
476、美国专利号5,817,483、美国专利号5,824,514、美国专利号5,976,862、美国专利号5,
605,793、美国专利号5,811,238、美国专利号5,830,721、美国专利号5,834,252、美国专利号5,837,458、WO 1995/22625、WO 1996/33207、WO 1997/20078、WO 1997/35966、WO 1999/
41402、WO 1999/41383、WO 1999/41369、WO 1999/41368、EP 752008、EP 0932670、WO 1999/
23107、WO 1999/21979、WO 1998/31837、WO 1998/27230、WO 1998/27230、WO 2000/00632、WO 2000/09679、WO 1998/42832、WO 1999/29902、WO 1998/41653、WO 1998/41622、WO 
1998/42727、WO 2000/18906、WO 2000/04190、WO 2000/42561、WO 2000/42559、WO 2000/
42560、WO 2001/23401和PCT/US 01/06775。

[0098] 实施例的核苷酸序列也可用于从其他生物体分离相应序列，特别是其他细菌，特别是假单孢菌属物种并且更特别是恶臭假单孢菌、黄褐假单孢菌或绿针假单孢菌菌株。以
这种方式，可以使用如PCR、杂交等方法来鉴定这样的序列(基于其与本文所述序列的序列
同源性)。实施例涵盖基于与在此阐明的全部序列或其片段的序列同一性选择的序列。这些序列包含作为披露序列的直向同源物的序列。术语“直向同源物”是指衍生自共同祖先基因并且由于物种形成而在不同物种中发现的基因。当其核苷酸序列和/或其编码的蛋白质序
列共有如本文其他地方所定义的实质同一性时，在不同物种中发现的基因被认为是直向同
源物。直向同源物的功能通常在物种间是高度保守的。

[0099] 在PCR方法中，可以设计寡核苷酸引物用于PCR反应，以从由感兴趣的任何生物体提取的cDNA或基因组DNA扩增相应的DNA序列。用于设计PCR引物以及PCR克隆的方法是本领
域通常已知的并且披露于Sambrook，et al.，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory 
Manual[Sambrook等人，(1989)分子克隆：实验室手册](第2版，冷泉港实验室出版社，普莱恩维尤，纽约州))中，以下为“Sambrook”。还参见，Innis，et al.，eds.(1990)PCR 
Protocols：A Guide to Methods and Applications[Innis等人编辑，(1990)，PCR方案：方法和应用指南](学术出版社，纽约州)：Innis and Gelfand，eds.(1995)PCR Strategies [Innis和Gelfand编辑，(1995)PCR策略](学术出版社，纽约州)；和Innis and Gelfand，
eds.(1999)PCRMethods Manual[Innis和Gelfand编辑，(1999)，PCR方法手册](学术出版
社，纽约州)。已知的PCR方法包括但不限于：使用成对引物、巢式引物、单特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。

[0100] 为了从细菌收集中鉴定潜在的杀昆虫多肽，可以使用蛋白质印迹和/或ELISA方法用针对本披露的杀昆虫多肽产生的抗体筛选细菌细胞裂解物。这种类型的测定可以以高通
量方式进行。可以通过各种技术如基于抗体的蛋白质纯化和鉴定进一步分析阳性样品。产
生抗体的方法是本领域熟知的，如下文所述。

[0101] 可替代地，基于质谱的蛋白质鉴定方法可以使用文献中的方案用于杀昆虫多肽的同源物(Scott Patterson，(1998)，10.22，1‑24，Current Protocol in Molecular 
Biology published by John Wiley&Son Inc[Scott Patterson，(1998)，10.22，1‑24，由约翰&威利父子公司出版的当前分子生物学方案])。具体来说，使用基于LC‑MS/MS的蛋白质鉴定方法将给定细胞裂解物或所需分子量富集样品(从相关分子量带的SDS‑PAGE凝胶切除
的)的MS数据与本披露的杀昆虫多肽的序列信息结合。肽序列中的任何匹配表明在样品中
具有同源物的可能性。可以使用另外技术(蛋白质纯化和分子生物学)来分离蛋白质并鉴定
同源物的序列。

[0102] 在杂交方法中，全部或部分杀有害生物核酸序列可用于筛选cDNA或基因组文库。用于构建此类cDNA和基因组文库的方法是本领域通常已知的，并且披露于Sambrook和
Russell，(2001)，同上。所谓的杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸，并且可以用一个可检测基团(如32P或任何其他可检测的标志物，如其他放射性
同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子)进行标记。用于杂交的探针可以通过标记基于在此披露的编码杀昆虫多肽的核酸序列的合成的寡核苷酸来制备。可以另外使用简并引物，这些
简并引物是基于在该核酸序列或所编码的氨基酸序列中的保守性核苷酸或氨基酸残基而
设计的。这种探针典型地包含以下核酸序列的区域，该核酸序列区域在严格条件下与编码
本披露的杀昆虫多肽的核酸序列或其片段或变体的至少约12个、至少约25个、至少约50、
75、100、125、150、175或200个连续核酸进行杂交。用于制备用于杂交的探针的方法是本领域通常已知的，并且披露于Sambrook和Russell，(2001)，同上，其通过引用结合在此。

[0103] 例如，编码本披露的杀昆虫多肽的在此披露的完整的核酸序列或其一个或多个部分可以用作能够与编码杀昆虫多肽样序列的相应的核酸序列和信使RNA特异性杂交的探
针。为了实现在不同的条件下的特异性杂交，这样的探针包括以下序列，这些序列是独特的并且长度优选为至少约10个核苷酸、或长度为至少约20个核苷酸。此类探针可以用于通过
PCR对来自所选生物体的相应杀有害生物序列进行扩增。可以使用这种技术从所希望的生
物体中分离另外的编码序列，或作为用于确定生物体中存在编码序列的诊断试验。杂交技
术包括杂交筛选电镀DNA文库(斑块或菌落)；参见例如Sambrook，et al.，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual[Sambrook等人，(1989)分子克隆：实验室手册](第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约州)。

[0104] 这样的序列的杂交可以在严格条件下进行。“严格条件”或“严格杂交条件”在此用于是指探针与其靶序列杂交的程度将比它与其他序列杂交的程度可检测地更高(例如，比背景高至少2倍)的条件。严格条件是序列依赖性的，并且在不同情况下将有所不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定与该探针100％互补的靶序列(同源探测)。可替
代地，也能够调整严格条件以允许序列中的某些错配，以便检测到更低程度的相似性(异源探测)。通常，探针的长度为小于约1000个核苷酸，优选地长度小于500个核苷酸。

[0105] 典型地，严格条件将是以下条件，在这些条件下该盐浓度在pH 7.0至8.3下是小于约1.5M Na离子、典型地约0.01至1.0M Na离子浓度(或其他盐类)，并且温度对于短探针(例如，10至50个核苷酸)为至少约30℃，而对于长探针(例如，超过50个核苷酸)为至少约60℃。
通过添加去稳定试剂(例如，甲酰胺)也可以实现严格的条件。示例性低严格性条件包括在
37℃下使用30％至35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液进行杂交，并且在50℃至55℃下在1×至2×SSC(20×SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中洗涤。示例
性中严格条件包括在37℃下在40％至45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中进行杂交，并且在
55℃至60℃下在0.5×至1×SSC中洗涤。示例性高严格条件包括在37℃下在50％甲酰胺、1M 
NaCl、1％SDS中杂交，并且在60℃至65℃下在0.1×SSC中洗涤。可任选的是，洗涤缓冲液可以包含约0.1％至大约1％SDS。杂交持续时间通常小于约24小时，通常为约4至约12小时。

[0106] 特异性典型地取决于杂交后洗涤的功能，关键因素是最终洗涤溶液的离子强度以及温度。对于DNA‑DNA杂交物，Tm可以从Meinkoth and Wahl，(1984)Anal.Biochem.138：
267‑284[Meinkoth和Wahl，(1984)，分析生物化学，138：267‑284]的等式中进行估计：Tm＝
81.5℃.+16.6(log M)+0.41(％GC)‑0.61(％form)‑500/L；其中M是一价阳离子的摩尔浓
度，％GC是在DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form是在杂交溶液中甲酰胺的百分
比，并且L是以碱基对计的杂交体的长度。Tm是温度(在定义的离子强度以及pH下)，在该温度下50％的互补靶序列杂交到完全配对的探针上。对于每1％的错配，Tm降低约1℃；因此，可调整Tm、杂交和/或洗涤条件以与所期需同一性的序列杂交。例如，如果查找具有≥90％同一性的序列，该Tm可以降低10℃。通常选择严格条件为在限定离子强度和pH下低于特定
序列及其互补序列的热熔点Tm约5℃。然而，极严格条件能够在比热熔点(Tm)低1℃、2℃、3℃或4℃下杂交和/或洗涤；中严格条件能够在比热熔点(Tm)低6℃、7℃、8℃、9℃或10℃下杂交和/或洗涤；低严格条件能够在比热熔点(Tm)低11℃、12℃、13℃、14℃、15℃或20℃下杂交和/或洗涤。使用方程式、杂交和洗涤组合物以及所需的Tm，本领域普通技术人员将理解，本质上描述了杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化。如果所希望的错配程度导致Tm小于
45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则优选增加SSC浓度以使得可使用较高温度。对核酸杂交的全面指导见于以下文献：Tijssen，(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology‑Hybridization with Nucleic Acid Probes，Part I，Chapter 2 (Elsevier，N.Y.)[Tijssen，(1993)，生物化学与分子生物学技术，与核酸探针的杂交，第2章第1部分，(Elsevier，纽约)]；以及Ausubel，et al.，eds.(1995)Current Protocols in Molecular Biology，Chapter 2[Ausubel等人编辑，(1995)，分子生物学当前方案，第2章](格林出版和韦利科学公司，纽约)。参见Sambrook，et al.，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual[Sambrook等人，(1989)，分子克隆：实验室手册](第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)。

[0107] 蛋白质及其变体和片段

[0108] 本披露的一方面是分离的杀昆虫多肽。

[0109] 本披露涵盖了PIP‑45‑1多肽。如在此使用的“假单孢菌属杀昆虫蛋白‑45‑1”、“PIP‑45‑1多肽”或“PIP‑45‑1蛋白”互换地是指对鳞翅目和/或鞘翅目的一种或多种昆虫有害生物具有杀昆虫活性的多肽，并且与SEQ ID NO：1的蛋白质足够同源。考虑了多种PIP‑45‑1多肽。PIP‑45‑1多肽或相关蛋白的一种来源是细菌菌株，该细菌菌株包含分别编码SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：234和SEQ ID NO：236的PIP‑45‑1多肽的SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：
124、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：150、SEQ ID NO：
152、SEQ ID NO：220或SEQ ID NO：222的多核苷酸。PIP‑45‑1多肽或相关蛋白的一种来源来自假单孢菌属、Thalassuspira、副球菌属或纤维弧菌属菌株。PIP‑45‑1多肽或相关蛋白的一种来源来自假单孢菌属菌株，该假单孢菌属菌株选自但不限于：布式假单孢菌、蒙氏假单孢菌、盖氏假单孢菌、变形假单孢菌、恶臭假单孢菌、草假单孢菌、平凡假单孢菌、黎巴嫩假单孢菌、荧光假单孢菌和铁角蕨假单孢菌。

[0110] 在一些实施例中，PIP‑45‑1多肽是与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：234或SEQ ID NO：236的氨基酸序列足够同源并且具有杀昆虫活性。“足够同源的”在此用于是指使用在此所述的这些比对程序中的一个，使用标准参数，与参比序列相比，具有至少约50％、55％、
60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或更大序列同源性的氨基酸序列。本领域技术人员将认识到，考虑到氨基酸相似性等，可以适当地调整这些值以确定的蛋白质的相应同源性。在一些实施例中，序列同源性针对PIP‑45‑1多肽的全长序列。

[0111] 在一些实施例中，该PIP‑45‑1多肽与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：234或SEQ ID NO：236相比具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、
77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性。

[0112] 在一些实施例中，该PIP‑45‑1多肽与SEQ ID NO：1相比具有至少99.1％或更高序列同一性。在一些实施例中，该PIP‑45‑1多肽与SEQ ID NO：17相比具有至少99.4％或更高序列同一性。在一些实施例中，该PIP‑45‑1多肽与SEQ ID NO：19相比具有至少99.6％或更高序列同一性。在一些实施例中，该PIP‑45‑1多肽与SEQ ID NO：21相比具有至少87％或更高序列同一性。在一些实施例中，该PIP‑45‑1多肽与SEQ ID NO：23相比具有至少88％或更高序列同一性。在一些实施例中，该PIP‑45‑1多肽与SEQ ID NO：27相比具有至少99.1％或更高序列同一性。在一些实施例中，该PIP‑45‑1多肽与SEQ ID NO：29相比具有至少99.8％或更高序列同一性。在一些实施例中，该PIP‑45‑1多肽与SEQ ID NO：31相比具有至少92.3％或更高序列同一性。在一些实施例中，该PIP‑45‑1多肽与SEQ ID NO：33相比具有至少91.1％或更高序列同一性。在一些实施例中，该PIP‑45‑1多肽与SEQ ID NO：35相比具有至少95.4％或更高序列同一性。在一些实施例中，该PIP‑45‑1多肽与SEQ ID NO：39相比具有至少93％或更高序列同一性。在一些实施例中，该PIP‑45‑1多肽与SEQ ID NO：43相比具有至少97.5％或更高序列同一性。在一些实施例中，该PIP‑45‑1多肽与SEQ ID NO：45相比具有至少70％或更高序列同一性。

[0113] 本披露涵盖了PIP‑45‑2多肽。如在此使用的“假单孢菌属杀昆虫蛋白‑45‑2”、“PIP‑45‑2多肽”或“PIP‑45‑2蛋白”互换地是指对鳞翅目和/或鞘翅目的一种或多种昆虫有害生物具有杀昆虫活性的多肽，并且与SEQ ID NO：2的蛋白质足够同源。考虑了多种PIP‑45‑2多肽。PIP‑45‑2多肽或相关蛋白的一种来源是细菌菌株，该细菌菌株包含分别编码SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：235和SEQ ID NO：237的PIP‑45‑2多肽的SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：
125、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：151、SEQ ID NO：
153、SEQ ID NO：221或SEQ ID NO：223的多核苷酸。PIP‑45‑2多肽或相关蛋白的一种来源来自假单孢菌属、Thalassuspira、副球菌属或纤维弧菌属菌株。PIP‑45‑2多肽或相关蛋白的一种来源来自假单孢菌属菌株，该假单孢菌属菌株选自但不限于：布式假单孢菌、蒙氏假单孢菌、盖氏假单孢菌、变形假单孢菌、恶臭假单孢菌、草假单孢菌、平凡假单孢菌、黎巴嫩假单孢菌、荧光假单孢菌和铁角蕨假单孢菌。

[0114] 在一些实施例中，PIP‑45‑2多肽是与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：235或SEQ ID NO：237的氨基酸序列足够同源并且具有杀昆虫活性。“足够同源的”在此用于是指使用在此所述的这些比对程序中的一个，使用标准参数，与参比序列相比，具有至少约50％、55％、
60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或更大序列同源性的氨基酸序列。本领域技术人员将认识到，考虑到氨基酸相似性等，可以适当地调整这些值以确定的蛋白质的相应同源性。在一些实施例中，序列同源性针对PIP‑45‑2多肽的全长序列。在一些实施例中，该PIP‑45‑2多肽与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：235或SEQ ID NO：237相比具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、
74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、
89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性。

[0115] 在一些实施例中，该PIP‑45‑2多肽与SEQ ID NO：2相比具有至少99.2％或更高序列同一性。在一些实施例中，该PIP‑45‑2多肽与SEQ ID NO：18相比具有至少98.5％或更高序列同一性。在一些实施例中，该PIP‑45‑2多肽与SEQ ID NO：20相比具有至少96％或更高序列同一性。在一些实施例中，该PIP‑45‑2多肽与SEQ ID NO：22相比具有至少80％或更高序列同一性。在一些实施例中，该PIP‑45‑2多肽与SEQ ID NO：24相比具有至少81％或更高序列同一性。在一些实施例中，该PIP‑45‑2多肽与SEQ ID NO：28相比具有至少99.5％或更高序列同一性。在一些实施例中，该PIP‑45‑2多肽与SEQ ID NO：30相比具有至少98.5％或更高序列同一性。在一些实施例中，该PIP‑45‑2多肽与SEQ ID NO：32相比具有至少92％或更高序列同一性。在一些实施例中，该PIP‑45‑2多肽与SEQ ID NO：34相比具有至少91.5％或更高序列同一性。在一些实施例中，该PIP‑45‑2多肽与SEQ ID NO：36相比具有至少70％或更高序列同一性。在一些实施例中，该PIP‑45‑2多肽与SEQ ID NO：40相比具有至少90％或更高序列同一性。在一些实施例中，该PIP‑45‑2多肽与SEQ ID NO：44相比具有至少94％或更高序列同一性。在一些实施例中，该PIP‑45‑2多肽与SEQ ID NO：46相比具有至少70％或更高序列同一性。

[0116] 本披露涵盖了PIP‑64‑1多肽。如在此使用的“假单孢菌属杀昆虫蛋白‑64‑1”、“PIP‑64‑1多肽”或“PIP‑64‑1蛋白”互换地是指对鳞翅目和/或鞘翅目的一种或多种昆虫有害生物具有杀昆虫活性的多肽，并且与SEQ ID NO：53的蛋白质足够同源。考虑了多种PIP‑64‑1多肽。PIP‑64‑1多肽或相关蛋白的一种来源是细菌菌株，该细菌菌株包含编码SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：238的PIP‑64‑1多肽的SEQ ID NO：160、SEQ ID NO：165或SEQ ID NO：224的多核苷酸。PIP‑64‑1多肽或相关蛋白的一种来源来自假单孢菌属、肠杆菌属或产碱菌属菌株。PIP‑64‑1多肽或相关蛋白的一种来源来自假单孢菌属或产碱菌属菌株，该假单孢菌属或产碱菌属菌株选自但不限于：布式假单孢菌、盖氏假单孢菌、荧光假单孢菌、芸苔假单孢菌、虫媒假单孢菌、和粪产碱菌。

[0117] 在一些实施例中，PIP‑64‑1多肽与SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：238的氨基酸序列足够同源并且具有杀昆虫活性。“足够同源的”在此用于是指使用在此所述的这些比对程序中的一个，使用标准参数，与参比序列相比，具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、
84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、
99％或更大序列同源性的氨基酸序列。本领域技术人员将认识到，考虑到氨基酸相似性等，可以适当地调整这些值以确定的蛋白质的相应同源性。在一些实施例中，序列同源性针对
PIP‑64‑1多肽的全长序列。在一些实施例中，该PIP‑64‑1多肽与SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：
58或SEQ ID NO：238相比具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、
75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性。

[0118] 在一些实施例中，该PIP‑64‑1多肽与SEQ ID NO：53相比具有至少75％或更高序列同一性。在一些实施例中，该PIP‑64‑1多肽与SEQ ID NO：58相比具有至少99.7％或更高序列同一性。在一些实施例中，该PIP‑64‑1多肽与SEQ ID NO：238相比具有至少75％或更高序列同一性。

[0119] 本披露涵盖了PIP‑64‑2多肽。如在此使用的“假单孢菌属杀昆虫蛋白‑64‑2”、“PIP‑64‑2多肽”或“PIP‑64‑2蛋白”互换地是指对鳞翅目和/或鞘翅目的一种或多种昆虫有害生物具有杀昆虫活性的多肽，并且与SEQ ID NO：54的蛋白质足够同源。考虑了多种PIP‑64‑2多肽。PIP‑64‑2多肽或相关蛋白的一种来源是细菌菌株，该细菌菌株包含分别编码SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：239的PIP‑64‑2多肽的SEQ ID NO：
161、SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：166或SEQ ID NO：225的多核苷酸。PIP‑64‑2多肽或相关蛋白的一种来源来自假单孢菌属、肠杆菌属或产碱菌属菌株。PIP‑64‑2多肽或相关蛋白的一种来源来自假单孢菌属或产碱菌属菌株，该假单孢菌属或产碱菌属菌株选自但不限于：布
式假单孢菌、盖氏假单孢菌、荧光假单孢菌、芸苔假单孢菌、虫媒假单孢菌、和粪产碱菌。

[0120] 在一些实施例中，PIP‑64‑2多肽与SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：59或SEQ ID NO：239的氨基酸序列足够同源并且具有杀昆虫活性。“足够同源的”在此用于是指使用在此所述的这些比对程序中的一个，使用标准参数，与参比序列相比，具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、
81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、99％或更大序列同源性的氨基酸序列。本领域技术人员将认识到，考虑到氨基酸相似性等，可以适当地调整这些值以确定的蛋白质的相应同源性。在一些实施例中，序列同源性针对PIP‑64‑2多肽的全长序列。在一些实施例中，该PIP‑64‑2多肽与SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：59或SEQ ID NO：239相比具有至少约50％、55％、60％、
65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、
84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、
99％或更高序列同一性。

[0121] 在一些实施例中，该PIP‑64‑2多肽与SEQ ID NO：54相比具有至少70％或更高序列同一性。在一些实施例中，该PIP‑64‑2多肽与SEQ ID NO：55相比具有至少70％或更高序列同一性。在一些实施例中，该PIP‑64‑2多肽与SEQ ID NO：59相比具有至少91％或更高序列同一性。在一些实施例中，该PIP‑64‑2多肽与SEQ ID NO：239相比具有至少70％或更高序列同一性。

[0122] 本披露涵盖了PIP‑74‑1多肽。如在此使用的“假单孢菌属杀昆虫蛋白‑74‑1”、“PIP‑74‑1多肽”或“PIP‑74‑1蛋白”互换地是指对鳞翅目和/或鞘翅目的一种或多种昆虫有害生物具有杀昆虫活性的多肽，并且与SEQ ID NO：73的蛋白质足够同源。考虑了多种PIP‑74‑1多肽。PIP‑74‑1多肽或相关蛋白的一种来源是细菌菌株，该细菌菌株包含分别编码SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75和SEQ ID NO：77的PIP‑74‑1多肽的SEQ ID NO：180、SEQ ID NO：
182或SEQ ID NO：184的多核苷酸。PIP‑74‑1多肽或相关蛋白的一种来源来自假单孢菌属菌株。PIP‑74‑1多肽或相关蛋白的一种来源来自假单孢菌属菌株，该假单孢菌属菌株选自但不限于：罗氏假单孢菌和东方假单孢菌。

[0123] 在一些实施例中，PIP‑74‑1多肽与SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75或SEQ ID NO：77的氨基酸序列足够同源并且具有杀昆虫活性。“足够同源的”在此用于是指使用在此所述的这些比对程序中的一个，使用标准参数，与参比序列相比，具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、
84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、
99％或更大序列同源性的氨基酸序列。本领域技术人员将认识到，考虑到氨基酸相似性等，可以适当地调整这些值以确定的蛋白质的相应同源性。在一些实施例中，序列同源性针对
PIP‑74‑1多肽的全长序列。在一些实施例中，该PIP‑74‑1多肽与SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：
75或SEQ ID NO：77相比具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、
75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性。

[0124] 在一些实施例中，该PIP‑74‑1多肽与SEQ ID NO：73相比具有至少75％或更高序列同一性。在一些实施例中，该PIP‑74‑1多肽与SEQ ID NO：75相比具有至少75％或更高序列同一性。在一些实施例中，该PIP‑74‑1多肽与SEQ ID NO：77相比具有至少75％或更高序列同一性。

[0125] 本披露涵盖了PIP‑74‑2多肽。如在此使用的“假单孢菌属杀昆虫蛋白‑74‑2”、“PIP‑74‑2多肽”或“PIP‑74‑2蛋白”互换地是指对鳞翅目和/或鞘翅目的一种或多种昆虫有害生物具有杀昆虫活性的多肽，并且与SEQ ID NO：74的蛋白质足够同源。考虑了多种PIP‑74‑2多肽。PIP‑74‑2多肽或相关蛋白的一种来源是细菌菌株，该细菌菌株包含分别编码SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：76和SEQ ID NO：78的PIP‑74‑2多肽的SEQ ID NO：181、SEQ ID NO：
183、SEQ ID NO：185的多核苷酸。PIP‑74‑2多肽或相关蛋白的一种来源来自假单孢菌属菌株。PIP‑74‑2多肽或相关蛋白的一种来源来自假单孢菌属菌株，该假单孢菌属菌株选自但不限于：罗氏假单孢菌和东方假单孢菌。

[0126] 在一些实施例中，PIP‑74‑2多肽与SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：76或SEQ ID NO：78的氨基酸序列足够同源并且具有杀昆虫活性。“足够同源的”在此用于是指使用在此所述的这些比对程序中的一个，使用标准参数，与参比序列相比，具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、
84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、
99％或更大序列同源性的氨基酸序列。本领域技术人员将认识到，考虑到氨基酸相似性等，可以适当地调整这些值以确定的蛋白质的相应同源性。在一些实施例中，序列同源性针对
PIP‑74‑2多肽的全长序列。在一些实施例中，该PIP‑74‑2多肽与SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：
76或SEQ ID NO：78相比具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、
75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性。

[0127] 在一些实施例中，该PIP‑74‑2多肽与SEQ ID NO：74相比具有至少75％或更高序列同一性。在一些实施例中，该PIP‑74‑2多肽与SEQ ID NO：76相比具有至少75％或更高序列同一性。在一些实施例中，该PIP‑74‑2多肽与SEQ ID NO：78相比具有至少75％或更高序列同一性。

[0128] 本披露涵盖了PIP‑75多肽。如在此使用的“假单孢菌属杀昆虫蛋白‑75”、“PIP‑75多肽”或“PIP‑75蛋白”互换地是指对鳞翅目和/或鞘翅目的一种或多种昆虫有害生物具有杀昆虫活性的多肽，并且与SEQ ID NO：79的蛋白质足够同源。考虑了多种PIP‑75多肽。PIP‑75多肽或相关蛋白的一种来源是细菌菌株，该细菌菌株包含分别编码SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86和SEQ ID NO：87的PIP‑75多肽的SEQ ID NO：186、SEQ ID NO：187、SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：191、SEQ ID NO：192、SEQ ID NO：193或SEQ ID NO：194的多核苷酸。PIP‑75多肽或相关蛋白的一种来源来自假单孢菌属、肠杆菌属或沙雷氏菌属菌株。PIP‑75多肽或相关蛋白的一种来源来自假单孢菌属、肠杆菌属或沙雷氏菌属菌株，该菌株选自但不限于：南极假单孢菌、东方假单孢菌、阿氏肠杆菌、普城沙雷氏菌、和液化沙雷氏菌。

[0129] 在一些实施例中，PIP‑75多肽与SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86或SEQ ID NO：87的氨基酸序列足够同源并且具有杀昆虫活性。“足够同源的”在此用于是指使用在此所述的这些比对程序中的一个，使用标准参数，与参比序列相比，具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同源性的氨基酸序列。本领域技术人员将认识到，考虑到氨基酸相似性等，可以适当地调整这些值以确定的蛋白质的相应同源性。在一些实施例中，序列同源性针对PIP‑75多肽的全长序列。在一些实施例中，该PIP‑75多肽与SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86或SEQ ID NO：87相比具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、71％、
72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、
87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性。

[0130] 在一些实施例中，该PIP‑75多肽与SEQ ID NO：79相比具有至少75％或更高序列同一性。在一些实施例中，该PIP‑75多肽与SEQ ID NO：80相比具有至少75％或更高序列同一性。在一些实施例中，该PIP‑75多肽与SEQ ID NO：81相比具有至少86％或更高序列同一性。在一些实施例中，该PIP‑75多肽与SEQ ID NO：84相比具有至少75％或更高序列同一性。在一些实施例中，该PIP‑75多肽与SEQ ID NO：85相比具有至少75％或更高序列同一性。在一些实施例中，该PIP‑75多肽与SEQ ID NO：86相比具有至少75％或更高序列同一性。在一些实施例中，该PIP‑75多肽与SEQ ID NO：87相比具有至少75％或更高序列同一性。

[0131] 本披露涵盖了PIP‑77多肽。如在此使用的“假单孢菌属杀昆虫蛋白‑77”、“PIP‑77多肽”或“PIP‑77蛋白”互换地是指对鳞翅目和/或鞘翅目的一种或多种昆虫有害生物具有杀昆虫活性的多肽，并且与SEQ ID NO：88的蛋白质足够同源。考虑了多种PIP‑77多肽。PIP‑77多肽或相关蛋白的一种来源是细菌菌株，该细菌菌株包含分别编码SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：241、SEQ ID NO：242和SEQ ID NO：245的PIP‑77多肽的SEQ ID NO：195、SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：200、SEQ ID NO：201、SEQ ID NO：202、SEQ ID NO：203、SEQ ID NO：204、SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：207、SEQ ID NO：227、SEQ ID NO：228或SEQ ID NO：231的多核苷酸。PIP‑77多肽或相关蛋白的一种来源来自假单孢菌属、肠杆菌属、希瓦氏菌属、嗜血杆菌属或气单孢菌属菌株。PIP‑77多肽或相关蛋白的一种来源来自假单孢菌属菌株，该假单孢菌属菌株选自但不限于：绿针假单孢菌、芸苔假单孢菌、荧光假单孢菌和罗氏假单孢菌。

[0132] 在一些实施例中，PIP‑77多肽是与SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：241、SEQ ID NO：242或SEQ ID NO：245的氨基酸序列足够同源并且具有杀昆虫活性。“足够同源的”在此用于是指使用在此所述的这些比对程序中的一个，使用标准参数，与参比序列相比，具有至少约50％、55％、60％、65％、
70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同源性的氨基酸序列。本领域技术人员将认识到，考虑到氨基酸相似性等，可以适当地调整这些值以确定的蛋白质的相应同源性。在一些实施例中，序列同源性针对PIP‑77多肽的全长序列。在一些实施例中，该PIP‑77多肽与SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：241、SEQ ID NO：242或SEQ ID NO：245相比具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、
79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、
94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性。

[0133] 在一些实施例中，该PIP‑77多肽与SEQ ID NO：88相比具有至少93％或更高序列同一性。在一些实施例中，该PIP‑77多肽与SEQ ID NO：89相比具有至少97％或更高序列同一性。在一些实施例中，该PIP‑77多肽与SEQ ID NO：90相比具有至少99％或更高序列同一性。在一些实施例中，该PIP‑77多肽与SEQ ID NO：92相比具有至少97％或更高序列同一性。在一些实施例中，该PIP‑77多肽与SEQ ID NO：93相比具有至少87％或更高序列同一性。在一些实施例中，该PIP‑77多肽与SEQ ID NO：94相比具有至少86％或更高序列同一性。在一些实施例中，该PIP‑77多肽与SEQ ID NO：95相比具有至少85％或更高序列同一性。在一些实施例中，该PIP‑77多肽与SEQ ID NO：96相比具有至少84％或更高序列同一性。在一些实施例中，该PIP‑77多肽与SEQ ID NO：97相比具有至少85％或更高序列同一性。在一些实施例中，该PIP‑77多肽与SEQ ID NO：98相比具有至少83％或更高序列同一性。在一些实施例中，该PIP‑77多肽与SEQ ID NO：100相比具有至少80％或更高序列同一性。在一些实施例中，该PIP‑77多肽与SEQ ID NO：241相比具有至少85％或更高序列同一性。在一些实施例中，该PIP‑77多肽与SEQ ID NO：242相比具有至少83％或更高序列同一性。在一些实施例中，该PIP‑77多肽与SEQ ID NO：245相比具有至少96％或更高序列同一性。

[0134] 如在此使用的，术语“蛋白质”、“肽分子”、或“多肽”包括包含五个或更多个氨基酸的任何分子。本领域熟知蛋白质、肽或多肽分子可以进行修饰，该修饰包括翻译后修饰，如但不限于二硫键形成、糖基化、磷酸化或寡聚化。因此，如在此使用的，术语“蛋白质”、“肽分子”或“多肽”包括通过任何生物或非生物过程修饰的任何蛋白质。术语“氨基酸”是指所有天然存在的L‑氨基酸。

[0135] 在一些实施例中，PIP‑45‑1多肽具有在约40kDa和约80kDa之间、在约50kDa和约70kDa之间、在约60kDa和约65kDa之间、在约61kDa和约64kDa之间、在约62kDa和约63kDa之间、以及在约62.25kDa和约62.75kDa之间的所计算的分子量。如在此使用的，在杀昆虫多肽的分子量的上下文中所使用的术语“约”意指±0.25千道尔顿。

[0136] 在一些实施例中，PIP‑45‑2多肽具有在约40kDa和约80kDa之间、在约50kDa和约64kDa之间、在约55kDa和约60kDa之间、在约56.5kDa和约59kDa之间、以及在约57.25kDa和约58kDa之间的所计算的分子量。

[0137] 在一些实施例中，PIP‑64‑1多肽具有在约20kDa和约40kDa之间、在约25kDa和约32kDa之间、在约26kDa和约31kDa之间、在约27kDa和约30kDa之间、在约28kDa和约29kDa之间、以及在约28.1kDa和约28.7kDa之间的所计算的分子量。

[0138] 在一些实施例中，PIP‑64‑2多肽具有在约20kDa和约40kDa之间、在约25kDa和约32kDa之间、在约26kkDa和约31kkDa之间、在约27kDa和约30kDa之间、以及在约28.25kDa和约29kDa之间的所计算的分子量。

[0139] 在一些实施例中，PIP‑74‑1多肽具有在约40kDa和约80kDa之间、在约50kDa和约70kDa之间、在约55kDa和约73kDa之间、在约57kDa和约61kDa之间、在约58kDa和约60kDa之间、以及在约58.75kDa和约59.25kDa之间的所计算的分子量。如在此使用的，在杀昆虫多肽的分子量的上下文中所使用的术语“约”意指±0.25千道尔顿。

[0140] 在一些实施例中，PIP‑74‑2多肽具有在约35kDa和约65kDa之间、在约45kDa和约51.5kDa之间、在约47.5kDa和约49.5kDa之间、以及在约48.25kDa和约48.75kDa之间的所计算的分子量。

[0141] 在一些实施例中，PIP‑75多肽具有在约6kDa和约14kDa之间、在约8kDa和约13.5kDa之间、在约9kDa和约12kDa之间、在约9.5kDa和约11.5kDa之间、以及在约10.4kDa和约10.8kDa之间的所计算的分子量。

[0142] 在一些实施例中，PIP‑77多肽具有在约7kDa和约13kDa之间、在约8kDa和约12kDa之间、在约9kDa和约11kDa之间、在约9.5kDa和约10.3kDa之间、以及在约9.75kDa和约
10.25kDa之间的所计算的分子量。

[0143] 在一些实施例中，本披露的杀昆虫多肽具有改性的物理性质。如在此使用的，术语“物理性质”是指适于描述蛋白质的物理化学特征的任何参数。如在此使用的，“感兴趣的物理性质”和“感兴趣的性质”可互换使用，以指正在研究和/或修饰的蛋白质的物理性质。物理性质的实例包括但不限于：蛋白质表面上的净表面电荷和电荷分布、蛋白质表面上的净疏水性和疏水残基分布、表面电荷密度、表面疏水密度、表面电离基团的总计数、表面张力、蛋白质大小及其在溶液中的分布、熔融温度、热容量、和第二维里系数。物理性质的实例还包括但不限于：溶解度、折叠、稳定性、和消化性。在一些实施例中，本披露的杀昆虫多肽增加了昆虫肠中的蛋白水解片段的消化性。通过模拟胃液消化的模型是本领域技术人员已知
的(Fuchs，R.L.and J.D.Astwood.Food Technology 50：83‑88，1996；Astwood，J.D.，et al Nature Biotechnology 14：1269‑1273，1996；Fu TJ et al J.Agric Food Chem.50：7154‑
7160，2002[Fuchs，R.L.和J.D.Astwood，食品科技，50：83‑88，1996；Astwood，J.D.等人，自然生物技术，14：1269‑1273，1996；Fu TJ等人，农业与食品化学杂志，50：7154‑7160，
2002])。

[0144] 在一些实施例中，变体包括由于诱变而在氨基酸序列方面不同的多肽。本披露所涵盖的变体蛋白质具有生物学活性，即它们仍然具有天然蛋白质所需的生物学活性(即杀
有害生物活性)。在一些实施例中，该变体将具有至少约10％、至少约30％、至少约50％、至少约70％、至少约80％或更高的天然蛋白质的杀昆虫活性。在一些实施例中，变体可以具有比天然蛋白质改进的活性。

[0145] 细菌基因通常在开放阅读框的起始附近具有多个甲硫氨酸起始密码子。经常，在这些起始密码子中的一个或多个处的翻译起始将导致一种功能蛋白质的产生。这些起始密
码子可以包括ATG密码子。然而，细菌(如，芽孢杆菌属物种)还将该密码子GTG识别为起始密码子，并且在GTG密码子处起始翻译的蛋白质在第一个氨基酸处包含甲硫氨酸。在少数情况下，细菌系统中的翻译可以在TTG密码子处启动，尽管在此事件中TTG编码甲硫氨酸。此外，常常不首先确定这些密码子中的哪一些在细菌中自然地使用。因此，应当理解，使用这些可替代的甲硫氨酸密码子之一也可能导致杀虫蛋白的产生。这些杀有害生物蛋白涵盖于本披
露之中，并且可以在本披露的这些方法中使用。应当理解的是当在植物中表达时将有必要
将替代起始密码子改变为ATG以用于正确的翻译。

[0146] 在另一方面，本披露的杀昆虫多肽可以表达为具有催化多步翻译后蛋白质剪接的间插序列的前体蛋白。蛋白质剪接涉及从多肽切除间插序列，并伴随连接侧翼序列以产生
新的多肽(Chong，et al.，(1996)J.Biol.Chem.，271：22159‑22168[Chong等人，(1996)，生物化学杂志，271：22159‑22168])。这种被称为内含肽的间插序列或蛋白质剪接元件，通过在N末端和C末端剪接点处的以下三个协调反应催化其自身的切除：N末端半胱氨酸或丝氨
酸的酰基重排；两个末端之间形成支链酯或硫酯中间体的酯交换反应，和与内含肽C末端天冬酰胺的环化相偶联释放内含肽的肽键切割(Evans，et al.，(2000)J.Biol.Chem.，275：
9091‑9094[Evans等人，(2000)，生物化学杂志，275：9091‑9094])。阐明蛋白质剪接的机制导致了许多基于内含肽的应用(Comb，et al.，US Patent Number 5，496，714；Comb，et al.，US Patent Number 5,834,247；Camarero and Muir，(1999)J.Amer.Chem.Soc.121：
5597‑5598；Chong，et al.，(1997)Gene 192：271‑281，Chong，et al.，(1998)Nucleic Acids Res.26：5109‑5115；Chong，et al.，(1998)J.Biol.Chem.273：10567‑10577；Cotton，et al.，(1999)J.Am.Chem.Soc.121：1100‑1101；Evans，et al.，(1999)J.Biol.Chem.274：
18359‑18363；Evans，et al.，(1999)J.Biol.Chem.274：3923‑3926；Evans，et al.，(1998)Protein Sci.7：2256‑2264；Evans，et al.，(2000)J.Biol.Chem.275：9091‑9094；Iwai and Pluckthun，(1999)FEBS Lett.459：166‑172；Mathys，et al.，(1999)Gene 231：1‑13；
Mills，et al.，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：3543‑3548；Muir，et al.，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：6705‑6710；Otomo，et al.，(1999)Biochemistry 38：16040‑
16044；Otomo，et al.，(1999)J.Biolmol.NMR 14：105‑114；Scott，et al.，(1999)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：13638‑13643；Severinov and  Muir，(1998)
J.Biol.Chem.273：16205‑16209；Shingledecker，et al.，(1998)Gene 207：187‑195；
Southworth，et al.，(1998)EMBO J. 17：918‑926；Southworth，et al.，(1999)
Biotechniques 27：110‑120；Wood，et al.，(1999)Nat.Biotechnol.17：889‑892；Wu，et al.，(1998a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：9226‑9231；Wu，et al.，(1998b)Biochim 
Biophys Acta 1387：422‑432；Xu，et al.，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：388‑393；
Yamazaki，et al.，(1998)J.Am.Chem.Soc.，120：5591‑5592[Comb等人，美国专利号5,496,
714；Comb等人，美国专利号5,834,247；Camarero和Muir，(1999)，美国化学学会学报，121：
5597‑5598；Chong等人，(1997)，基因，192：271‑281，Chong等人，(1998)，核酸研究，26：
5109‑5115；Chong等人，(1998)，生物化学杂志，273：10567‑10577；Cotton等人，(1999)，美国化学会志，121：1100‑1101；Evans等人，(1999)，生物化学杂志，274：18359‑18363；Evans等人，(1999)，生物化学杂志，274：3923‑3926；Evans等人，(1998)，蛋白质科学，7：2256‑
2264；Evans等人，(2000)，生物化学杂志，275：9091‑9094；Iwai和Pluckthun，(1999)，欧洲生化学会联盟通讯，459：166‑172；Mathys等人，(1999)，基因，231：1‑13；Mills等人，(1998)，美国国家科学院院刊，95：3543‑3548；Muir等人，(1998)，美国国家科学院院刊，95：
6705‑6710；Otomo等人，(1999)，生物化学，38：16040‑16044；Otomo等人，(1999)，生物分子核磁共振杂志，14：105‑114；Scott等人，(1999)，美国国家科学院院刊，96：13638‑13643；
Severinov和Muir，(1998)，生物化学杂志，273：16205‑16209；Shingledecker等人，(1998)，基因，207：187‑195；Southworth等人，(1998)，欧洲分子生物学杂志，17：918‑926；
Southworth等人，(1999)，生物技术，27：110‑120；Wood等人，(1999)，自然生物技术，17：
889‑892；Wu等人，(1998a)，美国国家科学院院刊，95：9226‑9231；Wu等人，(1998b)，生物化学与生物物理学报，1387：422‑432；Xu等人，(1999)，美国国家科学院院刊，96：388‑393；
Yamazaki等人，(1998)，美国化学会志，120：5591‑5592])。针对在植物转基因中应用内含肽，参见，Yang，et al.，(Transgene Res 15：583‑593(2006))and Evans，et al.，
(Annu.Rev.Plant Biol.56：375‑392(2005))[Yang等人，(转基因研究，15：583‑593(2006))和Evans等人，(植物生物学年评，56：375‑392(2005))]。

[0147] 在另一方面，本披露的杀昆虫多肽可以由两个单独的基因编码，其中前体蛋白的内含肽来自两个称为分裂内含肽的基因，并且前体的两部分通过肽键形成连接。该肽键的
形成通过内含肽介导的反式剪接实现。为此目的，包含两个单独基因的第一和第二表达盒
进一步编码能够介导蛋白质反式剪接的内含肽。通过反式剪接，由第一和第二片段编码的
蛋白质和多肽可以通过肽键形成连接。反式剪接内含肽可以选自包括真核生物、古细菌和
真细菌在内的不同生物体的核仁和细胞器基因组。可以使用的内含肽列在neb.com/neb/
inteins.html上，其可以使用“www”前缀在万维网上访问。编码内含肽的核苷酸序列可以分裂成5′和3′部分，该5′和3′部分分别编码内含肽的5′和3′部分。可能使内含肽剪接不需要的序列部分(例如归巢内切核酸酶结构域)缺失。将内蛋白编码序列分裂，使得5′和3′部分能够进行反式剪接。为了选择内含肽编码序列的合适的分裂位点，可以遵循由Southworth，et al.，(1998)EMBO J.17：918‑926[Southworth等人，(1998)，欧洲分子生物学杂志，17：
918‑926]公开的注意事项。在构建第一和第二表达盒中，5′内含肽编码序列连接到编码本披露的杀昆虫多肽的N末端部分的第一片段的3′末端，并且3′内含肽编码序列连接到编码本披露的杀昆虫多肽的C末端部分的第二片段的5′末端。

[0148] 通常，可以使用任何分裂内含肽来设计反式剪接配偶体，包括任何天然存在或人工分裂的分裂内含肽。已知若干种天然存在的分裂内含肽，例如：集胞藻属物种PCC6803的DnaE基因的分裂内含肽(参见，Wu，et al.，(1998)Proc Natl Acad Sci USA.95(16)：9226‑
31 and Evans，et al.，(2000)J Biol Chem.275(13)：9091‑4[Wu等人，(1998)，美国国家科学院院刊，95(16)：9226‑31和Evans等人，(2000)，生物化学杂志，275(13)：9091‑4])和来自点状念珠藻的DnaE基因的分裂内含肽(参见，Iwai，et al.，(2006)FEBS Lett.580(7)：
1853‑8[Iwai等人，(2006)，欧洲生化学会联盟通讯，580(7)：1853‑8])。非分裂内含肽在实验室中人为分裂以产生新的分裂内含肽，例如：人工分裂Ssp DnaB内含肽(参见，Wu，et 
al.，(1998)Biochim Biophys Acta.1387：422‑32[Wu等人，(1998)，生物化学与生物物理学报，1387：422‑32])和分裂Sce VMA内含肽(参见，Brenzel，et al.，(2006)Biochemistry.45(6)：1571‑8[Brenzel等人，(2006)，生物化学，45(6)：1571‑8])和人工分裂的真菌微型内含肽(参见，Elleuche，et al.，(2007)Biochem Biophys Res Commun.355(3)：830‑4
[Elleuche等人，(2007)，生物化学与生物物理学研究通讯，355(3)：830‑4])。还有把已知的内含肽编入目录的内含肽数据库(参见，例如，可以在bioinformatics.weizmann.ac.il/～pietro/inteins/Inteinstable.html处获得的在线数据库，其可以使用“www”前缀在万维网上访问)。

[0149] 天然存在的非分裂内含肽可能具有内切核酸酶活性或其他酶活性，这些活性通常可以在设计人工分裂的分裂内含肽时被去除。这样的迷你内含肽或最小化的分裂内含肽是
本领域熟知的，并且通常小于200个氨基酸残基长(参见，Wu，et al.，(1998)Biochim 
Biophys Acta.1387：422‑32[Wu等人，(1998)，生物化学与生物物理学报，1387：422‑32])。
合适的分裂内含肽可以向其结构添加使其他纯化可行的多肽元件，条件是这些元件不会抑
制分裂内含肽的剪接，或以允许它们在拼接之前被去除的方式添加。已经报道了使用包含
以下各项的蛋白质的蛋白质剪接：细菌内含肽样(BIL)结构域(参见，Amitai，et al.，
(2003)Mol Microbiol.47：61‑73[Amitai，et al.，(2003)Mol Microbiol.47：61‑73])和刺猬(Hog)自动加工结构域(当称为Hog/内含肽超家族或HINT家族时，后者与内含肽组合；参
见，Dassa，et al.，(2004)J Biol Chem.279：32001‑7[Dassa等人，(2004)，生物化学杂志，
279：32001‑7]))以及结构域如还可用于制备人工分裂的内含肽的这些。特别地，可以通过分子生物学方法来修饰这些家族的非剪接成员，以引入或恢复在这些相关物种中的剪接活
性。最近的研究表明，当允许N末端分裂内含肽组分与自然界中未发现的C末端裂解内含肽
组分反应作为其“配偶体”时，可以观察到剪接；例如，已经观察到使用与“自然”剪接配偶体具有少至30％至50％同源性的配偶体进行剪接(参见，Dassa，et al.，(2007)
Biochemistry.46(1)：322‑30[Dassa等人，(2007)，生物化学，46(1)：322‑30])。不同分裂内含肽的其他这种混合物已被证明与另一个不反应的混合物(参见，Brenzel，et al.，(2006)Biochemistry.45(6)：1571‑8[Brenzel等人，(2006)，生物化学，45(6)：1571‑8])。然而，使用常规方法并且酶有运用创造性技能是情况下确定特定的一对多肽是否能够彼此结合以
提供功能性内含肽，在相关领域的技术人员的能力范围内。

[0150] 在另一方面，本披露的杀昆虫多肽是环形排列的变体。重组DNA方法的发展使得有可能研究序列转座对蛋白质折叠、结构和功能的影响。用于创建新序列的方法类似于通过
其氨基酸序列的线性重组相关的天然存在的蛋白质对的方法(Cunningham，et al.，(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76：3218‑3222；Teather  and  Erfle，(1990)
J.Bacteriol.172：3837‑3841；Schimming，et al.，(1992)Eur.J.Biochem.204：13‑19；
Yamiuchi and Minamikawa，(1991)FEBSLett.260：127‑130；MacGregor，et al.，(1996)FEBS Lett.378：263‑266[Cunningham等人，(1979)，美国国家科学院院刊，76：3218‑3222；
Teather和Erfle，(1990)，细菌学杂志，172：3837‑3841；Schimming等人，(1992)，欧洲生物化学杂志，204：13‑19；Yamiuchi和Minamikawa，(1991)，欧洲生化学会联盟通讯，260：127‑
130；MacGregor等人，(1996)，欧洲生物化学杂志，378：263‑266])。Goldenberg和Creighton描述了这种类型的重排对蛋白质的第一次体外应用(J.Mol.Biol.165：407‑413，1983[分子生物学杂志，165：407‑413，1983])。在创建环形排列的变体中，在原始序列的内部位点(断点)处选择新的N末端，该新序列从断点与原始序列具有氨基酸相同的次序，直到其达到原
始C末端或其附近的氨基酸。在这一点上，新序列直接或通过序列(接头)的另外部分连接到原始N末端或其附近的氨基酸，并且新序列以原始序列相同的序列继续，直到其达到原始序列的断点位点的N末端的氨基酸处于或附近的点，该残基形成链的新C末端。接头的氨基酸
序列的长度可以凭经验或以结构信息的指导或通过使用两种方法的组合来选择。当没有结
构信息可用时，可以使用设计和采取必要的确认，而不会破坏杀有害生物多肽的构型的能
力(构象灵活；Karplus and Schulz，(1985)Naturwissenschaften 72：212‑213[Karplus和Schulz，(1985)，自然科学，72：212‑213])制备小系列接头用于测试，该设计的长度为了跨越从0至 的范围而变化并且选择该设计的序列以与表面暴露一致(亲水性，Hopp and 
Woods，(1983)Mol.Immunol.20：483‑489；Kyte and Doolittle，(1982)J.Mol.Biol.157：
105‑132；solvent exposed surface area，Lee and Richards，(1971)J.Mol.Biol.55：
379‑400[Hopp和Woods，(1983)，分子免疫学，20：483‑489；Kyte和Doolittle，(1982)，分子生物学杂志，157：105‑132；溶剂暴露表面积，Lee和Richards，(1971)，分子生物学杂志，55：
379‑400])。假设每个残基平均翻译为2.0至 这意味着要测试的长度在0至30个残基
之间，其中0至15个残基为优选范围。这种经验性系列的实例将是使用重复n次的盒序列如
Gly‑Gly‑Gly‑Ser构建接头，其中n为1、2、3或4。本领域技术人员将认识到，存在许多长度或组成不同的这样的序列，其可以用作接头，其中主要注意事项是它们是既不过长也不过短
的(cf.，Sandhu，(1992)Critical Rev.Biotech.12：437‑462[cf.，Sandhu，(1992)，生物技术评论，12：437‑462])；如果它们太长，熵效应可能会使三维折叠不稳定，并且也可能使得折叠在动力学上是不切实际的，并且如果它们太短，则它们可能由于扭转或空间应变使分
子不稳定。蛋白质结构信息分析的技术人员将认识到，使用定义为c‑α碳之间距离的链末端之间的距离可用于定义待使用的序列的长度，或至少限制在接头的经验选择中必须测试的
可能性的数量。他们还将认识到，在有时多肽链末端的位置在源自X射线衍射或核磁共振光谱数据的结构模型中是不明确的情况下，并且在当真实时的情况下，因此，需要考虑这种情况，以便正确估计所需接头的长度。从其位置定义明确的那些残基选择两个与链末端顺序
接近的残基，并且使用它们的c‑α碳之间的距离来计算它们之间的接头的近似长度。使用计算出的长度作为指导，然后选择具有一定范围数量的残基(每个残基使用2至 计算)
的接头。这些接头可以由原始序列组成，必要时缩短或延长，并且当延长时，可以如上所述选择灵活的和亲水性的另外的残基；或任选地，原始序列可以用一系列接头取代，一个实例是以上提及的Gly‑Gly‑Gly‑Ser盒方法；或任选地，可以使用具有适当总长度的原始序列和新序列的组合。能够折叠到生物活性状态的杀有害生物多肽的序列可以通过从原始多肽链
中开始(氨基末端)和末端(羧基末端)位置的适当选择，同时使用如上所述的接头序列来制
备。氨基和羧基末端使用下面所述的方法从称为断点区域的序列的常见延伸中选出。因此，通过从同一断点区域内选择氨基和羧基末端来产生新颖的氨基酸序列。在许多情况下，新
末端的选择将使得羧基末端的原始位置紧邻氨基末端的位置。然而，本领域技术人员将认
识到，区域内任何地方的末端的选择可能起作用，并且这些将有效地导致新序列的氨基或
羧基部分的缺失或添加。蛋白质的主要氨基酸序列决定了折叠至表达其生物功能所必需的
三维结构是分子生物学的核心原则。本领域技术人员已知使用单一蛋白晶体的x射线衍射
或蛋白质溶液的核磁共振光谱来获得和解释三维结构信息的方法。与断点区域的识别有关
的结构信息的实例包括蛋白质二级结构的位置和类型(α和3‑10个螺旋，平行和反平行β折叠，链反转和链回转，以及环；Kabsch and Sander，(1983)Biopolymers 22：2577‑2637[Kabsch和Sander，(1983)，生物聚合体，22：2577‑2637]氨基酸残基的溶剂暴露程度，残基相互作用的程度和类型(Chothia，(1984)，生物化学年鉴，53：537‑572)和沿着多肽链的构象的静态和动态分布(Alber and Mathews，(1987)Methods Enzymol.154：511‑533[Alber和Mathews，(1987)，酶学方法，154：511‑533])。在某些情况下，已知关于残基溶剂暴露的另外的信息；一个实例是碳水化合物的翻译后附着位点，该位点必然在蛋白质的表面上。当实验结构信息不可获得或不可能获得时，也可以使用方法来分析初级氨基酸序列，以便预测
蛋白质三级和二级结构，溶剂可及性以及回转和环的存在。当直接结构方法不可行时，生物化学方法有时也适用于经验确定表面暴露；例如，使用有限蛋白水解后的链裂解位点的鉴
定以便推测表面暴露(Gentile and Salvatore，(1993)Eur.J.Biochem.218：603‑621
[Gentile和Salvatore，(1993)，欧洲生物化学杂志，218：603‑621])。因此，使用实验衍生的结构信息或预测方法(例如，Srinivisan and Rose，(1995)Proteins：Struct.，Funct.&
Genetics 22：81‑99[Srinivisan和Rose，(1995)，蛋白质：结构，功能和遗传学，22：81‑
99])，检查亲本氨基酸序列根据它们是否对维持二级和三级结构是必不可少的对区域进行
分类。已知涉及周期性二级结构(α和3‑10个螺旋，平行和反平行β折叠)的区域内的序列的存在是应该避免的区域。相似地，观察或预测具有低溶剂暴露程度的氨基酸序列的区域更
可能是蛋白质的所谓疏水核心的一部分，并且也应避免选择氨基和羧基末端。相比之下，已知或预测为表面回转或循环的那些区域，并且特别是已知生物活性所不需要的那些区域，
是用于定位多肽链极端的优选位点。基于上述标准优选的氨基酸序列的连续延伸被称为断
点区域。可以基本上遵循Mullins，et al.，(1994)J.Am.Chem.Soc.116：5529‑5533[Mullins等人，(1994)，美国化学会志，116：5529‑5533]中所描述的方法制备编码具有新N末端/C末端的本披露的环形排列的杀昆虫多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含将原C末端与N末端分隔
开的连接区。聚合酶链反应(PCR)扩增的多个步骤用于重排编码蛋白质的一级氨基酸序列
的DNA序列。可以基于Horlick，et al.，(1992)Protein Eng.5：427‑431[Horlick等人，(1992)，蛋白质工程，5：427‑431]中所描述的串联重复方法制备编码具有新N末端/C末端的本披露的环形排列的杀昆虫多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含将原C末端与N末端分隔开的
连接区。使用串联重复的模板DNA进行新的N末端/C末端基因的聚合酶链反应(PCR)扩增。

[0151] 在另一方面，提供了在其氨基酸序列中包含氨基酸序列的融合蛋白，该氨基酸序列包含本披露的杀昆虫多肽。用于设计和构建融合蛋白(以及编码它们的多核苷酸)的方法
是本领域技术人员已知的。编码本披露的杀昆虫多肽的多核苷酸可以融合到信号序列，这
些信号序列将指导本披露的杀昆虫多肽定位于来自原核或真核细胞的实施例的杀昆虫多
肽。例如，在大肠杆菌中，人们可能希望指导蛋白质表达至周质空间。本披露的杀昆虫多肽可以融合以便指导多肽表达至细菌周质空间的信号序列或蛋白质(或其片段)的实例包括
但不限于：pelB信号序列、麦芽糖结合蛋白(MBP)信号序列、MBP、ompA信号序列，周质性大肠杆菌不耐热肠毒素B亚基的信号序列和碱性磷酸酶的信号序列。用于构建将指导蛋白质定
位的融合蛋白的若干种载体是可商购的，如可从New England (240县道，伊普斯
威奇，马萨诸塞，01938‑2723)获得的pMAL系列的载体(特别是pMAL‑p系列)。在具体实施例中，本披露的杀昆虫多肽可以与pelB果胶酸裂解酶信号序列融合，以增加革兰氏阴性菌中
这些多肽的表达和纯化的效率(参见，美国专利号5,576,195和5,846,818)。植物质体转运
肽/多肽融合是本领域熟知的(参见，美国专利号7,193,133)。质外体转运肽如水稻或大麦
α‑淀粉酶分泌信号也是本领域熟知的。质体转运肽通常与待靶向的多肽(例如，融合配偶体)进行N末端融合。在一个实施例中，融合蛋白基本上由待靶向的本披露的质体转运肽和
杀昆虫多肽组成。在另一个实施例中，融合蛋白包含待靶向的质体转运肽和多肽。在这样的实施例中，质体转运肽优选位于融合蛋白的N末端。然而，另外的氨基酸残基可以是在质体转运肽的N末端，条件是该融合蛋白质至少部分地靶向质体。在具体实施例中，质体转运肽在融合蛋白的N末端一半处，N末端三分之一处或N末端四分之一处。当插入质体时，大部分或全部质体转运肽通常从融合蛋白上切割。由于特定的细胞间条件或所使用的转运肽/融
合配偶体的具体组合，在不同植物发育阶段，切割位置可能在植物物种之间略有变化。在一个实施例中，质体转运肽切割是均相的，使得切割位点在融合蛋白群体中是相同的。在另一个实施例中，质体转运肽不是均匀的，使得融合蛋白群体中切割位点相差1‑10个氨基酸。质体转运肽可以以若干种方式之一重组融合到第二种蛋白质。例如，可以将限制性内切核酸
酶识别位点引入到其C末端的相应位置的转运肽的核苷酸序列中，并且可以将相同或相容
的位点工程化为在其N末端待靶向的蛋白质的核苷酸序列。必须注意设计这些位点，以确保转运肽和第二个蛋白质的编码序列保持“框架”，以允许合成所需的融合蛋白。在一些情况下，当引入新的限制性位点时，优选除去第二种蛋白质的引发剂甲硫氨酸密码子。在两个亲本分子上引入限制性内切核酸酶识别位点，以及它们随后通过重组DNA技术连接可导致在
转运肽和第二蛋白质之间添加一个或多个额外的氨基酸。这通常不影响靶向活性，只要转
运肽切割位点保持可及，并且通过在其N末端添加这些额外的氨基酸而不改变第二蛋白质
的功能。可替代地，本领域技术人员可以使用基因合成(Stemmer，et al.，(1995)Gene 164：
49‑53[Stemmer等人，(1995)，基因，164：49‑53])或相似的方法在转运肽和第二蛋白质之间产生精确的切割位点(有或没有其引发剂甲硫氨酸)。此外，转运肽融合可以有意地包括切
割位点下游的氨基酸。成熟蛋白质N末端的氨基酸可影响转运肽将蛋白质靶向质体的能力
和/或蛋白质进入后的切割效率。这可能取决于待靶向的蛋白质。参见，例如，Comai，et al.，(1988)J.Biol.Chem.263(29)：15104‑9[Comai等人，(1988)，生物化学杂志，263(29)：
15104‑9]。

[0152] 在一些实施例中，提供包含本披露的杀昆虫多肽的融合蛋白，以及通过氨基酸接头连接的杀昆虫多肽。

[0153] 在一些实施例中，提供了由选自下组的化学式所示的融合蛋白，该组由以下各项组成：

[0154] R1‑L‑R2、R2‑L‑R1、R1‑R2或R2‑R1

[0155] 其中R1是本披露的杀昆虫多肽。该R1多肽直接或通过接头(L)区段融合至R2多肽。1 2
术语“直接”定义在没有肽接头的情况下多肽连接的融合。因此，“L”表示R 和R在框架中融
1 2 1
合的化学结合或多肽区段，最常见的是，L是R和R通过酰胺键将R的羧基末端连接到L的氨
2 1 2
基末端并且将L的羧基末端连接到R的氨基末端的线性肽。“在框内融合”意指R和R的阅读
框之间没有翻译终止或中断。连接基团(L)通常是长度在1至500个氨基酸之间的多肽。连接两个分子的接头优选设计成(1)允许两个分子彼此独立第折叠并且起作用，(2)不具有发展
可能干扰两种蛋白质的功能结构域的有序二级结构的倾向，(3)具有可与功能性蛋白质结
1 2 1 2
构域相互作用的最小的疏水或带电特征，并且(4)提供R 和R的空间分离，使得R 和R可以
与单个细胞上的相应受体同时相互作用。通常，在柔性蛋白质区域中的表面氨基酸包括
Gly、Asn和Ser。期望包含Gly、Asn和Ser的氨基酸序列的几乎任何排列满足上述接头序列的标准。其他中性的氨基酸，如Thr和Ala也可以用于接头序列中。由于在接头序列中添加了独特的限制性位点以便于构建融合体，另外的氨基酸也可以包括在接头中。

[0156] 在一些实施例中，接头包含选自以下组的化学式的序列：(Gly3Ser)n、(Gly4Ser)n、(Gly5Ser)n、(GlynSer)n或(AlaGlySer)n，其中n是整数。高度柔性接头的一个实例是存在于丝状噬菌体(例如，噬菌体M13或fd)的pIII蛋白质内的富含(GlySer)的间隔子(Schaller等人，1975)。该区域在pIII表面蛋白质的两个结构域之间提供长、柔性的间隔子区域。还包括接头，在接头中包括内肽酶识别序列。这样的切割位点对于分离融合物的各个组分以确定
它们在体外是否适当折叠和是否具有活性可能是有价值的。各种内肽酶的实例包括但不限
于：纤溶酶、肠激酶、激肽释放酶、尿激酶、组织纤溶酶原激活剂、梭菌蛋白酶、凝乳酶、胶原酶、鲁塞尔氏蝰蛇毒蛋白酶、后脯氨酸切割酶、V8蛋白酶、凝血酶和因子Xa。在一些实施例中，接头包含来自多基因表达载体(MGEV)的氨基酸EEKKN(SEQ ID NO：215)，其如美国专利申请公开号US 2007/0277263中所披露的被液泡蛋白酶切割。在其他实施例中，来自重链免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、IgD或IgE的铰链区域的肽接头区段在附着的多肽之间提供角度关系。特别有用的是那些半胱氨酸被丝氨酸替换的铰链区域。本披露的接头包括源自鼠IgGγ
2b铰链区域的序列，其中半胱氨酸已经被变为丝氨酸。融合蛋白不受所使用的接头序列的
形式、大小或数目的限制，并且接头的唯一要求是功能上不会与融合的各个分子的折叠和
功能产生不利的干扰。

[0157] 在另一方面，提供了嵌合杀昆虫多肽，该嵌合杀昆虫多肽通过连接本披露的杀昆虫多肽基因的两个或更多个部分产生，该杀昆虫多肽基因最初编码分离的杀昆虫蛋白以产
生嵌合基因。嵌合基因的翻译导致具有源自每个原始多肽的区域、基序或结构域的单个嵌
合杀昆虫多肽。

[0158] 应当认识到，可以通过各种方法改变DNA序列，并且这些改变可能导致编码具有与野生型(或天然)杀有害生物蛋白编码的氨基酸序列不同的氨基酸序列的蛋白质的DNA序
列。在一些实施例中，本披露的杀昆虫多肽可以以各种方式改变，这些方式包括与SEQ ID NO：1‑SEQ ID NO：107、和SEQ ID NO：232‑SEQ ID NO：245中任一项相比，一个或多个氨基酸的氨基酸取代、缺失、截短和插入，包括高达2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、
18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、
43、44、45或更多氨基酸取代、缺失和/或插入或其组合。在一些实施例中，本披露的杀昆虫多肽包含从本披露的杀昆虫多肽的N末端和/或C末端的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、
14、15或更多个氨基酸的缺失。

[0159] 这种操作的方法是本领域通常已知的。例如，本披露的杀昆虫多肽的氨基酸序列变体可以通过DNA突变来制备。这还可以通过几种诱变形式之一和/或在定向进化中来完
成。在一些方面，在该氨基酸序列中所编码的变化将基本上不影响该蛋白质的功能。这样的变体将具有所希望的杀有害生物活性。然而，应当理解，可以通过在本披露的组合物上使用这些技术改进本披露的杀昆虫多肽赋予杀有害生物活性的能力。

[0160] 例如，可以在一个或多个、预测的、非必需氨基酸残基处做出保守性氨基酸取代。“非必需”氨基酸残基是可以从本披露的杀昆虫多肽的野生型序列改变而不改变生物活性
的残基。“保守的氨基酸取代”是其中用具有相似侧链的氨基酸残基替换该氨基酸残基的取代。在本领域中已经限定了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括：具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)；具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)；具有极性的、带负电荷的残基及其酰胺的氨基酸(例如，天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺)；具有不带电极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)；具有小脂肪族、非极性或微小极性的残基的氨基酸(例如，丙胺酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甘胺酸)；具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙胺酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)；具有大脂肪族、非极性残基的氨基酸(例如，甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、半胱氨酸)；具有β‑支链侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)；具有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)；具有大芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。

[0161] 氨基酸取代可以在保留功能的非保守性区域中进行。总体上，此类取代并非针对保守的氨基酸残基、或针对在一个保守基序内的氨基酸残基而进行，其中此类残基是蛋白
质活性所必要的。保守的并且对于蛋白质活性可能是必需的残基的实例包括例如，在与实
施例的序列相相似或相关的毒素的比对中所包含的全部蛋白质之间是相同的残基(例如，
在同源物比对中相同残基)。保守的但可能允许保守的氨基酸取代、并且仍保留活性的残基的实例包括例如，在与实施例的序列相相似或相关的毒素的比对中所包含的全部蛋白质之
间仅具有保守性取代的残基(例如，在同源物比对中所包含的全部蛋白质之间仅具有保守
性取代的残基)。然而，本领域的技术人员应当理解，功能性变体在保守的残基中可以具有少量的保守的或非保守的改变。关于不影响感兴趣的蛋白质的生物活性的适当的氨基酸取
代的指导可以发现于Dayhoff，et al.，(1978)Atlas of Protein Sequence and 
Structure(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.)[Dayhoff等人，(1978)，蛋白质序列和结构图谱(国家生物医学研究基金会，华盛顿)的模型中，其通过引用结合在此。

[0162] 在进行这种变化时，可考虑氨基酸的亲水指数。亲水氨基酸指数在赋予蛋白质以交互性生物功能中的重要性在本领域中通常是被理解的(Kyte and Doolittle，(1982)J 
Mol Biol.157(1)：105‑32[Kyte和Doolittle，(1982)，分子生物学杂志，157(1)：105‑32])。
接受的是该氨基酸的相对亲水特征有助于所得蛋白的次级结构，该次级结构进而定义该蛋
白与其他分子(例如酶、基质、受体、DNA、抗体、抗原等等)的相互作用。

[0163] 本领域已知某些氨基酸可以被具有相似亲水指数或评分的其他氨基酸取代，并且仍然产生具有相似生物学活性的蛋白质，即仍然获得生物功能等同的蛋白质。每个氨基酸
基于其疏水性和电荷特征被指定亲水指数(Kyte和Doolittle，同上)。这些是：异亮氨酸(+
4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘胺酸(‑0.4)；苏氨酸(‑0.7)；丝氨酸(‑0.8)；色氨酸(‑0.9)；酪氨酸(‑1.3)；脯氨酸(‑1.6)；组氨酸(‑3.2)；谷氨酸(‑3.5)；谷氨酰胺(‑3.5)；天冬氨酸(‑
3.5)；天冬酰胺(‑3.5)；赖氨酸(‑3.9)和精氨酸(‑4.5)。在进行这种变化时，优选亲水性指数在+2以内的氨基酸取代，特别优选在+1以内的氨基酸取代，并且甚至更特别优选+0.5以
内的氨基酸取代。

[0164] 在本领域中也可以理解，可以基于亲水性有效地进行类似氨基酸的取代。美国专利号4,554,101说明蛋白的最大局部平均亲水性(如由其相邻氨基酸的亲水性支配的)与该
蛋白的生物特性相关。

[0165] 如美国专利号4,554,101中所详述的，以下亲水性值已被分配到氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0.+0.1)；谷氨酸(+3.0.+0.1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘胺酸(0)；苏氨酸(‑0.4)；脯氨酸(‑0.5.+0.1)；丙氨酸(‑
0.5)；组氨酸(‑0.5)；半胱氨酸(‑1.0)；甲硫氨酸(‑1.3)；缬氨酸(‑1.5)；亮氨酸(‑1.8)；异亮氨酸(‑1.8)；酪氨酸(‑2.3)；苯丙氨酸(‑2.5)；色氨酸(‑3.4)。

[0166] 可替代地，可以在氨基或羧基的末端上对多种蛋白质的蛋白质序列进行改变，而基本上不影响活性。这可以包括由现代分子方法所引入的插入、缺失或改变，这些方法如
PCR，包括PCR扩增，这些PCR扩增借助于将氨基酸编码序列包括到在PCR扩增中所使用的寡
核苷酸之中而改变或延长了这种蛋白质编码序列。可替代地，所添加的蛋白质序列可以包
括完整的蛋白质编码序列，如在本领域内通常用于产生蛋白质融合物的那些序列。此类融
合蛋白常常用于(1)增加感兴趣的蛋白质的表达；(2)引入结合结构域、酶活性或表位以促
进蛋白质纯化、蛋白检测或本领域已知的其他实验用途；(3)将蛋白质的分泌或翻译靶向亚细胞器，如革兰氏阴性菌的周质空间，植物的线粒体或叶绿体或真核细胞的内质网，这些中的后者常常导致蛋白质的糖基化。

[0167] 本披露的变体核苷酸和氨基酸序列还涵盖了由诱变和引起重组的程序(如DNA改组)所衍生的序列。在这样的方法的情况下，可以使用本披露编码区域的一种或多种不同的杀昆虫多肽来产生具有所需性质的本披露的新的杀昆虫多肽。以此方式，由一群相关的序
列多核苷酸产生重组多核苷酸文库，这些多核苷酸包含具有基本序列同一性并且能够在体
外或体内同源重组的序列区域。例如，使用这种方法，可以将编码感兴趣的结构域的序列基序在杀有害生物基因与其他已知的杀有害生物基因之间进行改组，以获得编码具有改进的
感兴趣的性质(如增加的杀昆虫活性)的新基因。这种DNA改组的策略是本领域已知的。参
见，例如，Stemmer，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：10747‑10751；Stemmer，(1994)Nature 370：389‑391；Crameri，et al.，(1997)Nature Biotech.15：436‑438；Moore，et al.，(1997)J.Mol.Biol.272：336‑347；Zhang，et al.，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 
94：4504‑4509；Crameri，et al.，(1998)Nature 391：288‑291[Stemmer，(1994)，美国国家科学院院刊，91：10747‑10751；Stemmer，(1994)，自然，370：389‑391；Crameri等人，(1997)，自然生物技术，15：436‑438；Moore等人，(1997)，分子生物学杂志，272：336‑347；Zhang等人，(1997)，美国国家科学院院刊，94：4504‑4509；Crameri等人，(1998)，自然，391：288‑
291]；以及美国专利号5,605,793和5,837,458。

[0168] 结构域交换或改组是用于产生本披露的改变的杀昆虫多肽的另一种机制。可以在本披露的杀昆虫多肽之间交换结构域，导致具有改进的杀昆虫活性或靶谱的杂交或嵌合毒
素。用于产生重组蛋白质并测试其杀有害生物活性的方法是本领域熟知的(参见，例如，
Naimov，et al.，(2001)Appl.Environ.Mcrobiol.67：5328‑5330；de Maagd，et al.，(1996)Appl.Environ.Microbiol.62：1537‑1543；Ge，et al.，(1991)J.Biol.Chem.266：17954‑
17958；Schnepf，et al.，(1990)J.Biol.Chem.265：20923‑20930；Rang，et al.，91999)Appl.Environ.Microbiol.65：2918‑2925[Naimov等人，(2001)，应用与环境微生物学，67：
5328‑5330；de Maagd等人，(1996)，应用与环境微生物学，62：1537‑1543；，Ge等人，(1991)，生物化学杂志，266：17954‑17958；Schnepf等人，(1990)，生物化学杂志，265：20923‑20930；
Rang等人，(1999)，应用与环境微生物学，65：2918‑2925])。

[0169] 杀昆虫多肽的同源物的比对(图1、2、3、4、5、6、7和8)允许鉴定这些家族的同源物中高度保守的残基。

[0170] 组合物

[0171] 也可以设想包含本披露的杀昆虫多肽的组合物。考虑了包含本披露的PIP‑45‑1多肽和本披露的PIP‑45‑2多肽的组合物。在一些实施例中，该组合物包含杀昆虫有效浓度的本披露PIP‑45‑1多肽和本披露的PIP‑45‑2多肽。考虑了包含本披露的PIP‑64‑1多肽和本披露的PIP‑64‑2多肽的组合物。在一些实施例中，该组合物包含杀昆虫有效浓度的本披露PIP‑64‑1多肽和本披露的PIP‑64‑2多肽。考虑了包含本披露的PIP‑74‑1多肽和本披露的PIP‑74‑2多肽的组合物。在一些实施例中，该组合物包含杀昆虫有效浓度的本披露PIP‑74‑
1多肽和本披露的PIP‑74‑2多肽。考虑了包含本披露的PIP‑75多肽的组合物。在一些实施例中，该组合物包含杀昆虫有效浓度的本披露PIP‑75多肽。考虑了包含本披露的PIP‑77多肽的组合物。在一些实施例中，该组合物包含杀昆虫有效浓度的本披露PIP‑77多肽。在一些实施例中，该组合物进一步包含一种农业上可接受的载体。

[0172] 抗体

[0173] 还涵盖了针对实施例的本披露的杀昆虫多肽或针对其变体或片段的抗体。本披露的抗体包括保留其结合昆虫肠道中发现的杀昆虫蛋白的能力的多克隆和单克隆抗体及其
片段。据说抗体、单克隆抗体或其片段如果其能够与分子特异性反应从而将分子与抗体、单克隆抗体或其片段结合，则能够结合分子。术语“抗体”(Ab)或“单克隆抗体”(Mab)意指包括够结合半抗原的完整分子以及其片段或结合区域或结构域(例如像，Fab和F(ab).sub.2片
段)。这种片段通常通过蛋白水解切割产生，如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶。可替代地，可以通过应用重组DNA技术或通过合成化学生产半抗原结合片段。用于制备本披露的抗体的方法是
本领域通常已知的。例如，参见Antibodies，A Laboratory Manual，Ed Harlow and David Lane(eds.)Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.(1988)[抗体，实验室手册，Ed Harlow和David Lane(编辑)，冷泉港实验室，纽约州，(1988)]，以及其中引用的参考文献。阐述免疫学的一般原则的标准参考文献包括：Klein，J.Immunology：The Science of Cell‑
Noncell Discrimination，John Wiley&Sons，N.Y.(1982)；Dennett，et al.，Monoclonal Antibodies，Hybridoma：A New Dimension in Biological Analyses，Plenum Press，N.Y.(1980)and Campbell，″Monoclonal Antibody Technology，″In Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology，Vol.13，Burdon，et al.，(eds.)，Elsevier，Amsterdam(1984)[Klein，免疫学杂志：细胞‑非细胞鉴别科学，约翰&威利父子公司，纽约，(1982)；Dennett等人，单克隆抗体，杂交瘤：生物分析的新维度，普莱纽姆出版社，纽约，(1980)和Campbell，“单克隆抗体技术”，在：生物化学与分子生物学实验室技术，第13卷，Burdon等人，(编辑)，爱思唯尔，阿姆斯特丹，(1984)]。还参见，美国专利号4,196,265、4,
609,893、4,713,325、4,714,681、4,716,111、4,716,117和4,720,459。本披露的杀昆虫多肽或其抗原结合部分的抗体可以通过多种技术产生，包括常规单克隆抗体方法，例如Kohler and Milstein，(1975)Nature 256：495[Kohler和Milstein，(1975)，自然，256：495]的标准体细胞杂交技术。还可以使用产生单克隆抗体的其他技术，如B淋巴细胞的病毒或致癌性转化。用于制备杂交瘤的动物系统是小鼠系统。分离用于融合的免疫的脾细胞的免疫方案和
技术是本领域已知的。融合配偶体(例如，小鼠骨髓瘤细胞)和融合方法也是已知的。本披露的抗体和单克隆抗体可以通过使用本披露的杀昆虫多肽作为抗原来制备。

[0174] 提供了用于在样品中检测本披露的杀昆虫多肽的存在或检测编码本披露的杀昆虫多肽的核苷酸序列的存在的试剂盒。在一个实施例中，试剂盒提供基于抗体的试剂，用于检测组织样品中本披露的杀昆虫多肽的存在。在另一个实施例中，试剂盒提供用于检测编
码本披露的杀昆虫多肽的一种或多种多核苷酸的存在的标记的核酸探针。将试剂盒与用于
进行检测方法的适当的试剂和对照物，以及试剂盒的使用说明书一起提供。

[0175] 受体鉴别和分离

[0176] 还涵盖了针对实施例的杀昆虫多肽或其变体或片段的受体。用于鉴定受体的方法是本领域熟知的(参见，Hofmann，et.al.，(1988)Eur.J.Biochem.173：85‑91；Gill，et al.，(1995)J.Biol.Chem.27277‑27282[Hofmann等人，(1988)，欧洲生物化学杂志，173：85‑91；
Gill等人，(1995)，生物化学杂志，27277‑27282)可以使用来自易感昆虫的刷状缘膜囊泡用于鉴定和分离识别本披露的杀昆虫多肽的受体。除了引用文献中列出的放射性标记方法之
外，可以将杀昆虫多肽用荧光染料和其他常见标记如链霉亲和素进行标记。可以根据参考
文献中列出的方案制备易感昆虫(如大豆夜蛾和椿象)的刷状缘膜囊泡(BBMV)，并在SDS‑
PAGE凝胶上分离，并在合适的膜上印迹。本披露的标记的杀昆虫多肽可以与BBMV的印迹膜
一起孵育，并标记的本披露的杀昆虫多肽可以用标记的报道基因鉴定。与本披露的杀昆虫
多肽相互作用的蛋白质带的鉴定可以通过基于N末端氨基酸气相测序或基于质谱的蛋白质
鉴定方法进行检测(Patterson，(1998)10.22，1‑24，Current Protocol in Molecular 
Biology published by John Wiley&Son Inc[Patterson，(1998)，10.22，1‑24，由约翰&威利父子公司出版的当前分子生物学方案])。一旦鉴定出蛋白质，可以从易感昆虫的基因组
DNA或cDNA文库中克隆相应的基因，并且可以直接用本披露的杀昆虫多肽测量结合亲和力。
通过本披露的杀昆虫多肽的杀昆虫活性的受体功能可以通过RNAi型的基因敲除法完成验
证(Rajagopal，et al.，(2002)J.Biol.Chem.277：46849‑46851[Rajagopal等人，(2002)，生物化学杂志，277：46849‑46851])。

[0177] 核苷酸构建体、表达盒和载体

[0178] 在此使用术语“核苷酸构建体”并不旨在将实施例限制为包含DNA的核苷酸构建体。本领域普通技术人员将认识到，核苷酸构建体特别是由核糖核苷酸以及核糖核苷酸和
脱氧核糖核苷酸的组合组成的多核苷酸和寡核苷酸也可用于在此披露的方法中。实施例的
核苷酸构建体、核酸和核苷酸序列另外涵盖这种构建体、分子和序列的所有互补形式。此
外，实施例的核苷酸构建体、核苷酸分子和核苷酸序列涵盖能用于实施例的转化植物方法
的所有核苷酸构建体、分子和序列，包括但不限于由脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸及其组合所构成的那些。所述脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子和合成类似物二
者。实施例的核苷酸构建体、核酸和核苷酸序列还涵盖核苷酸构建体的所有形式，这些形式包括但不限于单链形式、双链形式、发夹、茎环结构等。

[0179] 另一实施例涉及转化的生物体，如选自以下各项的生物体：植物和昆虫细胞、细菌、酵母、杆状病毒、原生动物、线虫和藻的生物体。转化的生物体包含实施例的DNA分子、包含DNA分子的表达盒或包含表达盒的载体，它可以稳定地并入所转化生物体的基因组。

[0180] 在DNA构建体中提供实施例的序列，用于在感兴趣的生物体中表达。该构建体将包括有效地连接至实施例的序列的5′和3′的调节序列。如在此使用的术语“有效地连接”是指启动子和第二序列之间的功能性连接，其中启动子序列启动并介导相应于第二序列的DNA
序列的转录。通常，有效地连接意味着所连接的核酸序列是连续的，并且在必要时在相同阅读框中连接两个蛋白质编码区域。该构建体可以另外包含待共转化进生物体的至少一个另
外的基因。可替代地，可以在多DNA构建体上提供另外的基因。

[0181] 这种DNA构建体具有多个用于插入杀昆虫多肽基因序列的限制性位点，该杀昆虫多肽基因序列将位于调节性区域的转录调节之下。该DNA构建体可以另外包含可选标记基
因。

[0182] 按5′到3′的转录方向，DNA构建体将通常包括：转录和翻译起始区域(即，启动子)、实施例的DNA序列以及在用作宿主的生物体内具有功能的转录和翻译终止区域(即，终止区域)。转录起始区域(即，启动子)对于实施例的宿主生物体和/或序列，可以是天然的、类似的、外源的或异源的。此外，该启动子可以是自然序列或者，可替代地，是合成序列。如在此使用的术语“外源”表示在引入启动子的天然生物体中没有发现启动子。在启动子对于实施例的序列而言是“外源的”或“异源的”的情况下，它是指该启动子对于实施例的有效地连接的序列而言不是天然的或天然存在的启动子。如在此使用的，嵌合基因包含有效地连接至
与编码序列异源的转录起始区域的编码序列。当启动子是天然或自然的序列时，有效地连
接的序列的表达改造自野生型表达，这导致表型的改变。

[0183] 在一些实施例中，DNA构建体还可以包括转录增强子序列。如在此使用的，术语“增强子”是指可以刺激启动子活性的DNA序列，并且可以是插入以增强启动子的水平或组织特异性的启动子的先天元件或异源元件。各种增强子是本领域已知的，包括例如，在植物中具有基因表达增强特性的内含子(美国专利申请公开号2009/0144863)、泛素内含子(即，玉蜀黍泛素内含子1(参见，例如，NCBI序列S94464；Christensen and Quail(1996)Transgenic Res.5：213‑218；Christensen et al.(1992)Plant Molecular Biology 18：675‑689[Christensen和Quail，(1996)，转基因研究，5：213‑218；Christensen等人，(1992)，植物分子生物学，18：675‑689]))、ω增强子或ω主要增强子(Gallie，et al.，(1989)Molecular Biology of RNA ed.Cech(Liss，New York)237‑256 and Gallie，et al.，(1987)Gene 60：
217‑25[Gallie等人，(1989)，RNA的分子生物学，编辑：Cech(丽丝，纽约)237‑256和Gallie等人，(1987)，基因，60：217‑25])、CaMV 35S增强子(参见，例如，Benfey，et al.，(1990)EMBO J.9：1685‑96[Benfey等人，(1990)，欧洲分子生物学杂志，9：1685‑96])、玉蜀黍AdhI内含子(Kyozuka et al.(1991)Mol.Gen.Genet.228：40‑48；Kyozuka et al.(1990)
Maydica 35：353‑357[Kyozuka等人，(1991)，分子遗传和基因组学，228：40‑48；Kyozuka等人，(1990)，Maydica，35：353‑357])和也可以使用的美国专利号7,803,992的增强子，其中每一个通过引用并入。以上转录增强子的列表并不意指是限制性的。任何合适的转录增强
子都可用于实施例中。

[0184] 该终止区域与该转录起始区域在一起可以是天然的、与感兴趣的有效地连接的DNA序列在一起可以是天然的、与该植物宿主在一起可以是天然的、或者可以源自另一种来源(即，对于该启动子、该感兴趣的序列、该植物宿主或其任何组合是外源的或异源的)。

[0185] 方便的终止区域可从根瘤土壤杆菌的Ti‑质粒获得，如章鱼碱合酶和胭脂氨酸合酶终止区域。还参见，Guerineau，et al.，(1991)Mol.Gen.Genet.262：141‑144；Proudfoot，(1991)Cell 64：671‑674；Sanfacon，et al.，(1991)Genes Dev.5：141‑149；Mogen，et al.，(1990)Plant Cell 2：1261‑1272；Munroe，et al.，(1990)Gene 91：151‑158；Ballas，et al.，(1989)Nucleic Acids Res.17：7891‑7903 and Joshi，et al.，(1987)Nucleic Acid Res.15：9627‑9639[Guerineau等人，(1991)，分子遗传和基因组学，262：141‑144；
Proudfoot，(1991)，细胞，64：671‑674；Sanfacon等人，(1991)，基因与发育，5：141‑149；
Mogen等人，(1990)，植物细胞，2：1261‑1272；Munroe等人，(1990)，基因，91：151‑158；
Ballas等人，(1989)，核酸研究，17：7891‑7903和Joshi等人，(1987)，核酸研究，15：9627‑
9639]。

[0186] 适当时可以优化核酸以增加在宿主生物体中的表达。因此，当宿主生物体是植物时，合成核酸可以使用植物优先的密码子合成以改进表达。对于宿主优先的密码子使用的
讨论，参见，例如，Campbell and Gowri，(1990)Plant Physiol.92：1‑11[Campbell和
Gowri，(1990)，植物生理学，92：1‑11]。例如，虽然在单子叶和双子叶植物物种中均可以表达实施例的核酸序列，但是可以修饰序列，以解决单子叶或双子叶植物特异的密码子偏好
和GC含量偏好，这是因为这些偏好已经表现出了差异(Murray et al.(1989)Nucleic 
Acids Res.17：477‑498[Murray等人，(1989)，核酸研究，17：477‑498])。因而，特定氨基酸的玉蜀黍优先的密码子可以源自玉蜀黍的已知基因序列。来自玉蜀黍植物的28种基因的玉
蜀黍密码子使用在Murray等人(同上)的表4中列出。本领域中可获得用于合成植物优先的
基因的方法。参见，例如，美国专利号5,380,831和5,436,391，和Murray，et al.，(1989)Nucleic Acids Res.17：477‑498，and Liu H et al.Mol Bio Rep 37：677‑684，2010
[Murray等人，(1989)，核酸研究，17：477‑498，和Liu H等人，分子生物学报告，37：677‑684，
2010]，其通过引用结合在此。玉蜀黍密码子使用表也可以在kazusa.or．jp/codon/cgi‑
bin/showcodon.cgi？species＝4577上找到，其可以使用www前缀进行访问。表2显示玉蜀黍最佳密码子分析(改编自Liu H et al.Mol Bio Rep 37：677‑684，2010[Liu H等人，分子生物学报告，37：677‑684，2010])。

[0187] 表2

[0188]

[0189] 使用卡方列联测试(Chi squared contingency test)比较密码子使用，以鉴定最佳密码子。出现明显更频繁的密码子(P\0.01)用星号表示。

[0190] 大豆密码子使用表如表3所示，并且也可以在kazusa.or.jp/codon/cgi‑bin/showcodon.cgi？species＝3847&aa＝1&style＝N上找到，其可以使用www前缀进行访问。

[0191] 表3

[0192] TTT F 21.2 (10493) TCT S 18.4 (9107)TTC F 21.2 (10487) TCC S 12.9 (6409)
TTA L 9.2 (4545) TCA S 15.6 (7712)
TTG L 22.9 (11340) TCG S 4.8 (2397)
CTT L 23.9 (11829) CCT P 18.9 (9358)
CTC L 17.1 (8479) CCC P 10.1 (5010)
CTA L 8.5 (4216) CCA P 19.1 (9461)
CTG L 12.7 (6304) CCG P 4.7 (2312)
ATT I 25.1 (12411) ACT T 17.1 (8490)
ATC I 16.3 (8071) ACC T 14.3 (7100)
ATA I 12.9 (6386) ACA T 14.9 (7391)
ATG M 22.7 (11218) ACG T 4.3 (2147)
GTT V 26.1 (12911) GCT A 26.7 (13201)
GTC V 11.9 (5894) GCC A 16.2 (8026)
GTA V 7.7 (3803) GCA A 21.4 (10577)
GTG V 21.4 (10610) GCG A 6.3 (3123)
TAT Y 15.7 (7779) TGT C 8.1 (3995)
TAC Y 14.9 (7367) TGC C 8.0 (3980)
TAA * 0.9 (463) TGA * 1.0 (480)
TAG * 0.5 (263) TGG W 13.0 (6412)
CAT H 14.0 (6930) CGT R 6.6 (3291)
CAC H 11.6 (5759) CGC R 6.2 (3093)
CAA Q 20.5 (10162) CGA R 4.1 (2018)
CAG Q 16.2 (8038) CGG R 3.1 (1510)
AAT N 22.4 (11088) AGT S 12.6 (6237)
AAC N 22.8 (11284) AGC S 11.3 (5594)
AAA K 26.9 (13334) AGA R 14.8 (7337)
AAG K 35.9 (17797) AGG R 13.3 (6574)
GAT D 32.4 (16040) GGT G 20.9 (10353)
GAC D 20.4 (10097) GGC G 13.4 (6650)
GAA E 33.2 (16438) GGA G 22.3 (11022)
GAG E 33.2 (16426) GGG G 13.0 (6431)

[0193] 在一些实施例中，编码本披露的杀昆虫多肽的重组核酸分子具有玉蜀黍优化的密码子。

[0194] 已知另外的序列修饰增强细胞宿主中的基因表达。这些包括清除序列，这些序列编码假的聚腺苷化信号、外显子‑内含子剪接位点信号、转座子样重复和可能不利于基因表达的其他良好表征的序列。可以将序列的GC含量调整至给定细胞宿主的平均水平，如参考
在该宿主细胞中表达的已知基因而计算的。如在此使用的术语“宿主细胞”是指包含载体并支持表达载体的复制和/或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌，或真核细胞如酵母、昆虫、两栖类或哺乳动物细胞、或单子叶或双子叶植物细胞。单子叶宿主细胞的实例是玉蜀黍宿主细胞。当可能时，修饰序列以避免出现预测的发夹二级mRNA结构。

[0195] 表达盒可以另外包含5′前导序列。这些前导序列可以起到增强翻译的作用。翻译前导序列是本领域已知的并且包括：小核糖核酸病毒前导序列，例如，EMCV前导序列(脑心肌炎5’非编码区域)(Elroy‑Stein，et al.，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6126‑
6130[Elroy‑Stein等人，(1989)，美国国家科学院院刊，86：6126‑6130])；马铃薯Y病毒组前导序列，例如，TEV前导序列(烟草蚀纹病毒)(Gallie，et al.，(1995)Gene 165(2)：233‑238[Gallie等人，(1995)，基因，165(2)：233‑238])；MDMV前导序列(玉蜀黍矮花叶病毒)、人类免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak，et al.，(1991)Nature 353：90‑94[Macejak等人，(1991)，自然，353：90‑94])；来自苜蓿花叶病病毒的外壳蛋白mRNA的非翻译前导序列(AMV RNA 4)(Jobling，et al.，(1987)Nature 325：622‑625[Jobling等人，(1987)，自然，
325：622‑625])；烟草花叶病毒前导序列(TMV)(Gallie，et al.，(1989)in Molecular 
Biology of RNA，ed.Cech(Liss，New York)，pp.237‑256[Gallie等人，(1989)，在：RNA的分子生物学，编辑：Cech(丽丝，纽约)，第237‑256页])；和玉蜀黍褪绿斑驳病毒前导序列
(MCMV)(Lommel，et al.，(1991)Virology 81：382‑385[Lommel等人，(1991)，病毒学，81：
382‑385])。还参见，Della‑Cioppa，et al.，(1987)Plant Physiol.84：965‑968[Della‑Cioppa等人，(1987)，植物生理学，84：965‑968]。此类构建体还可以包含“信号序列”或“前导序列”，以促进该肽的共翻译成或翻译后运输至某些细胞内结构，如叶绿体(或其他质
体)、内质网或高尔基体。

[0196] 如在此使用的“信号序列”是指已知或怀疑导致跨细胞膜的共翻译或翻译后肽运输。在真核生物中，这典型地涉及分泌到高尔基体内，其中具有某些产生的糖基化。细菌的杀昆虫毒素经常被合成为原毒素，它们是在该靶有害生物的肠中经蛋白水解激活(Chang，
(1987)Methods Enzymol.153：507‑516[Chang，(1987)，酶学方法，153：507‑516])。在一些实施例中，该信号序列位于该天然的序列中，或可以源自实施例的序列。如在此使用的术语“前导序列”是指当翻译时产生足以引发肽链与亚细胞器的共翻译转运的氨基酸序列的任
何序列。因此，这包括通过进入内质网内、进入液泡、质体(包括叶绿体、线粒体)等中来对运输和/或糖基化进行靶向的前导序列。靶向叶绿体类囊体腔室的核编码蛋白具有由基质靶
向信号肽和腔靶向信号肽组成的特征二分转运肽。基质靶向信息位于转运肽的氨基‑近端
部分。腔靶向信号肽位于转运肽的羧基近端部分，并且包含用于靶向腔的所有信息。最近对高等植物叶绿体的蛋白质组学的研究已经在许多核编码的腔蛋白质的鉴定中实现
(Kieselbach et al.FEBS LETT 480：271‑276，2000；Peltier et al.Plant Cell 12：319‑
341，2000；Bricker et al.Biochim.Biophys Acta 1503：350‑356，2001[Kieselbach等人，欧洲生化学会联盟通讯，480：271‑276，2000；Peltier等人，植物细胞，12：319‑341，2000；
Bricker等人，生物化学与生物物理学报，1503：350‑356，2001])，根据本披露可能使用该核编码的腔蛋白质的腔靶向信号肽。Kieselbach et al.，Photosynthesis Research，78：
249‑264，2003[Kieselbach等人，“光合作用研究”，78：249‑264，2003]报道了来自拟南芥属约80种蛋白质以及来自菠菜和豌豆的同源蛋白质。特别地，该出版物的表2(其通过引用并
入本说明书中)披露了通过其登录号鉴别的来自叶绿体腔的85种蛋白质(还参见美国专利
申请公开2009/09044298)。此外，最近公开的水稻基因组草拟版本(Goff et al，Science 
296：92‑100，2002[Goff等人，科学，296：92‑100，2002])是可以根据本披露使用的用于腔靶向信号肽的合适来源。

[0197] 本领域技术人员熟知的合适的叶绿体转运肽(CTP)还包含嵌合CTP，这些嵌合CTP包括但不限于：来自以下各项的CTP的N末端结构域、中心结构域或C末端结构域：水稻1‑脱氧‑D木酮糖‑5‑磷酸合酶、水稻‑超氧化物歧化酶、水稻‑可溶性淀粉合酶、水稻‑NADP‑依赖性苹果酸酶、水稻‑磷酸2‑脱氢‑3‑脱氧庚酸醛缩酶2、水稻‑L‑抗坏血酸过氧化物酶5、水稻‑磷酸葡聚糖水二激酶、玉蜀黍ssRUBISCO、玉蜀黍‑β‑葡糖苷酶、玉蜀黍‑苹果酸脱氢酶、玉蜀黍硫氧还蛋白M‑型(美国专利申请公开2012/0304336)。美国专利公开物US 20130205440 
A1、US 20130205441 A1和US 20130210114 A1的叶绿体转运肽。

[0198] 可以针对在叶绿体中的表达来优化待靶向该叶绿体的杀昆虫基因，以解决植物核与该细胞器之间密码子使用的差异。以此方式，感兴趣的核酸可使用叶绿体优先的密码子
进行合成。参见，例如，美国专利号5,380,831，其通过引用结合在此。

[0199] 在制备表达盒时，可以操作各种DNA片段，以提供处于适当方向以及合适时，处于适当阅读框中的DNA序列。为此，可使用衔接子(adapter)或接头以连接DNA片段，或可以涉及其他操纵以提供方便的限制位点、去除多余的DNA、去除限制位点等。出于这个目的，可以涉及体外诱变、引物修复、限制性酶切(restriction)、退火、再取代(例如转换和颠换)。

[0200] 许多启动子可用于实施这些实施例。可基于所需结果，选择启动子。核酸可与组成性、组织优先的、可诱导的或其他启动子组合用于在宿主生物体中的表达。用于植物宿主细胞的适合的组成型启动子包括例如Rsyn7启动子的核心启动子以及披露于WO 1999/43838和美国专利号6,072,050中的其他组成型启动子；核心CaMV35S启动子(Odell，et al.，
(1985)Nature 313：810‑812[Odell等人，(1985)，自然，313：810‑812])；水稻肌动蛋白(McElroy，et al.，(1990)Plant Cell 2：163‑171[McElroy等人，(1990)，植物细胞，2：163‑
171])；泛素(Christensen，et  al.，(1989)Plant Mol.Biol.12：619‑632 and 
Christensen，et al.，(1992)Plant Mol.Biol.18：675‑689[Christensen等人，(1989)，植物分子生物学，12：619‑632和Christensen等人，(1992)，植物分子生物学，18：675‑689])；
pEMU(Last，et al.，(1991)Theor.Appl.Genet.81：581‑588[Last等人，(1991)，理论与应用遗传学，81：581‑588])；MAS(Velten，et al.，(1984)EMBO J.3：2723‑2730[Velten等人，(1984)，欧洲分子生物学杂志，3：2723‑2730])；ALS启动子(美国专利号5,659,026)等。其他组成型启动子包括例如美国专利号5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,
785、5,399,680、5,268,463、5,608,142和6,177,611中所讨论的那些。合适的组成型启动子还包括在几乎所有组织中具有强表达但在花粉中具有低表达的启动子，这些启动子包括但
不限于：美国专利US 8,338,662中所披露的香蕉条斑病毒(Acuminata Yunnan)启动子(BSV
(AY))、美国专利US 8,350,121中所披露的香蕉条斑病毒(Acuminata Vietnam)启动子(BSV
(AV))、和美国专利US 8,395,022中所披露的香蕉条斑病毒(Mysore)启动子(BSV(MYS))。

[0201] 根据期望的结果，从诱导型启动子表达基因可能是有益的。用于调节植物中实施例的核苷酸序列表达的特别感兴趣的是伤口诱导型启动子。这种伤口诱导型启动子可能对
昆虫摄食引起的损害作出反应，并且包括马铃薯蛋白酶抑制剂(pin II)基因(Ryan，(1990)Ann.Rev.Phytopath.28：425‑449；Duan，et al.，(1996)Nature Biotechnology 14：494‑
498[Ryan，(1990)，植物病理学年评，28：425‑449；Duan等人，(1996)，自然生物技术，14：
494‑498])；wun1和wun2(美国专利号5，428，148)；win1和win2(Stanford，et al.，(1989)Mol.Gen.Genet.215：200‑208[Stanford等人，(1989)，分子遗传和基因组学，215：200‑
208])；系统素(McGurl，et al.，(1992)Science 225：1570‑1573[McGurl等人，(1992)，科学，225：1570‑1573])；WIP1(Rohmeier，et al.，(1993)Plant Mol.Biol.22：783‑792；
Eckelkamp，et al.，(1993)FEBS Letters 323：73‑76[Rohmeier等人，(1993)，植物分子生物学，22：783‑792；Eckelkamp等人，(1993)，欧洲生化学会联盟通讯，323：73‑76])；MPI基因(Corderok，et al.，(1994)Plant J.6(2)：141‑150[Corderok等人，(1994)，植物杂志，6(2)：141‑150])等，其通过引用结合在此。

[0202] 此外，可以在实施例的方法和核苷酸构建体中使用病原体诱导型启动子。此类病原体诱导型启动子包括来自病程相关蛋白(PR蛋白)的那些，这些病程相关蛋白在由病原体
侵染后被诱导；例如PR蛋白、SAR蛋白、β‑1，3‑葡聚糖酶、几丁质酶等。参见，例如，Redolfi，et al.，(1983)Neth.J.Plant Pathol.89：245‑254；Uknes，et al.，(1992)Plant Cell 4：
645‑656and Van Loon，(1985)Plant Mol.Virol.4：111‑116[Redolfi等人，(1983)，荷兰植物病理学杂志，89：245‑254；Uknes等人，(1992)，植物细胞，4：645‑656；以及Van Loon，(1985)，植物分子病毒学，4：111‑116]。还参见，WO 1999/43819，其通过引用结合在此。

[0203] 感兴趣的是在病原体侵染部位处或附近局部表达的启动子。参见，例如，Marineau，et al.，(1987)Plant Mol.Biol.9：335‑342；Matton，et al.，(1989)Molecular Plant‑Microbe Interactions  2：325‑331；Somsisch，et  al.，(1986)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：2427‑2430；Somsisch，et al.，(1988)Mol.Gen.Genet.2：93‑
98 and Yang，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：14972‑14977[Marineau等人，(1987)，植物分子生物学，9：335‑342；Matton等人，(1989)，分子植物‑微生物相互作用，2：325‑331；
Somsisch等人，(1986)，美国国家科学院院刊，83：2427‑2430；Somsisch等人，(1988)，分子遗传和基因组学，2：93‑98和Yang，(1996)，美国国家科学院院刊，93：14972‑14977]。还参见，Chen，et  al.，(1996)Plant  J.10：955‑966；Zhang，et  al.，(1994)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：2507‑2511；Warner，et al.，(1993)Plant J.3：191‑201；
Siebertz，et al.，(1989)Plant Cell 1：961‑968[Chen等人，(1996)，植物杂志，10：955‑
966；Zhang等人，(1994)，美国国家科学院院刊，91：2507‑2511；Wamer等人，(1993)，植物杂志，3：191‑201；Siebertz等人，(1989)，植物细胞，1：961‑968]；美国专利号5,750,386(线虫诱导的)，以及在其中引用的参考文献。特别感兴趣的是玉蜀黍PRms基因的诱导型启动子，该基因的表达是由病原体串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)诱导(参见，例如，Cordero，et al.，(1992)Physiol.Mol.Plant Path.41：189‑200[Cordero等人，(1992)，生理与分子植物病理学，41：189‑200])。

[0204] 可以使用化学调节型启动子以通过应用外源化学调节剂来调节植物中的基因表达。根据目标，启动子可以是化学诱导型启动子，其中施用化学品来诱导基因表达，或化学抑制型启动子，其中施用化学品来抑制基因表达。化学品诱导型启动子在本领域中是已知
的，并且包括但不限于：玉蜀黍In2‑2启动子(其由苯磺酰胺除草剂安全剂激活)、玉蜀黍GST启动子(其由用作发芽前除草剂的疏水亲电子化合物激活)、以及烟草PR‑1a启动子(其由水杨酸激活)。其他感兴趣的化学品调节型启动子包括类固醇应答启动子(参见，例如，
Schena，et al.，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10421‑10425 and McNellis，et al.，(1998)Plant J.14(2)：247‑257[Schena等人，(1991)，美国国家科学院院刊，88：
10421‑10425和McNellis等人，(1998)，植物杂志，14(2)：247‑257]中的糖皮质激素诱导型启动子)以及四环素诱导型和四环素抑制型启动子(参见，例如，Gatz，et al.，(1991)
Mol.Gen.Genet.227：229‑237[Gatz等人，(1991)，分子遗传学和基因组学，227：229‑237]，以及美国专利号5,814,618和5,789,156)，其通过引用结合在此。

[0205] 组织优先的启动子可以用于靶向特定植物组织内的增强的杀昆虫多肽表达。组织优先的启动子包括以下各项中讨论的那些：Yamamoto，et al.，(1997)Plant J.12(2)255‑
265；Kawamata，et al.，(1997)Plant Cell Physiol.38(7)：792‑803；Hansen，et al.，(1997)Mol.Gen Genet.254(3)：337‑343；Russell，et al.，(1997)Transgenic Res.6(2)：
157‑168；Rinehart，et al.，(1996)Plant Physiol.112(3)：1331‑1341；Van Camp，et al.，(1996)Plant Physiol.112(2)：525‑535；Canevascini，et al.，(1996)Plant Physiol.112(2)：513‑524；Yamamoto，et al.，(1994)Plant Cell Physiol.35(5)：773‑778；Lam，(1994)Results Probl.Cell Differ.20：181‑196；Orozco，et al.，(1993)Plant Mol Biol.23(6)：1129‑1138；Matsuoka，et al.，(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA 90(20)：9586‑
9590and Guevara‑Garcia，et al.，(1993)Plant J.4(3)：495‑505[Yamamoto等人，(1997)，植物杂志，12(2)255‑265；Kawamata等人，(1997)，植物细胞生理学，38(7)：792‑803；Hansen等人，(1997)，分子遗传和基因组学，254(3)：337‑343；Russell等人，(1997)，转基因研究，6(2)：157‑168；Rinehart等人，(1996)，植物生理学，112(3)：1331‑1341；Van Camp等人，(1996)，植物生理学，112(2)：525‑535；Canevascini等人，(1996)，植物生理学，112(2)：
513‑524；Yamamoto等人，(1994)，植物细胞生理学，35(5)：773‑778；Lam，(1994)，细胞分化中的结果和问题，20：181‑196；Orozco等人，(1993)，植物分子生物学，23(6)：1129‑1138；
Matsuoka等人，(1993)，美国国家科学院院刊，90(20)：9586‑9590和Guevara‑Garcia等人，(1993)，植物杂志，4(3)：495‑505]。必要的话，此类启动子可经修饰用于弱表达。

[0206] 叶子优先的启动子在本领域中是已知的。参见，例如，Yamamoto，et al.，(1997)Plant J.12(2)：255‑265；Kwon，et al.，(1994)Plant Physiol.105：357‑67；Yamamoto，et al.，(1994)Plant Cell Physiol.35(5)：773‑778；Gotor，et al.，(1993)Plant J.3：509‑18；Orozco，et al.，(1993)Plant Mol.Biol.23(6)：1129‑1138 and Matsuoka，et al.，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(20)：9586‑9590[Yamamoto等人，(1997)，植物杂志，12(2)：255‑265；Kwon等人，(1994)，织物生理学，105：357‑67；Yamamoto等人，(1994)，植物细胞生理学，35(5)：773‑778；Gotor等人，(1993)，植物细胞，3：509‑18；Orozco等人，(1993)，植物分子生物学，23(6)：1129‑1138和Matsuoka等人，(1993)，美国国家科学院院刊，90(20)：9586‑9590]。

[0207] 根优先的或根特异性的启动子是已知的，并且可以从来自文献中的许多可获得的来选择，或者从不同的相容物种重新分离。参见，例如，Hire，et al.，(1992)Plant 
Mol.Biol.20(2)：207‑218[Hire等人，(1992)，植物分子生物学，20(2)：207‑218](大豆根特异性谷氨酰胺合成酶基因)；Keller and Baumgartner，(1991)Plant Cell 3(10)：1051‑
1061[Keller和Baumgartner，(1991)，植物细胞，3(10)：1051‑1061](法国菜豆的GRP 1.8基因中的根特异性控制元件)；Sanger，et al.，(1990)Plant Mol.Biol.14(3)：433‑443
[Sanger等人，(1990)，植物分子生物学，14(3)：433‑443](根癌土壤杆菌的甘露碱合酶
(MAS)基因的根特异性启动子)和Miao，et al.，(1991)Plant Cell 3(1)：11‑22[Miao等人，(1991)，植物细胞，3(1)：11‑22](编码细胞溶质谷氨酰胺合成酶(GS)的全长cDNA克隆，其在大豆的根和根结节中表达)。还参见，Bogusz，et al.，(1990)Plant Cell2(7)：633‑641[Bogusz等人，(1990)，植物细胞，2(7)：633‑641]，其中描述了从来自固氮的非豆科植物榆科山黄麻(Parasponia andersonii)以及相关的非固氮的非豆科植物山黄麻(Trema 
tomentosa)的血红蛋白基因分离的两个根特异性启动子。这些基因的启动子被连接至β‑葡萄糖醛酸酶报道基因并且被引入非豆科植物烟草(Nicotiana tabacum)以及豆科植物百脉
根(Lotus corniculatus)两者中，并且在两个实例中根特异性启动子活性被保留。Leach和Aoyagi(1991)描述了他们对发根土壤杆菌的高表达的roIC和roID根诱导基因的启动子的
分析(参见，Plant Science(Limerick)79(1)：69‑76[植物科学(利默里克)79(1)：69‑76])。
他们推断在那些启动子中增强子和组织优先的DNA决定簇不相关联。Teeri等人(1989)使用
与lacZ的基因融合以显示编码章鱼碱合酶的农杆菌属T‑DNA基因尤其是在根尖的表皮中有
活性，并且TR2′基因在完整植物中具有根特异性并且被叶组织中的创伤刺激，这是与杀昆虫的或杀幼虫的基因一起使用的特征的特别所希望的组合(参见，EMBO J.8(2)：343‑350
[欧洲分子生物学杂志，8(2)：343‑350])。与nptII(新霉素磷酸转移酶II)融合的TR1′基因显示相似的特征。另外的根优先的启动子包括VfENOD‑GRP3基因启动子(Kuster，et al.，(1995)Plant Mol.Biol.29(4)：759‑772[Kuster等人，(1995)，植物分子生物学，29(4)：
759‑772])；和rolB启动子(Capana，et al.，(1994)Plant Mol.Biol.25(4)：681‑691
[Capana等人，(1994)，植物分子生物学，25(4)：681‑691])。还参见，美国专利号5,837,876、
5,750,386、5,633,363、5,459,252、5,401,836、5,110,732和5,023,179。美国专利申请US 
20130117883中披露了拟南芥根优先的调节序列。美国专利申请US 20120210463中披露了
根优先的高粱属(双色高粱)RCc3启动子。

[0208] “种子优先的”启动子包括“种子特异性”启动子(在种子发育期间有活性的那些启动子如种子贮藏蛋白的启动子)以及“种子发芽性”启动子(在种子发芽期间有活性的那些启动子)。参见，Thompson，et al.，(1989)BioEssays 10：108[Thompson等人，(1989)，生物测定，10：108]，其通过引用结合在此。这样的种子优选的启动子包括但不限于Cim1(细胞分裂素诱导的信息)；cZ1981(玉蜀黍19kDa玉蜀黍蛋白)；和milps(肌醇‑1‑磷酸合酶)(参见，美国专利号6,225,529，其通过引用结合在此)。γ‑玉蜀黍蛋白和Glb‑1是胚乳特异性启动子。对于双子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于：库尼兹(Kunitz)胰蛋白酶抑制剂3(KTi3)(Jofuku and Goldberg，(1989)Plant Cell 1：1079‑1093[Jofuku和Goldberg，
(1989)，植物细胞，1：1079‑1093])、豆β‑菜豆素、油菜籽蛋白、β‑伴大豆球蛋白、大豆球蛋白
1、大豆凝集素、十字花科蛋白等。对于单子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于：玉蜀黍15kDa玉蜀黍蛋白、22kDa玉蜀黍蛋白、27kDa玉蜀黍蛋白、g‑玉蜀黍蛋白、蜡质、收缩素1、收缩素2、球蛋白1等。还参见，WO 2000/12733，其中披露了来自end1和end2基因的种子优先的启动子；其通过引用结合在此。在双子叶植物中，种子特异性启动子包括但不限于：来自拟南芥属的种皮启动子，pBAN；和来自拟南芥属的早期种子启动子，p26、p63、和p63tr(美国专利号7,294,760和7,847,153)。在特定组织中具有“优选”表达的启动子在该组织中比在至少一种其他植物组织中更大程度地表达。一些组织优先的启动子几乎专门在特定组织中
表达。

[0209] 当希望低水平表达时，可使用弱启动子。通常，如在此使用的术语“弱启动子”是指以低水平驱动编码序列的表达的启动子。低水平表达旨在约1/1000转录物至约1/100,000转录物至约1/500,000转录物的水平。可替代地，应当认识到，术语“弱启动子”还涵盖仅在少数细胞中驱动表达但不在其他细胞中表达以给出完全低表达水平的启动子。当启动子以
不可接受的高水平驱动表达时，可以删除或修饰部分启动子序列以降低表达水平。

[0210] 这样弱组成型启动子包括，例如，Rsyn7启动子的核心启动子(WO 1999/43838和美国专利号6,072,050)，核心35S CaMV启动子等。其他组成型启动子包括例如美国专利号5,
608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268,463、5,608,142和6,177,611中所讨论的那些，其通过引用结合在此。

[0211] 以上启动子的列表并不意指是限制性的。任何合适的启动子都可用于实施例中。

[0212] 通常，表达盒将包括可选标记基因，用于选择转化的细胞。可选标记基因被利用于选择转化的细胞或组织。标志物基因包括编码抗生素抗性的基因，如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及赋予对除草剂化合物(如草胺磷、溴苯
腈、咪唑啉酮和2，4‑二氯苯氧基乙酸(2，4‑D))的抗性的基因。合适的可选标记基因的另外的实例包括但不限于编码对以下各项具有抗性的基因：氯霉素(Herrera Estrella，et 
al.，(1983)EMBO J.2：987‑992[Herrera Estrella等人，(1983)，欧洲分子生物学杂志，2：
987‑992])；甲氨蝶呤(Herrera Estrella，et al.，(1983)Nature 303：209‑213 and 
Meijer，et al.，(1991)Plant Mol.Biol.16：807‑820[Herrera Estrella等人，(1983)，自然，303：209‑213和Meijer等人，(1991)，植物分子生物学，16：807‑820])；链霉素(Jones，et al.，(1987)Mol.Gen.Genet.210：86‑91[Jones等人，(1987)，分子遗传学和基因组学，210：
86‑91])；链霉素(Bretagne‑Sagnard，et al.，(1996)Transgenic Res.5：131‑137
[Bretagne‑Sagnard等人，(1996)，转基因研究，5：131‑137])；博莱霉素(Hille，et al.，(1990)Plant Mol.Biol.7：171‑176[Hille等人，(1990)，植物分子生物学，7：171‑176])；磺酰胺(Guerineau，et al.，(1990)Plant Mol.Biol.15：127‑136[Guerineau等人，(1990)，植物分子生物学，15：127‑136])；溴苯腈(Stalker，et al.，(1988)Science 242：419‑423[Stalker等人，(1988)，科学，242：419‑423])；草甘膦(Shaw，et al.，(1986)Science 233：
478‑481[Shaw等人，(1986)，科学，233：478‑481]和美国专利申请序列号10/004,357和10/
427,692)；草丁膦(DeBlock，et al.，(1987)EMBO J.6：2513‑2518[DeBlock等人，(1987)，欧洲分子生物学杂志，6：2513‑2518])。通常参见，Yarranton，(1992)Curr.Opin.Biotech.3：
506‑511；Christopherson，et al.，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：6314‑6318；Yao，et al.，(1992)Cell 71：63‑72；Reznikoff，(1992)Mol.Microbiol.6：2419‑2422；Barkley，et al.，(1980)in The Operon，pp.177‑220；Hu，et al.，(1987)Cell 48：555‑566；Brown，et al.，(1987)Cell 49：603‑612；Figge，et al.，(1988)Cell 52：713‑722；Deuschle，et al.，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：5400‑5404；Fuerst，et  al.，(1989)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2549‑2553；Deuschle，et al.，(1990)Science 248：480‑
483；Gossen，(1993)Ph.D.Thesis，University of Heidelberg；Reines，et al.，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：1917‑1921；Labow，et al.，(1990)Mol.Cell.Biol.10：3343‑
3356；Zambretti，et al.，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：3952‑3956；Baim，et al.，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：5072‑5076；Wyborski，et al.，(1991)Nucleic Acids Res.19：4647‑4653；Hillenand‑Wissman，(1989)Topics Mol.Struc.Biol.10：143‑162；
Degenkolb，et al.，(1991)Antimicrob.Agents Chemother.35：1591‑1595；Kleinschnidt，et al.，(1988)Biochemistry 27：1094‑1104；Bonin，(1993)Ph.D.Thesis，University of Heidelberg；Gossen，et al.，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5547‑5551；Oliva，et al.，(1992)Antimicrob.Agents Chemother.36：913‑919；Hlavka，et al.，(1985)Handbook of Experimental Pharmacology，Vol.78(Springer‑Verlag，Berlin)and Gill，et al.，(1988)Nature334：721‑724[Yarranton，(1992)，当前对生物技术的意见，3：506‑511；
Christopherson等人，(1992)，美国国家科学院院刊，89：6314‑6318；Yao等人，(1992)，细胞，71：63‑72；Reznikoff，(1992)，分子微生物学，6：2419‑2422；Barkley等人，(1980)，在：
操纵子，第177‑220页；Hu等人，(1987)，细胞，48：555‑566；Brown等人，(1987)，细胞，49：
603‑612；Figge等人，(1988)，细胞，52：713‑722；Deuschle等人，(1989)，美国国家科学院院刊，86：5400‑5404；Fuerst等人，(1989)，美国国家科学院院刊，86：2549‑2553；Deuschle等人，(1990)，科学，248：480‑483；Gossen，(1993)，博士论文，海德堡大学；Reines等人，(1993)，美国国家科学院院刊，90：1917‑1921；Labow等人，(1990)，分子与细胞生物学，10：
3343‑3356；Zambretti等人，(1992)，美国国家科学院院刊，89：3952‑3956；Baim等人，(1991)，美国国家科学院院刊，88：5072‑5076；Wyborski等人，(1991)，核酸研究，19：4647‑
4653；Hillenand‑Wissman，(1989)，热点分子结构生物学，10：143‑162；Degenkolb等人，(1991)，抗微生物剂化学疗法，35：1591‑1595；Kleinschnidt等人，(1988)，生物化学，27：
1094‑1104；Bonin，(1993)，博士论文，海德堡大学；Gossen等人，(1992)，美国国家科学院院刊，89：5547‑5551；Oliva等人，(1992)，抗微生物剂化学疗法，36：913‑919；Hlavka等人，(1985)，实验药理学手册，第78页，(施普林格出版社，柏林)和Gill等人，(1988)，自然，334：
721‑724]。此类披露通过引用结合在此。

[0213] 以上可选标记基因的列表并不意指是限制性的。在实施例中可以使用任何可选标记基因。

[0214] DNA构建体

[0215] 涵盖编码本公开的杀昆虫多肽的多核苷酸的DNA构建体。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与异源调节元件有效地连接的PIP‑45‑1多肽的多核苷酸。在一些实施例
中，该DNA构建体包含分别编码SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：232、SEQ ID NO：234和SEQ ID NO：236的PIP‑45‑1多肽的SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：150、SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：154、SEQ ID NO：156、SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：218、SEQ ID NO：220或SEQ ID NO：222的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含分别编码SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：234和SEQ ID NO：236的PIP‑45‑1多肽的SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：
146、SEQ ID NO：150、SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：220或SEQ ID NO：222的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码PIP‑45‑1多肽的非基因组核酸分子。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：
9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：
21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：232、SEQ ID NO：234或SEQ ID NO：236的氨基酸序列足够同源并且具有杀昆虫活性的PIP‑45‑1多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：234或SEQ ID NO：236的氨基酸序列足够同源并且具有杀昆虫活性的PIP‑45‑1多肽的多核苷酸。“足够同源的”在此用于是指使用在此所述的这些比对程序中的一个，使用标准参数，与参比序列相比，具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、
81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、99％或更大序列同源性的氨基酸序列。本领域技术人员将认识到，考虑到氨基酸相似性等，可以适当地调整这些值以确定的蛋白质的相应同源性。在一些实施例中，序列同源性针对PIP‑45‑1多肽的全长序列。

[0216] 在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：232、SEQ ID NO：234或SEQ ID NO：236相比具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、
86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性并且具有杀昆虫活性的PIP‑45‑1多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：234或SEQ ID NO：236相比具有至少约50％、55％、
60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或更高序列同一性并且具有杀昆虫活性的PIP‑45‑1多肽的多核苷酸。

[0217] 在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：1相比具有至少99.1％或更高序列同一性的PIP‑45‑1多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：17相比具有至少99.4％或更高序列同一性的PIP‑45‑1多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：19相比具有至少99.6％或更高序列同一性的
PIP‑45‑1多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：21相比具有至少87％或更高序列同一性的PIP‑45‑1多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：23相比具有至少88％或更高序列同一性的PIP‑45‑1多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：27相比具有至少99.1％或更高序列同一性的PIP‑45‑1多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：29相比具有至少99.8％或更高序列同一性的PIP‑45‑1多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：31相比具有至少92.3％或更高序列同一性的PIP‑
45‑1多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：33相比具有至少91.1％或更高序列同一性的PIP‑45‑1多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：35相比具有至少95.4％或更高序列同一性的PIP‑45‑1多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：39相比具有至少93％或更高序列同一性的PIP‑45‑1多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：
43相比具有至少97.5％或更高序列同一性的PIP‑45‑1多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：45相比具有至少70％或更高序列同一性的PIP‑45‑1多肽的多核苷酸。

[0218] 本披露还涵盖了包含编码PIP‑45‑2多肽的多核苷酸的转基因植物或植物细胞。在一些实施例中，该DNA构建体包含分别编码SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：233、SEQ ID NO：235和SEQ ID NO：237的PIP‑45‑2多肽的SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：
145、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：151、SEQ ID NO：153、SEQ ID NO：155、SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：219、SEQ ID NO：221或SEQ ID NO：223的多核苷酸。
在一些实施例中，该DNA构建体包含分别编码SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：
34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：235和SEQ ID NO：237的PIP‑45‑2多肽的SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：
129、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：151、SEQ ID NO：153、SEQ ID NO：221或SEQ ID NO：
223的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码PIP‑45‑2多肽的非基因组核酸分子。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：
30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：233、SEQ ID NO：235和SEQ ID NO：237的氨基酸序列足够同源并且具有杀昆虫活性的PIP‑45‑2多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：235或SEQ ID NO：237的氨基酸序列足够同源并且具有杀昆虫活性的PIP‑45‑2多肽的多核苷酸。“足够同源的”在此用于是指使用在此所述的这些比对程序中的一个，使用标准参数，与参比序列相比，具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、
75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同源性的氨基酸序列。本领域技术人员将认识到，考虑到氨基酸相似性等，可以适当地调整这些值以确定的蛋白质的相应同源性。在一些实施例中，序列同源性针对PIP‑45‑2多肽的全长序列。

[0219] 在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：233、SEQ ID NO：235或SEQ ID NO：237相比具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、
86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性并且具有杀昆虫活性的PIP‑45‑2多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：235或SEQ ID NO：237相比具有至少约50％、55％、
60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或更高序列同一性并且具有杀昆虫活性的PIP‑45‑2多肽的多核苷酸。

[0220] 在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：2相比具有至少99.2％或更高序列同一性的PIP‑45‑2多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：18相比具有至少98.5％或更高序列同一性的PIP‑45‑2多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：20相比具有至少96％或更高序列同一性的PIP‑
45‑2多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：22相比具有至少80％或更高序列同一性的PIP‑45‑2多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：24相比具有至少81％或更高序列同一性的PIP‑45‑2多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：28相比具有至少99.5％或更高序列同
一性的PIP‑45‑2多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：30相比具有至少98.5％或更高序列同一性的PIP‑45‑2多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：32相比具有至少92％或更高序列同一性的PIP‑45‑2多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：34相比具有至少91.5％或更高序列同一性的PIP‑45‑2多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：36相比具有至少70％或更高序列同一性的PIP‑45‑2多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：40相比具有至少90％或更高序列同一性的
PIP‑45‑2多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：44相比具有至少94％或更高序列同一性的PIP‑45‑2多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：46相比具有至少70％或更高序列同一性的PIP‑45‑2多肽的多核苷酸。

[0221] 本披露还涵盖了包含编码PIP‑64‑1多肽的多核苷酸的转基因植物或植物细胞。在一些实施例中，该DNA构建体包含分别编码SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71和SEQ ID NO：238的PIP‑64‑1多肽的SEQ ID NO：160、SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：165、SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：171、SEQ ID NO：172、SEQ ID NO：
174、SEQ ID NO：176、SEQ ID NO：178或SEQ ID NO：224的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：238的PIP‑64‑1多肽的SEQ ID NO：160、SEQ ID NO：165或SEQ ID NO：224的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码PIP‑64‑1多肽的非基因组核酸分子。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71或SEQ ID NO：238的氨基酸序列足够同源并且具有杀昆虫活性的PIP‑64‑1多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：238的氨基酸序列足够同源并且具有杀昆虫活性的PIP‑64‑1多肽的多核苷酸。“足够同源的”在此用于是指使用在此所述的这些比对程序中的一个，使用标准参数，与参比序列相比，具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、
71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、
86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同源性的氨基酸序列。本领域技术人员将认识到，考虑到氨基酸相似性等，可以适当地调整这些值以确定的蛋白质的相应同源性。在一些实施例中，序列同源性针对PIP‑64‑1多肽的全长序列。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71或SEQ ID NO：238相比具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、
71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、
86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的PIP‑64‑1多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：238相比具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、71％、
72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、
87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的PIP‑64‑1多肽的多核苷酸。

[0222] 在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：53相比具有至少75％或更高序列同一性的PIP‑64‑1多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：58相比具有至少99.7％或更高序列同一性的PIP‑64‑1多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：238相比具有至少75％或更高序列同一性的PIP‑
64‑1多肽的多核苷酸。

[0223] 本披露还涵盖了包含编码PIP‑64‑2多肽的多核苷酸的转基因植物或植物细胞。在一些实施例中，该DNA构建体包含分别编码SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72和SEQ ID NO：239的PIP‑64‑2多肽的SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：164、SEQ ID NO：166、SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：170、SEQ ID NO：173、SEQ ID NO：
175、SEQ ID NO：177、SEQ ID NO：179或SEQ ID NO：225的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含分别编码SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：239的PIP‑
64‑2多肽的SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：166或SEQ ID NO：225的多核苷酸。
在一些实施例中，该DNA构建体包含编码PIP‑64‑2多肽的非基因组核酸分子。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：239的氨基酸序列足够同源并且具有杀昆虫活性的PIP‑64‑2多肽的多核苷
酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：59或SEQ ID NO：239的氨基酸序列足够同源并且具有杀昆虫活性的PIP‑64‑2多肽的多核苷
酸。“足够同源的”在此用于是指使用在此所述的这些比对程序中的一个，使用标准参数，与参比序列相比，具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、
76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同源性的氨基酸序列。本领域技术人员将认识到，考虑到氨基酸相似性等，可以适当地调整这些值以确定的蛋白质的
相应同源性。在一些实施例中，序列同源性针对PIP‑64‑2多肽的全长序列。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：239相比具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、
75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性并且具有杀昆虫活性的PIP‑64‑2多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：
54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：59或SEQ ID NO：239相比具有至少约50％、55％、60％、65％、
70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性并且具有杀昆虫活性的PIP‑64‑2多肽的多核苷酸。

[0224] 在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：54相比具有至少70％或更高序列同一性的PIP‑64‑2多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：55相比具有至少70％或更高序列同一性的PIP‑64‑2多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：59相比具有至少91％或更高序列同一性的PIP‑64‑
2多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：239相比具有至少
70％或更高序列同一性的PIP‑64‑2多肽的多核苷酸。

[0225] 本披露还涵盖了包含编码PIP‑74‑1多肽的多核苷酸的转基因植物或植物细胞。在一些实施例中，该DNA构建体包含分别编码SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75和SEQ ID NO：77的PIP‑74‑1多肽的SEQ ID NO：180、SEQ ID NO：182或SEQ ID NO：184的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码PIP‑74‑1多肽的非基因组核酸分子。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75或SEQ ID NO：77的氨基酸序列足够同源并且具有杀昆虫活性的PIP‑74‑1多肽的多核苷酸。“足够同源的”在此用于是指使用在此所述的这些比对程序中的一个，使用标准参数，与参比序列相比，具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、
84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、
99％或更大序列同源性的氨基酸序列。本领域技术人员将认识到，考虑到氨基酸相似性等，可以适当地调整这些值以确定的蛋白质的相应同源性。在一些实施例中，序列同源性针对
PIP‑74‑1多肽的全长序列。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：
75或SEQ ID NO：77相比具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、
75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的PIP‑74‑1多肽。

[0226] 在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：73相比具有至少75％或更高序列同一性的PIP‑74‑1多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：75相比具有至少75％或更高序列同一性的PIP‑74‑1多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：77相比具有至少75％或更高序列同一性的PIP‑74‑
1多肽的多核苷酸。

[0227] 本披露还涵盖了包含编码PIP‑74‑2多肽的多核苷酸的转基因植物或植物细胞。在一些实施例中，该DNA构建体包含分别编码SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：76和SEQ ID NO：78的PIP‑74‑2多肽的SEQ ID NO：181、SEQ ID NO：183、SEQ ID NO：185的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码PIP‑74‑2多肽的非基因组核酸分子。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：76或SEQ ID NO：78的氨基酸序列足够同源并且具有杀昆虫活性的PIP‑74‑2多肽。“足够同源的”在此用于是指使用在此所述的这些比对程序中的一个，使用标准参数，与参比序列相比，具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、
87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同源性的氨基酸序列。本领域技术人员将认识到，考虑到氨基酸相似性等，可以适当地调整这些值以确定的蛋白质的相应同源性。在一些实施例中，序列同源性针对PIP‑74‑2多肽的全长序列。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：76或SEQ ID NO：78相比具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、
78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的PIP‑74‑2多肽。

[0228] 在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：74相比具有至少75％或更高序列同一性的PIP‑74‑2多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：76相比具有至少75％或更高序列同一性的PIP‑74‑2多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：78相比具有至少75％或更高序列同一性的PIP‑74‑
2多肽的多核苷酸。

[0229] 本披露还涵盖了包含编码PIP‑75多肽的多核苷酸的转基因植物或植物细胞。在一些实施例中，该DNA构建体包含分别编码SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86和SEQ ID NO：87的PIP‑75多肽的SEQ ID NO：186、SEQ ID NO：187、SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：190、SEQ ID NO：191、SEQ ID NO：192、SEQ ID NO：193或SEQ ID NO：194的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含分别编码SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86和SEQ ID NO：87的PIP‑75多肽的SEQ ID NO：
186、SEQ ID NO：187、SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：191、SEQ ID NO：192、SEQ ID NO：193或SEQ ID NO：194的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码PIP‑75多肽的非基因组核酸分子。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86或SEQ ID NO：87的氨基酸序列足够同源的PIP‑75多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：
85、SEQ ID NO：86或SEQ ID NO：87的氨基酸序列足够同源并且具有杀昆虫活性的PIP‑75多肽的多核苷酸。“足够同源的”在此用于是指使用在此所述的这些比对程序中的一个，使用标准参数，与参比序列相比，具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、
74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、
89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同源性的氨基酸序列。本领域技术人员将认识到，考虑到氨基酸相似性等，可以适当地调整这些值以确定的蛋白质的相应同源性。在一些实施例中，序列同源性针对PIP‑75多肽的全长序列。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86或SEQ ID NO：87相比具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、
81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、99％或更高序列同一性并且具有杀昆虫活性的PIP‑75多肽。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86或SEQ ID NO：87相比具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、
71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、
86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性并且具有杀昆虫活性的PIP‑75多肽。

[0230] 在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：79相比具有至少75％或更高序列同一性的PIP‑75多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：80相比具有至少75％或更高序列同一性的PIP‑75多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：81相比具有至少86％或更高序列同一性的PIP‑75多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：84相比具有至少75％或更高序列同一性的PIP‑75多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：85相比具有至少75％或更高序列同一性的PIP‑75多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：86相比具有至少75％或更高序列同一性的PIP‑75多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：87相比具有至少75％或更高序列同一性的PIP‑75多肽的多核苷酸。

[0231] 本披露还涵盖了包含编码PIP‑77多肽的多核苷酸的DNA构建体。在一些实施例中，该DNA构建体包含分别编码SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：240、SEQ ID NO：241、SEQ ID NO：242、SEQ ID NO：243、SEQ ID NO：244和SEQ ID NO：245的PIP‑
45‑2多肽的SEQ ID NO：195、SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：
199、SEQ ID NO：200、SEQ ID NO：201、SEQ ID NO：202、SEQ ID NO：203、SEQ ID NO：204、SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：206、SEQ ID NO：207、SEQ ID NO：208、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：
210、SEQ ID NO：211、SEQ ID ID NO：212、SEQ ID NO：213、SEQ ID NO：214、SEQ ID NO：226、SEQ ID NO：227、SEQ ID NO：228、SEQ ID NO：229、SEQ ID NO：230或SEQ ID NO：231的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含分别编码SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：241、SEQ ID NO：242和SEQ ID NO：245的PIP‑77多肽的SEQ ID NO：195、SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：200、SEQ ID NO：201、SEQ ID NO：202、SEQ ID NO：203、SEQ ID NO：204、SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：207、SEQ ID NO：227、SEQ ID NO：228或SEQ ID NO：231的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：
90、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：
107、SEQ ID NO：241、SEQ ID NO：242、SEQ ID NO：243、SEQ ID NO：244或SEQ ID NO：245的氨基酸序列足够同源并且具有杀昆虫活性的PIP‑77多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：241、SEQ ID NO：242或SEQ ID NO：245的氨基酸序列足够同源并且具有杀昆虫活性的PIP‑77多肽的多核苷酸。“足够同源的”在此用于是指使用在此所述的这些比对程序中的一个，使用标准参数，与参比序列相比，具有至少约50％、55％、60％、65％、
70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同源性的氨基酸序列。本领域技术人员将认识到，考虑到氨基酸相似性等，可以适当地调整这些值以确定的蛋白质的相应同源性。在一些实施例中，序列同源性针对PIP‑77多肽的全长序列。

[0232] 在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：241、SEQ ID NO：242、SEQ ID NO：243、SEQ ID NO：244或SEQ ID NO：245相比具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、
79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、
94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性并且具有杀昆虫活性的PIP‑77多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：
107、SEQ ID NO：241、SEQ ID NO：242、SEQ ID NO：243、SEQ ID NO：244或SEQ ID NO：245相比具有至少约80％或更高序列同一性并且具有杀昆虫活性的PIP‑77多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：
241、SEQ ID NO：242、SEQ ID NO：243、SEQ ID NO：244或SEQ ID NO：245相比具有至少约
90％或更高序列同一性并且具有杀昆虫活性的PIP‑77多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：
103、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：241、SEQ ID NO：242、SEQ ID NO：243、SEQ ID NO：244或SEQ ID NO：245相比具有至少约95％或更高序列同一性并且具有杀昆虫活性的PIP‑77多肽的多核苷酸。

[0233] 在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：241、SEQ ID NO：242或SEQ ID NO：245相比具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、
94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性并且具有杀昆虫活性的PIP‑77多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：241、SEQ ID NO：242或SEQ ID NO：245相比具有至少约80％或更高序列同一性并且具有杀昆虫活性的PIP‑77多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：241、SEQ ID NO：242或SEQ ID NO：245相比具有至少约
95％或更高序列同一性并且具有杀昆虫活性的PIP‑77多肽的多核苷酸。

[0234] 在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：88相比具有至少93％或更高序列同一性的PIP‑77多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：89相比具有至少97％或更高序列同一性的PIP‑77多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：90相比具有至少99％或更高序列同一性的PIP‑77多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：92相比具有至少97％或更高序列同一性的PIP‑77多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：93相比具有至少87％或更高序列同一性的PIP‑77多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：94相比具有至少86％或更高序列同一性的PIP‑77多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：95相比具有至少85％或更高序列同一性的PIP‑77多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：96相比具有至少84％或更高序列同一性的PIP‑77多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：97相比具有至少85％或更高序列同一性的PIP‑77多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：98相比具有至少83％或更高序列同一性的PIP‑77多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：100相比具有至少80％或更高序列同一性的PIP‑77多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：241相比具有至少85％或更高序列同一性的PIP‑77多
肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：242相比具有至少
83％或更高序列同一性的PIP‑77多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该DNA构建体包含编码与SEQ ID NO：245相比具有至少96％或更高序列同一性的PIP‑77多肽的多核苷酸。

[0235] 植物转化

[0236] 这些实施例的方法涉及将多肽或多核苷酸引入植物。如在此使用的“引入”意指以下述方式给予植物多核苷酸或多肽，所述方式使得该序列可以访问植物细胞的内部。这些实施例的方法不依靠将多核苷酸或多肽引入植物的具体方法，只要多核苷酸或多肽可以访
问植物的至少一个细胞的内部。将多核苷酸或多肽引入植物的方法在本领域内是已知的，
这些方法包括但不限于：稳定转化方法、瞬时转化方法、和病毒介导方法。

[0237] 如在此使用的“稳定转化”意指被引入植物的核苷酸构建体整合到植物的基因组并且能够被其后代遗传。如在此使用的“瞬时转化”意指多核苷酸被引入植物中但并不整合到植物的基因组中，或者多肽被引入植物中。如在此使用的“植物”是指整个植物、植物器官(例如，叶、茎、根等)、种子、植物细胞、繁殖体、胚以及其子代。植物细胞可以是分化的或未分化的(例如，愈伤组织、悬浮培养物细胞、原生质体、叶细胞、根细胞、韧皮部细胞和花粉)。

[0238] 转化方案以及将核苷酸序列引入植物中的方案，可根据要靶向转化的植物或者植物细胞的类型(即单子叶植物或者双子叶植物)而变化。将核苷酸序列引入植物细胞并随后
插入植物基因组的合适方法包括显微注射(Crossway，et al.，(1986)Biotechniques 4：
320‑334[Crossway等人，(1986)，生物科技，4：320‑334])、电穿孔(Riggs，et al.，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5602‑5606[Riggs等人，(1986)，美国国家科学院院刊，83：
5602‑5606])、农杆菌介导的转化(美国专利号5,563,055和5,981,840)、直接基因转移
(Paszkowski，et al.，(1984)EMBO J.3：2717‑2722[Paszkowski等人，(1984)，欧洲分子生物学杂志，3：2717‑2722])和弹道粒子加速(参见，例如，美国专利号4,945,050、5,879,918、
5,886,244和5,932,782；Tomes，et al.，(1995)in Plant Cell，Tissue，and Organ 
Culture：Fundamental Methods，ed.Gamborg and Phillips，(Springer‑Verlag，Berlin)and McCabe，et al.，(1988)Biotechnology 6：923‑926[Tomes等人，(1995)，在：植物细胞，组织和器官培养：基本方法中，编辑：Gamborg和Phillips，(施普林格出版社，柏林)和
McCabe等人，(1988)，生物科技，6：923‑926])和Lecl转化(WO 00/28058)对于马铃薯转化参见，Tu，et al.，(1998)Plant Molecular Biology 37：829‑838 and Chong，et al.，(2000)Transgenic Research9：71‑78[Tu等人，(1998)，植物分子生物学，37：829‑838和Chong等人，(2000)，转基因研究，9：71‑78]。另外的转化程序可以在以下找到：Weissinger，et al.，(1988)Ann.Rev.Genet.22：421‑477；Sanford，etal.，(1987)Particulate Science and Technology 5：27‑37(onion)；Christou，et al.，(1988)Plant Physiol.87：671‑674(soybean)；McCabe，et al.，(1988)Bio/Technology 6：923‑926(soybean)；Finer and McMullen，(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.27P：175‑182(soybean)；Singh，et al.，
(1998)Theor.Appl.Genet.96：319‑324(soybean)；Datta，et al.，(1990)Biotechnology 
8：736‑740(rice)；Klein，et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：4305‑4309
(maize)；Klein，et al.，(1988)Biotechnology 6：559‑563(maize)；US Patent Numbers 
5,240,855；5,322,783 and 5,324,646；Klein，et al.，(1988)Plant Physiol.91：440‑444(maize)；Fromm，et al.，(1990)Biotechnology 8：833‑839(maize)；Hooykaas‑Van 
Slogteren，et al.，(1984)Nature(London)311：763‑764；US Patent Number 5,736,369(cereals)；Bytebier，et al.，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5345‑5349
(Liliaceae)；De Wet，et al.，(1985)in The Experimental Manipulation of Ovule 
Tissues，ed.Chapman，et al.，(Longman，New York)，pp.197‑209(pollen)；Kaeppler，et al.，(1990)Plant Cell Reports  9：415‑418 and Kaeppler，et al.，(1992)
Theor.Appl.Genet.84：560‑566(whisker‑mediated transformation)；D′Halluin，et al.，(1992)Plant Cell 4：1495‑1505(electroporation)；Li，et al.，(1993)Plant Cell Reports 12：250‑255 and Christou and Ford，(1995)Annals of Botany 75：407‑413(rice)；Osjoda，et al.，(1996)Nature Biotechnology 14：745‑750(maize via 
Agrobacterium tumefaciens)[Weissinger等人，(1988)，遗传学年评，22：421‑477；
Sanford等人，(1987)，粒子科学与技术，5：27‑37(洋葱)；Christou等人，(1988)，植物生理学，87：671‑674(大豆)；McCabe等人，(1988)，生物/技术，6：923‑926(大豆)；Finer和McMullen，(1991)，体外细胞和发育生物学，27P：175‑182(大豆)；Singh等人，(1998)，理论与应用遗传学，96：319‑324(大豆)；Datta等人，(1990)，生物技术，8：736‑740(水稻)；Klein等人，(1988)，美国国家科学院院刊，85：4305‑4309(玉蜀黍)；Klein等人，(1988)，生物科技，6：559‑563(玉蜀黍)；美国专利号5,240,855、5,322,783和5,324,646；Klein等人，(1988)，植物生理学，91：440‑444(玉蜀黍)；Fromm等人，(1990)，生物科技，8：833‑839(玉蜀黍)；Hooykaas‑Van Slogteren等人，(1984)，自然(伦敦)，311：763‑764；美国专利号5,736,
369(谷物)；Bytebier等人，(1987)，美国国家科学院院刊，84：5345‑5349(百合科)；De Wet等人，(1985)，在：卵巢组织的实验操作，编辑：Chapman等人，(朗文出版社，纽约)，第197‑
209页(花粉)；Kaeppler等人，(1990)，植物细胞报道，9：415‑418和Kaeppler等人，(1992)，理论与应用遗传学，84：560‑566(晶须介导的转化)；D′Halluin等人，(1992)，植物细胞，4：
1495‑1505(电穿孔)；Li等人，(1993)，植物细胞报道，12：250‑255以及Christou和Ford，(1995)，植物学年报，75：407‑413(水稻)；Osjoda等人，(1996)，自然生物科技，14：745‑750(经由根癌土壤杆菌的玉蜀黍)]；其全部通过引用结合在此。

[0239] 在具体实施例中，可以使用各种瞬时转化方法将实施例的序列提供给植物。此类瞬时转化方法包括但不限于：将本披露的杀昆虫多肽或其变体或片段直接引入植物中或者
将本披露转录物的杀昆虫多肽引入植物中。此类方法包括例如显微注射或粒子轰击。参见，例如，Crossway，et al.，(1986)Mol Gen.Genet.202：179‑185；Nomura，et al.，(1986)PlantSci.44：53‑58；Hepler，et al.，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.91：2176‑2180 and Hush，et al.，(1994)The Journal of Cell Science107：775‑784[Crossway等人，(1986)，分子遗传和基因组学，202：179‑185；Nomura等人，(1986)，植物科学，44：53‑58；Hepler等人，(1994)，美国国家科学院院刊，91：2176‑2180和Hush等人，(1994)，细胞科学杂志，107：
775‑784]，其全部通过引用结合在此。可替代地，可以使用本领域已知的技术将本披露多核苷酸的杀昆虫多肽瞬时转化到植物中。此类技术包括病毒载体系统和以排除后续DNA释放
的方式沉淀多核苷酸。因此，可以从微粒结合的DNA进行转录，但其被释放以整合至基因组的频率大大降低了。这种方法包括使用包被有聚乙烯亚胺(PEI；西格玛(Sigma)#P3143)的
粒子。

[0240] 用于在植物基因组的特定位置定向插入多核苷酸的方法是本领域已知的。在一个实施例中，利用位点特异性重组系统实现多核苷酸在所期望的基因组位置的插入。参见，例如，WO 1999/25821、WO 1999/25854、WO 1999/25840、WO 1999/25855和WO 1999/25853，其全部通过引用结合在此。简而言之，本实施例的多核苷酸可以包含在侧翼为两个不相同重
组位点的转移盒内。将转移盒引入植物中，该植物已经稳定地将靶位点并入其基因组，该靶位点侧接对应转移盒位点的两个不相同重组位点。提供了适当的重组酶，并且将该转移盒
整合至靶位点。由此，感兴趣的多核苷酸被整合在植物基因组中特定的染色体位置。

[0241] 植物转化载体可以由对于实现植物转化所需要的一个或多个DNA载体构成。例如，使用由一个以上连续DNA区段构成的植物转化载体是本领域常见的实践。在本领域内，这些载体经常被称为“二元载体”。二元载体以及具有辅助质粒的载体最通常被用于农杆菌介导的转化，其中对于实现有效转化所需要的DNA区段的大小以及复杂度是相当大的，并且将功能分到分离的DNA分子上是有利的。二元载体典型地包含质粒载体，该质粒载体包含T‑DNA转移所需的顺式作用序列(如，左边界和右边界)、被工程化能够在植物细胞中表达的可选
择的标志物、以及“感兴趣的基因”(被工程化能够在植物细胞中表达的基因，对于该植物细胞，产生转基因植物是所希望的)。在这种质粒载体上还存在着细菌复制所需要的序列。这些顺式作用序列以一种方式进行排列以便允许有效转移到植物细胞中并在其中进行表达。
例如，该可选标记基因以及该杀有害生物基因位于该左边界与右边界之间。通常第二质粒
载体包含反式作用因子，这些反式作用因子介导从农杆菌属到植物细胞的T‑DNA转化。这种质粒经常包含这些毒性功能(Vir基因)，这些毒性功能允许由农杆菌属侵染植物细胞，并且通过在边界序列上的切割以及vir‑介导的DNA转移来转移DNA，如在本领域中所理解的
(Hellens and Mullineaux，(2000)Trends in Plant Science 5：446‑451[Hellens和
Mullineaux，(2000)，植物科学趋势，5：446‑451])。若干种类型的农杆菌属菌株(例如，LBA4404、GV3101、EHA101、EHA105等)可以用于植物转化。该第二质粒载体是通过其他方法(如微粒轰击、显微注射、电穿孔、聚乙二醇等)转化这些植物所不必要的。

[0242] 总体上，植物转化方法涉及将异源DNA转移到目标植物细胞中(例如，未成熟的或成熟的胚、悬浮培养物、未分化的愈伤组织、原生质体等)，随后应用最大阈值水平的适当选择(取决于可选标记基因)来从一组未转化的细胞物质中回收转化的植物细胞。在将异源外
源DNA整合到植物细胞中之后，然后在该培养基中应用最大阈值水平的合适选择以杀灭这
些未转化的细胞，并且通过定期转移到新鲜培养基中来分离和增殖从这种选择处理中存活
的这些假定转化的细胞。通过连续传代和使用合适的选择进行攻击，鉴定并增殖了这些用
该质粒载体转化的细胞。然后，可以使用分子和生物化学的方法来证实整合到该转基因植
物的基因组中的感兴趣的异源基因的存在。

[0243] 典型地将外植体转移到新鲜供应的相同培养基中并将其常规培养。随后，在被置于补充有最大阈值水平的选择试剂的再生培养基上之后，这些转化的细胞分化成枝条。然
后，将这些枝条转移到选择性生根培养基中用于回收已生根的枝条或小植株。然后，该转基因小植株长成成熟植物并且产生能育的种子(例如，Hiei，et al.，(1994)The Plant 
Journal 6：271‑282；Ishida，et al.，(1996)Nature Biotechnology 14：745‑750[Hiei等人，(1994)，植物杂志，6：271‑282；Ishida等人，(1996)，自然生物科技，14：745‑750])。典型地将外植体转移到新鲜供应的相同培养基中并将其常规培养。用于产生转基因植物的技术
和方法的一般说明可见于Ayres and Park，(1994)Critical Reviews in Plant Science 
13：219‑239 and Bommineni and Jauhar，(1997)Maydica 42：107‑120[Ayres和Park，(1994)，植物科学的关键性评论，13：219‑239以及Bommineni和Jauhar，(1997)，Maydica，
42：107‑120]。因为这种转化的材料包含多个细胞；转化的和未转化的细胞二者都存在于受试的靶愈伤组织或组织或细胞组群的任何部分中。杀灭未转化的细胞并允许转化的细胞进
行增殖的能力导致了转化的植物培养物。通常地，去除未转化的细胞的能力是对于快速回
收转化的植物细胞并且成功地生产转基因植物的一个限制。

[0244] 已经被转化的细胞可根据常规方法生长为植物。参见，例如，McCormick，et al.，(1986)Plant Cell Reports5：81‑84[McCormick等人，(1986)，植物细胞报道，5：81‑84]。这些植物然后可以生长，并且用同样转化的菌株或不同的菌株授粉，并且所得杂交体具有鉴定的所需表型特征的组成型或诱导型表达。可以培养两代或更多代，以确保所需表型特征
的表达稳定地保持并遗传，并且然后收获种子以确保已经实现了所需表型特征的表达。

[0245] 可以通过使植物与病毒或者病毒核酸接触而向植物提供实施例的核苷酸构建体。通常，这类方法涉及将感兴趣的核苷酸构建体并入到病毒DNA或RNA分子中。应当认识到，实施例的重组蛋白最初可以被合成为病毒多蛋白的一部分，然后该病毒多蛋白的一部分可以
通过在体内或体外蛋白水解加工，以产生所希望的杀昆虫多肽。还认识到，包含实施例的本披露的杀昆虫多肽的至少一部分氨基酸序列的这种病毒多蛋白可具有所需的杀有害生物
活性。实施例涵盖这些病毒多蛋白和编码它们的核苷酸序列。为植物提供核苷酸构建体并
在植物中产生所编码的蛋白质的方法是本领域已知的，该方法涉及病毒DNA或RNA分子。参
见，例如，美国专利号5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367和5,316,931；其通过引用结合在此。

[0246] 用于叶绿体转化的方法是本领域已知的。参见，例如，Svab，et al.，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA  87：8526‑8530；Svab  and  Maliga，(1993)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：913‑917；Svab and Maliga，(1993)EMBO J.12：601‑606[Svab等人，(1990)，美国国家科学院院刊，87：8526‑8530；Svab和Maliga，(1993)，美国国家科学院院刊，90：913‑917；Svab和Maliga，(1993)，欧洲分子生物学杂志，12：601‑606]。该方法依赖于粒子枪递送包含可选择的标志物的DNA和经同源重组使DNA靶向质体基因组。另
外，通过利用核编码的和质体导向的RNA合酶的组织优先的表达，通过反式激活沉默的质体携带的转基因，实现质体转化。这种系统己报导于McBride，et  al.，(1994)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：7301‑7305[McBride等人，(1994)，美国国家科学院院刊，91：
7301‑7305]中。

[0247] 实施例进一步涉及实施例的转化植物的植物繁殖材料，这些繁殖材料包括但不限于种子、块茎、球茎、鳞茎、叶和根和枝条的插条。

[0248] 实施例可以用于转化任何植物物种，这些任何植物物种包括但不限于：单子叶植物和双子叶植物。感兴趣的植物的实例包括但不限于：玉米(玉蜀黍)、芸苔属物种(例如，欧洲油菜(B.napus)、白菜型油菜(B.rapa)、芥菜(B.Juncea))，具体地可用作种子油来源的芸苔属物种的那些，苜蓿(alfalfa、Medicagosativa)、水稻(rice、Oryzasativa)、黑麦(rye，Secale cereale)、高粱(双色高粱、甜高粱)、小米(例如，珍珠粟(御谷(Pennisetum 
glaucum))、猪粟(黍稷)、粟(foxtail  millet)(谷子)、穇子(龙爪稷(Eleusine 
coracana)))、向日葵(sunflower，Helianthus annuus)、红花(safflower，Carthamus 
tinctorius)、小麦(wheat，Triticum aestivum)、大豆(soybean，Glycine max)、烟草
(tobacco，Nicotiana tabacum)、马铃薯(potato，Solanum tuberosum)、花生(peanut，
Arachis hypogaea)、棉花(海岛棉、陆地棉)、红薯(甘薯(Ipomoea batatus))、木薯
(cassava，Manihot esculenta)、咖啡豆(咖啡属物种(Coffea spp.))、椰子(coconut，
Cocos nucifera)、菠萝(pineapple，Ananasco mosus)、柑橘树(柑橘属物种(Citrus 
spp.)、可可(cocoa，Theobroma cacao)、茶(野茶树)、香蕉(芭蕉属物种)、鳄梨(油梨
(Persea americana))、无花果(fig，Ficus casica)、番石榴(guava，Psidium guajava)、芒果(杧果(Mangifera indica))、橄榄(油橄榄(Olea europaea))、番木瓜(papaya，Carica papaya)、腰果(cashew，Anacardium occidentale)、夏威夷坚果(澳洲坚果(Macadamia 
integrifolia))、扁桃(巴旦杏)、甜菜(sugar beets、Beta vulgaris)、甘蔗(甘蔗属物种)、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物、和针叶树。

[0249] 蔬菜包括番茄(西红柿)，生菜(例如，莴苣)，青豆(菜豆)，利马豆(大莱豆)，豌豆(山黎豆属物种)，以及黄瓜属的成员，如黄瓜(胡瓜)、香瓜(cantaloupe，C.cantalupensis)、以及甜瓜(musk melon，C.melo)。观赏植物包括杜鹃花(杜鹃花属物
种)、八仙花(绣球花)、木槿(hibiscus、Hibiscus rosasanensis)、蔷薇(蔷薇属物种)、郁金香(郁金香属物种)、水仙花(水仙属物种)、矮牵牛花(矮牵牛)、康乃馨(香石竹)、猩猩木(一品红)、和菊花。可以用于实施实施例的针叶树包括，例如，松树，如火炬松(loblolly pine，Pinus taeda)、湿地松(slash pine，Pinus elliotii)、美国黄松(西黄松)、美国黑松(扭叶松)、和蒙特利松(辐射松)，道格拉斯‑杉(北美黄杉)，西部铁杉(加拿大铁杉)，北美云杉(白云杉)，红木(北美红杉)，冷杉如银杉(温哥华冷杉)和香脂冷杉(胶冷杉)，以及雪松如美国西部侧柏(北美乔柏)和阿拉斯加黄杉(黄扁柏)。实施例的植物包括例作物植物(例如玉米、苜蓿、向日葵、芸苔属、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、小米、烟草等)如玉米和大豆植物。

[0250] 草坪草包括但不限于：一年生早熟禾(早熟禾)、一年生黑麦草(多花黑麦草)、加拿大早熟禾(扁早熟禾)、咀嚼用羊茅(紫羊茅)、细弱剪股颖(colonial bentgrass、Agrostis tenuis)、匍匐剪股颖(creeping bentgrass、Agrostis palustris)、麦穗草(沙生冰草)、扁穗冰草(冰草)、硬羊茅(苇草(Festuca longifolia))、肯塔基蓝草(草地早熟禾)、鸭茅(猫尾草)、多年生黑麦草(黑麦草)、红狐茅(紫羊茅)、小糠草(白翦股颖)、粗茎早熟禾(普通早熟禾)、羊茅(sheep fescue)(酥油草)、无芒雀麦(无芒雀麦草)、高羊茅(tallfescue、Festuca arundinacea)、梯牧草(timothy、Phleum pratense)、绒毛剪股颖(velvet 
bentgrass、Agrostis canina)、碱茅(weeping alkaligrass、Puccinellia distans)、西部麦草(蓝茎冰草)、百慕大草(狗牙根属物种)、圣奥古斯丁草(偏序钝叶草)、结缕草(结缕草属物种)、百喜草(Bahia grass、Paspalum notatum)、冰结草地(类地毯草)、百足草(假俭草)、隐花狼尾草(铺地狼尾草)、海滨雀稗(海雀稗)、blue gramma(格兰马草)、野牛草
(buffalo grass、Buchloedactyloids)、sideoats gramma(垂穗草)。

[0251] 感兴趣的植物包括提供感兴趣的种子的谷物植物、油料种子植物、和豆科植物。感兴趣的种子包括谷物种子，如玉米、小麦、大麦、水稻、高粱、黑麦、小米等。油料种子植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔属植物、玉蜀黍、苜蓿、棕榈、椰子、亚麻、蓖麻、橄榄等。豆科植物包括豆和豌豆。菜豆包括瓜尔豆、槐豆、苦豆、大豆、菜用刀豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等。

[0252] 转基因植物

[0253] 本披露还涵盖了包含编码杀昆虫多肽的多核苷酸的转基因植物或植物细胞。本披露涵盖了包含编码PIP‑45‑1多肽的多核苷酸的转基因植物或植物细胞。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含分别编码SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：232、SEQ ID NO：234和SEQ ID NO：236的PIP‑45‑1多肽的SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：150、SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：154、SEQ ID NO：156、SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：218、SEQ ID NO：220或SEQ ID NO：222的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含分别编码SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：234和SEQ ID NO：236的PIP‑45‑1多肽的SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：150、SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：220或SEQ ID NO：222的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码PIP‑45‑1多肽的非基因组核酸分子。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：232、SEQ ID NO：234或SEQ ID NO：236的氨基酸序列足够同源并且具有杀昆虫活性的PIP‑45‑1多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：234或SEQ ID NO：236的氨基酸序列足够同源并且具有杀昆虫活性的PIP‑45‑1多肽的多核苷酸。“足够同源的”在此用于是指使用在此所述的这些比对程序中的一个，使用标准参数，与参比序列相比，具有至少约50％、55％、60％、65％、
70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同源性的氨基酸序列。本领域技术人员将认识到，考虑到氨基酸相似性等，可以适当地调整这些值以确定的蛋白质的相应同源性。在一些实施例中，序列同源性针对PIP‑45‑
1多肽的全长序列。

[0254] 在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：
27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：232、SEQ ID NO：234或SEQ ID NO：236相比具有至少约50％、55％、60％、
65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、
84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、
99％或更高序列同一性并且具有杀昆虫活性的PIP‑45‑1多肽的多核苷酸。在一些实施例
中，该转基因植物或植物细胞包含编码SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：234或SEQ ID NO：236相比具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、
79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、
94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性并且具有杀昆虫活性的PIP‑45‑1多肽的多核苷酸。

[0255] 在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：1相比具有至少99.1％或更高序列同一性的PIP‑45‑1多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：17相比具有至少99.4％或更高序列同一性的PIP‑45‑1多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：19相比具有至少99.6％或更高序列同一性的PIP‑45‑1多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：21相比具有至少87％或更高序列同一性的
PIP‑45‑1多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：23相比具有至少88％或更高序列同一性的PIP‑45‑1多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：27相比具有至少99.1％或更高序列同一
性的PIP‑45‑1多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：29相比具有至少99.8％或更高序列同一性的PIP‑45‑1多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：31相比具有至少92.3％或更高序列同一性的PIP‑45‑1多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：33相比具有至少91.1％或更高序列同一性的PIP‑45‑1多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：35相比具有至少95.4％或更高序列同一性的PIP‑45‑1多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：39相比具有至少95％或更高序列同一性的PIP‑45‑1多肽的多核苷酸。
在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：43相比具有至少97.5％或更高序列同一性的PIP‑45‑1多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：45相比具有至少70％或更高序列同一性的PIP‑45‑1多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：234相比具有至少
94％或更高序列同一性的PIP‑45‑1多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：236相比具有至少96％或更高序列同一性的PIP‑45‑1多肽的多核苷酸。

[0256] 本披露还涵盖了包含编码PIP‑45‑2多肽的多核苷酸的转基因植物或植物细胞。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含分别编码SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：233、SEQ ID NO：235和SEQ ID NO：237的PIP‑45‑2多肽的SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：
133、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：151、SEQ ID NO：153、SEQ ID NO：
155、SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：219、SEQ ID NO：221或SEQ ID NO：223的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含分别编码SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：235和SEQ ID NO：237的PIP‑45‑2多肽的SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：
127、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：151、SEQ ID NO：153、SEO ID NO：
221或SEQ ID NO：223的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码
PIP‑45‑2多肽的非基因组核酸分子。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：
24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：233、SEQ ID NO：235和SEQ ID NO：237的氨基酸序列足够同源并且具有杀昆虫活性的PIP‑45‑2多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：235或SEQ ID NO：237的氨基酸序列足够同源并且具有杀昆虫活性的PIP‑45‑2多肽的多核苷酸。“足够同源的”在此用于是指使用在此所述的这些比对程序中的一个，使用标准参数，与参比序列相比，具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、
81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、99％或更大序列同源性的氨基酸序列。本领域技术人员将认识到，考虑到氨基酸相似性等，可以适当地调整这些值以确定的蛋白质的相应同源性。在一些实施例中，序列同源性针对PIP‑45‑2多肽的全长序列。

[0257] 在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：
16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：233、SEQ ID NO：235或SEQ ID NO：237相比具有至少约50％、55％、60％、
65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、
84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、
99％或更高序列同一性并且具有杀昆虫活性的PIP‑45‑2多肽的多核苷酸。在一些实施例
中，该转基因植物或植物细胞包含编码SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：235或SEQ ID NO：237相比具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、
79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、
94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性并且具有杀昆虫活性的PIP‑45‑2多肽的多核苷酸。

[0258] 在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：2相比具有至少99.2％或更高序列同一性的PIP‑45‑2多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：18相比具有至少98.5％或更高序列同一性的PIP‑45‑2多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：20相比具有至少96％或更高序列同一性的PIP‑45‑2多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：22相比具有至少80％或更高序列同一性的PIP‑
45‑2多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：
24相比具有至少81％或更高序列同一性的PIP‑45‑2多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：28相比具有至少99.5％或更高序列同一性
的PIP‑45‑2多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：30相比具有至少98.5％或更高序列同一性的PIP‑45‑2多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：32相比具有至少92％或更高序列同一性的PIP‑45‑2多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：34相比具有至少91.5％或更高序列同一性的PIP‑45‑2多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：36相比具有至少70％或更高序列同一性的PIP‑45‑2多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：40相比具有至少90％或更高序列同一性的PIP‑45‑2多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：44相比具有至少94％或更高序列同一性的PIP‑45‑2多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：46相比具有至少70％或更高序列同一性的PIP‑45‑2多肽的多核苷酸。

[0259] 本披露还涵盖了包含编码PIP‑64‑1多肽的多核苷酸的转基因植物或植物细胞。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含分别编码SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71和SEQ ID NO：238的PIP‑64‑1多肽的SEQ ID NO：160、SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：165、SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：171、SEQ ID NO：172、SEQ ID NO：174、SEQ ID NO：176、SEQ ID NO：178或SEQ ID NO：224的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：238的PIP‑64‑1多肽的SEQ ID NO：160、SEQ ID NO：165或SEQ ID NO：224的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码PIP‑64‑1多肽的非基因组核酸分子。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：
69、SEQ ID NO：71或SEQ ID NO：238的氨基酸序列足够同源并且具有杀昆虫活性的PIP‑64‑
1多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：238的氨基酸序列足够同源并且具有杀昆虫活性的PIP‑64‑1多肽的多核苷酸。“足够同源的”在此用于是指使用在此所述的这些比对程序中的一个，使用标准参数，与参比序列相比，具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、
74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、
89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同源性的氨基酸序列。本领域技术人员将认识到，考虑到氨基酸相似性等，可以适当地调整这些值以确定的蛋白质的相应同源性。在一些实施例中，序列同源性针对PIP‑64‑1多肽的全长序列。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71或SEQ ID NO：238相比具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、71％、
72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、
87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的PIP‑64‑1多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：238相比具有至少约50％、55％、60％、65％、
70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的PIP‑64‑1多肽的多核苷酸。

[0260] 在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：53相比具有至少75％或更高序列同一性的PIP‑64‑1多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：58相比具有至少99.7％或更高序列同一性的PIP‑64‑1多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：238相比具有至少75％或更高序列同一性的PIP‑64‑1多肽的多核苷酸。

[0261] 本披露还涵盖了包含编码PIP‑64‑2多肽的多核苷酸的转基因植物或植物细胞。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含分别编码SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72和SEQ ID NO：239的PIP‑64‑2多肽的SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：164、SEQ ID NO：166、SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：170、SEQ ID NO：173、SEQ ID NO：175、SEQ ID NO：177、SEQ ID NO：179或SEQ ID NO：225的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含分别编码SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：239的PIP‑64‑2多肽的SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：166或SEQ ID NO：225的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码PIP‑64‑2多肽的非基因组核酸分子。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：
54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：239的氨基酸序列足够同源并且具有杀昆虫活性的PIP‑64‑2多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：59或SEQ ID NO：239的氨基酸序列足够同源并且具有杀昆虫活性的PIP‑64‑2多肽的多核苷酸。“足够同源的”在此用于是指使用在此所述的这些比对程序中的一个，使用标准参数，与参比序列相比，具有至少约
50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、
81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、99％或更大序列同源性的氨基酸序列。本领域技术人员将认识到，考虑到氨基酸相似性等，可以适当地调整这些值以确定的蛋白质的相应同源性。在一些实施例中，序列同源性针对PIP‑64‑2多肽的全长序列。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：239相比具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、
79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、
94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性并且具有杀昆虫活性的PIP‑64‑2多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：59或SEQ ID NO：239相比具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、71％、
72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、
87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性并且具有杀昆虫活性的PIP‑64‑2多肽的多核苷酸。

[0262] 在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：54相比具有至少70％或更高序列同一性的PIP‑64‑2多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：55相比具有至少70％或更高序列同一性的PIP‑64‑2多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：59相比具有至少91％或更高序列同一性的PIP‑64‑2多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：239相比具有至少70％或更高序列同一性的PIP‑64‑2多肽的多核苷酸。

[0263] 本披露还涵盖了包含编码PIP‑74‑1多肽的多核苷酸的转基因植物或植物细胞。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含分别编码SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75和SEQ ID NO：77的PIP‑74‑1多肽的SEQ ID NO：180、SEQ ID NO：182或SEQ ID NO：184的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码PIP‑74‑1多肽的非基因组核酸分子。
在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75或SEQ ID NO：77的氨基酸序列足够同源并且具有杀昆虫活性的PIP‑74‑1多肽的多核苷酸。“足够同源的”在此用于是指使用在此所述的这些比对程序中的一个，使用标准参数，与参比序列相比，具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、
78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同源性的氨基酸序列。本领域技术人员将认识到，考虑到氨基酸相似性等，可以适当地调整这些值以确定的蛋白质的相应同源性。
在一些实施例中，序列同源性针对PIP‑74‑1多肽的全长序列。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75或SEQ ID NO：77相比具有至少约50％、55％、60％、
65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、
84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、
99％或更高序列同一性的PIP‑74‑1多肽。

[0264] 在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：73相比具有至少75％或更高序列同一性的PIP‑74‑1多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：75相比具有至少75％或更高序列同一性的PIP‑74‑1多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：77相比具有至少75％或更高序列同一性的PIP‑74‑1多肽的多核苷酸。

[0265] 本披露还涵盖了包含编码PIP‑74‑2多肽的多核苷酸的转基因植物或植物细胞。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含分别编码SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：76和SEQ ID NO：78的PIP‑74‑2多肽的SEQ ID NO：181、SEQ ID NO：183、SEQ ID NO：185的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码PIP‑74‑2多肽的非基因组核酸分子。
在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：76或SEQ ID NO：78的氨基酸序列足够同源并且具有杀昆虫活性的PIP‑74‑2多肽。“足够同源的”在此用于是指使用在此所述的这些比对程序中的一个，使用标准参数，与参比序列相比，具有至少约50％、55％、
60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或更大序列同源性的氨基酸序列。本领域技术人员将认识到，考虑到氨基酸相似性等，可以适当地调整这些值以确定的蛋白质的相应同源性。在一些实施例中，序列同源性针对PIP‑74‑2多肽的全长序列。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：76或SEQ ID NO：78相比具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、
74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、
89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的PIP‑
74‑2多肽。

[0266] 在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：74相比具有至少75％或更高序列同一性的PIP‑74‑2多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：76相比具有至少75％或更高序列同一性的PIP‑74‑2多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：78相比具有至少75％或更高序列同一性的PIP‑74‑2多肽的多核苷酸。

[0267] 本披露还涵盖了包含编码PIP‑75多肽的多核苷酸的转基因植物或植物细胞。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含分别编码SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86和SEQ ID NO：87的PIP‑75多肽的SEQ ID NO：186、SEQ ID NO：187、SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：
189、SEQ ID NO：190、SEQ ID NO：191、SEQ ID NO：192、SEQ ID NO：193或SEQ ID NO：194的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含分别编码SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86和SEQ ID NO：87的PIP‑
75多肽的SEQ ID NO：186、SEQ ID NO：187、SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：191、SEQ ID NO：
192、SEQ ID NO：193或SEQ ID NO：194的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码PIP‑75多肽的非基因组核酸分子。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86或SEQ ID NO：87的氨基酸序列足够同源的PIP‑75多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID 
NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86或SEQ ID NO：87的氨基酸序列足够同源并且具有杀昆虫活性的PIP‑75多肽的多核苷酸。“足够同源的”在此用于是指使用在此所述的这些比对程序中的一个，使用标准参数，与参比序列相比，具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、
78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同源性的氨基酸序列。本领域技术人员将认识到，考虑到氨基酸相似性等，可以适当地调整这些值以确定的蛋白质的相应同源性。
在一些实施例中，序列同源性针对PIP‑75多肽的全长序列。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86或SEQ ID NO：87相比具有至少约50％、55％、60％、
65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、
84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、
99％或更高序列同一性并且具有杀昆虫活性的PIP‑75多肽。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86或SEQ ID NO：87相比具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、
74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、
89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性并且具有杀昆虫活性的PIP‑75多肽。

[0268] 在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：79相比具有至少75％或更高序列同一性的PIP‑75多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：80相比具有至少75％或更高序列同一性的PIP‑75多肽的多
核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：81相比具有至少86％或更高序列同一性的PIP‑75多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：84相比具有至少75％或更高序列同一性的PIP‑75多肽的多
核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：85相比具有至少75％或更高序列同一性的PIP‑75多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：86相比具有至少75％或更高序列同一性的PIP‑75多肽的多
核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：87相比具有至少75％或更高序列同一性的PIP‑75多肽的多核苷酸。

[0269] 本披露还涵盖了包含编码PIP‑77多肽的多核苷酸的转基因植物或植物细胞。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含分别编码SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：
107、SEQ ID NO：241、SEQ ID NO：242、SEQ ID NO：243、SEQ ID NO：244和SEQ ID NO：245的PIP‑45‑2多肽的SEQ ID NO：195、SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：200、SEQ ID NO：201、SEQ ID NO：202、SEQ ID NO：203、SEQ ID NO：204、SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：206、SEQ ID NO：207、SEQ ID NO：208、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：210、SEQ ID NO：211、SEQ ID ID NO：212、SEQ ID NO：213、SEQ ID NO：214、SEQ ID NO：
226、SEQ ID NO：227、SEQ ID NO：228、SEQ ID NO：229、SEQ ID NO：230或SEQ ID NO：231的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含分别编码SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：241、SEQ ID NO：242和SEQ ID NO：245的PIP‑77多肽的SEQ ID NO：195、SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：200、SEQ ID NO：201、SEQ ID NO：202、SEQ ID NO：203、SEQ ID NO：204、SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：207、SEQ ID NO：227、SEQ ID NO：228或SEQ ID NO：231的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：
94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：240、SEQ ID NO：241、SEQ ID NO：242、SEQ ID NO：243、SEQ ID NO：244或SEQ ID NO：245的氨基酸序列足够同源并且具有杀昆虫活性的PIP‑77多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID 
NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：241、SEQ ID NO：242或SEQ ID NO：245的氨基酸序列足够同源并且具有杀昆虫活性的PIP‑77多肽的多核苷酸。“足够同源的”在此用于是指使用在此所述的这些比对程序中的一个，使用标准参数，与参比序列相比，具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、
75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列同源性的氨基酸序列。本领域技术人员将认识到，考虑到氨基酸相似性等，可以适当地调整这些值以确定的蛋白质的相应同源性。在一些实施例中，序列同源性针对PIP‑77多肽的全长序列。

[0270] 在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：
106、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：240、SEQ ID NO：241、SEQ ID NO：242、SEQ ID NO：243、SEQ ID NO：244或SEQ ID NO：245相比具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、
73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、
88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性并且具有杀昆虫活性的PIP‑77多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：241、SEQ ID NO：242或SEQ ID NO：245相比具有至少约50％、55％、60％、65％、
70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性并且具有杀昆虫活性的PIP‑77多肽的多核苷酸。

[0271] 在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：88相比具有至少86％或更高序列同一性的PIP‑77多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：89相比具有至少85％或更高序列同一性的PIP‑77多肽的多
核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：90相比具有至少85％或更高序列同一性的PIP‑77多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：91相比具有至少85％或更高序列同一性的PIP‑77多肽的多
核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：92相比具有至少85％或更高序列同一性的PIP‑77多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：93相比具有至少85％或更高序列同一性的PIP‑77多肽的多
核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：94相比具有至少85％或更高序列同一性的PIP‑77多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：95相比具有至少85％或更高序列同一性的PIP‑77多肽的多
核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：96相比具有至少80％或更高序列同一性的PIP‑77多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：97相比具有至少80％或更高序列同一性的PIP‑77多肽的多
核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：98相比具有至少80％或更高序列同一性的PIP‑77多肽的多核苷酸。在一些实施例中，该转基因植物或植物细胞包含编码与SEQ ID NO：100相比具有至少80％或更高序列同一性的PIP‑77多肽的多核苷酸。

[0272] 植物转化的评估

[0273] 在将异源外源DNA引入植物细胞中之后，通过不同的方法来证实异源基因在植物类基因组中的转化或整合，这些方法如对与该整合的基因相关的核酸、蛋白质以及代谢产
物的分析。

[0274] PCR分析是在移植到土壤中之前的较早阶段时针对经并入的基因的存在来筛选转化的细胞、组织或枝条的一种快速方法(Sambrook and Russell，(2001)Molecular 
Cloning：A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring 
Harbor，NY[Sambrook和Russell，(2001)，分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约州])。使用对感兴趣的基因或农杆菌属载体背景等具有特异性的寡核苷酸引物
进行PCR。

[0275] 可以通过基因组DNA的DNA印迹分析来证实植物转化(Sambrook和Russell，(2001)，同上)。通常，从转化体中提取总DNA，该转化体用适当的限制酶进行消化，在琼脂糖凝胶中进行分馏并且转到硝酸纤维素或尼龙膜上。然后，根据标准的技术，用例如放射性标记32P的靶DNA片段来探测该膜或“印迹”以证实引入的基因整合到该植物基因组中
(Sambrook和Russell，(2001)，同上)。

[0276] 在RNA印迹分析中，从该转化体的特定组织中分离了RNA，在甲醛琼脂糖凝胶中进行分馏，并且根据本领域常规使用的标准程序来印迹到尼龙滤膜上(Sambrook和Russell，
(2001)，同上)。然后，通过在本领域内已知的方法，通过将该滤膜与源自杀有害生物基因的放射性探针进行杂交来测试由该杀有害生物基因所编码的RNA的表达(Sambrook和
Russell，(2001)，同上)。

[0277] 可以对转基因植物进行蛋白质印迹、生物化学测定以及类似测定，以便通过标准程序使用与本披露的杀有害生物多肽上存在的一个或多个表位结合的抗体来证实由该杀
有害生物基因所编码的蛋白质的存在(Sambrook和Russell，(2001)，同上)。

[0278] 转基因植物中性状的堆叠

[0279] 转基因植物可以包含在此披露的一种或多种杀昆虫多核苷酸与一种或多种另外的多核苷酸的堆叠，导致产生或抑制多个多肽序列。包含多核苷酸序列堆叠的转基因植物
可以通过传统育种方法或通过遗传工程方法中的一种或两种获得。这些方法包含但不限
于：育种各自包含感兴趣的多核苷酸的单个系，将包含在此披露的基因的转基因植物与随
后的基因转化并将基因共转化为单个植物细胞。如在此使用的，术语“堆叠”包括在同一植物中存在多个性状(即，将两个性状并入核基因组中，将一个性状并入核基因组中，并且将一个性状并入质体的基因组中，或者这两种性状都被并入质体的基因组中)。在一个非限制性实例中，“堆叠性状”包括其中序列在物理上彼此相邻的分子堆叠。如在此使用的性状是指源自特定序列或序列组群的表型。可以使用包含多个基因或在多个载体上分别携带的基
因的单一转化载体进行基因的共转化。如果通过遗传转化植物来堆叠序列，则感兴趣的多
核苷酸序列可以在任意时间并以任意次序组合。可以用由转化盒的任何组合提供的感兴趣
的多核苷酸在共转化方案中同时引入性状。例如，若引入两个序列，则这两个序列可包含在分开的转化盒(反式)或包含在同一个转化盒(顺式)。这些序列的表达可以通过相同的启动
子或通过不同的启动子驱动。在某些情况下，可能所希望的是引入一种将抑制所关注的聚
核苷酸的表达的转化盒。此可以与其他抑制盒或过度表达盒的任何组合进行组合以在该植
物中产生所需性状组合。进一步应当认识到，可以使用位点特异重组系统，来在希望的基因组位置堆叠多核苷酸序列。参见，例如，WO 1999/25821、WO 1999/25854、WO 1999/25840、WO 
1999/25855和WO 1999/25853，其全部通过引用结合在此。

[0280] 在一些实施例中，单独或与一种或多种另外的昆虫抗性性状堆叠的编码在此披露的杀昆虫多肽的多核苷酸可以与一种或多种另外的输入性状(例如，除草剂抗性、真菌抗
性、病毒抗性、胁迫耐受性、抗病性、雄性不育性、茎强度等)或输出性状(例如，增加的产量、改性淀粉、改进的油特性、平衡的氨基酸、高赖氨酸或甲硫氨酸、增加的消化性、改进的纤维品质、抗旱性等)堆叠。因此，可以使用多核苷酸实施例来提供改进的作物品质的完整的农艺包，具有灵活和成本有效地控制任何数量的农艺有害生物的能力。

[0281] 用于堆叠的转基因包括但不限于：

[0282] 1.赋予昆虫抗性或抗病性并编码以下各项的转基因：

[0283] (A)植物疾病抗性基因。通常通过植物中抗病性基因(R)的产物与病原体中相应的无毒性(Avr)基因的产物之间的特异性相互作用来活化植物防御。可以用经克隆的抗性基
因来转化植物变种，以工程化对特定病原菌株具有抗性的植物。参见，例如，Jones，et al.，(1994)Science 266：789[Jones等人，(1994)，科学，266：789](克隆番茄Cf‑9基因以抵抗黄枝孢霉(Cradosporium fulvum))；Martin，et al.，(1993)Science 262：1432[Martin等人，(1993)，科学，262：1432](对编码蛋白激酶的丁香假单孢菌番茄致病变种的抗性的番茄Pto基因)；Mindrinos，et al.，(1994)Cell 78：1089[Mindrinos等人，(1994)，细胞，78：1089](对丁香假单孢菌的抗性的拟南芥属RSP2基因)；McDowell and Woffenden，(2003)Trends Biotechnol.21(4)：178‑83 and Toyoda，et al.，(2002)Transgenic Res.11(6)：567‑82[McDowell和Woffenden，(2003)，生物技术趋势，21(4)：178‑83和Toyoda等人，(2002)，转基因研究，11(6)：567‑82]。与野生型植物相比，对疾病具有抗性的植物对病原体更具抗性。

[0284] (B)编码苏云金芽孢杆菌蛋白质的基因，其衍生物或其上建模的合成多肽。参见，例如，Geiser，et al.，(1986)Gene 48：109[Geiser等人，(1986)，基因，48：109]，其披露了Btδ‑内毒素基因的克隆和核苷酸序列。此外，编码δ‑内毒素基因的DNA分子可购自美国典型培养物保藏中心(罗克维尔(Rockville)，马里兰州)，例如在 登录号40098、67136、
31995和31998下。在遗传工程中的苏云金芽孢杆菌转基因的其他非限制性实例在以下专利
和专利申请中给出，并且以此目的通过引用结合在此：美国专利号5,188,960、5,689,052、
5,880,275、5,986,177、6,023,013、6,060,594、6,063,597、6,077,824、6,620,988、6,642,
030、6,713,259、6,893,826、7,105,332、7,179,965、7,208,474、7,227,056、7,288,643、7,
323,556、7,329,736、7,449,552、7,468,278、7,510,878、7,521,235、7,544,862、7,605,
304、7,696,412、7,629,504、7,705,216、7,772,465、7,790,846、7,858,849以及WO 1991/
14778、WO 1999/31248、WO 2001/12731、WO 1999/24581和WO 1997/40162。

[0285] 编码杀有害生物蛋白的基因也可以被堆叠，这些杀有害生物蛋白包括但不限于：来自以下各项的杀昆虫蛋白：假单孢菌属物种，如PSEEN3174(Monalysin，(2011)PLoS 
Pathogens，7：1‑13[Monalysin，(2011)，PLoS病原体，7：1‑13])、假单胞菌(Pseudomonas protegens)菌株CHA0和Pf‑5(之前为荧光假单孢菌)(Pechy‑Tarr，(2008)Environmental Microbiology 10：2368‑2386：GenBank Accession No.EU400157[Pechy‑Tarr，(2008)，环境微生物学，10：2368‑2386：GenBank登录号EU400157])；台湾假单孢菌(Pseudomonas 
Taiwanensis)(Liu，et al.，(2010)J.Agric.FoodChem.58：12343‑12349[Liu等人，(2010)，农业与食品化学杂志，58：12343‑12349])和假产碱假单孢菌(Zhang，et al.，(2009)Annals of Microbiology 59：45‑50 and Li，et al.，(2007)Plant Cell Tiss.Organ Cult.89：
159‑168[Zhang等人，(2009)，微生物学年鉴，59：45‑50和Li等人，(2007)，植物细胞、组织和器官培养，89：159‑168])来自发光杆菌属物种和致病杆菌属物种的杀昆虫蛋白
(Hinchliffe，et al.，(2010)The Open Toxinology Journal 3：101‑118 and Morgan，et al.，(2001)Applied and Envir.Micro.67：2062‑2069[Hinchliffe等人，(2010)，开放的毒理学杂志，3：101‑118和Morgan等人，(2001)，应用与环境微生物学，67：2062‑2069])；美国专利号6,048,838和美国专利号6,379,946；美国专利号US 2014‑0007297‑A1的PIP‑1多肽；
美国专利公开号US 2014‑0033361的AfIP‑1A和/或AfIP‑1B多肽；美国序列号13/839702的PHI‑4多肽；PCT序列号PCT/US 14/51063的PIP‑47多肽；美国专利公开US 20140274885或PCT专利公开WO 2014/150914的PHI‑4多肽；PCT序列号PCT/US 14/55128的PIP‑72多肽；美国序列号61/863761和61/863763的杀昆虫蛋白；以及δ‑内毒素，包括但不限于：Cry1、Cry2、Cry3、Cry4、Cry5、Cry6、Cry7、Cry8、Cry9、Cry10、Cry11、Cry12、Cry13、Cry14、Cry15、Cry16、Cry17、Cry18、Cry19、Cry20、Cry21、Cry22、Cry23、Cry24、Cry25、Cry26、Cry27、Cry28、Cry29、Cry30、Cry31、Cry32、Cry33、Cry34、Cry35、Cry36、Cry37、Cry38、Cry39、Cry40、Cry41、Cry42、Cry43、Cry44、Cry45、Cry46、Cry47、Cry49、Cry51、Cry52、Cry53、Cry54、Cry55、Cry56、Cry57、Cry58、Cry59、Cry60、Cry61、Cry62、Cry63、Cry64、Cry65、Cry66、Cry67、Cry68、Cry69、Cry70、Cry71和Cry72类的δ‑内毒素基因和苏云金芽孢杆菌细胞溶解性Cyt1和Cyt2基因。苏云金芽孢杆菌杀昆虫蛋白的这些类别的成员包括但不限于Cry1Aa1
(登录号AAA22353)；Cry1Aa2(登录号AAA22552)；Cry1Aa3(登录号BAA00257)；Cry1Aa4(登录号CAA31886)；Cry1Aa5(登录号BAA04468)；Cry1Aa6(登录号AAA86265)；Cry1Aa7(登录号
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(登录号JN646781)；Cry70Ba1(登录号ADO51070)；Cry70Bb1(登录号EEL67276)；Cry71Aa1
(登录号JX025568)；Cry72Aa1(登录号JX025569)。

[0286] δ‑内毒素的实例还包括但不限于：美国专利号5,880,275和7,858,849的Cry1A蛋白；美国专利号8,304,604和8.304,605的DIG‑3或DIG‑11毒素(cry蛋白(如Cry1A)的α螺旋1和/或α螺旋2变体的N末端缺失)，美国专利申请序列号10/525,318的Cry1B；美国专利号6,
033,874的Cry1C；美国专利号5,188,960、6,218,188的Cry1F；美国专利号7,070,982、6,
962,705和6,713,063的Cry1A/F嵌合体；美国专利号7,064,249的Cry2蛋白如Cry2Ab蛋白；
Cry3A蛋白，包括但不限于：通过融合至少两种不同Cry蛋白的可变区和保守区的独特组合
产生的工程化杂合杀昆虫蛋白(eHIP)(美国专利申请公开号2010/0017914)；Cry4蛋白；
Cry5蛋白；Cry6蛋白；美国专利号7,329,736、7,449,552、7,803,943、7,476,781、7,105,
332、7,378,499和7,462,760的Cry8蛋白；Cry9蛋白如Cry9A、Cry9B、Cry9C、Cry9D、Cry9E和Cry9F家族的成员；Naimov，et al.，(2008)Applied and Environmental Microbiology，
74：7145‑7151[Naimov等人，(2008)，应用与环境微生物学，74：7145‑7151]的Cry15蛋白；美国专利号6,127,180、6,624,145和6,340,593的Cry22、Cry34Ab1蛋白；美国专利号6,248,
535、6,326,351、6,399,330、6,949,626、7,385,107和7,504,229的CryET33和CryET34蛋白；
美国专利公开号2006/0191034、2012/0278954，和PCT公开号WO 2012/139004的CryET33和
CryET34同源物；美国专利号6,083,499、6,548,291和6,340,593的Cry35Ab1蛋白；Cry46蛋白、Cry51蛋白、Cry二元毒素；TIC901或相关毒素；US 2008/0295207的TIC807；PCT US 
2006/033867的ET29、ET37、TIC809、TIC810、TIC812、TIC127、TIC128；US 2040194351的TIC807；美国专利8,513,494的TIC853毒素，美国专利号8,236,757的AXMI‑027、AXMI‑036、和AXMI‑038；US 7,923,602的AXMI‑031、AXMI‑039、AXMI‑040、AXMI‑049；WO 2006/083891的AXMI‑018、AXMI‑020、和AXMI‑021；WO 2005/038032的AXMI‑010；WO 2005/021585的AXMI‑
003；US 2004/0250311的AXMI‑008；US 2004/0216186的AXMI‑006；US 2004/0210965的
AXMI‑007；US 2004/0210964的AXMI‑009；US 2004/0197917的AXMI‑014；US 2004/0197916的AXMI‑004：WO 2006/119457的AXMI‑028和AXMI‑029；WO 2004/074462的AXMI‑007、AXMI‑
008、AXMI‑0080rf2、AXMI‑009、AXMI‑014和AXMI‑004；美国专利号8,084,416的AXMI‑150；US 
20110023184的AXMI‑205；US 2011/0263488的AXMI‑011、AXMI‑012、AXMI‑013、AXMI‑015、AXMI‑019、AXMI‑044、AXMI‑037、AXMI‑043、AXMI‑033、AXMI‑034、AXMI‑022、AXMI‑023、AXMI‑
041、AXMI‑063、和AXMI‑064；US 2010/0197592的AXMI‑R1和相关蛋白；WO 2011/103248的AXMI221Z、AXMI222z、AXMI223z、AXMI224z和AXMI225z；WO 11/103247的AXMI218、AXMI219、AXMI220、AXMI226、AXMI227、AXMI228、AXMI229、AXMI230和AXMI231；美国专利号8,334,431的AXMI‑115、AXMI‑113、AXMI‑005、AXMI‑163和AXMI‑184；US 2010/0298211的AXMI‑001、AXMI‑002、AXMI‑030、AXMI‑035、和AXMI‑045；US 20090144852的AXMI‑066和AXMI‑076；美国专利号8,318,900的AXMI128、AXMI130、AXMI131、AXMI133、AXMI140、AXMI141、AXMI142、AXMI143、AXMI144、AXMI146、AXMI148、AXMI149、AXMI152、AXMI153、AXMI154、AXMI155、AXMI156、AXMI157、AXMI158、AXMI162、AXMI165、AXMI166、AXMI167、AXMI168、AXMI169、AXMI170、AXMI171、AXMI172、AXMI173、AXMI174、AXMI175、AXMI176、AXMI177、AXMI178、AXMI179、AXMI180、AXMI181、AXMI182、AXMI185、AXMI186、AXMI187、AXMI188、AXMI189；US 
2010/0005543的AXMI079、AXMI080、AXMI081、AXMI082、AXMI091、AXMI092、AXMI096、
AXMI097、AXMI098、AXMI099、AXMI100、AXMI101、AXMI102、AXMI103、AXMI104、AXMI107、AXMI108、AXMI109、AXMI110、AXMI111、AXMI112、AXMI114、AXMI116、AXMI117、AXMI118、AXMI119、AXMI120、AXMI121、AXMI122、AXMI123、AXMI124、AXMI1257、AXMI1268、AXMI127、AXMI129、AXMI164、AXMI151、AXMI161、AXMI183、AXMI132、AXMI138、AXMI137；US 
20140196175的AXMI221；US 20140373195的AXMI345；和美国专利号8,319,019的具有修饰
的蛋白水解位点的Cry蛋白如Cry1A和Cry3A；和美国专利申请公开号2011/0064710的来自
苏芸金芽孢杆菌菌株VBTS 2528的Cry1Ac、Cry2Aa和Cry1Ca毒素蛋白。其他Cry蛋白是本领
域技术人员熟知的(参见，Crickmore，et al.，“Bacillus thuringiensis toxin 
nomenclature”(2011)[Crickmore等人，“苏云金芽孢杆菌毒素命名法”(2011)]在
lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/intro.html上，其可以使用“www”前缀在万维网上访问)。Cry蛋白的杀昆虫活性是本领域技术人员熟知的(综述参见，van 
Frannkenhuyzen，(2009)J.Invert.Path.101：1‑16[van Frannkenhuyzen，(2009)，无脊椎动物病理学杂志，101：1‑16])。使用Cry蛋白作为转基因植物性状是本领域技术人员熟知的，并且Cry转基因植物(包括但不限于：Cry1Ac、Cry1Ac+Cry2Ab、Cry1Ab、Cry1A.105、
Cry1F、Cry1Fa2、Cry1F+Cry1Ac、Cry2Ab、Cry3A、mCry3A、Cry3Bb1、Cry34Ab1、Cry35Ab1、Vip3A、mCry3A、Cry9c和CBI‑Bt)已获得法规性审批(参见，Sanahuja，(2011)Plant Biotech Journal 9：283‑300 and the CERA(2010)GM Crop Database Center for Environmental Risk Assessment(CERA)，ILSI Research Foundation，Washington D.C.[Sanahuja，
(2011)，植物生物技术杂志，9：283‑300和CERA，(2010)，环境风险评估的转基因作物数据库中心(CERA)，ILSI研究基金会，华盛顿])。本领域技术人员熟知的多于一种杀有害生物蛋白也可以在植物中表达，这些杀有害生物蛋白如Vip3Ab和Cry1Fa(US 2012/0317682)、Cry1BE和Cry1F(US 2012/0311746)、Cry1CA和Cry1AB(US 2012/0311745)、Cry1F和CryCa(US 
2012/0317681)、Cry1DA和Cry1BE(US 2012/0331590)、Cry1DA和Cry1Fa(US 2012/
0331589)、Cry1AB和Cry1BE(US 2012/0324606)、以及Cry1Fa和Cry2Aa、Cry1I或Cry1E(US 
2012/0324605)。杀有害生物蛋白还包括杀昆虫脂肪酶，这些杀昆虫脂肪酶包括美国专利号
7,491,869的脂质酰基水解酶，和胆固醇氧化酶，如来自链霉菌属(Purcell et al.(1993)
Biochem Biophys Res Commun 15：1406‑1413[Purcell等人，(1993)，生物化学与生物物理学研究通讯15：1406‑1413])。杀有害生物蛋白还包括美国专利号5,877,012、6,107,279、6,
137,033、7,244,820、7,615,686、和8,237,020等的VIP(营养期杀昆虫蛋白)毒素。其他VIP蛋白质是本领域技术人员熟知的(参见，lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/
Bt/vip.html，其可以使用“www”前缀在万维网上访问)。杀有害生物蛋白还包括毒素复合物(TC)蛋白，该毒素复合物(TC)蛋白可从生物体如致病杆菌属、发光杆菌属和类芽孢杆菌属
获得(参见，美国专利号7,491,698和8,084,418)。一些TC蛋白具有“独立”杀昆虫活性并且其他TC蛋白增强由相同给定生物体产生的独立毒素的活性。可以通过源自不同属的来源生
物体的一种或多种TC蛋白“增效剂”来增强“独立”TC蛋白(例如来自发光杆菌属、致病杆菌属或类芽孢杆菌属)的毒性。有三种主要类型的TC蛋白。如在此所述，A类蛋白(“蛋白A”)是独立的毒素。B类蛋白(“蛋白B”)和C类蛋白(“蛋白C”)提高了A类蛋白的毒性。A类蛋白的实例是TcbA、TcdA、XptA1和XptA2。B类蛋白的实例是TcaC、TcdB、XptB1Xb和XptC1Wi。C类蛋白的实例是TccC、XptC1Xb和XptB1Wi。杀有害生物蛋白还包括蜘蛛、蛇和蝎毒蛋白。蜘蛛肽的实例包括但不限于莱科毒素‑1肽及其突变体(美国专利号8,334,366)。

[0287] (C)编码昆虫特异性激素或信息素(如蜕化类固醇和保幼激素)的多核苷酸，其变体，基于其的模拟物，或者其拮抗剂或激动剂。参见，例如Hammock，et al.，(1990)Nature 
344：458[Hammock等人，(1990)，自然，344：458]，该文献披露了经克隆的保幼激素酯酶的杆状病毒表达是保幼激素的灭活剂。

[0288] (D)编码昆虫特异性肽的多核苷酸，该昆虫特异性肽在表达时破坏受影响的有害生物的生理学。例如，参见以下披露：Regan，(1994)J.Biol.Chem.269：9[Regan，(1994)，生物化学杂志，269：9](表达克隆产生编码昆虫利尿激素受体的DNA)；Pratt，et al.，(1989)Biochem.Biophys.Res.Comm.163：1243[Pratt等人，(1989)，生物化学与生物物理学研究通讯，163：1243](Diploptera puntata中索鉴定的allostatin)；Chattopadhyay，et al.，(2004)Critical Reviews in Microbiology 30(1)：33‑54；Zjawiony，(2004)J Nat Prod 
67(2)：300‑310；Carlini and Grossi‑de‑Sa，(2002)Toxicon 40(11)：1515‑1539；Ussuf，et al.，(2001)Curr Sci.80(7)：847‑853 and Vasconcelos and Oliveira，(2004)
Toxicon 44(4)：385‑403[Chattopadhyay等人，(2004)，微生物学重要评论，30(1)：33‑54；
Zjawiony，(2004)，天然产物杂志，67(2)：300‑310；Carlini和Grossi‑de‑Sa，(2002)，毒素，
40(11)：1515‑1539；Ussuf等人，(2001)，当代科学，80(7)：847‑853以及Vasconcelos和Oliveira，(2004)，毒素，44(4)：385‑403]。还参见，Tomalski等人的美国专利号5,266,317，其披露编码昆虫特异性毒素的基因。

[0289] (E)编码负责单萜、倍半萜、类固醇、异羟肟酸、苯丙素衍生物或具有杀昆虫活性的另一种非蛋白质分子的超累积的酶的多核苷酸，包括但不限于7‑epizingiberene合酶(美国专利公开20140157456)。

[0290] (F)编码涉及生物活性分子修饰(包括翻译后修饰)的酶的多核苷酸；例如，糖解酶、蛋白水解酶、脂解酶、核酸酶、环化酶、转氨酶、酯酶、水解酶、磷酸酶、激酶、磷酸化酶、聚合酶、弹性蛋白酶、几丁质酶以及葡聚糖酶，无论是天然还是合成的。参见，Scott等人名下的PCT申请WO 1993/02197，其披露了葡聚糖酶(callase)基因的核苷酸序列。可以获得包含几丁质酶编码序列的DNA分子，例如，从 在登录号39637和67152下。还参见，
Kramer，et al.，(1993)Insect Biochem.Molec.Biol.23：691[Kramer等人，(1993)，昆虫生物化学与分子生物学，23：691]，其教导编码烟草钩虫几丁质酶的cDNA的核苷酸序列，和
Kawalleck，et al.，(1993)Plant Molec.Biol.21：673[Kawalleck等人，(1993)植物分子生物学，21：673]，其提供欧芹ubi4‑2多泛素基因的核苷酸序列，和美国专利号6,563,020、7,
145,060和7,087,810。

[0291] (G)编码刺激信号转导的分子的多核苷酸。例如，参见，由Botella，et al.，(1994)Plant Molec.Biol.24：757[Botella等人，(1994)，植物分子生物学，24：757]的，绿豆钙调蛋白cDNA克隆的核苷酸序列的披露，以及Griess，et al.，(1994)Plant Physiol.104：1467[Griess等人，(1994)，植物生理学，104：1467]，其提供了玉蜀黍钙调素cDNA克隆的核苷酸序列。

[0292] (H)编码疏水力矩肽的多核苷酸。参见，PCT申请WO 1995/16776和美国专利号5,580,852，速普肽(其抑制真菌植物病原体)的肽衍生物的披露和PCT申请WO 1995/18855和
美国专利号5,607,914(教导了赋予疾病抗性的合成抗微生物肽)。

[0293] (I)编码膜通透酶，通道形成剂或通道阻断剂的多核苷酸。例如，参见，由Jaynes，et al.，(1993)Plant Sci.89：43[Jaynes等人，(1993)，植物科学，89：43]的，杀菌肽β‑溶解肽类似物的异源表达以使转基因烟草植物对青枯假单孢菌具有抗性的披露。

[0294] (J)编码病毒侵入性蛋白质或由其衍生的复合毒素的基因。例如，病毒外壳蛋白在转化的植物细胞中的积累赋予由外源蛋白基因来源的病毒以及由相关病毒导致的病毒侵
染和/或疾病发展的抗性。参见，Beachy，et al.，(1990)Ann.Rev.Phytopathol.28：451
[Beachy等人，(1990)，植物病理学年评，28：451]。外壳蛋白介导的抗性已被赋予至转化植物抵抗以下各项：苜蓿花叶病毒、黄瓜花叶病毒、烟草线条病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、烟草蚀纹病毒、烟草脆裂病毒和烟草花叶病毒。同上。

[0295] (K)编码昆虫特异性抗体或由其衍生的免疫毒素的基因。因此，靶向昆虫肠道中关键代谢功能的抗体将使受影响的酶失活，杀灭昆虫。Cf.Taylor，et al.，Abstract#497，SEVENTH INT′L SYMPOSIUM ON MOLECULAR PLANT‑MICROBE INTERACTIONS[Cf.Taylor等
人，摘要#497，分子植物‑微生物相互作用的第七届国际研讨会](爱丁堡，苏格兰，1994)(通过生产单链抗体片段在转基因烟草中酶促失活)。

[0296] (L)编码病毒特异性抗体的基因。参见，例如，Tavladoraki，et al.，(1993)Nature 366：469[Tavladoraki等人，(1993)，自然，366：469]，其表明表达重组抗体基因的转基因植物可以免受病毒攻击。

[0297] (M)编码在自然界中由病原体或寄生虫产生的发育阻滞蛋白的多核苷酸。因此，真菌内α‑1，4‑D‑多聚半乳糖醛酸酶通过溶解植物细胞壁均α‑1，4‑D‑半乳糖醛酸酶促进真菌定植和植物营养释放。参见，Lamb，et al.，(1992)Bio/Technology 10：1436[Lamb等人，(1992)，生物/技术，10：1436]。Toubart，et al.，(1992)Plant J.2：367[Toubart等人，(1992)，植物杂志，2：367]描述了编码豆内聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的基因的克隆和表征。

[0298] (N)编码在自然界中由植物产生的发育阻滞蛋白的多核苷酸。例如，Logemann，et al.，(1992)Bio/Technology 10：305[Logemann等人，(1992)，生物/技术，10：305]已经表明表达大麦核糖体失活基因的转基因植物具有增加的对真菌病的抗性。

[0299] (O)参与系统获得抗性(SAR)应答的基因和/或发病相关基因。Briggs，(1995)Current Biology 5(2)，Pieterse and Van Loon，(2004)Curr.Opin.Plant Bio.7(4)：
456‑64 and Somssich，(2003)Cell 113(7)：815‑6[Briggs，(1995)，当代生物学，5(2)，Pieterse和Van Loon，(2004)，当代植物生物学观点，7(4)：456‑64和Somssich，(2003)，细胞，113(7)：815‑6]。

[0300] (P)抗真菌基因(Comelissen and Melchers，(1993)Pl.Physiol.101：709‑712 and Parijs，et al.，(1991)Planta 183：258‑264 and Bushnell，et al.，(1998)Can.J.of Plant Path.20(2)：137‑149[Cornelissen和Melchers，(1993)，植物生理学，101：709‑712和Parijs等人，(1991)，植物学，183：258‑264和Bushnell等人，(1998)，加拿大植物病理学杂志，20(2)：137‑149])。还参见，美国专利申请序列号09/950,933、11/619,645、11/657,
710、11/748,994、11/774,121和美国专利号6,891,085和7,306,946。用于感知几丁质片段的LysM受体样激酶作为对真菌病原体的植物防御应答中的第一步(US 2012/0110696)。

[0301] (Q)解毒基因，如伏马菌素、白僵菌素、念珠菌素和玉米赤霉烯酮及其结构相关的衍生物的基因。例如，参见，美国专利号5,716,820、5,792,931、5,798,255、5,846,812、6,
083,736、6,538,177、6,388,171和6,812,380。

[0302] (R)编码半胱氨酸蛋白酶抑制剂和半胱氨酸蛋白酶抑制剂的多核苷酸。参见，美国专利号7,205,453。

[0303] (S)防御素基因。参见，WO 2003/000863和美国专利号6,911,577、6,855,865、6,777,592和7,238,781。

[0304] (T)赋予对线虫抗性的基因。参见，例如，PCT申请WO 1996/30517，PCT申请WO 1993/19181，WO 2003/033651和Urwin，et al.，(1998)Planta 204：472‑479，Williamson，(1999)Curr Opin Plant Bio.2(4)：327‑31[Urwin等人，(1998)，植物学，204：472‑479，Williamson，(1999)，当代植物生物学观点，2(4)：327‑31]，美国专利号6,284,948和7,301,
069和miR164基因(WO 2012/058266)。

[0305] (U)孵育对疫霉根腐病抗性的基因，如Rps 1、Rps 1‑a、Rps 1‑b、Rps 1‑c、Rps 1‑d、Rps 1‑e、Rps 1‑k、Rps 2、Rps 3‑a、Rps 3‑b、Rps 3‑c、Rps 4、Rps 5、Rps 6、Rps 7和其他Rps基因。参见，例如，Shoemaker，et al.，Phytophthora Root Rot Resistance Gene Mapping in Soybean，Plant Genome IV Conference，San Diego，Calif.(1995)
[Shoemaker等人，大豆中的疫霉根腐病抗性基因图谱，植物基因组IV会议，圣迭哥，加利福尼亚州，(1995)]。

[0306] (V)赋予对褐色茎腐病抗性的基因，如美国专利号5,689,035中所述，并以此目的通过引用结合。

[0307] (W)赋予对炭疽菌属抗性的基因，如美国专利申请公开US 2009/0035765中所述，并以此目的通过引用结合。这包括可以用作单一基因座转化的Rcg基因座。

[0308] 2.赋予除草剂抗性的转基因，例如：

[0309] (A)编码对抑制生长点或分生组织的除草剂(如咪唑啉酮或磺酰脲)的抗性的多核苷酸。该类别中的示例性基因例如由Lee，et al.，(1988)EMBO J.7：1241and Miki，et al.，(1990)Theor.Appl.Genet.80：449[Lee等人，(1988)，欧洲分子生物学杂志，7：1241和Miki等人，(1990)，理论与应用遗传学，80：449]所描述的分别编码突变ALS和AHAS酶。还参见，美国专利号5,605,011、5,013,659、5,141,870、5,767,361、5,731,180、5,304,732、4,761,
373、5,331,107、5,928,937和5,378,824，美国专利申请序列号11/683,737和国际公开WO 
1996/33270。

[0310] (B)编码对草甘膦(分别由突变体5‑烯醇丙酮酰‑3‑磷酸合酶(EPSPS)和aroA基因赋予的抗性)和其他膦酰基化合物如草铵膦(草丁膦乙酰转移酶(PAT)和吸水链霉菌草丁膦
乙酰转移酶(bar)基因)和吡啶氧基或苯氧基丙酸和环己酮(ACC酶抑制剂编码基因)有抗性
的蛋白质的多核苷酸。参见，例如，美国专利号4,940,835至Shah等人，其披露了可以赋予草甘膦抗性的一种形式的EPSPS的核苷酸序列。美国专利号5,627,061至Barry等人，还披露了编码EPSPS酶的基因。还参见，美国专利号6,566,587、6,338,961、6,248,876 B1、6,040,
497、5,804,425、5,633,435、5,145,783、4,971,908、5,312,910、5,188,642、5,094,945、4,
940,835、5,866,775、6,225,114 B1、6,130,366、5,310,667、4,535,060、4,769,061、5,633,
448、5,510,471、Re.36,449、RE37,287E和5,491,288以及国际公开EP 1173580、WO 2001/
66704、EP 1173581和EP 1173582，以此目的将其通过引用结合在此。还将草甘膦抗性赋予表达编码草甘膦氧化还原酶的基因的植物，如在美国专利号5,776,760和5,463,175更完整
描述的那样，以此目的将其通过引用结合在此。另外，草甘膦抗性可以通过编码草甘膦N‑乙酰转移酶的基因的过表达赋予植物。参见，例如，美国专利号7,462,481、7,405,074以及美国专利申请公开号US 2008/0234130。编码突变体aroA基因的DNA分子可以在 登录
号39256下获得，并且美国专利号4,769,061至Comai中披露了突变基因的核苷酸序列。EP申请号0333033至Kumada等人，以及美国专利号4,975,374至Goodman等人披露了赋予对除草
剂如L‑草丁膦的抗性的谷氨酰胺合酶基因的核苷酸序列。EP申请号0 242 246和0 242 236至Leemans等人中提供了草丁膦乙酰基转移酶基因的核苷酸序列；De Greef，et al.，
(1989)Bio/Technology 7：61[De Greef等人，(1989)，生物/技术，7：61]描述了表达编码草丁膦乙酰转移酶活性的嵌合bar基因的转基因植物的生产。还参见，美国专利号5,969,213、
5,489,520、5,550,318、5,874,265、5,919,675、5,561,236、5,648,477、5,646,024、6,177,
616 B1和5,879,903；以此目的将其通过引用结合在此。赋予对苯氧基丙酸和环己酮(如烯
禾啶和氟吡甲禾灵)抗性的示例性基因是由Marshall，et  al .，(1992)
Theor.Appl.Genet.83：435[Marshall等人，(1992)，理论与应用遗传学，83：435]所描述的Acc1‑S1、Acc1‑S2和Acc1‑S3基因。

[0311] (C)编码对抑制光合作用的除草剂具有抗性蛋白质的多核苷酸，如三嗪(psbA和gs+基因)和苯基氰(腈水解酶基因)。Przibilla，et al.，(1991)Plant Cell 3：169
[Przibilla等人，(1991)，植物细胞，3：169]描述了用编码突变体psbA基因的质粒转化衣藻属。美国专利号4,810,648至Stalker中披露了腈水解酶基因的核苷酸序列，并且包含这些
基因的DNA分子可在 登录号53435、67441和67442下获得。Hayes，et al.，(1992)
Biochem.J.285：173[Hayes等人，(1992)，生物化学杂志，285：173]描述了编码谷胱甘肽S‑转移酶的DNA的克隆和表达。

[0312] (D)编码已经被引入到各种植物中对乙酰羟酸合酶具有抗性的蛋白质的多核苷酸，已经发现其使表达该酶的植物对多种类型的除草剂具有抗性(参见，例如，Hattori，et al.，(1995)Mol Gen Genet.246：419[Hattori等人，(1995)，分子遗传和基因组学，246：
419])。赋予对除草剂抗性的其他基因包括：编码大鼠细胞色素P4507A1和酵母NADPH‑细胞色素P450氧化还原酶的嵌合蛋白的基因(Shiota，et al.，(1994)Plant Physiol 106：17
[Shiota等人，(1994)，植物生理学，106：17])、谷胱甘肽还原酶和超氧化物歧化酶的基因(Aono，et al.，(1995)Plant Cell Physiol 36：1687[Aono等人，(1995)，植物细胞生理学，
36：1687])和各种磷酸转移酶的基因(Datta，et al.，(1992)Plant MolBiol20：619[Datta等人，(1992)，植物分子生物学，20：619])。

[0313] (E)编码对靶向原卟啉原氧化酶(protox)的除草剂的抗性的多核苷酸，该原卟啉原氧化酶是生产叶绿素所必需的。原卟啉原氧化酶酶用作为多种除草剂化合物的靶标。这
些除草剂也抑制存在的所有不同物种的植物的生长，导致其完全破坏。美国专利号6,288,
306 B1、6,282,837 B1和5,767,373和国际公开WO 2001/12825中描述了包含对这些除草剂
具有抗性的改变的原卟啉原氧化酶活性的植物的发育。

[0314] (F)编码芳氧基链烷酸酯双加氧酶(AAD‑1)蛋白的aad‑1基因(最初来自于鞘氨醇除草剂)。性状赋予2，4‑二氯苯氧基乙酸和芳氧基苯氧基丙酸酯(通常称为“fop”除草剂，如喹禾灵)除草剂的耐受性。在植物中除草剂耐受性的aad‑1基因本身首先在WO 2005/107437中披露了(还参见，US 2009/0093366)。该aad‑12基因，源自食酸戴尔福特菌，其编码芳氧基链烷酸酯双加氧酶(AAD‑12)蛋白，蛋白质通过用芳氧基链烷酸酯部分使若干种除草剂去活来赋予对2，4‑二氯苯氧基乙酸和吡啶氧基乙酸酯除草剂的耐受性，包括苯氧基生长素(例如，2，4‑D，MCPA)以及吡啶氧基生长素(例如，氟草烟，绿草定)。

[0315] (G)编码美国专利申请公开2003/0135879中披露的用于赋予麦草畏耐受性的除草剂抗性麦草畏单加氧酶的多核苷酸；

[0316] (H)编码美国专利号4,810,648中所披露的用于赋予溴苯腈耐受性的溴草腈腈水解酶(Bxn)的多核苷酸分子；

[0317] (I)编码Misawa，et al.，(1993)Plant J.4：833‑840 and in Misawa，et al.，(1994)Plant J.6：481‑489[Misawa等人，(1993)，植物杂志，4：833‑840和在：Misawa等人，(1994)，植物杂志，6：481‑489]中所描述的达草灭耐受性的八氢番茄红素(crtl)的多核苷酸分子。

[0318] 3.赋予或贡献于改变的谷物特征的转基因

[0319] 如：

[0320] (A)改变的脂肪酸，例如，通过以下各项

[0321] (1)下调硬脂酰‑ACP以增加植物的硬脂酸含量。参见，Knultzon，et al.，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：2624 and WO 1999/64579[Knultzon等人，(1992)，美国国家科学院院刊，89：2624和WO 1999/64579](改变玉米脂质谱的基因)。

[0322] (2)通过FAD‑2基因修饰提高油酸和/或通过FAD‑3基因修饰降低亚麻酸(参见，美国专利号6,063,947、6,323,392、6,372,965和WO 1993/11245)。

[0323] (3)改变共轭亚麻酸或亚油酸含量，如在WO 2001/12800中。

[0324] (4)改变LEC1，AGP，Dek1，Superall，mil ps，各种Ipa基因如Ipa1、Ipa3、hpt或hggt。例如，参见，WO 2002/42424、WO 1998/22604、WO 2003/011015、WO 2002/057439、WO 2003/011015、美国专利号6,423,886、6,197,561、6,825,397和美国专利申请公开号US 
2003/0079247、US  2003/0204870和Rivera‑Madrid，et  al.，(1995)
Proc.Natl.Acad.Sci.92：5620‑5624[Rivera‑Madrid等人，(1995)，美国国家科学院院刊，
92：5620‑5624]。

[0325] (5)编码用于制备长链多不饱和脂肪酸的δ‑8去饱和酶(美国专利号8,058,571和8,338,152)，用于降低饱和脂肪的δ‑9去饱和酶(美国专利号8,063,269)，用于改进ω‑3脂肪酸谱的报春花属Δ6‑去饱和酶的基因。

[0326] (6)与脂质和糖代谢调节相关的分离的核酸和蛋白质，具体地，在生产转基因植物和调节种子储存化合物(包括脂质、脂肪酸、淀粉或种子贮藏蛋白)的水平的方法中使用的
和在调节植物的种子大小、种子数、种子重量、根长和叶片大小的方法中使用的脂质代谢蛋白(LMP)(EP 2404499)。

[0327] (7)改变植物中糖诱导型2(HSI2)蛋白的高水平表达以增加或减少植物中HSI2的表达。增加HSI2的表达会增加油含量，同时降低HSI2的表达降低脱落酸敏感性和/或增加抗旱性(美国专利申请公开号2012/0066794)。

[0328] (8)细胞色素b5(Cb5)单独或与FAD2一起表达调节植物种子中的油含量，特别是增加ω‑3脂肪酸的水平，并改进ω‑6与ω‑3脂肪酸的比例(美国专利申请公开号201I/
0191904)。

[0329] (9)编码wrinkledl样多肽的核酸分子用于调节糖代谢(美国专利号8,217,223)。

[0330] (B)改变的磷含量，例如，通过以下各项

[0331] (1)引入植酸酶编码基因将增强植酸的分解，向转化的植物添加更多的游离磷酸。例如，参见，Van Hartingsveldt，et al.，(1993)Gene 127：87[Van Hartingsveldt等人，(1993)，基因，127：87]，公开了黑曲霉植酸酶基因的核苷酸序列。

[0332] (2)调节降低植酸含量的基因。在玉蜀黍中，例如，这可以通过以下各项来完成：克隆然后重新引入与以低水平植酸表征的玉蜀黍突变体中鉴定的一个或多个等位基因(LPA等位基因)相关的DNA，如在WO 2005/113778中，和/或改变肌醇激酶活性，如在WO 2002/
059324、美国专利申请公开号2003/0009011、WO 2003/027243、美国专利申请公开号2003/
0079247、WO 1999/05298、美国专利号6,197,561、美国专利号6,291,224、美国专利号6,
391,348、WO 2002/059324、美国专利申请公开号2003/0079247、WO 1998/45448、WO 1999/
55882、WO 2001/04147。

[0333] (C)例如，通过改变影响淀粉分支模式的酶的基因而影响的改变的碳水化合物，或改变硫氧还蛋白如NTR和/或TRX(参见，美国专利号6,531,648，以此目的2005/0204418其通过引用结合)和/或γ玉蜀黍蛋白敲除或突变体如cs27或TUSC27或en27的基因(参见，美国
专利号6,858,778和美国专利申请公开号2005/0160488、美国专利申请公开号2005/
0204418，以此目的其通过引用结合)。参见，Shiroza，et al.，(1988)J.Bacteriol.170：810[Shiroza等人，(1988)，细菌学杂志，170：810](链球菌突变果糖基转移酶基因的核苷酸序列)，Steinmetz，et al.，(1985)Mol.Gen.Genet.200：220[Steinmetz等人，(1985)，分子遗传学和基因组学，200：220](枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因的核苷酸序列)，Pen，et al.，(1992)Bio/Technology 10：292[Pen等人，(1992)，生物/技术，10：292](生产表达地衣芽孢杆菌α‑淀粉酶的转基因植物)，Elliot，et al.，(1993)Plant Molec.Biol.21：515[Elliot等人，(1993)，植物分子生物学，21：515](番茄转化酶基因的核苷酸序列)， et 
al.，(1993)J.Biol.Chem.268：22480[ 等人，(1993)，生物化学杂志，268：22480]
(大麦α‑淀粉酶基因的定点诱变)和Fisher，et al.，(1993)Plant Physiol.102：1045
[Fisher等人，(1993)，植物生理学，102：1045](玉米胚乳淀粉分支酶II)，WO 1999/10498(通过修饰UDP‑D‑木糖4‑差向异构酶、脆性1和2、Refl、HCHL、C4H改进的消化性和/或淀粉提取)，美国专利号6,232,529(通过改变淀粉水平(AGP)生产高油种子的方法)。在此提及的脂肪酸修饰基因也可用于通过淀粉和油途径的相互关系影响淀粉含量和/或组成。

[0334] (D)改变的抗氧化剂含量或组成，如改变生育酚或生育三烯酚。例如，参见，涉及操作抗氧化剂水平的美国专利号6,787,683、美国专利申请公开号2004/0034886和WO 2000/68393，和通过改变尿黑酸香叶基转移酶(hggt)的WO 2003/082899。

[0335] (E)改变的必需种子氨基酸。例如，参见，美国专利号6,127,600(增加种子中必需氨基酸积累的方法)，美国专利号6,080,913(增加种子中必需氨基酸积累的二元方法)，美
国专利号5,990,389(高赖氨酸)，WO 1999/40209(种子中氨基酸组成的变化)，WO 1999/
29882(用于改变蛋白质氨基酸含量的方法)，美国专利号5,850,016(种子中氨基酸组成的
改变)，WO 1998/20133(具有增加必需氨基酸水平的蛋白质)，美国专利号5,885,802(高甲
硫氨酸)，美国专利号5,885,801(高苏氨酸)，美国专利号6,664,445(植物氨基酸生物合
酶)，美国专利号6,459,019(增加的赖氨酸和苏氨酸)，美国专利号6,441,274(植物色氨酸
合酶β亚基)，美国专利号6,346,403(甲硫氨酸代谢酶)，美国专利号5,939,599(高硫)，美国专利号5,912,414(增加的甲硫氨酸)，WO 1998/56935(植物氨基酸生物合酶)，WO 1998/
45458(具有较高百分比必需氨基酸的工程化种子蛋白)，WO 1998/42831(增加的赖氨酸)，
美国专利号5,633,436(增加的硫氨基酸含量)，美国专利号5,559,223(具有包含可编程水
平的必需氨基酸的所定义结构的合成贮藏蛋白，用于改进植物的营养价值)，WO 1996/
01905(增加的苏氨酸)，WO 1995/15392(增加的赖氨酸)，美国专利申请公开号2003/
0163838，美国专利申请公开号2003/0150014，美国专利申请公开号2004/0068767，美国专利号6,803,498，WO 2001/79516。

[0336] 4.控制雄性不育性的基因

[0337] 存在若干可用的赋予遗传雄性不育性的方法，如在基因组内的单独位置处赋予雄性不育性的多个突变基因，如美国专利号4,654,465和4,727,219至Brar等人中所披露的，
以及由美国专利号3,861,709和3,710,511中Patterson所描述的染色体易位。除了这些方
法之外，Albertsen等人，美国专利号5,432,068描述了包括以下各项的核雄性不育：鉴定对雄性能育性至关重要的基因；沉默这种对雄性能育性至关重要的天然基因；从基本的雄性
能育性基因中除去天然启动子并用诱导型启动子替换；将该遗传工程化基因插回入植物；
并因此产生雄性不育的植物，因为诱导型启动子不是“开”的，导致雄性能育性基因不被转录。通过诱导或打“开”来恢复能育性，启动子进允许赋予雄性能育性的基因被转录。

[0338] (A)在绒毡层特异性启动子的控制下以及应用化学品N‑Ac‑PPT引入脱乙酰酶基因(WO 2001/29237)。

[0339] (B)引入各种雄蕊特异性启动子(WO 1992/13956、WO 1992/13957)。

[0340] (C)引入芽孢杆菌RNA酶和芽孢杆菌RNA酶抑制剂基因(Paul，et al.，(1992)Plant Mol.Biol.19：611‑622[Paul等人，(1992)，植物分子生物学，19：611‑622])。

[0341] 对于核雄性和雌性不育系统和基因的另外的实例，还参见美国专利号5,859,341、6,297,426、5,478,369、5,824,524、5,850,014和6,265,640，将其全部通过引用结合在此。

[0342] 5.产生用于位点特异性DNA整合的位点的基因。

[0343] 这包括引入可以在FLP/FRT系统中使用的FRT位点和/或可以在Cre/Loxp系统中使用的Lox位点。例如，参见，Lyznik，et al.，(2003)Plant Cell Rep 21：925‑932[Lyznik等人，(2003)，植物细胞报告，21：925‑932]和WO 1999/25821，将其通过引用结合在此。可以使用的其他系统包括噬菌体Mu的Gin重组酶(Maeser，et al.，(1991)Vicki Chandler，The 
Maize Handbook ch.118[Maeser等人，(1991)，Vicki Chandler，玉蜀黍手册，第118章](施普林格出版社，1994))、大肠杆菌的Pin重组酶(Enomoto等人，1983)和pSRi质粒的R/RS系统(Araki等人，1992)。

[0344] 6.影响非生物胁迫抗性的基因

[0345] 包括但不限于开花，穗和种子发育，提高氮利用效率，改变氮反应性，抗旱性或耐旱性，抗寒性或耐寒性，抗盐性或耐盐性以及在胁迫下产量的增加。

[0346] (A)例如，参见：WO 2000/73475，其中通过改变苹果酸来改变用水效率；美国专利5,892,009、5,965,705、5,929,305、5,891,859、6,417,428、6,664,446、6,706,866、6,717,
034、6,801,104、WO 2000/060089、WO 2001/026459、WO 2001/035725、WO 2001/034726、WO 
2001/035727、WO 2001/036444、WO 2001/036597、WO 2001/036598、WO 2002/015675、WO 
2002/017430、WO 2002/077185、WO 2002/079403、WO 2003/013227、WO 2003/013228、WO 
2003/014327、WO 2004/031349、WO 2004/076638、WO 199809521。

[0347] (B)WO 199938977描述了基因，这些基因包括有效减轻冷冻、高盐度和干旱对植物的负面影响以及赋予植物表型其他积极作用的CBF基因和转录因子

[0348] (C)美国专利申请公开号2004/0148654和WO 2001/36596，其中脱落酸在植物中被改变，导致改进的植物表型，如增加的产量和/或增加的对非生物胁迫的耐受性。

[0349] (D)WO 2000/006341、WO 2004/090143、美国专利号7,531,723和6,992,237，其中细胞分裂素表达被修饰，导致具有增加的胁迫耐受性的植物，如耐旱性和/或增加的产量。
还参见，WO 2002/02776、WO 2003/052063、JP 2002/281975、美国专利号6,084,153、WO 
2001/64898、美国专利号6,177,275和美国专利号6,107,547(提高氮利用率和改变的氮反
应性)。

[0350] (E)对于乙烯改变，参见美国专利申请公开号2004/0128719、美国专利申请公开号2003/0166197和WO 2000/32761。

[0351] (F)对于植物转录因子或非生物胁迫的转录调节子，参见，例如，美国专利申请公开号2004/0098764或美国专利申请公开号2004/0078852。

[0352] (G)增加液泡焦磷酸酶如AVP1表达以提高产量的基因，(美国专利号8,058,515)；编码HSFA4或HSFA5的核酸(A4或A5类的热休克因子)多肽，寡肽转运蛋白(OPT4样)多肽的核
酸；间隔期2样(PLA2样)多肽或Wuschel相关同同源框1样(WOX1样)多肽(美国专利申请公开
号US2011/0283420)。

[0353] (H)下调编码聚(ADP‑核糖)聚合酶(PARP)蛋白的多核苷酸以调节程序性细胞死亡(美国专利号8,058,510)以增加活力。

[0354] (I)编码用于赋予抗旱性的DTP21多肽的多核苷酸(美国专利申请公开号US 2011/0277181)。

[0355] (J)编码用于调节发育，调节对胁迫的应答和调节胁迫耐受性的ACC合酶3(ACS3)蛋白的核苷酸序列(美国专利申请公开号US 2010/0287669)。

[0356] (K)编码赋予耐旱性表型(DTP)以赋予抗旱性的蛋白质的多核苷酸(WO 2012/058528)。

[0357] (L)用于赋予耐旱性和耐盐性的生育酚环化酶(TC)基因(美国专利申请公开号2012/0272352)。

[0358] (M)针对胁迫耐受性的CAAX氨基末端家族蛋白质(美国专利号8,338,661)。

[0359] (N)SAL1编码基因的突变具有增加的胁迫耐受性，包括耐旱性增加(美国专利申请公开号2010/0257633)。

[0360] (O)编码选自下组的多肽的核酸序列的表达，该组由以下各项组成：GRF多肽、RAA1样多肽、SYR多肽、ARKL多肽、和YTP多肽，增加产量相关性状(美国专利申请公开号2011/0061133)。

[0361] (P)调节植物中编码III类海藻糖磷酸酶(TPP)多肽的核酸的表达，用于增强植物中的产量相关性状，特别是增加种子产量(美国专利申请公开号2010/0024067)。

[0362] 影响植物生长和农艺性状的其他基因和转录因子如产量，开花，植物生长和/或植物结构可以被引入或渗入植物，参见，例如，WO 1997/49811(LHY)、WO 1998/56918(ESD4)、WO 1997/10339和美国专利号6,573,430(TFL)、美国专利号6,713,663(FT)、WO 1996/14414(CON)、WO 1996/38560、WO 2001/21822(VRN1)、WO 2000/44918(VRN2)、WO 1999/49064
(GI)、WO 2000/46358(FR1)、WO 1997/29123、美国专利号6,794,560、美国专利号6,307,126(GAI)、WO 1999/09174(D8和Rht)和WO 2004/076638和WO 2004/031349(转录因子)。

[0363] 7.赋予产量增加的基因

[0364] (A)由1‑氨基环丙烷‑1‑羧酸脱氨酶多肽(ACCDP)编码核酸转化的转基因作物植物，其中在作物植物中核酸序列的表达导致与植物的野生型品种相比，植物的根生长增加
和/或增加的产量，和/或对环境胁迫的耐受性增加(美国专利号8,097,769)。

[0365] (B)已经显示出使用种子优先的启动子的玉蜀黍锌指蛋白基因(Zm‑ZFP1)的过表达增强植物生长，增加每株植物的核数和总核重量(美国专利申请公开号2012/0079623)。

[0366] (C)已经显示出玉蜀黍侧生器官边界(LOB)结构域蛋白(Zm‑LOBDP1)的组成型过表达增加每株植物的核数和总核重量(美国专利申请公开号2012/0079622)。

[0367] (D)通过调节植物中编码VIM1(甲基化的变体1)样多肽或VTC2样(GDP‑L‑半乳糖磷酸化酶)多肽或DUF1685多肽或ARF6样(生长素应答因子)多肽的核酸的表达来增强植物中
的产量相关性状(WO 2012/038893)。

[0368] (E)调节植物中编码Ste20样多肽或其同源物的核酸的表达，给出相对于对照植物具有增加的产量的植物(EP 2431472)。

[0369] (F)编码用于修饰植物根系结构的核苷二磷酸酶激酶(NDK)多肽及其同源物的基因(美国专利申请公开号2009/0064373)。

[0370] 8.赋予植物消化性的基因。

[0371] (A)通过调节木聚糖合酶的表达来改变植物细胞壁中存在的木聚糖水平(美国专利号8,173,866)。

[0372] 在一些实施例中，堆叠的性状可以是已经获得法规性审批的性状或事件，包括但不限于表4A‑4F中的事件。

[0373] 表4A 向日葵(Helianthus annuus Sunflower)

[0374]

[0375] 表4B 水稻(Oryza sativa、Rice)

[0376]

[0377] 表4C 大豆(Glycine max L.、Soybean)

[0378]

[0379]

[0380] 表4D 小麦(Triticum aestivum、Wheat)

[0381]

[0382] 表4E 苜蓿(Medicago sativa、Alfalfa)

[0383]

[0384] 表4F 玉蜀黍(Zea mays L、Maize)

[0385]

[0386]

[0387]

[0388]

[0389]

[0390]

[0391]

[0392]

[0393] 具有法规性审批的其他事件是本领域技术人员熟知的，并且可以在环境风险评估中心(cera‑gmc.org/？action＝gm_crop_database，其可以使用www前缀访问)和国际获得农业生物技术应用服务(isaaa.org/gmapprovaldatabase/default.asp，其可以使用www前
缀访问)找到。

[0394] 基因沉默

[0395] 在一些实施例中，堆叠的性状可以处于一种或多种感兴趣的多核苷酸沉默的形式，导致抑制一种或多种靶有害生物多肽。在一些实施例中，通过使用抑制DNA构建体来实现沉默。

[0396] 在一些实施例中，编码本披露的杀昆虫多肽的多肽或其片段或变体的一种或多种多核苷酸可以与编码具有如上所述的杀昆虫活性或农艺性状的一种或多种多肽的一种或
多种多核苷酸堆叠，并且任选地可以进一步包括提供如下文所述一种或多种靶多核苷酸的
基因沉默的一种或多种多核苷酸。

[0397] “抑制DNA构建体”是在转化或稳定整合进植物基因组时，导致该植物中的靶基因“沉默”的重组DNA构建体。对该植物来说，该靶基因可以是内源性的或是转基因的。如在此关于靶基因所使用的，“沉默”通常指在由靶基因表达的mRNA或蛋白质/酶的水平的抑制，和/或在酶活性或蛋白质功能性的水平的抑制。术语“抑制”包括降低、减少、下调、减弱、抑制、消除和阻止。“沉默”或“基因沉默”并没有规定机制，并且包括但不限于反义、共抑制、病毒抑制、发夹抑制、茎环抑制、基于RNAi的方法和基于小RNA的方法。

[0398] 抑制DNA构建体可以包含源自感兴趣的靶基因的区域并且可以包含感兴趣的靶基因的正义链(或反义链)的核酸序列的所有或部分。取决于待利用的方法，该区域可以与感
兴趣的基因的正义链(或反义链)的所有或部分是100％相同的或小于100％相同的(例如，
至少50％或在51％和100％之间的任何整数相同的)。

[0399] 抑制DNA构建体是本领域所熟知的，一旦选定感兴趣的靶基因就很容易构建，并且包括但不限于共抑制构建体、反义构建体、病毒抑制构建体、发夹抑制性构建体、茎环抑制性构建体、产生双链RNA的构建体、以及更通常的是，RNAi(RNA干扰)构建体和小RNA构建体，如siRNA(短干扰RNA)构建体和miRNA(微RNA)构建体。

[0400] “反义抑制”是指能够抑制靶蛋白表达的反义RNA转录物的产生。

[0401] “反义RNA”是指与靶初级转录物或mRNA的全部或部分互补，并阻断靶分离的核酸片段表达的RNA转录物(美国专利号5,107,065)。反义RNA可与特定基因转录物的任何部分，即5′非编码序列、3′非编码序列、内含子或编码序列互补。

[0402] “共抑制”是指能够抑制靶蛋白表达的正义RNA转录物的产生。“正义”RNA是指包括mRNA并且可在细胞内或体外翻译成蛋白质的RNA转录物。此前，已通过着眼于以正义方向过表达与天然mRNA具有同源性的核酸序列(其导致与过表达的序列具有同源性的所有RNA减少)设计出了植物中的共抑制构建体(参见，Vaucheret，et al.，(1998)Plant J.16：651‑
659 and Gura，(2000)Nature 404：804‑808[Vaucheret等人，(1998)，植物杂志，16：651‑
659和Gura，(2000)，自然，404：804‑808])。

[0403] 另一种变型描述了将植物病毒序列用于引导对近端mRNA编码序列的抑制(PCT公开WO 1998/36083)。

[0404] 最近的工作已经描述了“发夹”结构的利用，这些结构以互补方向并入mRNA编码序列的全部或部分，导致所表达的RNA的潜在的“茎‑环”结构(PCT公开WO 1999/53050)。在这种情况下，茎是由相应于相对于启动子以正义或反义方向插入的感兴趣的基因的多核苷酸形成，并且环时由感兴趣的基因的一些多核苷酸形成，这些多核苷酸在构建体中不具有互
补序列。这增加了回收的转基因植物中共抑制或沉默的频率。对于发夹抑制的综述，参见，Wesley，et al.，(2003)Methods in Molecular Biology，Plant Functional Genomics：
Methods and Protocols236：273‑286[Wesley等人，(2003)，分子生物学方法，植物功能基因组学：方法和方案，236：273‑286]。

[0405] 其中茎由至少来自待抑制基因的30个核苷酸形成并且环由随机的核苷酸序列形成的构建体也已经有效地用于抑制(PCT公开WO 1999/61632)。

[0406] 已经描述了使用聚‑T和聚‑A序列产生茎环结构中的茎(PCT公开WO 2002/00894)。

[0407] 然而另一种变型包括使用合成的重复序列来促进茎环结构中的茎的形成。已经证实，用这样的重组DNA片段制备的转基因生物体具有降低水平的由形成环的核苷酸片段编
码的蛋白，如PCT公开WO 2002/00904中所述。

[0408] RNA干扰是指由短干扰性RNA(siRNA)介导的动物中序列特异性转录后基因沉默的过程(Fire等人，(1998)，自然，391：806)。在植物中的对应过程通常称为转录后基因沉默(PTGS)或RNA沉默，并且在真菌中又称为压制(quelling)。据信转录后基因沉默过程是用于防止外源基因表达的进化保守性细胞防御机制，并且通常由不同植物区系和门所共有
(Fire，et al.，(1999)Trends Genet.15：358[Fire等人，(1999)，遗传学趋势，15：358])。这种防止外源基因表达的保护可能已经响应于双链RNA(dsRNA)的产生而演变，这些双链RNA
源自病毒侵染或源自通过细胞应答将转座子元件随机整合到宿主基因组中，该细胞应答特
异性地破坏病毒基因组RNA的同源单链RNA。dsRNA在细胞中的存在通过还没有完全表征的
机制引发了RNAi应答。

[0409] 细胞中长dsRNA的存在刺激称为dicer的核糖核酸酶III酶的活性。Dicer涉及使dsRNA加工成称为短干扰RNA(siRNA)的dsRNA是短片段(Berstein，et al.，(2001)Nature 
409：363[Berstein等人，(2001)，自然，409：363])。源自dicer活性的短干扰RNA的长度通常是约21至约23个核苷酸，并且包含约19个碱基对的双链体(Elbashir，et al.，(2001)Genes Dev.15：188[Elbashir等人，(2001)，基因与发育，15：188])。Dicer还涉及从参与翻译控制的保守结构的前体RNA上切下21个和22个核苷酸的小时序RNA(stRNA)(Hutvagner，et al.，(2001)Science 293：834[Hutvagner等人，(2001)，科学，293：834])。RNAi应答的特征还在于内切核酸酶复合物，通常称为RNA诱导沉默复合物(RISC)，该复合物介导具有与siRNA双
链体的反义链互补的序列的单链RNA的裂解。靶RNA的裂解在与siRNA双链体的反义链互补
的区域中间发生(Elbashir，et al.，(2001)Genes Dev.15：188[Elbashir等人，(2001)，基因与发育，15：188])。此外，RNA干扰还涉及小RNA(例如，miRNA)介导的基因沉默，可推定是通过调节染色质结构并由此防止靶基因序列转录的细胞机制(参见，例如，Allshire，
(2002)Science 297：1818‑1819；Volpe，et al.，(2002)Science 297：1833‑1837；
Jenuwein，(2002)Science297：2215‑2218and Hall，et al.，(2002)Science297：2232‑2237[Allshire，(2002)，科学，297：1818‑1819；Volpe等人，(2002)，科学，297：1833‑1837；
Jenuwein，(2002)，科学，297：2215‑2218和Hall等人，(2002)，科学，297：2232‑2237])。这样，本披露的miRNA分子可用于通过与RNA转录物的相互作用或可替代地通过与特定基因序
列的相互作用介导基因沉默，其中这种相互作用导致转录或转录后水平的基因沉默。

[0410] 进一步提供了允许增加从沉默元件所产生的RNAi的方法和组合物。在这些实施例中，这些方法和组合物使用包含有效地连接于植物细胞中有活性的启动子的靶有害生物序
列的沉默元件的第一多核苷酸，和包括包含有效地连接于植物细胞中有活性的启动子的靶
有害生物序列或活性变体或片段的抑制增强子元件的第二多核苷酸。沉默元件与抑制增强
子元件的组合表达导致从沉默元件产生的抑制性RNA的扩增增加超过仅通过单独的沉默元
件的表达可实现的抑制RNA的扩增。除了特定的RNAi种类自身的扩增增加以外，这些方法和组合物进一步允许产生可以提高破坏靶基因表达的有效性的RNAi种类的不同群体。正如，
当抑制增强子元件在植物细胞中与沉默元件组合表达时，这些方法和组合物可以允许在整
个植物内系统地产生RNAi；生产比仅用单独的沉默元件构建体观察到的更大量的RNAi；并
且改进地将RNAi加载到植物的韧皮部中，从而通过RNAi方法更好地提供韧皮部摄食昆虫的
控制。因此，各种方法和组合物提供用于将抑制性RNA递送至靶生物体的改进方法。参见，例如，美国专利申请公开2009/0188008。

[0411] 如在此使用的，“抑制增强子元件”包括包含待抑制的靶序列或其活性片段或变体的多核苷酸。应当认识到，抑制增强子元件不需要与靶序列相同，而是，抑制增强子元件可以包含靶序列的变体，只要抑制增强子元件与靶序列具有足够的序列同一性，以允许由沉默元件产生的RNAi的增加水平超过仅通过沉默元件表达可实现的RNAi水平。相似地，抑制
增强子元件可以包含靶序列的片段，其中该片段具有足够长度，以允许由沉默元件产生的
RNAi的增加水平超过仅通过沉默元件表达可实现的RNAi水平。

[0412] 应当认识到，可以使用来自相同靶序列或来自不同靶序列或来自相同靶序列的不同区域的多重抑制增强子元件。例如，所用的抑制增强子元件可以包含源自靶序列的不同
区域(即，源自3′UTR、编码区、内含子、和/或5′URT)的靶序列片段。此外，抑制增强子元件可以如在此其他地方所述包含在表达盒内，并且在具体实施例中，抑制增强子元件作为沉默
元件在相同或不同的DNA载体或构建体上。抑制增强子元件可以有效地连接于如在此披露
的启动子。应当意识到，可以组成型或替代地表达抑制增强子元件，或可任选地，它可以以阶段特异性方式使用在此别处讨论的各种可诱导或组织优先的或发育调节的启动子产生。

[0413] 在具体实施例中，使用沉默元件和抑制增强子元件两者时，RNAi的系统性产生发生在整个植物中。在其他实施例中，本披露的植物或植物部分具有比单独表达沉默元件构
建体观察到的改进的RNAi加载到植物韧皮部中，从而通过RNAi方法提供更好的对韧皮部摄
食昆虫的控制。在具体实施例中，本披露的植物、植物部分和植物细胞可以被进一步表征为允许生产可以增强破坏靶基因表达的有效性的多种RNAi种类。

[0414] 在具体实施例中，沉默元件和抑制增强子元件的组合表达增加植物细胞、植物、植物部分、植物组织或韧皮部中的抑制性RNA的浓度超过当沉默元件单独表达时实现的水平。

[0415] 如在此使用的，当与适当的对照植物相比时，“增加的抑制性RNA水平”包括在具有组合表达的植物中产生的RNAi水平的任何统计学显著的增加。例如，当与适当的对照相比时，植物、植物部分或植物细胞中RNAi水平的增加可以包括植物、植物部分、植物细胞或韧皮部中RNAi水平的至少约1％、约1％‑5％、约5％‑10％、约10％‑20％、约20％‑30％、约
30％‑40％、约40％‑50％、约50％‑60％、约60％‑70％、约70％‑80％、约80％‑90％、约90％‑
100％或更高的增加。在其他实施例中，当与适当的对照相比时，植物、植物部分、植物细胞或韧皮部内RNAi水平增加包括植物、植物部分、植物细胞或韧皮部内RNAi水平的至少约1
倍、约1倍‑5倍、约5倍‑10倍、约10倍‑20倍、约20倍‑30倍、约30倍‑40倍、约40倍‑50倍、约50倍‑60倍、约60倍‑70倍、约70倍‑80倍、约80倍‑90倍、约90倍‑100倍或更高的增加。用于控制蝽象和草盲蝽的沉默元件与抑制增强子元件的组合表达的实例可以在美国专利申请公开
2011/0301223和美国专利申请公开2009/0192117中找到。

[0416] 一些实施例涉及通过干扰核糖核酸(RNA)分子下调昆虫有害生物物种中靶基因的表达。PCT公开WO 2007/074405描述了抑制包括马铃薯甲虫在内的无脊椎有害生物中靶基
因表达的方法。PCT公开WO 2005/110068描述了作为控制昆虫侵袭的手段抑制无脊椎有害
生物(包括具体地西方玉米根虫)中靶基因表达的方法。另外，PCT公开WO 2009/091864描述了用于抑制昆虫有害生物物种(包括来自草盲蝽(Lygus)属的有害生物)中的靶基因的组合
物和方法。核酸分子包含用于靶向液泡ATP酶H亚基的RNAi，其可用于控制鳞翅目有害生物
群体和侵袭，如美国专利申请公开2012/0198586中所描述的。PCT公开WO 2012/055982描述了抑制或下调编码以下各项的靶基因表达的核糖核酸(RNA或双链RNA)：昆虫核糖体蛋白如
核糖体蛋白L19、核糖体蛋白L40或核糖体蛋白S27A；昆虫蛋白酶体亚基，如Rpn6蛋白、
Pros25、Rpn2蛋白、蛋白酶体β1亚基蛋白或Pros β2蛋白；COPI囊泡的昆虫β‑外被体，COPI囊泡的γ‑外被体，COPI囊泡的β′‑外被体蛋白或ζ‑外被体；昆虫四跨膜蛋白2A蛋白，其是假定跨膜结构域蛋白；属于肌动蛋白家族的昆虫蛋白，如肌动蛋白5C；昆虫泛素‑5E蛋白；昆虫Sec23蛋白，其是参与细胞内蛋白质转运的GTP酶活化剂；涉及运动活性的作为非常规肌球
蛋白的昆虫皱纹蛋白质；涉及核替代mRNA剪接调节的昆虫曲颈蛋白；昆虫液泡H+‑ATP酶G亚基蛋白和昆虫Tbp‑1如Tat结合蛋白。美国专利申请公开2012/029750，US 20120297501、和
2012/0322660描述了干扰核糖核酸(RNA或双链RNA)，其在昆虫有害生物物种摄取时起作用
以下调所述昆虫有害生物中靶基因的表达，其中该RNA包含至少一个沉默元件，其中该沉默元件是包含退火的互补链的双链RNA的区域，该双链RNA中的一条链包含与靶基因内的靶核
苷酸序列至少部分互补的核苷酸序列或由其组成。美国专利申请公开2012/0164205描述了
用于干扰双链核糖核酸(用于抑制无脊椎动物有害生物)的潜在靶标，包括：Chd3同源序列、β‑微管蛋白同源序列、40kDa V‑ATP酶同源序列、EF1α同源序列、26S蛋白质体亚基p28同源序列、保幼激素环氧化物酶水解酶同源序列、溶胀依赖氯通道蛋白同源序列、葡萄糖‑6‑磷酸1‑脱氢酶蛋白同源序列、Act42A蛋白同源序列、ADP‑核糖因子1同源序列、转录因子IIB蛋白同源序列、几丁质酶同源序列、泛素缀合酶同源序列、甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶同源序列、泛素B同源序列、保幼激素酯酶同源物、和α微管蛋白同源序列。

[0417] 在有害生物控制方面的用途

[0418] 在有害生物控制或使其他生物体工程化中使用包含实施例的核酸序列或其变体的菌株作为杀有害生物剂的一般方法是本领域已知的。参见，例如，美国专利号5,039,523和EP 0480762 A2。

[0419] 可以选择已知占据一种或多种感兴趣的作物的“植物圈”(叶面、叶际、根际和/或根面)的微生物宿主。选择这些微生物是为了能够在特定的环境中与野生型微生物成功竞争，提供表达本披露的杀昆虫多肽的基因的稳定维持和表达，并且理想的是，提供改进的保护杀有害生物剂免受环境退化和失活。

[0420] 这些微生物包括细菌、藻类和真菌。特别令人感兴趣的是微生物如细菌，例如，假单胞菌属、欧文氏菌属、沙雷氏菌属、克雷伯氏菌属、黄单胞菌属、链霉菌属、根瘤菌属、红假单胞菌属、Methylius、农杆菌属、醋杆菌属、乳酸杆菌属、节细菌属、固氮菌属、明串珠菌属、和产碱杆菌属，真菌，特别是酵母，例如酵母菌属、隐球菌属、克鲁维酵母菌属、掷孢酵母属、赤酿母属、和短梗霉属。特别感兴趣的是这样的植物圈细菌物种如：核果树溃疡病菌、荧光假单胞菌、绿针假单胞菌、粘质沙雷氏菌、木醋杆菌、农杆菌、球红假单胞菌、野油菜黄单胞菌、苜蓿根瘤菌(Rhizobium melioti)、真养产碱杆菌、木棍状杆菌(Clavibacter xyli)和棕色固氮菌以及植物圈酵母物种如深红类酵母菌、黏红酵母、海滨红酵母、橙色红酵母(R.Aurantiaca)、浅白隐球菌、液化隐球菌(C.diffluens)、罗伦隐球菌、罗斯酵母
(Saccharomyces rosei)、布雷多伦酵母(S.pretoriensis)、酿酒酵母、玫红掷孢酵母
(Sporobolomyces roseus)、香气掷孢酵母(S.odorus)、维罗那克鲁维酵母(Kluyveromyces veronae)、和出芽短梗霉(Aureobasidium pollulans)。特别令人感兴趣的是着色微生物。
特别感兴趣的宿主生物体包括酵母，如红酵母属物种、短梗霉属物种、酵母属物种(如酿酒酵母)、掷孢酵母属物种、叶面生物体如假单胞菌属物种(如绿脓假单胞菌、荧光假单胞菌、绿针假单胞菌)、欧文氏菌属物种、和黄杆菌属物种、和其他此类生物体，包括根癌土壤杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌等。

[0421] 可以将编码实施例的杀昆虫多肽的基因引入到在植物(体表寄生菌)上繁殖的微生物中，以将杀昆虫多肽递送至潜在的靶有害生物。例如，体表寄生菌可以是革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。

[0422] 例如根瘤化细菌可以通过本领域已知的方法从感兴趣的植物中分离出来。具体地，可以从植物的根中分离定植根部的蜡状芽孢杆菌菌株(参见，例如，Handelsman et al.(1991)Appl.Environ.Microbiol.56：713‑718[Handelsman等人，(1991)，应用与环境微生物学，56：713‑718])。可以通过本领域已知的标准方法将编码实施例的杀昆虫多肽的基因引入根瘤化蜡样芽胞杆菌。

[0423] 可以通过电转化将编码本披露的杀昆虫多肽的基因引入，例如，到根瘤化芽孢杆菌中。具体地，可以将编码本披露的杀昆虫多肽的基因克隆到穿梭载体中，例如pHT3101
(Lerecius，et al.，(1989)FEMS Microbiol.Letts.60：211‑218[Lerecius等人，(1989)，FEMS微生物学快报，60：211‑218])。可以通过电穿孔将包含本披露的具体杀昆虫多肽基因的编码序列的穿梭载体pHT3101转化到根瘤化芽孢杆菌(Lerecius，et al.，(1989)FEMS 
Microbiol.Letts.60：211‑218[Lerecius等人，(1989)，FEMS微生物学快报，60：211‑218])。

[0424] 可以设计表达系统，使得本披露的杀昆虫多肽例如在革兰氏阴性细菌如大肠杆菌的细胞质外分泌。具有所分泌的本披露的杀昆虫多肽的优点是：(1)避免所表达的本披露的杀昆虫多肽的潜在细胞毒性作用；和(2)本披露的杀昆虫多肽的纯化效率的改进，包括但不限于：每体积细胞培养液增加的蛋白质的回收和纯化效率和/或每单位蛋白回收和纯化的
成本。

[0425] 本披露的杀昆虫多肽可以在大肠杆菌中分泌，例如，通过将适当的大肠杆菌信号肽融合到本披露的杀昆虫多肽的氨基末端。由大肠杆菌识别的信号肽可以在已知在大肠杆
菌中分泌的蛋白质中发现，例如OmpA蛋白质(Ghrayeb，et al.，(1984)EMBOJ，3：2437‑2442[Ghrayeb等人，(1984)，欧洲分子生物学杂志，3：2437‑2442])。OmpA是大肠杆菌外膜的主要蛋白质，并且因此其信号肽被认为在易位过程中是有效的。此外，OmpA信号肽在处理之前不需要被修饰，如其他信号肽的情况，例如脂蛋白信号肽(Duffaud，et al.，(1987)
Meth.Enzymol.153：492[Duffaud等人，(1987)，酶学方法，153：492])。

[0426] 实施例的杀昆虫多肽可以在细菌宿主中发酵，并且将所得细菌以与Bt菌株用作杀昆虫喷雾剂相同的方式加工并用作微生物喷雾剂。在由芽胞杆菌属分泌的本披露的杀昆虫
多肽的情况下，使用本领域已知的程序除去或突变分泌信号。这种突变和/或缺失在发酵过程中防止杀昆虫多肽分泌到生长培养基中。本披露的杀昆虫多肽保留在细胞内，并且然后
处理细胞以产生封装的杀昆虫多肽。任何合适的微生物可以用于此目的。已经使用假单孢
菌属来表达Bt毒素作为包封的蛋白质，并将所得细胞作为杀昆虫剂加工和喷雾(Gaertner，et al.，(1993)，in：Advanced Engineered Pesticides，ed.Kim[Gaertner等人，(1993)，在：先进的工程化杀有害生物剂中，编辑：Kim])。

[0427] 可替代地，本披露的杀昆虫多肽通过将异源基因导入细胞宿主而产生。该异源基因的表达直接或间接地导致了该杀有害生物剂的细胞内产生和维持。然后在以下条件下对
这些细胞进行处理，当该细胞被施用到靶有害生物的环境时这些条件延长了在该细胞中产
生的毒素的活性。得到的产物保留该毒素的毒性。然后，可以按照常规技术来配制这些天然胶囊化的杀有害生物多肽，以用于施用到寄宿着靶有害生物的环境(例如，土壤、水、以及植物的叶)。参见，例如，EPA 0192319和其中引用的文献。

[0428] 杀有害生物组合物

[0429] 在一些实施例中，活性成分可以以组合物的形式进行施用，并且可以同时或相继地与其他化合物一起施用到待处理的作物区域或植物中。这些化合物可以是肥料、除草剂、冷冻保护剂(cryoprotectant)、表面活性剂、洗涤剂、杀有害生物肥皂(pesticidal soap)、休眠喷洒油(dormant oil)、聚合物、和/或定时释放或生物可降解载体配制品，这些配制品允许在单次施用该配制品之后对靶区域进行长期给药。它们还可以是选择性除草剂、化学
杀昆虫剂、杀病毒剂、杀微生物剂、杀变形虫剂、杀有害生物剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂或这些制剂中的若干种的混合物，如果希望的话，与在配制品领域内通常使用的其他农业上可接受的载体、表面活性剂或促进施用的佐剂一起。合适的载体和佐剂
可以是固体或液体，并且相应于在配制技术中常常采用的物质，例如天然的或再生的矿物
质、溶剂、分散剂、湿润剂、增粘剂、粘合剂或肥料。同样地，可将这些配制品制备成可食用的“诱饵”或塑造成有害生物“陷阱”以允许由靶有害生物来摄食或摄取该杀有害生物配制品。

[0430] 施用包含由细菌菌株产生的本披露的杀昆虫多肽中的至少一种的活性成分或农药组合物的方法包括叶施用、种子包衣和土壤施用。施用的次数和施用的速率取决于相应
有害生物虫的侵袭强度。

[0431] 可以将该组合物配制成粉末、粉剂、小丸、颗粒、喷雾剂、乳液、胶体、溶液、或类似剂型，并且并且可以通过脱水、冻干、匀浆、提取、过滤、离心、沉淀或浓缩包含该多肽的细胞培养物的常规方法来制备。在包含至少一种这种杀有害生物多肽的所有此类组合物中，该多肽可以按重量计以从约1％至约99％的浓度而存在。

[0432] 可以在一个给定的区域内通过本披露的这些方法来杀灭鳞翅目、双翅目、异翅亚目、线虫、半翅目或鞘翅目有害生物或在数量上减少，或者可以将它们预防性地施用到环境区域内以防止由易感性有害生物的侵袭。优选地，这种有害生物摄取杀有害生物有效量的
多肽、或与其接触。如在此使用的，“杀有害生物有效量”是指能够对至少一种有害生物造成死亡或明显减少有害生物生长、摄食或正常生理发育的杀有害生物剂的量。这个量将取决
于以下因素而变化，例如：待控制的特定的靶有害生物，待处理的特定的环境、地点、植物、作物或农业场所，环境条件，以及施用杀有害生物有效的多肽组合物的方法、速率、浓度、稳定性、以及质量。这些配制品还可以根据气候条件、环境因素、和/或施用频率和/或有害生物侵袭的严重度而变化。

[0433] 可通过将该细菌细胞、晶体、和/或孢子悬浮液或分离的蛋白组分与所希望的农业上可接受的载体配制在一起来制备所述的杀有害生物剂组合物。在施用之前，可以用适当
的手段如冻干、冷冻干燥、脱水的，或在一种水性载体、培养基或合适的稀释剂，如盐水或其他缓冲液中配制这些组合物。这些经配制的组合物可以处于以下形式：粉剂或颗粒材料、或在油(植物性或矿物性)或水或油/水乳液中的悬浮液、或作为可湿性粉末、或与适合于农业施用的任何其他载体材料相组合。合适的农业载体可以是固体的或液体的，并且是本领域
中熟知的。术语“农业上可接受的载体”覆盖了所有佐剂、惰性组分、分散剂、表面活性剂、增粘剂、粘合剂、等等，它们常用于杀有害生物剂配制技术中；这些是杀有害生物剂配制领域的技术人员熟知的。这些配制品可以与一种或多种固体或液体佐剂相混合，并且通过不同
的手段进行制备，例如通过使用常规的配制技术将这种杀有害生物组合物与合适的佐剂进
行均匀地混合、掺合和/或研磨。美国专利号6,468,523中描述了合适的配制品和施用方法，其通过引用结合在此。还可以用一种或多种化学组合物来处理植物，这些化学组合物包括
一种或多种除草剂、杀昆虫剂或杀真菌剂。示例性化学组合物包括：果实/蔬菜除草剂：莠去津、除草定、敌草隆、草甘膦、利谷隆、嗪草酮、西玛津、氟乐灵、吡氟禾草灵、草铵膦、氯吡嘧磺隆Gowan、百草枯、戊炔草胺、烯禾啶、氟丙嘧草酯、氯吡嘧磺隆、茚嗪氟草胺
(Indaziflam)；果实/蔬菜杀昆虫剂：涕灭威、苏云金芽孢杆菌(Bacillus 
thuriengiensis)、甲萘威、克百威、毒死蜱、氯氰菊酯、溴氰菊酯、二嗪磷、马拉硫磷、阿维菌素、氟氯氰菊酯/β‑氟氯氰菊酯、高氰戊菊酯、λ‑氯氟氰菊酯、灭螨醌、联苯肼酯、甲氧虫酰肼、双苯氟脲、环虫酰肼、噻虫啉、呋虫胺、嘧螨酯、唑虫酰胺、噻虫胺、螺螨酯、γ‑氯氟氰菊酯、螺甲螨酯、多杀菌素、氯虫酰胺、氰虫酰胺、Spinoteram、杀虫脲、螺虫乙酯、吡虫啉、氯虫双酰胺、硫双威、氰氟虫腙、氟啶虫胺腈、丁氟螨酯、Cyanopyrafen、吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、Spinotoram、硫双威、氟啶虫酰胺、甲硫威、因灭汀‑苯甲酸盐、茚虫威、噻唑磷、苯线磷、硫线磷、蚊蝇醚、苯丁锡、噻螨酮、灭多威、4‑[[(6‑氯吡啶‑3‑基)甲基](2，2‑二氟乙基)氨基]呋喃‑2(5H)‑酮；水果/蔬菜杀真菌剂：多菌灵、百菌清、EBDC、硫、甲基硫菌灵、嘧菌酯、霜脲氰、氟啶胺、乙膦酸、异菌脲、醚菌酯、甲霜灵/精甲霜灵、肟菌酯、噻唑菌胺、丙森锌、肟菌酯、环酰菌胺、富马酸噁咪唑、氰霜唑、咪唑菌酮、苯酰菌胺、啶氧菌酯、吡唑醚菌酯、环氟菌胺、啶酰菌胺；谷物除草剂：异丙隆、溴苯腈、碘苯腈、苯氧基类、氯磺隆、炔草酸、禾草灵、吡氟草胺、噁唑禾草灵、双氟磺草胺、氟草烟、甲磺隆、醚苯磺隆、氟酮磺隆、碘磺隆、丙苯磺隆、氟吡酰草胺、甲磺胺磺隆、氟丁酰草胺、唑啉草酯、酰嘧磺隆、噻吩磺隆甲基、苯磺隆、氟啶嘧磺隆、磺酰磺隆、磺酰草吡唑、甲氧磺草胺、氟噻草胺、肟草酮、吡咯磺隆；谷物杀真菌剂：多菌灵、百菌清、嘧菌酯、环唑醇、嘧菌环胺、丁苯吗啉、氟环唑、醚菌酯、喹氧灵、戊唑醇、肟菌酯、硅氟唑、啶氧菌酯、吡唑醚菌酯、醚菌胺、丙硫菌唑、氟嘧菌酯；谷物杀昆虫剂：乐果、λ‑氯氟氰菊酯、溴氰菊酯、α‑氯氰菊酯、β‑氟氯氰菊酯、联苯菊酯、吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、Clorphyriphos、甲胺磷、乙酰甲胺磷、抗蚜威、甲硫威；玉蜀黍除草剂：莠去津、甲草胺、溴苯腈、乙草胺、麦草畏、二氯吡啶酸、(S‑)二甲酚草胺、草铵膦、草甘膦、异噁唑草酮、(S‑)异丙甲草胺、甲基磺草酮、烟嘧磺隆、氟嘧磺隆、砜嘧磺隆、磺草酮、甲酰胺磺隆、苯吡唑草酮、环磺酮(Tembotrione)、嘧啶肟草醚、酮脲磺草吩酯、氟噻草胺、吡咯磺隆；玉蜀黍杀昆虫剂：克百威、毒死蜱、联苯菊酯、氟虫腈、吡虫啉、λ‑氯氟氰菊酯、七氟菊酯、特丁硫磷、噻虫嗪、噻虫胺、螺甲螨酯、氯虫双酰胺、杀虫脲、氯虫酰胺、溴氰菊酯、硫双威、B‑氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、联苯菊酯、虱螨脲、杀虫隆、七氟菊酯、嘧丙磷、乙虫腈、氰虫酰胺、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、阿维菌素、甲硫威、螺螨酯、螺虫乙酯；玉蜀黍杀真菌剂：种衣酯、福美双、丙硫菌唑、戊唑醇、肟菌酯；水稻除草剂：丁草胺、敌稗、四唑嘧磺隆、苄嘧磺隆、氰氟草酯、杀草隆、四唑酰草胺、唑吡嘧磺隆、苯噻草胺、去稗安、吡嘧磺隆、稗草畏、二氯喹啉酸、禾草丹、茚草酮、氟噻草胺、四唑酰草胺、氯吡嘧磺隆、去稗安、苯并双环酮、环酯草醚、五氟磺草胺、双草醚、丙炔噁草酮、乙氧嘧磺隆、丙草胺、甲基磺草酮、特呋三酮、噁草酮、噁唑禾草灵、吡丙醚；水稻杀昆虫剂：二嗪磷、杀螟硫磷、仲丁威、久效磷、丙硫克百威、噻嗪酮、呋虫胺、氟虫腈、吡虫啉、异丙威、噻虫啉、环虫酰肼、噻虫啉、呋虫胺、噻虫胺、乙虫腈、氯虫双酰胺、氯虫酰胺、溴氰菊酯、啶虫脒、噻虫嗪、氰虫酰胺、多杀菌素、Spinotoram、因灭汀‑苯甲酸盐、氯氰菊酯、毒死蜱、杀螟丹、甲胺磷、醚菊酯、三唑磷、4‑[[(6‑氯吡啶‑3‑基))甲基](2，2‑二氟乙基)氨基]呋喃‑2(5H)‑酮、克百威、丙硫克百威；水稻杀真菌剂：甲基硫菌灵、嘧菌酯、环丙酰菌胺、敌瘟磷、嘧菌腙、异稻瘟净、稻瘟灵、戊菌隆、噻菌灵、咯喹酮、三环唑、肟菌酯、双氯氰菌胺、氰菌胺、硅氟唑、噻酰菌胺；棉花除草剂：敌草隆、伏草隆、MSMA、乙氧氟草醚、扑草净、氟乐灵、唑草酮、烯草酮、吡氟禾草灵‑丁基、草甘膦、达草灭、二甲戊乐灵、嘧硫草醚钠、三氟啶磺隆、得杀草、草铵膦、丙炔氟草胺、塞苯隆；棉花杀昆虫剂：乙酰甲胺磷、涕灭威、毒死蜱、氯氰菊酯、溴氰菊酯、马拉硫磷、久效磷、阿维菌素、啶虫脒、因灭汀‑苯甲酸盐、吡虫啉、茚虫威、λ‑氯氟氰菊酯、多杀菌素、硫双威、γ‑氯氟氰菊酯、螺甲螨酯、啶虫丙醚、氟啶虫酰胺、氯虫双酰胺、杀虫脲、氯虫酰胺、β‑氟氯氰菊酯、螺虫乙酯、噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、呋虫胺、氯虫双酰胺、氰虫酰胺、多杀菌素、Spinotoram、γ‑氯氟氰菊酯、4‑[[(6‑氯吡啶‑3‑基)甲基](2，2‑二氟乙基)氨基]呋喃‑2(5H)‑酮、硫双威、阿维菌素、氟啶虫酰胺、啶虫丙醚、螺甲螨酯、氟啶虫胺腈、丙溴磷、三唑磷、硫丹；棉花杀真菌剂：土菌灵、甲霜灵、喹硫磷；大豆除草剂：甲草胺、灭草松、氟乐灵、氯嘧磺隆‑乙基、氯酯磺草胺、噁唑禾草灵、氟磺胺草醚、吡氟禾草灵、草甘膦、甲氧咪草烟、灭草喹、咪草烟、(S‑)异丙甲草胺、嗪草酮、二甲戊乐灵、得杀草、草铵膦；大豆杀昆虫剂：λ‑氯氟氰菊酯、灭多威、对硫磷、硫威(Thiocarb)、吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、氯虫双酰胺、氯虫酰胺、氰虫酰胺、多杀菌素、Spinotoram、因灭汀‑苯甲酸盐、氟虫腈、乙虫腈、溴氰菊酯、β‑氟氯氰菊酯、γ和λ氯氟氰菊酯、4‑[[(6‑氯吡啶‑3‑基)甲基](2，2‑二氟乙基)氨基]呋喃‑2(5H)‑酮、螺虫乙酯、螺螨酯、杀虫脲、氟啶虫酰胺、硫双威、β‑氟氯氰菊酯；大豆杀真菌剂：嘧菌酯、环唑醇、氟环唑、粉唑醇、吡唑醚菌酯、戊唑醇、肟菌酯、丙硫菌唑、四氟醚唑；甜菜除草剂：杀草敏、甜菜安、乙氧氟草黄、甜菜宁、野麦畏、二氯吡啶酸、吡氟禾草灵、环草定、苯嗪草酮、喹草酸、噻草酮、氟胺磺隆、得杀草、喹禾灵；甜菜杀昆虫剂：吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、啶虫脒、呋虫胺、溴氰菊酯、β‑氟氯氰菊酯、γ/λ氯氟氰菊酯、4‑[[(6‑氯吡啶‑3‑基))甲基](2，2‑二氟乙基)氨基]呋喃‑2(5H)‑酮、七氟菊酯、氯虫酰胺、氰虫酰胺、氟虫腈、克百威；卡诺拉除草剂：二氯吡啶酸、禾草灵、吡氟禾草灵、草铵膦、草甘膦、吡草胺、氟乐灵、胺苯磺隆、喹草酸、喹禾灵、烯草酮、得杀草；卡诺拉杀真菌剂：嘧菌酯、多菌灵、咯菌腈、异菌脲、丙氯灵、烯菌酮；卡诺拉杀昆虫剂：克百威、有机磷酸盐类、拟除虫菊酯、噻虫啉、溴氰菊酯、吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、啶虫脒、呋虫胺、β‑氟氯氰菊酯、γ以及λ氯氟氰菊酯、τ‑氟氰胺菊酯、乙虫腈、多杀菌素、Spinotoram、氯虫双酰胺、氯虫酰胺、氰虫酰胺、4‑[[(6‑氯吡啶‑3‑基)甲基](2，2‑二氟乙基)氨基]呋喃‑2(5H)‑酮。

[0434] 在一些实施例中，除草剂是莠去津、除草定、敌草隆、氯磺隆、甲磺隆、噻吩磺隆甲基、苯磺隆、乙草胺、麦草畏、异噁唑草酮、烟嘧磺隆、砜嘧磺隆、嘧硫草醚钠、丙炔氟草胺、氯嘧磺隆‑乙基、嗪草酮、喹禾灵、精‑异丙甲草胺、环己通(Hexazinne)或其组合。

[0435] 在一些实施例中，杀昆虫剂是高氰戊菊酯、氯虫苯甲酰胺、灭多威、茚虫威、草氨酰或其组合。

[0436] 杀有害生物和杀昆虫活性

[0437] “有害生物”包括但不限于：昆虫、真菌、细菌、线虫、螨、蜱等。昆虫有害生物包括选自以下各目的昆虫：鞘翅目、双翅目、膜翅目、鳞翅目、食毛目、同翅目、半翅目、直翅目、缨翅目、革翅目、等翅目、虱目、蚤目、毛翅目等，特别是鳞翅目和鞘翅目。

[0438] 本领域的技术人员会知道，不是所有的化合物均对所有有害生物同样有效。实施例的化合物显示针对昆虫有害生物的活性，其可以包括经济上重要的农艺学、森林、温室、苗圃观赏植物、食物和纤维，公共和动物健康，国内和商业结构，家庭和储存产品有害生物。

[0439] 鳞翅目幼虫包括但不限于：夜蛾科(Noctuidae)中的夜蛾、地老虎、尺蠖和实夜蛾亚科，草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda JE Smith)(秋夜蛾(fall armyworm))；甜菜夜蛾(S.exigua Hübner)(甜菜夜蛾(beet armyworm))；斜纹夜蛾(S.lituraFabricius)(斜纹
夜蛾(tobacco cutworm)，茶蚕(cluster caterpillar))；蓓带夜蛾(Mamestra 
configurata Walker)(披肩粘虫(bertha armyworm))；甘蓝夜蛾(M.brassicae Linnaeus)
(菜夜蛾(cabbage moth))；小地老虎(Agrotis ipsilon Hufnagel)(黑切根虫(black 
cutworm))；西方灰地老虎(A.orthogonia Morrison)(西部切根虫(western cutworm))；粒肤地老虎(A.subterranea Fabricius)(粒肤切根虫(granulate cutworm))；棉叶波纹夜蛾
(Alabama argillacea Hübner)(棉叶虫(cotton leaf worm))；粉纹夜蛾(Trichoplusia 
niHübner)(甘蓝银纹夜蛾(cabbage looper))；大豆尺夜蛾(大豆夜蛾)；梨豆夜蛾(黎豆夜
蛾)；粗长须夜蛾(Hypena scabra Fabricius)(苜猜绿夜蛾(green cloverworm))；烟芽夜
蛾(Heliothis virescens  Fabricius)(烟青虫(tobacco  budworm))；一星黏虫
(Pseudaletia unipuncta Haworth)(夜蛾)；粗皮委夜蛾(Athetis mindaraBarnes and 
Mcdunnough)(粗皮切根虫(rough skinned cutworm))；二点委夜蛾(Athetis lepigone)；
暗缘地老虎(Euxoa messoriaHarris)(暗黑切根虫(darksided cutworm))；棉斑实蛾
(Earias insulana Boisduval)(多刺螟蛉(spiny bollworm))；翠纹钻夜蛾(E.vittella 
Fabricius)(斑点螟蛉(spotted bollworm))；棉铃虫(Helicoverpa armigera Hübner)(美
洲螟蛉(American bollworm))；玉米穗虫(玉米穗蛾(corn earworm)或棉螟蛉(cotton 
bollworm))；斑马纹夜蛾(Melanchra pictaHarris)(斑马纹夜蛾(zebra caterpillar))；
柑橘夜蛾(Egira(Xylomyges)curialis Grote)(柑橘地老虎(citrus cutworm))；钻蛀虫、
鞘蛾、结网毛虫、球果蛾；大螟(Sesamia inferens)(亚洲粉红梗螟(Asiatic pink stem 
borer))、和来自螟蛾科玉米螟(欧洲玉米螟)的雕叶虫；脐橙螟蛾(Amyelois transitella Walker)(脐橙螟(naval orangeworm))；地中海粉螟(Anagasta kuehniellaZeller)(地中
海粉斑螟(Mediterranean flour moth))；干果斑螟(Cadracautella Walker)(粉斑螟
(almond moth))；二化螟(Chilo suppressalis Walker)(水稻螟虫(rice stem borer))；
斑禾草螟(C.partellus)，(高粱螟(sorghum borer))；米螟(Corcyra cephalonica 
Stainton)(米蛾(rice moth))；玉米根草螟(Crambus caliginosellus Clemens)(玉米根
网虫(corn root webworm))；早熟禾草螟(C.teterrellus Zincken)(早熟禾草螟
(bluegrass webworm))；稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis Guenée)(稻纵卷叶螟
(rice leafroller))葡萄里予螟(Desmia funeralis Hübner)(葡萄野螟(grape 
leaffolder))；甜瓜绢野螟(Diaphania hyalinata Linnaeus)(甜瓜野螟(melon worm))；
黄瓜绢野螟(D.nitidalis Stoll)(泡菜虫(pickleworm))；巨座玉米螟(Diatraea 
grandiosella Dyar)(西南玉米秆草螟(southwestern  corn borer))、蔗螟
(D.saccharalis Fabricius)(甘蔗螟虫(surgarcane borer))；墨西哥稻螟(Eoreuma 
loftini Dyar)(墨西哥稻螟(Mexican rice borer))；烟草粉斑螟(Ephestia elutella Hü
bner)(烟草飞蛾(tobacco (cacao)moth))；大蜡螟(Galleria mellonella Linnaeus)(大
蜡蛾(greater wax moth))；水稻切叶野螟(Herpetogramma licarsisalis Walker)(草地
螟(sod webworm))；向日葵同斑螟(Homoeosoma electellumHulst)(向日葵螟(sunflower 
moth))；南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellusZeller)(小玉米茎蛀虫(lesser 
cornstalk borer))；小蜡螟(Achroiagrisella Fabricius)(小蜡蛾(lesser wax moth))；
草地螟(Loxostege sticticalisLinnaeus)(草地螟(beet webworm))；茶树螟(Orthaga 
thyrisalisWalker)(茶树蛾(tea tree web moth))；豆荚野螟(Maruca testulalisGeyer)
(豆荚蛀螟(bean pod borer))；印度谷螟(Plodia interpunctellaHübner)(印度谷螟
(Indian meal moth))；三化螟(Scirpophagaincertulas Walker)(三化螟(yellow stem 
borer))；温室螟(Udea rubigalis Guenée)(芹菜卷叶螟(celery leaftier))；和卷蛾科
(Tortricidae)中的卷叶虫、蚜虫、种实虫以及果实虫，西部黑头长翅卷蛾(Acleris 
gloverana Walsingham)(西部黑头蚜虫(Western blackheaded budworm))；东部黑头长翅
卷蛾(A.varianaFernald)(东部黑头蚜虫(Eastern blackheaded budworm))；果树黄卷蛾
(ArchipsargyrospilaWalker)(果树卷叶蛾(fruit tree leaf roller))；罗萨娜黄卷蛾
(A.rosana Linnaeus)(欧洲卷叶蛾(European leafroller))；和其他黄卷蛾属物种，苹小
卷叶蛾(Adoxophyes orana Fischer von )(苹果小卷蛾(summer fruit 
tortrix moth))；条纹向日葵螟(Cochylis hospes Walsingham)(带状向日葵斑蛾(banded sunflower moth))；榛小卷蛾(Cydia latiferreana Walsingham)(filbertworm)；苹果蠹
蛾(C.pomonella Linnaeus)(苹果蚕蛾(codling moth))；杂色卷叶蛾(Platynota 
flavedana Clemens)(色稻纵卷叶螟(variegated leafroller))；荷兰石竹小卷蛾
(P.stultana Walsingham)(杂食卷叶蛾(omnivorous leafroller))；鲜食葡萄小卷蛾
(Lobesia botrana Denis&Schiffermüller)(欧洲葡萄蛾(European grape vine moth))；
苹白小卷蛾(Scilonota ocellana Denis&Schiffermüller)(苹果芽小卷叶蛾(eyespotted 
bud moth))；萄果实虫主虫(Endopiza viteana Clemens)(葡萄小卷叶蛾(grape berry 
moth))；女贞细卷蛾(Eupoecilia ambiguellaHübner)(葡萄果蠹蛾(vine moth))；巴西苹
果卷叶虫(Bonagota salubricola Meyrick)(巴西苹果小卷叶蛾(Brazilian apple 
leafroller))；东方果实蛾(Grapholita molesta Busck)(梨小食心虫(oriental fruit 
moth))；向日葵芽蛾(Suleima helianthana Riley)(向日葵芽蛾(sunflower bud moth))。
带卷蛾属物种；卷叶蛾属物种。

[0440] 鳞翅目中选择的其他农艺学有害生物包括但不限于秋星尺蠖(Alsophila pometariaHarris)(秋星尺蠖(fall  cankerworm))；桃条麦蛾(Anarsia 
lineatellaZeller)(桃条麦蛾(peach twig borer))；栎橙纹犀额蛾(Anisota 
senatoriaJ.E.Smith)(橙色斑纹橡木虫(orange striped oakworm))；柞蚕(Antheraea 
pernyi Guérin‑Méneville)(中橡木柞蚕虫(Chinese Oak Tussah Moth))；家蚕(Bombyx 
mori Linnaeus)(桑蚕(Silkworm))；棉潜蛾(Bucculatrix thurberiellaBusck)(棉叶潜蛾
(cotton leaf perforator))；纹黄豆粉蝶(Colias eurytheme Boisduval)(苜蓿粉蝶
(alfalfa caterpillar))；桃蛀螟(Conogethes punctiferalis)(桃蛀野螟(Yellow Peach Moth))；核桃舟蛾(Datana integerrima Grote&Robinson)(核桃天社蛾(walnut 
caterpillar))；落叶松毛虫(Dendrolimus sibiricus Tschetwerikov)(西伯利亚蚕蛾
(Siberian silk moth))，白尺蠖蛾(Ennomos subsignariaHübner)(榆角尺蠖(elm 
spanworm))；菩提尺蠖(Erannis tiliaria Harris)(椴尺蠖(linden looper))；黄毒蛾
(Euproctis chrysorrhoea Linnaeus)(棕尾毒蛾(browntail moth))；黑拟蛉蛾
(Harrisina americana Guérin‑Méneville)(野棉花夜蛾(grapeleaf skeletonizer))；牧草天蚕蛾(Hemileuca oliviae Cockrell)(牧草天蚕蛾(range caterpillar))；美国白蛾
(Hyphantria  cunea Drury)(美国白蛾(fall webworm))；番茄茎麦蛾(Keiferia 
lycopersicella Walsingham)(番茄蛲虫(tomato pinworm))；东部铁杉尺蠖(Lambdina 
fiscellaria fiscellariaHulst)(东部铁杉尺蠖(Eastern hemlock looper))；西部铁杉
尺蠖(L.fiscellaria lugubrosa Hulst)(西部铁杉尺蠖(Western hemlock looper))；柳
毒蛾(Leucoma salicis Linnaeus)(雪毒蛾(satin moth))；舞毒蛾(Lymantriad ispar 
Linnaeus)(舞毒蛾(gypsy moth))；番茄天蛾(Manduca quinquemaculata Haworth)(五点
天蛾(five spotted hawk moth)，番茄天蛾(tomato hornworm))；烟草天蛾(M.sexta 
Haworth)(番茄天蛾(tomato hornworm)，烟草天蛾(tobacco hornworm))；冬尺蠖蛾
(Operophtera brumataLinnaeus)(冬尺蠖蛾(winter moth))；春尺蠖(Paleacrita 
vernataPeck)(春尺蠖(spring cankerworm))；美洲大芷凤蝶(Papilio cresphontes 
Cramer)(大黄带凤蝶(giant swallowtail)，柑桔凤蝶(orange dog))；加州木角斗蛾
(Phryganidia californica Packard)(加州槲蛾(California oakworm))；柑桔潜蛾
(Phyllocnistis citrella Stainton)(柑桔潜叶蛾(citrus leafminer))；斑幕潜叶蛾
(Phyllonorycter blancardellaFabricius)(斑幕潜叶虫(spotted tentiform 
leafminer))；欧洲粉蝶(Pieris brassicae Linnaeus)(大白粉蝶(large white 
butterfly))；菜青虫(P.rapae Linnaeus)(小白粉蝶(small white butterfly))；暗脉菜
粉蝶(P.napi Linnaeus)(绿脉菜粉蝶(green veined white butterfly))；洋蓟葱羽蛾
(Platyptilia carduidactyla Riley)(洋蓟羽蛾(artichoke plume moth))；小菜蛾
(Plutella xylostella Linnaeus)(小菜蛾(diamondback moth))；棉红铃虫
(Pectinophora gossypiella Saunders)(粉螟蛉(pink bollworm))；多形云粉蝶(Pontia 
protodiceBoisduval and Leconte)(南方菜青虫(Southern cabbageworm))；杂食尺蠖
(Sabulodes aegrotata Guenée)(杂食尺蠖(omnivorous looper))；红抚天社蛾(Schizura concinna J.E.Smith)(红疣天社蛾(red humped caterpillar))；麦蛾(Sitotroga 
cerealella Olivier)(麦蛾(Angoumois grain moth))；松异舟蛾(Thaumetopoea 
pityocampa Schiffermuller)(松橡树带蛾毛虫(pine processionary caterpillar))；幕
谷蛾(Tineola bisselliella Hummel)(负袋夜蛾(webbing clothesmoth))；番茄斑潜蝇
(Tuta absoluta Meyrick)(番茄斑潜蝇(tomato leafminer))；苹果巢蛾(Yponomeuta 
padellaLinnaeus)(巢蛾(ermine moth))；Heliothis subflexa Guenée；天幕毛虫属
(Malacosoma)物种和古毒蛾属(Orgyia)物种

[0441] 感兴趣的是鞘翅目的幼虫和成体，其包括来自长角象科(Anthribidae)、豆象科(Bruchidae)和象甲科(Curculionidae)的象鼻虫(包括但不限于：墨西哥棉铃象
(Anthonomus grandis Boheman)(棉铃象甲(boll weevil))；稻水象甲(Lissorhoptrus 
oryzophilus Kuschel)(稻水象虫(rice water weevil))；谷象(Sitophilus granarius 
Linnaeus)(谷象(granary weevil))；米象(S.oryzae Linnaeus)(米象(rice weevil))；三叶草叶象(Hypera punctata Fabricius)(车轴草叶象虫(clover leaf weevil))；密点细
枝象(Cylindrocopturus adspersus LeConte)(向日葵茎象鼻虫(sunflower stem 
weevil))；黄褐小爪象(Smicronyx fulvus LeConte)(红葵花籽象甲(red sunflower seed weevil))；灰色小爪象(S.sordidusLeConte)(灰葵花籽象甲(gray sunflower seed 
weevil))；玉米隐啄象(Sphenophorus maidisChittenden)(玉蜀黍象虫(maize 
billbug)))；叶甲科(Chrysomelidae)的跳甲、黄瓜叶甲、根虫、叶甲、马铃薯叶甲以及潜叶虫(包括但不限于：马铃薯叶甲(Leptinotarsa decemlineata Say)(马铃薯甲虫(Colorado potato beetle))；玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera virgifera LeConte)(西方玉米
根虫)；北方玉米根虫(D.barberi Smith and Lawrence)(北方玉米根虫(northern corn 
rootworm))；黄瓜十一星叶甲食根亚种(D.undecimpunetata howardi Barber)(南方玉米
根虫(southern corn rootworm))；玉米铜色跳甲(Chaetocnema pulicaria Melsheimer)
(玉米跳甲(corn flea beetle))；十字花科跳甲(Phyllotreta cruciferae Goeze)(十字
花科蔬菜跳甲(Crucifer flea beetle))；黄曲条跳甲(Phyllotreta striolata)(黄曲条
跳甲(stripped flea beetle))；肖叶甲褐斑(Colaspis brunnea Fabricius)(葡萄肖叶甲
(grape colaspis))；橙足负泥虫(Oulema melanopus Linnaeus)(谷叶甲虫(cereal 
leafbeetle))；向日葵叶甲(Zygogramma exclamationisFabricius)(向日葵叶甲
(sunflower beetle)))；来自瓢虫科(Coccinellidae)的甲虫(包括但不限于：墨西哥豆瓢
虫(Epilachna varivestisMulsant)(墨西哥豆瓢虫(Mexican bean beetle)))；金龟子和
来自金龟子科(Scarabaeidae)的其他甲虫(包括但不限于：日本丽金龟(Popillia 
japonica Newman)(日本金龟子(Japanese beetle))；北方圆头犀金龟(Cyclocephala 
borealisArrow)(北方独角仙(northern masked chafer)，白蛴螬(white grub))；南方圆
头犀金龟(C.immaculata Olivier)(南方独角仙(southern masked chafer)，白蛴螬
(white grub))；欧洲切根鳃金龟(Rhizotrogus majalis Razoumowsky)(欧洲金龟子
(European chafer))；长毛食叶然金龟(Phyllophaga crinita Burmeister)(白蛴螬
(white grub))；胡萝卜金龟(Ligyrus gibbosus De Geer)(胡萝卜金龟(carrot 
beetle)))；来自皮蠹科(Dermestidae)的地毯圆皮蠹(carpet beetle)；来自叩甲科，伪金针虫属物种，梳爪叩头虫属物种的金针虫；宽胸叩头虫属物种；Limonius物种；缺隆叩甲属物种；Ctenicera物种；Aeolus物种；来自小蠹科的小蠹虫和来自拟步甲科的甲虫。

[0442] 双翅目(Diptera)的成体和未成熟体是感兴趣的，包括潜叶虫美洲黍潜叶蝇(Agromyza parvicornis Loew)(玉米斑潜叶蝇(corn blotch leafminer))；摇蚊科(包括
但不限于：高粱瘿蚊(Contarinia sorghicola Coquillett)(高梁瘿蚊(sorghum midge))；
黑森瘿蚊(Mayetiola destructor  Say)(黑森蝇(Hessian fly))；麦红吸浆虫
(Sitodiplosis  mosellana  Géhin)(小麦吸浆虫(wheat midge))；葵花籽蚊
(Neolasioptera murtfeldtiana Felt)，(向日葵籽瘿蚊(sunflower seed midge)))；果蝇(实蝇科(Tephritidae))、瑞典麦秆蝇(Oscinella frit Linnaeus)(果蝇(frit flies))；
蛆虫(包括但不限于：灰地种蝇(Deliaplatura Meigen)(种蝇(seedcorn maggot))；麦地种蝇(D.coarctata Fallen)(麦种蝇(wheat bulb fly))和其他地种蝇属，美洲麦秆蝇
(Meromyza americana Fitch)(美洲麦秆蝇(wheat stem maggot))；家蝇(Musca 
domesticaLinnaeus)(家蝇(house flies))；夏厕蝇(Fannia canicularis Linnaeus)、小
舍蝇(F.femoralis Stein)(小家蝇(lesser houseflies))；厩螫蝇(Stomoxys calcitrans Linnaeus)(螫蝇(stable flies))；秋家蝇，角蝇，绿头苍蝇，金蝇属；蝇属物种和其他麝香蝇(muscoid fly)有害生物、马蝇虻属(Tabanus)物种；肤蝇胃蝇属(Gastrophilus)物种；狂蝇属(Oestrus)物种；纹皮蝇皮蝇属(Hypoderma)物种；鹿蝇斑虻属(Chrysops)物种；绵羊虱蝇(Melophagus ovinus Linnaeus)(绵羊蜱)和其他短角亚目，蚊子伊蚊属(Aedes)物种；疟蚊属(Anopheles)物种；家蚊属(Culex)物种；黑蝇原蚋属(Prosimulium)物种；蚋属
(Simulium)物种；吸血蠓、沙蝇、眼菌蚊(sciarid)和其他长角亚目(Nematocera)。

[0443] 作为感兴趣的昆虫包括了半翅目和同翅目的成体和若虫，如但不限于：来自球蚜科(Adelgidae)的球蚜、来自盲蝽科(Miridae)的盲蝽、来自蝉科(Cicadidae)的蝉、叶蝉、小绿叶蝉属(Empoasca)物种；来自叶蝉科的，来自菱蜡蝉科(Cixiidae)、青翅飞虱科
(Flatidae)、蜡蝉总科(Fulgoroidea)、瓢蜡蝉科(Issidae)和(Delphacidae)的飞虱，来自角蝉科(Membracidae)的角蝉，来自木虱科(Psyllidae)的木虱，来自粉虱科(Aleyrodidae)的粉虱，来自蚜科(Aphididae)的蚜虫，来自根瘤蚜科(Phylloxeridae)的葡萄根瘤蚜，来自粉蚧科(Pseudococcidae)的粉蚧，来自链介壳虫科(Asterolecanidae)、蚧科(Coccidae)、粉蚧科(Dactylopiidae)、盾蚧科(Diaspididae)、绒蚧科(Eriococcidae)、旌介壳虫科
(Ortheziidae)、刺葵介壳虫科(Phoenicococcidae)和绵蚧科(Margarodidae)的介壳虫，来自网蝽科的网蝽，来自蝽科(Pentatomidae)的椿象，长蝽(cinch bug)，土长蝽属物种；和来自长蝽科(Lygaeidae)的其他籽长蝽、来自沫蝉科(Cercopidae)的沫蝉、来自缘蝽科
(Coreidae)的南瓜缘蝽和来自红蝽科(Pyrrhocoridae)的秋恙螨和棉蝽。

[0444] 来自同翅目的农艺重要成员进一步包括但不限于：豌豆蚜(Acyrthisiphon pisum Harris)(豌豆蚜虫(pea aphid))；黑豆蚜(Aphis craccivora Koch)(蚕豆蚜(cowpea 
aphid))；黑豆蚜(A.fabae Scopoli)(蚕豆蚜(black bean aphid))；棉蚜(A.gossypii 
Glover)(棉蚜(cotton aphid)，瓜叶菊蚜虫(melon aphid))；玉米根蚜(A.maidiradicis 
Forbes)(玉米根蚜(corn root aphid))；苹果黄蚜(A.pomi De Geer)(苹蚜(apple 
aphid))；绣线菊蚜(A.spiraecola Patch)(绣线菊蚜(spirea aphid))；茄粗额蚜
(Aulacorthum solani Kaltenbach)(指顶花无网长管蚜(foxglove aphid))；草莓钉蚜
(Chaetosiphon fragaefolii Cockerell)(草莓毛管蚜(strawberry aphid))；麦双尾蚜
(Diuraphis noxia Kurdjumov/Mordvilko)(俄罗斯小麦蚜虫(Russian wheat aphid))；车
前圆尾蚜(Dysaphis plantaginea Paaserini)(苹粉红劣蚜(rosy apple aphid))；苹果绵
蚜(Eriosoma lanigerum Hausmann)(苹果绵蚜(woolly apple aphid))；甘蓝蚜
(Brevicoryne brassicae Linnaeus)(菜蚜(cabbage aphid))；桃粉大尾蚜(Hyalopterus 
pruni Geoffroy)(桃大尾蚜(mealy  plum aphid))；萝卜蚜(Lipaphis erysimi 
Kaltenbach)(萝卜蚜(turnip aphid))；麦无网长管蚜(Metopolophium dirrhodum 
Walker)(麦蚜虫(cereal aphid))；马铃薯长管蚜(Macrosiphum euphorbiae Thomas)(马
铃薯蚜(potato aphid))；桃蚜(Myzuspersicae Sulzer)(桃蚜(peach‑potato aphid，
green peach aphid))；莴苣衲长管蚜(Nasonovia ribisnigri Mosley)(莴苣蚜(lettuce 
aphid))；瘿绵对属(Pemphigus)物种(根蚜虫(root aphids)和倍蚜(gall aphids))；玉米
蚜(Rhopalosiphum maidis Fitch)(玉米蚜(corn leafaphid))；禾谷缢管蚜(R.padi 
Linnaeus)(禾谷缢管蚜(bird cherry‑oat aphid))；麦二叉蚜(Schizaphis graminum 
Rondani)(麦二叉蚜(greenbug))；牛鞭草蚜(SiphaflavaForbes)(甘蔗黄蚜(yellow 
sugarcane aphid))；麦长管蚜(Sitobion avenae Fabricius)(麦长管蚜(English grain 
aphid))；苜蓿斑蚜(Therioaphis maculata Buckton)(苜蓿斑蚜(spotted alfalfa 
aphid))；茶二叉蚜(Toxoptera aurantii Boyer de Fonscolombe)(黑色柑橘蚜(black 
citrus aphid)和褐色橘蚜(T.citricida Kirkaldy)(桔二叉蚜(brown citrusaphid))；球
属(Adelges)物种(球蚜(adelgids))；长山核桃根瘤蚜(Phylloxera devastatrix 
Pergande)(山胡桃根瘤蚜(pecan phylloxera))；烟粉虱(Bemisia tabaci Gennadius)(烟
粉虱(tobacco  whitefly)，甘薯粉虱(sweetpotato whitefly))；银叶粉虱
(B.argentifolii Bellows&Perring)(银叶粉虱(silverleaf whitefly))；柑橘粉虱
(Dialeurodes citri  Ashmead)(柑桔粉虱(citrus whitefly))；结翅白粉虱
(Trialeurodes abutiloneus)(带状翅白粉虱(bandedwinged whitefly)和温室粉虱
(T.vaporariorum Westwood)(温室粉虱(greenhouse whitefly))；马铃薯小绿叶蝉
(Empoasca fabae Harris)(马铃薯叶蝉(potato leafhopper))；灰飞虱(Laodelphax 
striatellus Fallen)(灰飞虱(smaller brown planthopper))；二点叶蝉(Macrolestes 
quadrilineatus Forbes)(紫菀叶蝉(aster leafhopper))；黑尾叶蝉(Nephotettix 
cinticeps Uhler)(绿叶蝉(green leafhopper))；二条斑黑尾叶蝉(N.nigropictus )
(稻叶蝉(rice leafhopper))；褐飞虱(Nilaparvata lugens )(褐飞虱(brown 
planthopper))；玉米蜡蝉(Peregrinus  maidis Ashmead)(玉米飞虱(corn 
planthopper))；白背飞虱(Sogatella furcifera Horvath)(白背飞虱(white‑backed 
planthopper))；稻条背飞虱(Sogatodes orizicola Muir)(稻飞虱(rice delphacid))；苹果白叶蝉(Typhlocyba pomariaMcAtee)(苹白小叶蝉(white apple leafhopper))；葡萄斑
叶蝉属(Erythroneoura)物种(葡萄叶蝉(grape leafhoppers))；十七年蝉(Magicicada 
septendecimLinnaeus)(周期蝉(periodical cicada))；吹绵蚧(lcerya purchasi 
Maskell)(吹绵蚧(cottony cushion scale))；梨圆蚧(Quadraspidiotus perniciosus 
Comstock)(梨圆蚧(San Jose scale))；臀纹粉蚧(Planococcus citri Risso)(桔粉蚧
(citrus mealybug))；粉蚧属(Pseudococcus)物种(其他粉蚧系群)；梨木虱(Cacopsylla 
pyricolaFoerster)(梨木虱(pear psylla))；柿木虱(Trioza diospyri Ashmead)(柿木虱
(persimmon psylla))。

[0445] 来自半翅目的感兴趣的农艺重要物种包括但不限于：拟绿蝽(Acrosternum hilare Say)(稻绿蝽(green stink bug))；南瓜缘蝽(Anasa tristis De Geer)(南瓜虫
(squash bug))；美洲谷长蝽(Blissus leucopterus leucopterus Say)(麦长蝽(chinch 
bug))；方翅网蝽(Corythuca gossypii Fabricius)(棉网蝽(cotton lace bug))；番茄蝽
(Cyrtopeltis modesta Distant)(番茄蝽(tomato bug))；棉蝽(Dysdercus suturellus 
Herrich‑ )(棉红蝽(cotton stainer))；褐臭蝽(Euschistus servus Say)(褐臭
蝽(brown stink bug))；一斑臭蝽(E.variolarius Palisot de Beauvois)(一斑臭蝽
(one‑spotted stink bug))；长蝽属(Graptostethus)物种(果实蝽系群(complex of seed bugs))；松叶根蝽(Leptoglossus corculus Say)(松叶根蝽(leaf‑footed pine seed 
bug))；美洲牧草盲蝽(Lygus lincolaris Palisot de Beauvois)(牧草盲蝽(tarnished 
plant bug))；牧草盲蝽(L.HesperusKnight)(西部牧草盲蝽(Western tarnished plant 
bug))；牧草盲蝽(L.pratensisLinnaeus)(牧草盲蝽(common meadow bug))；长毛草盲蝽
(L.rugulipennis Poppius)(长毛草盲蝽(European tarnished plant bug))；长绿盲蝽
(Lygocoris pabulinus Linnaeus)(苹绿盲蝽(common green capsid))；稻绿蝽(Nezara 
viridula Linnaeus)(南方绿椿象(southern green stink bug))；美洲稻蝽(Oebalus 
pugnax Fabricius)(稻褐蝽(rice stink bug))；马利筋长蝽(Oncopeltus fasciatus 
Dallas)(大马利筋长蝽(large milkweed bug))；棉跳盲蝽(Pseudatomoscelis seriatus 
Reuter)(棉跳盲蝽(cotton fleahopper))。

[0446] 此外，实施例可以对半翅目有效，如草莓蝽(Calocoris norvegicus Gmelin)(草莓长蝽(strawberry bug))；Orthops campestris Linnaeus；苹果盲蝽(Plesiocoris 
rugicollis Fallen)(苹盲蝽(apple capsid))；番茄蝽(Cyrtopeltis modestus Distant)
(番茄蝽(tomato bug))；黑斑烟盲蝽(Cyrtopeltis notatus Distant)(吸蝇(suckfly))；
白斑盲蝽(Spanagonicus albofasciatus  Reuter)(白斑盲蝽(whitemarked 
fleahopper))；皂荚蝽(Diaphnocoris chlorionis Say)(皂角蝽(honeylocust plant 
bug))；洋葱蝽(Labopidicola allii Knight)(葱盲蝽(onion plant bug))；棉盲蝽
(Pseudatomoscelis seriatus Reuter)(棉盲蝽(cotton fleahopper))；苜蓿褐盲蝽
(Adelphocoris  rapidus  Say)(苜蓿褐盲蝽(rapid plant bug))；四线盲蝽
(Poecilocapsus lineatus Fabricius)(四线叶虫(four‑lined plant bug))；小长蝽
(Nysius ericae Schilling)(多彩长蝽(false chinch bug))；假麦长蝽(Nysius 
raphanus Howard)(假麦长蝽(false chinch bug))；稻绿蝽(Nezara viridula Linnaeus)
(南方绿椿象(Southern green stink bug))；扁盾蝽属(Eurygaster)物种；缘蝽科
(Coreidae)物种；红蝽科(Pyrrhocoridae)物种；谷蛾科(Tinidae)物种；负子蝽科
(Blostomatidae)物种；猪蝽科(Reduviidae)物种和臭虫科(Cimicidae)物种

[0447] 另外，包括蜱螨目(Acari)(螨类)的成体和幼虫，如小麦瘤瘿螨(Aceria tosichella Keifer)(小麦卷叶螨(wheat curl mite))；麦岩螨(Petrobia latens Mü
ller)(褐色小麦螨(brown wheat mite))；在叶螨科(Tetranychidae)中蜘蛛螨和红螨，苹
果全爪螨(Panonychus ulmi Koch)(欧洲红螨(European red mite))；二斑叶螨
(Tetranychus urticae Koch)(二点叶螨(two spotted spider mite))；迈叶螨
(T.mcdanieli  McGregor)(迈叶螨(McDaniel  mite))；朱砂叶螨
(T.cinnabarinusBoisduval)(朱砂叶螨(carmine spider mite))；土耳其斯坦叶螨
(T.turkestani Ugarov&Nikolski)(土耳其斯坦叶螨(strawberry spider mite))；细须螨
科中的葡萄短须螨，桔短须螨(Brevipalpus lewisi McGregor)桔短须螨(citrus flat 
mite))；瘿螨科(Eriophyidae)中的锈螨和芽瘿螨以及其他食叶螨和对人类和动物健康重
要的螨，即表皮螨科(Epidermoptidae)的尘螨、蠕形螨科(Demodicidae)的毛囊螨、食甜螨科(Glycyphagidae)的谷螨，硬蜱科(Ixodidae)的蜱。黑脚硬蜱(Ixodes scapularis Say)
(鹿蜱(deertick))；全环硬蜱(I.holocyclus Neumann)(澳大利亚致瘫痪埤(Australian 
paralysis tick))；变异矩头蜱(Dermacentor variabilis Say)(美洲犬蜱(American dog tick))；美洲钝眼蜱(Amblyomma americanum Linnaeus)(孤星蜱(lone star tick))以及
在痒螨科、蒲螨科和疥螨科中的痒螨和疥螨。

[0448] 缨尾目(Thysanura)的昆虫有害生物是感兴趣的，如衣鱼(Lepisma saccharina Linnaeus)(蠹虫(silverfish))；斑衣鱼(Thermobia domestica Packard)(小灶衣鱼
(firebrat))。

[0449] 所覆盖的另外节肢动物有害生物包括：蛛蛛目中的蜘蛛如褐隐毒蛛(Loxosceles reclusa Gertsch and Mulaik)(褐皮花蛛(brown recluse spider))和黑寡妇蜘蛛
(Latrodectus mactans Fabricius)(黑寡妇毒蛛(black widow spider))，以及蚰蜒目
(Scutigeromorpha)中的蜈蚣如蚰蜒(Scutigera coleoptrata Linnaeus)(蚰蜒(house 
centipede))。

[0450] 感兴趣的昆虫包括椿象和其他相关昆虫的超家族，包括但不限于属于以下各科的物种：蝽科(稻绿蝽、茶翅蝽(Halyomorpha halys)、Piezodorus guildini、褐臭蝽、拟绿蝽、英雄美洲蝽(Euschistus heros)、美洲蝽(Euschistus tristigmus)、拟绿蝽、褐蝽
(Dichelops melacanthus)、和蓓蝽(Bagrada hilaris)(蓓蝽(Bagrada Bug)))，龟蝽科
(Plataspidae)(筛豆龟蝽(Megacopta cribraria)‑豆平腹蝽蟓(Bean plataspid))和土蝽
科(Scaptocoris castanea‑Root stink bug)，以及鳞翅目物种包括但不限于：小菜蛾，例如，玉米穗虫；大豆夜蛾，例如，大豆尺夜蛾和黎豆夜蛾，例如，梨豆夜蛾。

[0451] 用于测量杀有害生物活性的方法是本领域中所熟知的。参见，例如，Czapla and Lang，(1990)J.Econ.Entomol.83：2480‑2485；Andrews，et al.，(1988)Biochem.J.252：
199‑206；Marrone，et al.，(1985)J.of Economic Entomology 78：290‑293[Czapla和Lang，(1990)，经济昆虫学杂志，83：2480‑2485；Andrews等人，(1988)，生物化学杂志，252：
199‑206；Marrone等人，(1985)，经济昆虫学杂志，78：290‑293]以及美国专利号5,743,477，它们全部通过引用以其全文结合在此。总体上，在摄食测定中混合并使用了这种蛋白质。参见，例如，Marrone，et al.，(1985)J.of Economic Entomology 78：290‑293[Marrone等人，(1985)，经济昆虫学杂志，78：290‑293]。此类测定可以包括将植物与一种或多种有害生物接触，并且确定该植物存活和/或造成这些有害生物死亡的能力。

[0452] 线虫包括寄生线虫如根结线虫、胞囊线虫、和腐线虫，包括异皮线虫属物种、根结线虫属物种、和球异皮线虫属物种；特别是胞囊线虫的成员，包括但不限于：大豆异皮线虫(大豆胞囊线虫)；甜菜异皮线虫(甜菜胞囊线虫)；燕麦异皮线虫(谷物胞囊线虫(cereal cyst nematode))和马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)和马铃薯白线虫
(Globodera pailida)(马铃薯胞囊线虫(potato cyst nematodes))。腐线虫包括短体线虫
属物种。

[0453] 种子处理

[0454] 为了保护并提高产量生产和性状技术，种子处理方案可以为昆虫、杂草和疾病提供另外的作物计划灵活性和成本有效的控制。种子材料可以用包含化学或生物除草剂、除
草剂安全剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、发芽抑制剂和增强剂、营养素、植物生长调节剂和活化剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀鸟剂和/或杀软体动物剂的组合的组合物进行处理，通常进行表面处理。这些化合物通常与配制品领域中通常使用的其他载体、表面活性剂或促进施用的
佐剂一起配制。这些包衣可通过用液体配制品浸渍增殖材料或通过用组合的湿或干配制品
进行涂覆来施加。在以下提供了可用作种子处理的各种类型的化合物的实例：The 
Pesticide Manual：A World Compendium，C.D.S.Tomlin Ed.，Published by the British Crop Production Council[农药手册：世界纲要，C.D.S.汤姆林编辑，由英国作物生产委员会出版]，其通过引用结合在此。

[0455] 可用于作物种子的一些种子处理包括但不限于下列一种或多种：脱落酸、阿拉酸式苯‑S‑甲基、阿维菌素、杀草强、阿扎康唑、固氮螺菌属、印楝素、嘧菌酯、芽孢杆菌属物种(包括蜡状芽孢杆菌，坚果芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌，短小芽孢杆菌，球形芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌和/或苏云金芽孢杆菌物种中的一种或多种)，短根瘤菌属物种(包括
bradyrhizobium betae、bradyrhizobium canariense、埃氏慢生根瘤菌、西表岛慢生根瘤菌、慢生型大豆根瘤菌、bradyrhizobium liaonigense、bradyrhizobium pachyrhizi和/或圆明慢生根瘤菌)，克菌丹，萎锈灵，壳聚糖，噻虫胺，铜，溴氰虫酰胺，苯醚甲环唑，氯唑灵，氟虫腈，咯菌腈，氟嘧菌酯，氟喹唑，解草胺，氟草肟，超敏蛋白，抑霉唑，吡虫啉，种菌唑，isoflavenoids，脂质几丁寡糖，代森锰锌，锰，代森锰，精甲霜灵，甲霜灵，叶菌唑，腈菌唑，PCNB，氟唑菌苯胺，青霉菌属，吡噻菌胺，氯菊酯，啶氧菌酯，丙硫菌唑，唑菌胺酯，氯虫苯甲酰胺，S‑metolachlor，皂苷，氟唑环菌胺，TCMTB，戊唑醇，噻苯咪唑，噻苯哒唑，硫威，福美双，甲基立枯磷，三唑醇，木霉属，肟菌酯，灭菌唑和/或锌。PCNB种皮是指包含喹硫磷和氯唑灵的EPA注册号00293500419。TCMTB是指2‑(硫氰基甲基硫代)苯并噻唑。

[0456] 可以测试具有特定转基因性状的种子品种和种子以确定哪些种子处理方案和施用率可以补充这些品种和转基因性状以增加产量。例如，具有良好产量潜力但丝黑穗病易
感性的品种可以受益于使用提供针对丝黑穗病的保护的种子处理，具有良好产量潜力但胞
囊线虫易感性的品种可以受益于使用提供针对胞囊线虫的保护的种子处理等。同样，涵盖
赋予昆虫抗性的转基因性状的品种可以从种子处理赋予的第二种作用方式中获益，涵盖赋
予除草剂抗性的转基因性状的品种可以从用安全剂的种子处理中获益，这种安全剂增强植
物对该除草剂的抗性，等。此外，当与种子处理组合时，正确使用种子处理所产生的良好根系建立和早期出苗可能导致更有效的氮利用，更好的抗干旱能力以及包含某种性状的一种
或多种品种的产量潜力的总体增加。

[0457] 用于杀灭昆虫有害生物和控制昆虫群体的方法

[0458] 在一些实施例中，提供了用于杀灭昆虫有害生物的方法，这些方法包括将昆虫有害生物与杀昆虫有效量的本披露的杀昆虫多肽接触。在一些实施例中，提供了用于杀灭昆
虫有害生物的方法，这些方法包括将昆虫有害生物与杀昆虫有效量的本披露的PIP‑45‑1多肽和本披露的PIP‑45‑2多肽、本披露的PIP‑64‑1多肽和本披露的PIP‑64‑2多肽、本披露的PIP‑74‑1多肽和本披露的PIP‑74‑2多肽、本披露的PIP‑75多肽和/或本披露的PIP‑77多肽接触。

[0459] 在一些实施例中，提供了用于控制昆虫有害生物群体的方法，这些方法包括将昆虫有害生物群体与杀昆虫有效量的这些实施例的重组杀昆虫多肽接触。在一些实施例中，
提供了用于控制昆虫有害生物群体的方法，这些方法包括将昆虫有害生物群体与杀昆虫有
效量的本披露的PIP‑45‑1多肽和本披露的PIP‑45‑2多肽、本披露的PIP‑64‑1多肽和本披露的PIP‑64‑2多肽、本披露的PIP‑74‑1多肽和本披露的PIP‑74‑2多肽、本披露的PIP‑75多肽和/或本披露的PIP‑77多肽接触。如在此使用的，“控制有害生物群体”或“控制有害生物”是指对有害生物的任何影响，导致限制了有害生物造成的损害。控制有害生物包括但不限于
以一定方式杀灭有害生物、抑制有害生物发育、改变有害生物能育性或生长，使得有害生物对植物造成的较少损害，减少所产生后代的数量，产生适应力较弱的有害生物，产生易受捕食者攻击的有害生物或阻止有害生物啃食植物。

[0460] 在一些实施例中，提供了用于控制对杀有害生物蛋白有抗性的昆虫有害生物群体的方法，这些方法包括将昆虫有害生物群体与杀昆虫有效量的本披露的重组杀昆虫多肽接
触。在一些实施例中，提供了用于控制对杀有害生物蛋白有抗性的昆虫有害生物群体的方
法，这些方法包括将昆虫有害生物群体与杀昆虫有效量的本披露的PIP‑45‑1多肽和本披露的PIP‑45‑2多肽、本披露的PIP‑64‑1多肽和本披露的PIP‑64‑2多肽、本披露的PIP‑74‑1多肽和本披露的PIP‑74‑2多肽、本披露的PIP‑75多肽和/或本披露的PIP‑77多肽接触。

[0461] 在一些实施例中，提供了用于保护植物免受昆虫有害生物侵害的方法，这些方法包括在植物或其细胞中表达编码本披露的杀昆虫多肽的重组多核苷酸。在一些实施例中，
提供了用于保护植物免受昆虫有害生物侵害的方法，这些方法包括在植物或其细胞中表达
编码本披露的PIP‑45‑1多肽和本披露的PIP‑45‑2多肽、本披露的PIP‑64‑1多肽和本披露的PIP‑64‑2多肽、本披露的PIP‑74‑1多肽和本披露的PIP‑74‑2多肽、本披露的PIP‑75多肽和/或本披露的PIP‑77多肽的杀有害生物蛋白的重组多核苷酸。

[0462] 昆虫抗性管理(IRM)策略

[0463] 苏云金芽孢杆菌δ‑内毒素在转基因玉米植物中的表达已被证明是控制农业重要昆虫有害生物的有效手段(Perlak等人，1990；1993)。然而，昆虫已经进化，这些昆虫对在转基因植物中表达的苏云金芽孢杆菌δ‑内毒素是具有抗性的。如果这种抗性普遍存在，它将明显限制包含编码这种苏云金芽孢杆菌δ‑内毒素的基因的种质的商业价值。

[0464] 增加转基因杀昆虫剂对靶有害生物的有效性并且同时减少杀昆虫剂抗性有害生物发展的一种方法是提供非转基因(即，非杀昆虫蛋白)避难所(一部分非杀昆虫作物/玉
米)用于与生产对靶有害生物具有活性的单一杀昆虫蛋白的转基因作物一起使用。美国环
境保护局(epa.gov/oppbppdl/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm，其可以使
用www前缀进行访问)发布与生产一种对靶有害生物具有活性的单一Bt蛋白的转基因作物
一起使用的要求。另外，国家玉米种植者协会在他们的网站上也提供了有关避难所要求的
类似指导：(ncga.com/insect‑resistance‑management‑fact‑sheet‑bt‑corn，其可以使用www前缀进行访问)。由于避难区内的昆虫损失，较大的避难所可能会降低总产量。

[0465] 增加转基因杀昆虫剂对靶有害生物的有效性并且同时减少杀昆虫剂抗性有害生物发展的另一种方法是具有杀昆虫基因的储存库，该储存库可以有效地对抗昆虫有害生物
的组，并通过不同的作用方式显现其作用。

[0466] 在植物中表达对相同昆虫物种有毒的两种或更多种杀昆虫组合物，每种杀昆虫剂以有效水平表达是实现对抗性发展的控制的另一种方法。这是基于以下原则：对两种不同
行动模式的抗性演变比仅一种远远更不可能。例如，罗斯概述了两种毒素战略，也称为“金字塔”或“堆叠”，用于管理杀昆虫转基因作物(The Royal Society.Phil.Trans.R.Soc.Lond.B.(1998)353：1777‑1786[英国皇家学会，英国皇家学会哲学学报B(1998)353：1777‑
1786])。每种都能有效抵抗靶有害生物并几乎没有或没有交叉抗性的两种不同蛋白质的堆
叠或金字塔可以允许使用较小的避难所。美国环境保护局要求所种植非Bt玉米的结构性避
难所(通常为5％)比单一性状产品(通常为20％)显著更少。存在各种方法提供避难所的IRM
效应，包括在田地的各种几何种植模式和袋内种子混合物，如进一步通过Roush所讨论的。

[0467] 在一些实施例中，本披露的杀昆虫多肽可用作与其他杀有害生物蛋白组合的(即金字塔的)昆虫抗性管理策略，包括但不限于Bt毒素、致病杆菌属物种或光杆状菌属物种杀昆虫蛋白等。

[0468] 提供了在促进昆虫抗性管理的转基因植物中控制鳞翅目和/或鞘翅目昆虫侵袭的方法，该方法包括在植物中表达具有不同作用模式的至少两种不同的杀昆虫蛋白。

[0469] 在一些实施例中，控制转基因植物中鳞翅目和/或鞘翅目昆虫侵袭并促进昆虫抗性管理的方法，该至少一种杀昆虫蛋白包含对鳞翅目和/或鞘翅目昆虫有杀昆虫性的本披
露的杀昆虫多肽。

[0470] 在一些实施例中，控制转基因植物中鳞翅目和/或鞘翅目昆虫侵袭并促进昆虫抗性管理的方法包括在转基因植物中表达本披露的杀昆虫多肽和对鳞翅目和/或鞘翅目昆虫
有杀昆虫性的具有不同作用模式的Cry蛋白。

[0471] 在一些实施例中，控制转基因植物中鳞翅目和/或鞘翅目昆虫侵袭并促进昆虫抗性管理的方法包括在转基因植物中实施例的PIP‑45‑1多肽和实施例的PIP‑45‑2多肽、实施例的PIP‑64‑1多肽和实施例的PIP‑64‑2多肽、实施例的PIP‑74‑1多肽和实施例的PIP‑74‑2多肽、实施例的PIP‑75多肽和实施例的PIP‑77多肽以及对鳞翅目和/或鞘翅目昆虫有杀昆虫性的具有不同作用模式的Cry蛋白。

[0472] 还提供了减少对转基因植物的鳞翅目和/或鞘翅目昆虫抗性的出现的可能性并在植物中表达杀昆虫蛋白以控制昆虫物种的方法，该方法包括表达与对该昆虫物种具有不同
作用模式的第二杀昆虫蛋白结合的对昆虫物种具有杀昆虫性的本披露的杀昆虫多肽。

[0473] 还提供了减少对转基因植物的鳞翅目和/或鞘翅目昆虫抗性的出现的可能性并在植物中表达杀昆虫蛋白以控制昆虫物种的方法，该方法包括表达与对昆虫物种具有不同作
用模式的第二杀昆虫蛋白结合的对昆虫物种具有杀昆虫性的实施例的PIP‑45‑1多肽和实
施例的PIP‑45‑2多肽、实施例的PIP‑64‑1多肽和实施例的PIP‑64‑2多肽、实施例的PIP‑74‑
1多肽和实施例的PIP‑74‑2多肽、实施例的PIP‑75多肽和实施例的PIP‑77多肽。

[0474] 还提供了转基因植物的有效鳞翅目和/或鞘翅目昆虫抗性管理的手段，该手段包括在植物中以高水平共表达对鳞翅目和/或鞘翅目具有毒性的两种或更多种杀昆虫蛋白，
但是每种都展现出不同的实行其杀灭活性的模式，其中这两种或更多种杀昆虫蛋白包含本
披露的杀昆虫多肽和Cry蛋白。还提供了转基因植物的有效鳞翅目和/或鞘翅目昆虫抗性管
理的手段，该手段包括在植物中以高水平共表达对鳞翅目和/或鞘翅目具有毒性的两种或
更多种杀昆虫蛋白，但是每种都展现出不同的实行其杀灭活性的模式，其中这两种或更多
种杀昆虫蛋白包含实施例的PIP‑45‑1多肽和实施例的PIP‑45‑2多肽、实施例的PIP‑64‑1多肽和实施例的PIP‑64‑2多肽、实施例的PIP‑74‑1多肽和实施例的PIP‑74‑2多肽、实施例的PIP‑75多肽和实施例的PIP‑77多肽、以及Cry蛋白。

[0475] 此外，提供了获得用于种植或商业化表达对鳞翅目和/或鞘翅目昆虫具有杀昆虫性的蛋白的植物的法规性审批的方法，该方法包括以下步骤：参考、提交或依赖昆虫测定结合数据，这些数据显示本披露的杀昆虫多肽不与这些昆虫中的Cry蛋白的结合位点竞争。此外，提供了获得用于种植或商业化表达对鳞翅目和/或鞘翅目昆虫具有杀昆虫性的蛋白的
植物的法规性审批的方法，该方法包括以下步骤：参考、提交或依赖昆虫测定结合数据，这些数据显示实施例的PIP‑45‑1多肽和实施例的PIP‑45‑2多肽、实施例的PIP‑64‑1多肽和实施例的PIP‑64‑2多肽、实施例的PIP‑74‑1多肽和实施例的PIP‑74‑2多肽、实施例的PIP‑75多肽和实施例的PIP‑77多肽不与这些昆虫中的Cry蛋白的结合位点竞争。

[0476] 用于增加植物产量的方法

[0477] 提供了用于增加植物产量的方法。这些方法包括提供表达对在此披露的杀有害生物多肽序列进行编码的多核苷酸的植物或植物细胞，并且在一块侵袭有有害生物的田地中
使该植物或其种子生长，该多肽具有针对该有害生物的杀有害生物活性。在一些实施例中，该多肽具有针对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、半翅目或线虫有害生物的杀有害生物活性，并且该田地侵袭有鳞翅目、半翅目、鞘翅目、双翅目或线虫有害生物。

[0478] 如在此所定义的，该植物的“产量”是指由该植物所产生的生物质的品质和/或数量。如在此使用的，“生物质”是指任何所测量的植物产品。生物质产生的增加是在所测量的植物产物的产量方面的任何改进。增加植物产量具有几种商业应用。例如，增加植物叶生物质可以增加用于人或动物消费的叶菜的产量。另外，增加叶生物质可以用于增加植物衍生
的药学或工业产物的生产。产量的增加可以包括与不表达该杀有害生物序列的植物相比任
何统计学显著的增加，包括但不限于：产量的至少1％的增加、至少3％的增加、至少5％的增加、至少10％的增加、至少20％的增加、至少30％、至少50％、至少70％、至少100％或更大的增加。

[0479] 在特定的方法中，植物产量由于表达本文披露的披露内容的杀昆虫多肽的植物的改进的有害生物抗性而增加。本披露的杀昆虫多肽的表达导致有害生物侵袭植物或以植物
为食的能力下降，从而改进植物产量。

[0480] 加工的方法

[0481] 进一步提供了加工植物、植物部分或种子以从包含本披露的杀昆虫多肽的植物、植物部分或种子获得食品或饲料产品的方法。可以加工本文提供的植物、植物部分或种子
以产生作为通过具有商业价值的加工获得的衍生物的油、蛋白质产物和/或副产物。非限制性实例包括包含编码本披露的杀昆虫多肽的核酸分子的转基因种子，这些转基因种子可以
被处理以产生大豆油、豆制品和/或大豆副产物。

[0482] “加工”是指用于获得任何豆制品的任何物理和化学方法，并且包括但不限于热调节、剥落和研磨、挤出、溶剂萃取或水性浸泡和提取全部或部分种子。

[0483] 以下实例以举例说明的方式而不是以限定的方式提供。

[0484] 实验

[0485] 实例1.昆虫摄食测定

[0486] 在清除的裂解物上进行杀昆虫活性生物测定筛选，以评估杀昆虫蛋白对各种以下品种的影响：鳞翅目物种(欧洲玉米螟(玉米螟)、玉米穗蛾(玉米穗虫)、黑切根虫(小地老
虎)、秋夜蛾(草地贪夜蛾)、大豆夜蛾(大豆尺夜蛾)和黎豆夜蛾(梨豆夜蛾))，鞘翅目物种
(西方玉米根虫(玉米根萤叶甲))，个两个半翅目物种，豆荚盲蝽和稻绿蝽(南方绿椿象
(Southern Green Stinkbug))。

[0487] 鳞翅目测定

[0488] 在96孔板装置中包含细菌菌株的澄清裂解物的人工饵料上进行鳞翅目摄食测定。将澄清裂解物与鳞翅目特异性人工饵料以20μl澄清裂解物和40ul饵料混合物的比例掺入。
在每个孔放置两至五只新生幼虫来摄食5天。结果表示为幼虫反应如生长抑制呈阳性和/或
死亡率。如果幼虫与正在摄食仅施用上述缓冲液的饵料的阴性对照相似，那么结果表示为
阴性。在欧洲玉米螟(玉米螟)、玉米穗蛾(玉米穗虫)、黑切根虫(小地老虎)、秋夜蛾(草地贪夜蛾)、大豆夜蛾(大豆尺夜蛾)和黎豆夜蛾(梨豆夜蛾)上测定每个澄清的裂解物。对这些昆虫进行了一系列浓度的浓度测定，并计算了个体的50％死亡率的浓度(LC50)或50％抑制的
浓度(IC50)。

[0489] 鞘翅目测定

[0490] 在96孔板装置中包含细菌菌株的澄清裂解物的人工饵料上进行鞘翅目摄食测定。将澄清裂解物与鞘翅目特异性人工饵料以10μl澄清裂解物和50ul饵料混合物的比例掺入。
在每个孔中放置两至五只西方玉米根虫(玉米根萤叶甲)新生幼虫来摄食5天。结果表示为
幼虫反应如生长抑制呈阳性和/或死亡率。如果幼虫与正在摄食仅施用上述缓冲液的饵料
的阴性对照相似，那么结果表示为阴性。对这些昆虫进行了一系列浓度的浓度测定，并计算了个体的50％死亡率的浓度(LC50)或50％抑制的浓度(IC50)。

[0491] 草盲蝽属豆荚盲蝽生物测定

[0492] 在96孔生物测定板(BD Falcon 353910)中的每个孔中将20μl澄清的裂解物样品与混合75ul草盲蝽属饵料(Bio‑Serv F9644B)，并用一片Parafilm覆盖。将不同数量的豆荚盲蝽二龄若虫(2至7只)置于96孔过滤板的每个孔中。然后将样品板翻转到过滤板上并用橡
皮筋保持在一起。测定在25℃下运行四天，并且然后对昆虫死亡率和/或昆虫生长的生长抑制迟缓进行评分。对这些昆虫进行了一系列浓度的浓度测定，并计算了个体的50％死亡率
的浓度(LC50)或50％抑制的浓度(IC50)。

[0493] 南方绿椿象(稻绿蝽)和棕纹蝽(Brown Marmorated Stinkbug)(茶翅蝽)生物测定

[0494] 将40ul澄清的裂解物样品与 包装中的360ul草盲蝽属饵料(Bio‑Serv F9644B)混合。将10至15只新蜕皮的龄若虫置于聚苯乙烯培养皿(100mmx20mm)中，该培养皿衬有湿式 滤纸(直径100mm)。在该平皿中包括水源。将生物测定在25℃下在黑
暗中孵育4天。针对死亡率和生长抑制对生物测定进行评分。为了产生ILC50或LC50数据，对昆虫进行了一系列浓度的纯化蛋白质的测定，并且50％的昆虫遭受严重损害的浓度是
ILC50并且50％昆虫死亡的浓度是LC50。

[0495] 马铃薯甲虫(Colorado Potato Beetle、Leptinotarsa decemlineata)生物测定

[0496] 在96孔生物测定板(BD Falcon 353910)中的每个孔中将20ul澄清的裂解物样品与混合75ul改良的鞘翅目饵料(Bio‑Serv F9800B)混合，并且允许凝固。将单个新生儿幼虫置于每个孔中，并用 盖板密封该板。在 片中打孔，并将板在25℃下不加光
照孵育4天。针对死亡率和/或生长抑制对生物测定进行评分。

[0497] 实例2.鉴定杀昆虫活性菌株

[0498] 从在LB培养基(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、和10g/L NaCl)或TSB(大豆胰蛋白酶肉汤)培养基(17g/L胰酶解胨、3g/L大豆蛋白胨、2.5g/L右旋糖、2.5g/L K2HPO4和5g/L NaCl)中生长的细菌菌株的清澈细胞裂解物中观察到针对SBL、CEW、BCW、VBC、ECB、Lygus、SGSB和WCRW的杀昆虫活性，并且在26℃下在以250rpm的震荡下孵育过夜。这种杀昆虫活性
表现出热和蛋白酶敏感性，表明蛋白质性质。活性菌株及其杀昆虫活性列于表5中。

[0499] 表5

[0500]

[0501] 实例3.活性菌株的物种鉴定和基因组测序

[0502] 根据制造商的说明书，用 细菌基因组DNA提取试剂盒(目录号NA2110‑KT，西格玛‑奥德里奇公司(Sigma‑Aldrich)，邮政信箱14508，圣路易，密苏里州63178)提取活TM
性菌株的基因组DNA。使用NanoDrop 分光光度计(赛默科技公司(Thermo Scientific)，西
尔维路3411号(3411Silverside Road)，班克罗夫特大厦(Bancroft Building)，100号套
房，威明顿市，多佛州，19810)确定DNA浓度，并将基因组DNA用无菌水稀释至40ng/ul。通过组合80ng基因组DNA，2ul(5uM)16S核糖体DNA引物TACCTTGTTACGACTT(SEQ ID NO：216)和
AGAGTTTGATCMTGGCTCAG(SEQ ID NO：217)，1ul 10cmM dNTP，1x HF缓冲液，和1
单位 高保真DNA聚合酶来建立25ul PCR反应(新英格兰生物实验室(New 
England Biolabs)，目录号M0530L，县公路240号，伊普斯威奇，马萨诸塞州，01938‑2723)。
PCR反应在MJ Research PTC‑200热循环仪(伯乐实验室有限公司(Bio‑Rad Laboratories，Inc.)，阿尔弗雷德诺贝尔道1000号，赫拉克勒斯，加利福尼亚州，94547，美国)中按以下程序运行：96℃1分钟；30个循环：96℃15秒，52℃2分钟和72℃2分钟；72℃10分钟；并且保持在
4℃。PCR产物用 DNA纯化试剂盒(目录号28104，凯杰公司(QIAGEN Inc.)，坦伯
利车道27220号，瓦伦西亚(Valencia)，加利福尼亚州91355)纯化。将纯化的PCR样品进行
DNA测序，并将所得的16S核糖体DNA序列对NCBI数据库进行BLAST搜索。顶部命中表明菌株
的物种(参见表5)。

[0503] 还根据依诺米那公司(Illumina)开发的文库构建方案制备活性菌株的基因组TM
DNA，并使用Illumina MiSeq 进行测序。组装核酸重叠序列，并且生成开放阅读框。

[0504] 实例4.通过LC‑MS/MS鉴定杀昆虫蛋白

[0505] 如所述分馏和富集所有杀昆虫蛋白。为了鉴别候选物，将蛋白条带切除，用胰蛋白酶消化并且通过纳米液相色谱/电喷雾串联质谱法(纳米‑LC/ESI‑MS/MS)在Thermo Q TM TM
Exactive  Orbitrap 质谱仪(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))，该质
TM TM
谱仪与 NanoLC‑1D  Plus nanoLC 系统(爱博才思公司(AB Sciex))接口。在
MS1全谱扫描后，以信息依赖采集模式收集十个产品离子谱。

[0506] 通过使用Mascot(Matrix Science)通过数据库搜索进行蛋白质鉴定。针对内部数据库Bacteria‑Plus进行搜索，该内部数据库Bacteria‑Plus组合了所有细菌蛋白质序列和源自NCBI非冗余数据库(nr)的角蛋白序列以及内部蛋白质序列。

[0507] 实例5.杀昆虫蛋白的分离和鉴定

[0508] PIP‑45‑Aa‑1和PIP‑45‑Aa‑2的分离和鉴定

[0509] 从布式假单孢菌菌株LBV 5480的透明细胞裂解物中观察到针对WCRW(玉米根萤叶甲)的杀昆虫活性，该布式假单孢菌菌株LBV5480在营养肉汤(蛋白胨‑5g/L、肉提取物‑1g/L、酵母提取物‑2g/L，氯化钠‑5g/L)中生长，并且在26℃下在以250rpm的震荡下孵育过夜。
这种杀昆虫活性表现出热和蛋白酶敏感性，表明蛋白质性质。

[0510] 在Tris缓冲液(pH 8)中再悬浮后，将LBV 5480的细胞颗粒在约20,000psi下匀浆。将粗裂解物通过离心清除并加载到HiTrap Q‑FF柱(GE医疗集团(GE Healthcare))上。结合蛋白用线性氯化钠梯度洗脱并分馏。将包含感兴趣的蛋白的馏分合并，并在50mM Tris(缓
冲液A)中调节至1M硫酸铵浓度。将该物质加载到在缓冲液A中平衡的苯基琼脂糖HP
柱(GE医疗集团)上。用从1M至0M硫酸铵的线性梯度洗脱活性蛋白，并通过尺寸排
阻层析进一步纯化。为此，将苯基池浓缩并加载到 200柱(GE医疗集团)上，在
20mM Tris、150mM NaCl，pH 8中平衡。具有WCRW活性的馏分的SDS‑PAGE分析在用
蓝染料染色后显示出2个主要条带。LC‑MS/MS用于鉴定由菌株LBV 5480编码
的两个新颖基因。这些基因形成操纵子，并且两种基因产物都是如用重组蛋白所证实的杀
昆虫活性所必需的。这些蛋白质被命名为PIP‑45‑Aa‑1(SEQ ID NO：1)和PIP‑45‑Aa‑2(SEQ ID NO：2)。

[0511] PIP‑64‑Aa‑1和PIP‑64‑Aa‑2的分离和鉴定

[0512] 从布式假单孢菌菌株LBV 9691的透明细胞裂解物中观察到针对WCRW(玉米根萤叶甲)和大豆夜蛾(SBL黄豆银纹夜蛾(Chrysodeixis includes))的杀昆虫活性，该布式假单
孢菌菌株LBV 9691在2x YT培养基(16g/L胰蛋白胨、10g/L酵母抽提物、5g/L NaCl)中生长，并且在26℃下在以250rpm的震荡下培养3天。这种杀昆虫活性表现出热和蛋白酶敏感性，表明蛋白质性质。

[0513] 生长条件和昆虫活动差异很大。较高活性还与约28kDa的蛋白质条带的较高表达水平相关，可通过SDS‑PAGE检测。为了进一步确认该候选条带，在20mM Tris缓冲液(pH 8)中再悬浮后，将LVB 9691的细胞颗粒在约30,000psi下匀浆。将粗裂解物通过离心清除并加载到 75柱(GE医疗集团(GE Healthcare))上。WCRW和SBL活性与洗脱馏分中的
28kDa条带密切相关。通过LC‑MS/MS鉴定蛋白质条带。数据库搜索通过菌株LBV 9691鉴定了在操纵子中编码的类似大小的两种新颖蛋白质，这两种新颖蛋白质命名为PIP‑64‑Aa‑1
(SEQ ID NO：53)和PIP‑64‑Aa‑2(SEQ ID NO：54)。重组表达显示，在所测试的浓度下，两种蛋白质都是针对鳞翅目和半翅目的物种的活性所需要的。发现PIP‑64Aa‑1(SEQ ID NO：53)和PIP‑64Aa‑2(SEQ ID NO：54)的摩尔比分别为5∶1的活性是最佳的。单独PIP‑64‑Aa‑1(SEQ ID NO：53)对于WCRW活性是足够的。

[0514] PIP‑74‑Aa‑1和PIP‑74‑Aa‑2的分离和鉴定

[0515] 从布式假单孢菌菌株SS135B4的透明细胞裂解物中观察到针对WCRW(玉米根萤叶甲)的杀昆虫活性，该布式假单孢菌菌株SS135B4在2x Yt培养基中生长，并且在26℃下在以
250rpm的震荡下培养2天。这种杀昆虫活性表现出热和蛋白酶敏感性，表明蛋白质性质。

[0516] 在25mM Tris缓冲液(pH 9)中再悬浮后，将SS135B4的细胞颗粒在约30,000psi下匀浆。将粗裂解物通过离心清除，调节至0.5M硫酸铵，并加载到苯基琼脂糖FF柱(GE医疗集团(GE Healthcare))上。将WCRW活性蛋白以线性梯度洗脱至0M硫酸铵，合并并透析至50mM
乙酸钠缓冲液(pH 5)。然后将调节的池装载到用相同缓冲液平衡的S‑琼脂糖FF柱(GE医疗
集团)上。将包含WCRW活性蛋白的未结合蛋白质馏分缓冲液交换为50mM CAPS(pH 10)，加载到 柱(GE医疗集团)上，并用50mM CAPS(pH 10)的线性氯化钠梯度洗脱。这些馏分
的SDS‑PAGE分析在用 染料染色后显示出若干个条带。切下蛋白质条带并通过
LC‑MS/MS鉴定。数据库搜索通过菌株SS135B4鉴定了在操纵子中编码的两种新颖蛋白质，这两种新颖蛋白质分别命名为PIP‑74‑Aa‑1(SEQ ID NO：73)和PIP‑74‑Aa‑2(SEQ ID NO：74)。
重组表达显示，在所测试的浓度下，两种蛋白质都是针对WCRW的活性所需要的。

[0517] PIP‑75‑Aa的分离和鉴别

[0518] 从南极假单胞菌LBV 6019的透明细胞裂解物中观察到针对WCRW(玉米根萤叶甲)的杀昆虫活性，该南极假单胞菌LBV 6019在2x Yt培养基中，在26℃下在以250rpm的震荡下生长1天。这种杀昆虫活性表现出热和蛋白酶敏感性，表明蛋白质性质。

[0519] 在25mM Tris缓冲液(pH 8.5)中再悬浮后，将LBV 6019的细胞颗粒在约30,000psi下匀浆。将粗裂解物通过离心清除并加载到 Q柱(生命技术公司(Life 
Technologies))上。将包含WCRW活性蛋白的未结合蛋白质馏分通过对10mM MES(pH 6)的透
析进行缓冲液交换，并且然后加载到 S‑HP柱(GE医疗集团)上，并用线性氯化钠梯
度洗脱。将包含活性蛋白的馏分合并，进行缓冲液调节，并在pH 8.5下进行重复的阴离子交换步骤。再次将未结合的馏分进行缓冲液交换，然后在用20mM MES(pH 6)平衡的Mono
柱(GE医疗集团)上进行最终分馏步骤。在以线性梯度洗脱至0.3M NaCl后获得若干种活性
馏分。具有WCRW活性的馏分的SDS‑PAGE分析在用 蓝染料染色后显示出若干个
主要条带。切下蛋白质条带并通过LC‑MS/MS鉴定。

[0520] 数据库搜索揭示了由菌株LBV 6019编码的3个新颖的基因候选物。克隆和重组表达证实了这些候选物之一的杀昆虫活性。该蛋白质被命名为PIP‑75‑Aa(SEQ ID NO：79)。

[0521] PIP‑77‑Aa的分离和鉴别

[0522] 从绿针假单胞菌菌株SS344E5的透明细胞裂解物中观察到针对WCRW(玉米根萤叶甲)的杀昆虫活性，该绿针假单胞菌菌株SS344E5在大豆胰蛋白酶肉汤(TSB，来自酪蛋白的
蛋白胨15g/L，来自豆粕的蛋白胨5g/L；氯化钠5.0g/L)中在26℃下在以250rpm的震荡下生
长1天。这种杀昆虫活性表现出热和蛋白酶敏感性，表明蛋白质性质。

[0523] 在25mM Tris缓冲液(pH 8.5)中再悬浮后，将SS344E5的细胞颗粒在约30,000psi下匀浆。将粗裂解物通过离心清除并加载到 Q柱(生命技术公司(Life 
Technologies))上。将包含WCRW活性蛋白的未结合蛋白质馏分对10mM MES(pH 6)进行透
析，加载到 S‑HP柱(GE医疗集团)上，并用线性氯化钠梯度洗脱至0.5M。将包含
WCRW活性蛋白的馏分合并，并使用 75柱(GE医疗集团)通过尺寸排阻色谱进一
步分离。具有WCRW活性的馏分的SDS‑PAGE分析在用 蓝染料染色后显示出7kDa
的主要条带。LC‑MS/MS用于鉴定由菌株SS344E5编码的两个新颖基因。克隆和重组表达证实了该基因产物的杀昆虫活性，其被命名为PIP‑77‑Aa(SEQ ID NO：88)。

[0524] 实例6.鉴定同源物

[0525] 从各种内部菌株中提取基因组DNA，鉴定出物种，并且基因组是如实例3中所述的序列。在与内部基因组和公开可用的BLAST“nr”数据库中包含的序列相似的默认参数下，基因同一性可以通过进行BLAST(基本局部比对20搜索工具(Basic Local Alignment 20 
Search Tool)；Altschul，et al.，(1993)J.Mol.Biol.215：403‑410[Altschul等人，
(1993)，分子生物学杂志，215：403‑410]；还参见ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/，其可以使用www前缀访问)搜索(包括所有非冗余的GenBank CDS翻译，源自3维结构布鲁克港蛋白质数
据库的序列，25SWISS‑PROT蛋白质序列数据库，EMBL和DDBJ数据库的最后主要版本)。分析以下各项的多肽序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：79和SEQ ID NO：88。

[0526] 表6显示了所鉴定的PIP‑45‑1多肽和PIP‑45‑多肽同源物，每个的序列识别号码和它们鉴定出的细菌菌株。表7显示在PIP‑45‑1多肽同源物之间的序列同一性百分比。图1a‑1m显示PIP‑45‑1多肽同源物的氨基酸序列比对。

[0527] 表6

[0528]

[0529]

[0530]

[0531] n.d.＝未确定

[0532] 表7

[0533]

[0534] 表7(续)

[0535]

[0536]

[0537] 表7(续)

[0538]

[0539]

[0540] 表8显示在PIP‑45‑2多肽同源物之间的序列同一性百分比。图2a‑21显示PIP‑45‑2多肽同源物的氨基酸序列比对。

[0541] 表8

[0542]

[0543]

[0544] 表8(续)

[0545]

[0546]

[0547] 表8(续)

[0548]

[0549] 表9显示了所鉴定的PIP‑64‑1多肽和PIP‑64‑2多肽同源物，每个的序列识别号码和它们鉴定出的细菌菌株。表10显示在PIP‑64‑1多肽同源物之间的序列同一性百分比。图3a‑3b显示PIP‑64‑1多肽同源物的氨基酸序列比对。表11显示在PIP‑64‑2多肽同源物之间的序列同一性百分比。图4a‑4b显示PIP‑64‑2多肽同源物的氨基酸序列比对。

[0550] 表9

[0551]

[0552]

[0553] 表10

[0554]

[0555] 表11

[0556]

[0557]

[0558] 表12显示了所鉴定的PIP‑74‑1多肽和PIP‑74‑2多肽同源物，每个的序列识别号码和它们鉴定出的细菌菌株。表13显示在PIP‑74‑1多肽家族成员之间的序列同一性百分比。图5a‑5b显示PIP‑74‑1多肽同源物的氨基酸序列比对。表14显示在PIP‑74‑2多肽家族成员之间的序列同一性百分比。图6显示PIP‑74‑2多肽同源物的氨基酸序列比对。

[0559] 表12

[0560]

[0561] 表13

[0562]  PIP‑74Ab‑1 PIP‑74Ca‑1
PIP‑74Aa‑1 99.6 74.5
PIP‑74Ab‑1 ‑ 74.5

[0563] 表14

[0564]   PIP‑74Ab‑2 PIP‑74Ca‑2PIP‑74Aa‑2 98.0 66.3
PIP‑74Ab‑2 ‑ 66.3

[0565] 表15显示了所鉴定的PIP‑75多肽同源物，每个的序列识别号码和它们鉴定出的细菌菌株。表16显示在PIP‑75多肽家族成员之间的序列同一性百分比。图7显示PIP‑75多肽同源物的氨基酸序列比对。

[0566] 表15

[0567]

[0568] 表16

[0569]

[0570] 表17显示了所鉴定的PIP‑77多肽同源物，每个的序列识别号码和它们鉴定出的细菌菌株。表18显示在PIP‑77多肽家族成员之间的序列同一性百分比。图8a‑8b显示PIP‑77多肽同源物的氨基酸序列比对。

[0571] 表17

[0572]

[0573]

[0574]

[0575] 表18

[0576]

[0577]

[0578] 表18

[0579]

[0580]

[0581] 实例7.来自不同来源的PIP‑45‑1和PIP‑45‑2组分的功能测试

[0582] 为了测试来自不同PIP‑45同源物的PIP‑45‑1和PIP‑45‑2组分的功能，单独表达了5个选择的活性同源物对(在表19中列出)。每个PIP‑45‑1组分与五个PIP‑45‑2组分中的每一个混合。如上所述，在基于饵料的测定中测试所有对的WCRW杀昆虫活性。结果示于表19
中，表明当将来自不同来源的PIP‑45‑1和PIP‑45‑2组分配对时可提供杀昆虫活性。

[0583] 表19

[0584]

[0585] 粗体有活性的＝来自原始对；有活性的＝用不同来源的组分检测的杀昆虫活性

[0586] 实例8.基因亚克隆和大肠杆菌表达

[0587] 首先通过使用其基因组DNA作为模板的PCR扩增编码杀昆虫蛋白的靶基因。基于具有所结合的适当限制性位点的5’末端和3’末端序列设计PCR引物。在限制酶消化后，将PCRTM
产物克隆到各种大肠杆菌表达载体中，即具有N‑His标签的pCOLD  1，具有和不具有MBP融TM TM
合的pMAL 载体或具有和不具有His标签的pCOLD 载体。在16℃下用1mM IPTG过夜诱导，蛋
白质在BL21(DE3)或C41大肠杆菌宿主细胞中表达。

[0588] 诱导后从大肠杆菌培养物中提取重组蛋白，如实例1所述，对昆虫靶标进行纯化和测定。

[0589] 实例9.在瞬时叶组织上的瞬时表达和昆虫生物测定

[0590] 编码PIP‑64Aa‑1(SEQ ID NO：160)和PIP‑64Aa‑2(SEQ ID NO：161)的多核苷酸分别在病毒启动子pDMMV的控制下克隆到瞬时表达载体中(Dav等人，(1999)，植物分子生物学，40：771‑782)。将农杆菌属细胞悬浮液引入完整组织的植物细胞以使得可重复侵染和随后的植物来源的转基因表达可被测量或研究的农杆菌浸润法是本领域熟知的(Kapila，
et.al.，(1997)Plant Science 122：101‑108[Kapila等人，(1997)，植物科学，122：101‑
108])。简而言之，用测试和对照菌株的标准化细菌细胞培养物对矮菜豆(bush bean)(菜豆(common bean、Phaseolus vulgaris))和大豆(soybean、Glycine max)的幼株进行农杆菌
浸润。每个小植株产生10个叶片，并且单独用大豆夜蛾(Soy Bean Looper、SBL)(大豆尺夜蛾)和黎豆夜蛾(VBC、梨豆夜蛾(Velvet Anticarsia gemmatalis))的3只幼虫侵袭，其中两个叶片对照仅用农杆菌属和农杆菌属中的DsRed2荧光标志物(克罗泰克公司，山景城，加利福尼亚州)产生。侵袭后两天对绿叶组织的消耗量进行评分。通过基于质谱法的蛋白鉴定方法，使用来自共浸润叶组织的提取的蛋白质裂解物确认PIP‑64‑1(SEQ ID NO：53)和PIP‑
64‑2(SEQ ID NO：54)的瞬时蛋白质表达(Patterson，(1998)10(22)：1‑24，Current 
Protocol in Molecular Biology published by John Wiley&Son Inc[Patterson，
(1998)，10(22)：1‑24，由约翰威利父子公司出版的当前分子生物学方案])。.PIP‑64‑1(SEQ ID NO：53)和PIP‑64‑2(SEQ ID NO：54)的瞬时共表达保护叶片免受侵袭昆虫的消耗，而观察到两个阴性对照的总绿色组织消耗。

[0591] 实例10‑农杆菌介导的玉蜀黍的稳定转化

[0592] 对于农杆菌介导的昆杀虫多肽的玉蜀黍转化，使用Zhao的方法(美国专利号5,981,840和国际专利公开号WO 1998/32326，其内容通过引用结合在此)。简而言之，从玉蜀黍中分离未成熟的胚，并且将胚与农杆菌属悬浮液接触，其中细菌能够将编码本披露的杀
昆虫多肽的多核苷酸转移至至少一种未成熟胚的至少一个细胞中(步骤1：侵染步骤)。在该步骤中，将未成熟胚胎浸泡在农杆菌属悬液中用于开始接种。使这些胚胎与农杆菌属共培
养一段时间(步骤2：共培养步骤)。将这些未成熟的胚胎在有抗生素但没有选择剂的固体培养基上培养，用于农杆菌属消除并用于经侵染的细胞的静置期。然后，接种的胚芽在含有一种选择剂的培养基上培养，回收生长的转化的愈伤组织(步骤4：选择步骤)。在含选择剂的固体培养基上培养这些未成熟胚胎，使经转化的细胞选择性生长。然后将愈伤组织再生成
植物(步骤5：再生步骤)，并将生长在选择培养基上的愈伤组织在固体培养基上培养以再生植物。

[0593] 为了检测叶组织中的杀昆虫多肽，将4个冻干叶穿孔/样品粉碎并重新悬浮于含有TM
0.1％TWEEN  20的100μL PBS(PBST)，含有1片/7mL完整的迷你蛋白酶抑制剂(罗氏公司
1183615301)的1％β‑巯基乙醇。将悬浮液超声处理2分钟，并且然后在4℃、20,000g下离心TM
15分钟。向上清液等份1/3体积的3X LDS样品缓冲液(Invitrogen ，加利福尼
亚州，美国)中，添加含有1片7mL完整迷你蛋白酶抑制剂的1％B‑ME。将反应物在80℃下加热TM
10min，并且然后离心。将上清液样品按照制造商(Invitrogen )说明书装载在具有MES运行TM
缓冲液的4％‑12％Bis‑Tris Midi凝胶上，并使用 装置(Invitrogen )转移到硝酸
纤维素膜上。将硝酸纤维素膜在含有5％脱脂奶粉的PBST中孵育2小时，然后在PBST中亲和
纯化的兔抗杀昆虫多肽中孵育过夜。将膜用PBST冲洗三次，并且然后在PBST中孵育15分钟，并且然后冲洗两次5分钟，然后孵育2小时在具有山羊抗兔HRP的PBST中持续3小时。使用ECL蛋白质印迹试剂(GE医疗集团，目录号RPN2106)和 Mr膜可以观察到所
检测的蛋白质。为了检测根中的杀昆虫蛋白，将根冻干，并且将每个样品2mg粉末重新悬浮于LDS中，添加含有1片/7mL完整迷你蛋白酶抑制剂的1％β‑巯基乙醇。将反应在80℃下加热TM
10分钟，并且然后在4℃、20,000g下离心15分钟。将上清液样品按照制造商(Invitrogen )说明书装载在具有MES运行缓冲液的4％‑12％Bis‑Tris Midi凝胶上，并使用 装置
TM
(Invitrogen )转移到硝酸纤维素膜上。将硝酸纤维素膜在含有5％脱脂奶粉的PBST中孵育
2小时，然后在PBST中亲和纯化的多克隆兔抗杀昆虫抗体中孵育过夜。膜用PBST冲洗三次，并且然后在PBST中孵育15分钟，并且然后冲洗两次5分钟，然后孵育2小时在具有山羊抗兔
TM
HRP的PBST中持续3小时。使用ECL 蛋白质印迹试剂(GE医疗集团，目录号RPN2106)和
Mr膜可以检测到抗体结合杀昆虫蛋白。

[0594] 使用本领域已知的标准生物测定法测试杀昆虫蛋白表达阳性的转基因玉蜀黍植物的杀有害生物活性。这些方法包括例如根切除生物测定和全植物生物测定。参见，例如，美国专利申请公开号US2003/0120054和国际公开号WO 2003/018810。

[0595] 实例11‑用于在植物中表达杀昆虫多肽的表达载体构建体

[0596] 可以构建植物表达载体以包括包含杀昆虫多肽编码序列的转基因盒，该昆虫多肽编码序列在于增强子元件结合的紫茉莉花叶病毒(MMV)启动子的控制下[Dey N and Maiti 
IB，1999，Plant Mol.Biol.40(5)：771‑82[Dey N和Maiti IB，1999，植物分子生物学，40(5)：771‑82]]。这些构建体可用于产生转基因玉蜀黍事件，以测试通过本披露的杀昆虫多肽的表达提供的针对玉米根虫的功效。

[0597] 事件的T0温室效应可以通过免受西方玉米根虫的根保护来测量。使用由Oleson，等人，(2005)，[J.Econ Entomol.(经济昆虫学期刊)98(1)：1‑8]开发的方法，根据损伤的根的节点数测量根保护(CRWNIS＝玉米根虫节点损伤评分)。根损伤评分测量为从“0”到“3”，其中“0”表示无可见根损伤，“1”表示1个根损害节点，“2”表示2个节点或根损害，并且“3”表示3个节点的根损害的最大分数。中间评分(例如1.5)表示损害节点的额外分数(例如一个
半所损伤的节点)。