[0001] 本发明涉及一种单萜吲哚类生物碱衍生物在制备预防或治疗脑缺血再灌注损伤药物中的应用。

[0002] 单萜吲哚类生物碱衍生物具有多样的分子结构和显著的生物活性，目前已经成为药学领域研究的重点。已知的单萜吲哚类生物碱骨架类型众多，表现出重要的药理学活性。

[0003] CN103446140A公开了钩藤碱在制备具有抗焦虑、抗抑郁作用药物中的应用。

[0004] CN110483552A公开了一种单萜吲哚生物碱类化合物，从云南萝芙木枝叶干品中分离得到。这种单萜吲哚生物碱类化合物结构新颖，且具有免疫抑制活性，可作为免疫抑制药物的先导化合物。

[0005] CN107827940A公开了钩藤酰胺A及其药物组合物和应用。该专利文献提供了新的吲哚生物碱三糖苷。作为褪黑素受体激动剂，及其在制备治疗或改善与褪黑素受体相关的中枢神经系统疾病的药物中的应用。

[0006] 因此，仍然需要开发单萜吲哚类生物碱衍生物的新的医药用途。

[0007] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种单萜吲哚类生物碱衍生物在制备预防或治疗脑缺血再灌注损伤药物中的应用。本发明的衍生物对脑缺血再灌注损伤的原代皮层神经元具有较好的保护作用，可用于制备抗脑缺血再灌注损伤的药物。本发明通过以下技术方案实现上述目的。

[0008] 本发明提供一种单萜吲哚类生物碱衍生物在制备预防或治疗脑缺血再灌注损伤药物中的应用，所述衍生物的结构如式(A)、(B)或(C)所示：

[0009]

[0010] 其中， 表示单键或双键；

[0011] R1选自氢、氧、羟基、羟基取代的C1‑C6烷基或胺基取代的C1‑C6烷基；R2选自C1‑C6烃基或羟基取代的C1‑C8烃基；R3选自含氧基团；R4为氧或亚氨基；

[0012] R1和R2之间可以形成氮杂环；

[0013] R2和R3之间可以形成氧杂环，氧杂环的至少一个氢原子可以被葡萄糖基取代。

[0014] 根据本发明所述的应用，优选地：

[0015] R1选自氢、氧、羟基取代的C1‑C3烷基或胺基取代的C1‑C3烷基；R2选自C1‑C3烃基或羟基取代的C1‑C3烃基；R4为氧。

[0016] 根据本发明所述的应用，优选地，R1选自氢、氧、羟甲基或氨甲基；R2选自C2‑C3烃基或羟甲基。

[0017] 根据本发明所述的应用，优选地，R3具有如式(I)所示的结构：

[0018]

[0019] 其中， 表示单键或双键；R5选自氢、C2‑C6链烯基、羟基取代的C1‑C4烷基或C1‑C6烷氧甲酰基；R6选自氢、羟基或C1‑C8烷氧基；R7选自羟基、C2‑C6酰氧基或C1‑C8烷氧基。

[0020] 根据本发明所述的应用，优选地：

[0021] R5选自氢、乙烯基、羟基取代的C2‑C4烷基或C1‑C3烷氧甲酰基；R6选自氢、羟基或C1‑C6烷氧基；R7选自羟基、乙酰氧基或C1‑C6烷氧基。

[0022] 根据本发明所述的应用，优选地：

[0023] R5选自氢、乙基、甲氧甲酰基或1,2‑二羟基乙基；

[0024] R6选自氢、羟基、甲氧基或葡萄糖基；

[0025] R7选自羟基、甲氧基、乙氧基或乙酰氧基。

[0026] 根据本发明所述的应用，优选地：

[0027] R1、R2和相邻的两个碳原子之间形成五元氮杂环；

[0028] R2、R3和相邻的两个碳原子之间形成六元氧杂环。

[0029] 本发明提供一种单萜吲哚类生物碱衍生物在制备预防或治疗脑缺血再灌注损伤药物中的应用，所述衍生物的结构如下式之一所示：

[0030]

[0031]

[0032]

[0033] 本发明提供一种单萜吲哚类生物碱衍生物在制备预防或治疗脑缺血再灌注损伤药物中的应用，所述衍生物的结构如下式所示：

[0034]

[0035] 本发明提供一种单萜吲哚类生物碱衍生物在制备预防或治疗脑缺血再灌注损伤药物中的应用，所述衍生物的结构如下式所示：

[0036]

[0037] 本发明的衍生物对脑缺血再灌注损伤的原代皮层神经元具有较好的保护作用，可用于制备抗脑缺血再灌注损伤的药物。

[0038] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。

[0039] 本发明提供单萜吲哚类生物碱衍生物在制备预防或治疗脑缺血再灌注损伤药物中的应用。本发明中，“预防”是指在可能的导致脑缺血再灌注损伤的因素存在的情况下，使用后防止或降低脑缺血再灌注损伤的发生。“治疗”是指减轻脑缺血再灌注损伤的程度，或者治愈脑缺血再灌注损伤使之正常，或者减缓脑缺血再灌注损伤发生的进程。

[0040] 本发明的单萜吲哚类生物碱衍生物的骨架为四环单萜吲哚。本发明的衍生物具有如式(A)、(B)或(C)所示的化学结构：

[0041]

[0042]

[0043] 在本发明中， 表示单键或双键。即R1和相邻的碳原子之间以单键或双键形式相连。R2和相邻的碳原子之间以单键或双键形式相连。

[0044] 在式(A)和(B)中，R1选自氢、氧、羟基、羟基取代的C1‑C6烷基或胺基取代的C1‑C6烷基。优选地，R1选自氢、氧、羟基取代的C1‑C3烷基或胺基取代的C1‑C3烷基。更优选地，R1选自氢、氧、羟甲基或氨甲基。C1‑C6烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、正己基。根据本发明的一个实施方式，R1选自氢、氧或羟甲基。

[0045] 式(A)和(B)和(C)中，R2选自C1‑C6烃基、羟基取代的C1‑C6烃基。优选地，R2选自C1‑C3烃基、羟基取代的C1‑C3烃基。C1‑C6烃基的实例包括C1‑C6烷基、C2‑C8链烯基。C1‑C6烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、正己基。C2‑C8链烯基的实例包括但不限于丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基。C1‑C8烃基可以为C1‑C8烷基，C1‑C8烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基。根据本发明的一个实施方式，R2选自乙基或乙烯基。

[0046] 在某些实施方案中，R1、R2和相邻的两个碳原子之间形成氮杂环；优选为形成五元氮杂环。

[0047] 式(C)中，R4为氧或亚氨基；优选地，R4为氧。

[0048] 式(A)和(B)和(C)中，R3选自含氧基团。从改善脑缺血再灌注损伤作用的角度考虑，这样的结构是合适的。目前为止，没有关于四环单萜吲哚骨架带有上述基团是可以具有预防或治疗脑缺血再灌注损伤的作用的报道。

[0049] 在某些实施方案中，R3具有如式(I)所示的结构：

[0050]

[0051] 式(I)中，R5选自氢、C2‑C6链烯基、羟基取代的C1‑C4烷基或C1‑C6烷氧甲酰基。优选地，R5选自氢、乙烯基、羟基取代的C2‑C4烷基或C1‑C3烷氧甲酰基。根据本发明的一个实施方式，R5选自氢、乙基、甲氧甲酰基或1,2‑二羟基乙基。

[0052] R6选自氢、羟基或C1‑C8烷氧基。优选地，R6选自氢、羟基或C1‑C6烷氧基。C1‑C8烷氧基的实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、正己氧基、正庚氧基、正辛氧基。根据本发明的一个实施方式，R6选自氢、羟基、甲氧基或葡萄糖基。

[0053] R7选自羟基、C2‑C6酰氧基或C1‑C8烷氧基。优选地，R7选自羟基、乙酰氧基或C1‑C6烷氧基。C2‑C6酰氧基的实例包括但不限于乙酰氧基、丙酰氧基、丁酰氧基、异丁酰氧基、正戊酰氧基、正己酰氧基、正庚酰氧基、正辛酰氧基。C1‑C8烷氧基的实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、正己氧基、正庚氧基、正辛氧基。根据本发明的一个实施方式，R7选自羟基、甲氧基、乙氧基或乙酰氧基。

[0054] 在某些具体的实施方案中，R6和R7形成环状结构。R6和R7形成的环状结构如下式(II)所示：

[0055]

[0056] X选自C1‑C6烷基。C1‑C6烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、正己基。根据本发明的一个实施方式，X选自甲基或乙基。

[0057] 根据本发明的一个具体实施方式，所述衍生物的结构如下式之一所示：

[0058]

[0059]

[0060] 在另一些实施方案中，R2、R3和相邻的两个碳原子之间形成氧杂环。氧杂环的至少一个氢原子可以被葡萄糖基取代。

[0061] 根据本发明的一个具体实施方式，所述衍生物的结构如下式之一所示：

[0062]

[0063]

[0064] 在本发明中，式(A)所示的衍生物可以选自化合物1‑化合物9，以及化合物12‑化合物28。式(B)所示的衍生物可以为化合物11。式(C)所示的衍生物可以为化合物10。从改善脑缺血再灌注损伤作用的角度考虑，这样的结构是合适的。

[0065] 本发明的单萜吲哚类生物碱衍生物通过如下步骤进行制备：

[0066] (1)将植物钩藤和无柄果钩藤药材分别用乙醇水溶液提取，分别得到总浸膏；

[0067] (2)将得到的总浸膏分别进行处理，处理步骤包括：将总浸膏用水分散，然后用石油醚萃取，得到水层；调节水层pH至2以下得到酸水层，然后用乙酸乙酯萃取；再将酸水层调节pH至10以上，然后用二氯甲烷萃取，得到二氯甲烷部位；

[0068] (3)将二氯甲烷部位采用硅胶柱色谱技术进行初步分离，根据流动相中二氯甲烷与甲醇的比例得到多个流份；

[0069] (4)将这些流份分别经Sephadex LH‑20柱色谱纯化分离，然后通过半制备型高效液相色谱纯化分离，得到所述化合物。

[0070] 本发明的化合物1‑化合物11(共11个化合物)通过提取分离植物钩藤药材获得。本发明的化合物12‑化合物28(共17个化合物)通过提取分离无柄果钩藤药材获得。下面分别进行详细说明。

[0071] 化合物1‑化合物11的制备

[0072] 植物钩藤(Uncaria rhynchophylla(Miq.)Miq.ex Havil.)药材为茜草科(Rubiaceae)钩藤属(Uncaria)。在本发明中，采购于中华人民共和国湖南省。

[0073] 步骤(1)中，乙醇水溶液的用量为无柄果钩藤药材体积的3～10倍，优选为5～8倍。乙醇水溶液的浓度为80～95vol％，优选为90～95vol％。提取3～5次，每次提取1～5h，优选为2～3h。合并提取液，过滤后进行减压浓缩，回收溶剂至无醇味，得到植物钩藤的总浸膏。

[0074] 在本发明中，提取时可以采用超声提取，提高提取效率。

[0075] 步骤(2)中，将植物钩藤的总浸膏用水分散。水的用量为总浸膏体积的3～10倍，优选为5～8倍。然后石油醚萃取，得石油醚萃取部位和水层。调节水层pH至2以下得到酸水层。该pH可以采用5～15vol％，优选为6～10vol％的HCl水溶液调节。然后用乙酸乙酯萃取除去非生物碱。再将酸水层调节pH至10以上。该pH可以采用氨水调节。然后用二氯甲烷萃取，得二氯甲烷部位和碱水层。二氯甲烷部位即为总生物碱部位。

[0076] 步骤(3)中，将二氯甲烷部位采用硅胶柱色谱技术进行初步分离，根据流动相(即洗脱液)中二氯甲烷与甲醇的比例得到多个流份。调节流动相中二氯甲烷与甲醇的体积比例，详情如下。经薄层色谱(TLC)分析，合并后共得到A、B、C、D六个流份。

[0077] 二氯甲烷与甲醇的体积比例：100:0→99:0.5→99:1→80:1→70:1→60:1→50:1→40:1→97:3→95:5→93:7→1:1→0:100。

[0078] 步骤(4)中，将这些流份分别经Sephadex LH‑20柱色谱纯化分离，然后通过半制备型高效液相色谱纯化分离，得到所述化合物。

[0079] A流份中分离得到4个化合物，分别为化合物1(毛钩藤碱)，化合物2(去氢毛钩藤碱)，化合物3(Geissoschizine methyl ether)和化合物4(Akuammigine)。C流份中分离得到4个化合物，分别为化合物5(Rhynchophyllionium D)，化合物6(Sitsirikine)，化合物7(16R,E‑isositsirikine)，化合物8(Uncanidine A)。D流份中分离得到3个化合物，分别为化合物9(异长春花苷内酰胺)，化合物10(卡丹宾碱)和化合物11(3α‑二氢卡丹宾碱)。

[0080] 化合物12‑化合物28的制备

[0081] 步骤(1)中，无柄果钩藤(Uncaria sessilifructus Roxb.)药材为茜草科(Rubiaceae)钩藤属(Uncaria)植物无柄果钩藤(Uncaria sessilifructus Roxb.)的干燥带钩茎枝，采购于中华人民共和国广西省。将无柄果钩藤药材粉碎，用乙醇水溶液提取，得到总浸膏。乙醇水溶液的用量为无柄果钩藤药材体积的3～10倍，优选为5～8倍。乙醇水溶液的浓度为80～95vol％，优选为90～95vol％。提取3～5次，每次提取1～5h，优选为2～3h。
合并提取液，过滤后进行减压浓缩，回收溶剂至无醇味，得到无柄果钩藤的总浸膏。

[0082] 在本发明中，提取时可以采用超声提取，提高提取效率。

[0083] 步骤(2)中，将总浸膏用水分散。水的用量为总浸膏体积的3～10倍，优选为5～8倍。然后石油醚萃取，得石油醚萃取部位和水层。调节水层pH至2以下得到酸水层。该pH可以采用5～15vol％，优选为6～10vol％的HCl水溶液调节。然后用乙酸乙酯萃取除去非生物碱。再将酸水层调节pH至10以上。该pH可以采用氨水调节。然后用二氯甲烷萃取，得二氯甲烷部位和碱水层。二氯甲烷部位即为总生物碱部位。

[0084] 步骤(3)中，将二氯甲烷部位采用硅胶柱色谱技术进行初步分离，根据流动相(即洗脱液)中二氯甲烷与甲醇的比例得到多个流份。调节流动相中二氯甲烷与甲醇的体积比例，详情如下。经薄层色谱(TLC)分析，合并后共得到A’、B’、C’、D’、E’和F’六个流份。

[0085] 二氯甲烷与甲醇的体积比例：100:0→99:0.5→99:1→80:1→70:1→60:1→50:1→40:1→97:3→95:5→93:7→1:1→0:100。

[0086] 步骤(4)中，将这些流份分别经Sephadex LH‑20柱色谱纯化分离，然后通过半制备型高效液相色谱纯化分离，得到所述化合物。

[0087] A’流份经Sephadex LH‑20柱色谱纯化，二氯甲烷‑甲醇(1:1)系统洗脱，流速调整为7s/d，得到两个流份A’1和A’2。A’2流份改良碘化铋钾显色显示仅有一个生物碱斑点，但荧光下显示有非生物碱斑点，进而通过Sephadex LH‑20柱色谱和半制备型高效液相色谱除去非生物碱，最终纯化得到化合物12(Tetrahydroalstonine)。

[0088] B’流份经Sephadex LH‑20柱色谱纯化，体积比为1:1的二氯甲烷‑甲醇系统洗脱，流速调整为7s/d，合并得两个流份B’1和B’2。B’1流份采用半制备高效液相色谱(体积比为65:35的甲醇‑水系统)纯化得到化合物13(Sitsirikine acetate)。B’2流份采用半制备型高效液相色谱(体积比为50:50的乙腈‑水系统)经纯化得到化合物14(Uncanidine G)和化合物15(Uncanidine I)，其余色谱峰采用半制备型高效液相色谱(体积比为60:40的甲醇‑水系统)二次纯化得到化合物16(Uncanidine K)。

[0089] C’流份经Sephadex LH‑20柱色谱纯化，体积比为1:1的二氯甲烷‑甲醇系统洗脱，流速调整为7s/d，得到流份C’1和C’2。C’1流份经半制备型高效液相色谱(体积比为65:35的甲醇‑水系统)纯化得到化合物17(17‑O‑ethylhirsutine)。C’2流份经半制备型高效液相色谱(体积比为65:35的甲醇‑水系统)纯化得到化合物18(Uncanidine H)。

[0090] D’流份经Sephadex LH‑20柱色谱纯化，体积比为1:1的二氯甲烷‑甲醇系统洗脱，流速调整为7s/d，除去非生物碱。经半制备型高效液相色谱(体积比为65:35的甲醇‑水系统)进行纯化得到化合物19(Uncanidine J)，其余色谱峰采用半制备型高效液相色谱(体积比为50:50的甲醇‑水系统)二次纯化得到化合物20(Uncanidine  C)和化合物21(Uncanidine D)。

[0091] E’流份经Sephadex LH‑20柱色谱纯化，体积比1:1的二氯甲烷‑甲醇系统洗脱，流速调整为7s/d，得到两个流份E’1和E’2。E’1流份利用半制备型高效液相色谱(体积比为60:40的甲醇‑水系统)进行制备得到化合物22(4R‑Corynantheidine N‑oxide)，化合物23(Geissoschizine Methyl Ether N‑oxide)和化合物24(Hirsuteine N‑oxide)。E’2流份经半制备型高效液相色谱(体积比为55:45的甲醇‑水系统)纯化得到化合物25
(Corynantheidine)。

[0092] F’流份经Sephadex LH‑20柱色谱纯化，体积比为1:1的二氯甲烷‑甲醇系统洗脱，流速调整为7s/d，得到四个流份F’1、F’2、F’3和F’4。F’1流份利用半制备型高效液相色谱(体积比为55:45的甲醇‑水系统)进行纯化得到化合物26(3β‑异二氢卡丹宾碱)和化合物27(喜果苷)。F’2流份利用半制备型高效液相色谱(体积比为60:40的甲醇‑水系统)进行纯化得到化合物28(Uncanidine F)。

[0093] 下面说明制备例所使用的仪器：

[0094] Agilent 1260型半制备高效液相色谱仪(G1361A四元泵系统和G1365D二极管阵列检测器)；半制备型高效液相色谱柱用Waters XBridge C18(5μm,10×250mm)；Bruker Ascend 400MHz,700MHz核磁共振仪(德国Bruker公司)；Waters Xevo‑G2‑SQ‑TOF MS质谱系统(美国Waters公司)。

[0095] 以下制备例中，除非特别声明，倍量表示体积比例。

[0096] 制备例1

[0097] 将植物钩藤药材晾干后粉碎，用5倍量90％乙醇超声提取3次，每次2小时，合并提取液，过滤后进行减压浓缩，回收溶剂至无醇味，得到钩藤的90％乙醇提取物总浸膏。

[0098] 将总浸膏用5倍量的水分散后，用石油醚萃取，得石油醚萃取部位和水层。于水层中加入适量酸水(10％HCl)调节pH为2以下，用乙酸乙酯萃取除去非生物碱。再将酸水层用氨水调节pH为10以上，加入二氯甲烷进行萃取，得二氯甲烷部位和碱水层，二氯甲烷部位即为总生物碱部位。

[0099] 总生物碱部位经硅胶柱层析，采用二氯甲烷‑甲醇系统梯度洗脱(二者的体积比为100:0→99:0.5→99:1→80:1→70:1→60:1→50:1→40:1→97:3→95:5→93:7→1:1→0:
100)。

[0100] 根据薄层色谱TLC结果合并分析，钩藤总生物碱部位共得到A、B、C、D四个流份，经Sephadex LH‑20柱色谱和半制备型高效液相色谱进行分离纯化。A流份中分离得到4个化合物，分别为化合物1(毛钩藤碱)，化合物2(去氢毛钩藤碱)，化合物3(Geissoschizine methyl ether)和化合物4(Akuammigine)。C流份中分离得到4个化合物，分别为化合物5(Rhynchophyllionium D)，化合物6(Sitsirikine)，化合物7(16R,E‑isositsirikine)，化合物8(Uncanidine A)。D流份中分离得到3个化合物，分别为化合物9(异长春花苷内酰胺)，化合物10(卡丹宾碱)和化合物11(3α‑二氢卡丹宾碱)。

[0101] 制备例2

[0102] 将无柄果钩藤药材粉碎，用5倍量90％乙醇超声提取3次，每次2h，合并提取液，过滤后进行减压浓缩，回收溶剂至无醇味，得到无柄果钩藤的90％乙醇提取物总浸膏。

[0103] 将总浸膏用5倍量的水分散后，用石油醚萃取，得石油醚萃取部位和水层。在水层中加入适量酸水(10vol％的HCl水溶液)调节pH为2，用乙酸乙酯萃取除去非生物碱。再将酸水层用氨水调节pH为10，加入二氯甲烷进行萃取，得二氯甲烷部位和碱水层，二氯甲烷部位即为总生物碱部位(18g)。

[0104] 将得到的总生物碱部位采用硅胶柱色谱技术进行初步分离(洗脱液为二氯甲烷‑甲醇)。二氯甲烷和甲醇的体积比为：

[0105] 100:0→99:0.5→99:1→80:1→70:1→60:1→50:1→40:1→97:3→95:5→93:7→1:1→0:100。

[0106] 经TLC分析，合并后共得到A’、B’、C’、D’、E’和F’六个流份。A’流份经Sephadex LH‑20柱色谱纯化，二氯甲烷‑甲醇(1:1)系统洗脱，流速调整为7s/d，得到两个流份A’1和A’2。
A’2流份改良碘化铋钾显色显示仅有一个生物碱斑点，但荧光下显示有非生物碱斑点，进而通过Sephadex LH‑20柱色谱和半制备型高效液相色谱除去非生物碱，最终纯化得到化合物
12(Tetrahydroalstonine)。

[0107] B’流份经Sephadex LH‑20柱色谱纯化，体积比为1:1的二氯甲烷‑甲醇系统洗脱，流速调整为7s/d，合并得两个流份B’1和B’2。B’1流份采用半制备高效液相色谱(体积比为65:35的甲醇‑水系统)纯化得到化合物13(Sitsirikine acetate)。B’2流份采用半制备型高效液相色谱(体积比为50:50的乙腈‑水系统)经纯化得到化合物14(Uncanidine G)和化合物15(Uncanidine I)，其余色谱峰采用半制备型高效液相色谱(体积比为60:40的甲醇‑水系统)二次纯化得到化合物16(Uncanidine K)。

[0108] C’流份经Sephadex LH‑20柱色谱纯化，体积比为1:1的二氯甲烷‑甲醇系统洗脱，流速调整为7s/d，得到流份C’1和C’2。C’1流份经半制备型高效液相色谱(体积比为65:35的甲醇‑水系统)纯化得到化合物17(17‑O‑ethylhirsutine)。C’2流份经半制备型高效液相色谱(体积比为65:35的甲醇‑水系统)纯化得到化合物18(Uncanidine H)。

[0109] D’流份经Sephadex LH‑20柱色谱纯化，体积比为1:1的二氯甲烷‑甲醇系统洗脱，流速调整为7s/d，除去非生物碱。经半制备型高效液相色谱(体积比为65:35的甲醇‑水系统)进行纯化得到化合物19(Uncanidine J)，其余色谱峰采用半制备型高效液相色谱(体积比为50:50的甲醇‑水系统)二次纯化得到化合物20(Uncanidine  C)和化合物21(Uncanidine D)。

[0110] E’流份经Sephadex LH‑20柱色谱纯化，体积比1:1的二氯甲烷‑甲醇系统洗脱，流速调整为7s/d，得到两个流份E’1和E’2。E’1流份利用半制备型高效液相色谱(体积比为60:40的甲醇‑水系统)进行制备得到化合物22(4R‑Corynantheidine N‑oxide)，化合物23(Geissoschizine Methyl Ether N‑oxide)和化合物24(Hirsuteine N‑oxide)。E’2流份经半制备型高效液相色谱(体积比为55:45的甲醇‑水系统)纯化得到化合物25
(Corynantheidine)。

[0111] F’流份经Sephadex LH‑20柱色谱纯化，体积比为1:1的二氯甲烷‑甲醇系统洗脱，流速调整为7s/d，得到四个流份F’1、F’2、F’3和F’4。F’1流份利用半制备型高效液相色谱(体积比为55:45的甲醇‑水系统)进行纯化得到化合物26(3β‑异二氢卡丹宾碱)和化合物27(喜果苷)。F’2流份利用半制备型高效液相色谱(体积比为60:40的甲醇‑水系统)进行纯化得到化合物28(Uncanidine F)。

[0112] 对于上述化合物1～28进行鉴定，结果如下：

[0113]

[0114] 化合物1:ESI‑MS(m/z:369[M+H]+)。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ:4.53(1H,brs,H‑3),3.35(2H,m,H‑5),2.64(1H,m,H‑6α),3.03(1H,m,H‑6β),7.50(1H,d,J＝7.6Hz,H‑9),7.11(1H,dd,J＝7.6,7.6Hz,H‑10),7.17(1H,dd,J＝7.6,7.6Hz,H‑11),7.39(1H,d,J＝7.6Hz,H‑
12),2.03(1H,m,H‑14α),2.42(1H,t,J＝10.8Hz,H‑14β),2.20(1H,m,H‑15),7.33(1H,s,H‑
17),0.76(3H,m,H‑18),0.76(1H,m,H‑19a),1.31(1H,m,H‑19b),2.50(1H,m,H‑20),2.24
13
(1H,m,H‑21α),2.85(1H,d,J＝10.5Hz,H‑21β),3.69(3H,s,H‑23),3.77(3H,s,H‑24)。C NMR(CDCl3,100MHz)δ:132.8(C‑2),54.4(C‑3),51.4(C‑5),17.0(C‑6),107.8(C‑7),127.9(C‑8),118.1(C‑9),119.6(C‑10),121.6(C‑11),111.3(C‑12),136.1(C‑13),31.7(C‑14),
34.9(C‑15),111.6(C‑16),160.0(C‑17),11.4(C‑18),24.4(C‑19),38.8(C‑20),50.7(C‑
21),169.1(C‑22),51.4(C‑23),61.7(C‑24)。

[0115]

[0116] 化合物2:ESI‑MS(m/z:367[M+H]+)。1H NMR(CDCl3,700MHz)δ:4.48(1H,brs,H‑3),3.31(2H,m,H‑5),2.57(1H,m,H‑6α),3.01(1H,m,H‑6β),7.48(1H,d,J＝7.8Hz,H‑9),7.10(1H,dd,J＝7.8,7.8Hz,H‑10),7.15(1H,dd,J＝7.8,7.8Hz,H‑11),7.36(1H,d,J＝7.8Hz,H‑
12),2.04(1H,m,H‑14α),2.38(1H,m,H‑14β),2.49(1H,td,J＝13.2,5.1Hz,H‑15),7.28(1H,s,H‑17),4.85(1H,dd,J＝10.3,2.1Hz,H‑18a),4.92(1H,ddd,J＝17.2,2.1,0.8Hz,H‑18b),
5.34(1H,1H,ddd,J＝17.2,10.2,8.5Hz,H‑19),2.99(1H,m,H‑20),2.65(2H,m,H‑21),3.68
13
(3H,s,H‑23),3.76(3H,s,H‑24)。C NMR(CDCl3,175MHz)δ:132.7(C‑2),54.0(C‑3),51.1(C‑5),16.9(C‑6),107.8(C‑7),127.8(C‑8),118.0(C‑9),121.4(C‑10),119.3(C‑11),
111.1(C‑12),135.9(C‑13),31.1(C‑14),34.0(C‑15),111.5(C‑16),159.7(C‑17),115.4(C‑18),139.3(C‑19),42.9(C‑20),51.1(C‑21),168.7(C‑22),51.3(C‑23),61.5(C‑24)。

[0117]

[0118] 化合物3:ESI‑MS(m/z:367[M+H]+)。1H NMR(CD3OD,400MHz)δ:3.48(1H,brs,H‑3),2.75(1H,m,H‑5α),3.09(1H,m,H‑5β),2.79(1H,m,H‑6α),2.98(1H,ddd,J＝14.8,8.2,
5.4Hz,H‑6β),7.45(1H,d,J＝7.8Hz,H‑9),7.07(1H,dd,J＝7.8,7.8Hz,H‑10),7.12(1H,dd,J＝7.8,7.8Hz,H‑11),7.28(1H,d,J＝7.8Hz,H‑12),1.93(1H,ddd,J＝7.4,5.6,3.2Hz,H‑14α),2.34(1H,dd,J＝12.3,12.3Hz,H‑14β),3.63(1H,d,J＝10.7Hz,H‑15),7.35(1H,s,H‑
17),1.54(3H,d,J＝7.1Hz,H‑18),5.45(1H,q,J＝7.1Hz,H‑19),3.26(1H,d,J＝12.2Hz,H‑
13
21α),3.52(1H,d,J＝12.2Hz,H‑21β),3.71(3H,s,H‑23),3.83(3H,s,H‑24)。C NMR(CD3OD,
100MHz)δ:134.2(C‑2),58.3(C‑3),51.6(C‑5),21.3(C‑6),108.3(C‑7),127.3(C‑8),118.3(C‑9),119.5(C‑10),121.5(C‑11),110.9(C‑12),136.3(C‑13),33.9(C‑14),36.1(C‑15),
112.4(C‑16),159.8(C‑17),13.2(C‑18),121.5(C‑19),133.5(C‑20),64.0(C‑21),168.7(C‑22),51.0(C‑23),61.9(C‑24)。

[0119]

[0120] 化合物4:ESI‑MS(m/z:353[M+H]+)。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ:4.43(1H,brs,H‑3),3.12(1H,m,H‑5α),3.01(1H,m,H‑5β),2.60(1H,m,H‑6α),3.00(1H,m,H‑6β),7.46(1H,d,J＝
7.8Hz,H‑9),7.08(1H,dd,J＝7.8,7.8Hz,H‑10),7.14(1H,dd,J＝7.8,7.8Hz,H‑11),7.34(1H,d,J＝7.8Hz,H‑12),1.85(1H,m,H‑14α),2.12(1H,m,H‑14β),2.59(1H,overlapped,H‑
15),7.55(1H,s,H‑17),1.34(3H,d,J＝6.4Hz,H‑18),3.12(1H,m,H‑19),2.60(1H,
13
overlapped,H‑20),2.70(1H,m,H‑21α),3.01(1H,m,H‑21β),3.74(3H,s,H‑23)。C NMR(CDCl3,100MHz)δ:133.1(C‑2),54.6(C‑3),52.3(C‑5),19.4(C‑6),107.8(C‑7),127.4(C‑
8),117.9(C‑9),119.3(C‑10),121.3(C‑11),111.0(C‑12),135.9(C‑13),30.8(C‑14),25.8(C‑15),107.8(C‑16),155.2(C‑17),18.5(C‑18),73.1(C‑19),37.8(C‑20),50.7(C‑21),
167.8(C‑22),51.1(C‑23)。

[0121]

[0122] 化合物5:ESI‑MS(m/z:353[M+H]+)。1H NMR(CD3OD,400MHz)δ:4.43(1H,m,H‑3),3.47(2H,m,H‑5),2.97(1H,m,H‑6α),3.02(1H,m,H‑6β),7.44(1H,d,J＝7.8Hz,H‑9),7.03(1H,dd,J＝7.8,7.8Hz,H‑10),7.12(1H,dd,J＝7.8,7.8Hz,H‑11),7.32(1H,d,J＝7.8Hz,H‑
12),2.41(2H,m,H‑14),4.07(1H,t,J＝7.7Hz,H‑15),7.27(1H,s,H‑17),1.64(3H,d,J＝
6.8Hz,H‑18),5.64(1H,q,J＝6.8Hz,H‑19),3.85(1H,d,J＝12.7Hz,H‑21α),4.38(1H,d,J＝
13
12.7Hz,H‑21β),3.75(3H,s,H‑23)。C NMR(CD3OD,100MHz)δ:130.7(C‑2),57.6(C‑3),50.6(C‑5),20.3(C‑6),107.3(C‑7),127.2(C‑8),119.1(C‑9),120.5(C‑10),123.4(C‑11),
112.3(C‑12),138.5(C‑13),31.7(C‑14),34.3(C‑15),116.0(C‑16),159.1(C‑17),13.6(C‑
18),128.8(C‑19),132.3(C‑20),60.8(C‑21),176.5(C‑22),61.6(C‑23)。

[0123]

[0124] 化合物6:ESI‑MS(m/z:353[M+H]+)。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ:4.45(1H,brs,H‑3),3.27(1H,overlapped,H‑5α),2.68(1H,overlapped,H‑5β),3.02(1H,m,H‑6α),2.63(1H,m,H‑6β),7.49(1H,d,J＝7.9Hz,H‑9),7.13(1H,ddd,J＝7.9,7.9,1.0Hz,H‑10),7.17(1H,ddd,J＝7.9,7.9,1.0Hz,H‑11),7.40(1H,d,J＝7.9Hz,H‑12),1.84(1H,m,H‑14α),2.40(1H,m,H‑
14β),1.54(1H,m,H‑15),2.83(1H,m,H‑16),3.88(1H,dd,J＝11.2,4.4Hz,H‑17a),3.78(1H,dd,J＝11.2,5.2Hz,H‑17b),5.16(1H,d dd,J＝17.2,1.8Hz,H‑18a),5.08(1H,dd,J＝10.0,
1.8Hz,H‑18b),5.40(1H,m,H‑19),2.53(1H,m,H‑20),3.22(1H,overlapped,H‑21α),1.59
13
(1H,overlapped,H‑21β),3.74(3H,s,H‑23)。C NMR(CDCl3,100MHz)δ:136.1(C‑2),54.2(C‑3),51.2(C‑5),17.2(C‑6),108.0(C‑7),127.8(C‑8),118.2(C‑9),119.7(C‑10),121.8(C‑11),111.4(C‑12),138.6(C‑13),29.6(C‑14),36.6(C‑15),47.1(C‑16),63.3(C‑17),
118.2(C‑18),139.0(C‑19),44.7(C‑20),51.4(C‑21),174.8(C‑22),51.8(C‑23)。

[0125]

[0126] 化合物7:ESI‑MS(m/z:355[M+H]+)。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ:4.30(1H,brs,H‑3),3.47(1H,m,H‑5α),3.26(1H,dd,J＝13.2,5.0Hz,H‑5β),3.15(1H,overlapped,H‑6α),2.99(1H,m,H‑6β),7.47(1H,d,J＝7.6Hz,H‑9),7.11(1H,ddd,J＝7.6,7.6,1.0Hz,H‑10),7.17(1H,ddd,J＝7.6,7.6,1.0Hz,H‑11),7.38(1H,d,J＝7.6Hz,H‑12),2.24(1H,m,H‑14α),2.17(1H,m,H‑14β),3.10(1H,m,H‑15),2.50(1H,m,H‑16),3.56(1H,overlapped,H‑17a),3.50(1H,overlapped,H‑17b),1.67(3H,d,J＝6.8Hz,H‑18),5.62(1H,q,J＝6.8Hz,H‑19),2.92
13
(1H,brd,J＝12.2Hz,H‑21α),2.63(1H,brd,J＝12.2Hz,H‑21β),3.81(3H,s,H‑23)。C NMR(CDCl3,100MHz)δ:133.6(C‑2),52.9(C‑3),51.5(C‑5),17.8(C‑6),107.9(C‑7),127.8(C‑
8),118.1(C‑9),119.7(C‑10),121.7(C‑11),111.5(C‑12),136.3(C‑13),30.5(C‑14),32.7(C‑15),49.8(C‑16),62.3(C‑17),13.4(C‑18),123.7(C‑19),134.0(C‑20),52.5(C‑21),
175.6(C‑22),52.4(C‑23)。

[0127]

[0128] 化合物8:ESI‑MS(m/z:366[M+H]+)。1H NMR(CD3OD,700MHz)δ:4.16(1H,m,H‑3),3.17(1H,m,H‑5α),2.89(1H,m,H‑5β),2.98(1H,m,H‑6α),2.69(1H,m,H‑6β),7.37(1H,d,J＝
7.8Hz,H‑9),6.96(1H,dd,J＝7.8,7.8Hz,H‑10),7.02(1H,dd,J＝7.8,7.8Hz,H‑11),7.27(1H,d,J＝7.8Hz,H‑12),2.16(1H,m,H‑14α),1.95(1H,m,H‑14β),3.13(1H,overlapped,H‑
15),7.52(1H,s,H‑17),3.57(1H,dd,J＝9.0,2.8Hz,H‑18α),4.36(1H,dd,J＝9.0,2.8Hz,H‑
18β),4.74(1H,d,J＝5.2Hz,H‑19),2.39(1H,m,H‑20),3.98(1H,ddd,J＝9.7,7.3,2.5Hz,H‑
13
21),3.35(3H,s,H‑23)。C NMR(CD3OD,175MHz)δ:138.1(C‑2),50.8(C‑3),52.4(C‑5),22.6(C‑6),107.4(C‑7),128.4(C‑8),118.4(C‑9),119.7(C‑10),121.7(C‑11),111.9(C‑12),
138.1(C‑13),31.1(C‑14),24.3(C‑15),101.9(C‑16),143.0(C‑17),63.4(C‑18),84.8(C‑
19),36.7(C‑20),63.8(C‑21),170.5(C‑22),51.3(C‑23)。

[0129]

[0130] 化合物9:ESI‑MS(m/z:499[M+H]+)。1H NMR(CD3OD,700MHz)δ:5.08(1H,brd,J＝4.4Hz,H‑3),3.11(1H,td,J＝12.4,4.7Hz,H‑5α),4.95(1H,dd,J＝12.8,5.6Hz,H‑5β),2.68(1H,m,H‑6α),2.93(1H,m,H‑6β),7.37(1H,d,J＝8.0Hz,H‑9),6.99(1H,ddd,J＝8.0,8.0,
0.8Hz,H‑10),7.08(1H,ddd,J＝8.0,8.0,0.8Hz,H‑11),7.32(1H,d,J＝8.0Hz,H‑12),2.04(1H,td,J＝14.0,6.0Hz,H‑14α),2.46(1H,ddd,J＝14.1,4.5,1.0Hz,H‑14β),2.80(1H,m,H‑
15),7.38(1H,brs,H‑17),5.31(1H,dd,J＝10.1,1.8Hz,H‑18a),5.37(1H,dd,J＝17.1,
1.4Hz,H‑18b),5.65(1H,dt,J＝17.1,10.1Hz,H‑19),2.68(1H,m,H‑20),5.41(1H,d,J＝
1.8Hz,H‑21),4.57(1H,d,J＝7.9Hz,H‑1'),2.96(1H,m,H‑2'),3.16～3.27(3H,m,H‑3'～H‑
13
5'),3.62(1H,dd,J＝11.8,6.0Hz,H‑6'a),3.85(1H,dd,J＝11.8,2.1Hz,H‑6'b)。C NMR(CD3OD,175MHz)δ:134.8(C‑2),55.2(C‑3),44.9(C‑5),22.2(C‑6),110.4(C‑7),128.8(C‑
8),118.7(C‑9),120.2(C‑10),122.5(C‑11),112.3(C‑12),137.8(C‑13),27.4(C‑14),25.0(C‑15),109.3(C‑16),149.2(C‑17),120.6(C‑18),134.4(C‑19),44.8(C‑20),98.1(C‑21),
167.2(C‑22),100.6(C‑1'),74.4(C‑2'),78.3(C‑3'),71.4(C‑4'),78.0(C‑5'),62.7(C‑
6')。

[0131]

[0132] 化合物10:ESI‑MS(m/z:545[M+H]+)。1H NMR(CD3OD,400MHz)δ:2.78(1H,m,H‑5α),3.15(1H,m,H‑5β),2.83(2H,m,H‑6),7.46(1H,d,J＝7.9Hz,H‑9),7.00(1H,dd,J＝7.9,
7.9Hz,H‑10),7.11(1H,dd,J＝7.9,7.9Hz,H‑11),7.32(1H,d,J＝7.9Hz,H‑12),2.06(2H,m,H‑14),3.24(1H,m,H‑15),7.56(1H,s,H‑17),3.02(1H,m,H‑18α),3.51(1H,d,J＝10.9Hz,H‑
18β),4.94(1H,d,J＝7.3Hz,H‑19),1.76(1H,m,H‑20),5.83(1H,d,J＝9.3Hz,H‑21),3.65(3H,s,H‑23),4.80(1H,d,J＝7.8Hz,H‑1'),3.34～3.47(4H,m,H‑2'～H‑5'),3.61(1H,m,H‑
13
6'a),3.87(1H,dd,J＝12.0,2.0Hz,H‑6'b)。C NMR(CD3OD,100MHz)δ:133.1(C‑2),92.9(C‑
3),53.7(C‑5),22.7(C‑6),111.2(C‑7),126.8(C‑8),119.7(C‑9),120.1(C‑10),123.3(C‑
11),112.4(C‑12),138.4(C‑13),43.0(C‑14),26.7(C‑15),111.5(C‑16),154.2(C‑17),
59.3(C‑18),74.4(C‑19),41.0(C‑20),97.5(C‑21),168.8(C‑22),51.7(C‑23),101.6(C‑
1'),74.8(C‑2'),78.0(C‑3'),71.6(C‑4'),78.4(C‑5'),62.8(C‑6')。

[0133]

[0134] 化合物11:ESI‑MS(m/z:547[M+H]+)。1H NMR(CD3OD,400MHz)δ:3.65(1H,m,H‑3),2.67(1H,m,H‑5α),3.18(1H,m,H‑5β),2.89(2H,m,H‑6),7.35(1H,d,J＝7.7Hz,H‑9),6.95(1H,dd,J＝7.7,7.7Hz,H‑10),7.02(1H,dd,J＝7.7,7.7Hz,H‑11),7.27(1H,d,J＝7.7Hz,H‑
12),2.32(1H,d,J＝14.2Hz,H‑14α),1.71(1H,m,H‑14β),3.04(1H,m,H‑15),7.52(1H,s,H‑
17),3.39(1H,m,H‑18α),2.99(1H,m,H‑18β),4.27(1H,m,H‑19),2.00(1H,m,H‑20),5.54(1H,d,J＝9.1Hz,H‑21),3.78(3H,s,H‑23),4.79(1H,d,J＝7.7Hz,H‑1'),3.25～3.34(4H,
13
m,H‑2'～H‑5'),3.81(1H,m,H‑6'a),3.72(1H,m,H‑6'b)。C NMR(CD3OD,100MHz)δ:135.9(C‑2),64.1(C‑3),56.0(C‑5),23.4(C‑6),108.7(C‑7),128.2(C‑8),118.6(C‑9),119.8(C‑
10),122.1(C‑11),112.1(C‑12),138.2(C‑13),37.4(C‑14),34.0(C‑15),111.2(C‑16),
153.6(C‑17),59.3(C‑18),66.5(C‑19),44.5(C‑20),97.5(C‑21),169.5(C‑22),52.0(C‑
23),100.9(C‑1'),74.6(C‑2'),78.3(C‑3'),71.0(C‑4'),77.9(C‑5'),62.3(C‑6')。

[0135]

[0136] 化合物12:ESI‑MS(m/z:353[M+H]+)。1H NMR(CDCl3,700MHz)δ:3.36(1H,brs,H‑3),2.96(1H,overlapped,H‑5α),3.12(1H,m,H‑5β),2.72(1H,overlapped,H‑6α),2.57(1H,m,H‑6β),7.45(1H,d,J＝7.4Hz,H‑9),7.08(1H,dd,J＝7.4,7.4Hz,H‑10),7.13(1H,dd,J＝
7.4,7.4Hz,H‑11),7.29(1H,d,J＝7.4Hz,H‑12),1.62～1.75(2H,m,H‑14),2.49(1H,m,H‑
15),7.56(1H,s,H‑17),1.41(3H,brs,H‑18),4.50(1H,m,H‑19),1.55(1H,m,H‑20),2.77
13
(1H,overlapped,H‑21α),2.96(1H,overlapped,H‑21β),3.75(3H,s,H‑23)。C NMR(CDCl3,
175MHz)δ:134.7(C‑2),60.0(C‑3),53.7(C‑5),21.9(C‑6),108.3(C‑7),127.3(C‑8),118.2(C‑9),119.6(C‑10),121.6(C‑11),111.0(C‑12),136.2(C‑13),34.3(C‑14),31.5(C‑15),
109.6(C‑16),155.9(C‑17),18.7(C‑18),72.6(C‑19),38.5(C‑20),56.4(C‑21),168.1(C‑
22),51.3(C‑23)。

[0137]

[0138] 化合物13:ESI‑MS(m/z:399[M+H]+)。1H NMR(CDCl3,700MHz)δ:4.51(1H,brs,H‑3),3.12(1H,m,H‑5α),2.91(1H,m,H‑5β),2.18(1H,m,H‑6α),3.07(1H,m,H‑6β),7.49(1H,d,J＝
7.7Hz,H‑9),7.10(1H,dd,J＝7.7,7.7Hz,H‑10),7.14(1H,dd,J＝7.7,7.7Hz,H‑11),7.29(1H,d,J＝7.7Hz,H‑12),2.13(1H,m,H‑14α),2.72(1H,m,H‑14β),3.44(1H,m,H‑15),2.66(1H,m,H‑16),4.04(1H,m,H‑17),1.60(3H,d,J＝7.0Hz,H‑18),1.25(2H,m,H‑19),2.30(1H,m,H‑20),3.02(1H,m,H‑21α),3.49(1H,m,H‑21β),2.03(3H,d,J＝18.2Hz,H‑24),3.67(3H,
13
s,H‑25)。C NMR(CDCl3,175MHz)δ:133.4(C‑2),52.9(C‑3),51.4(C‑5),17.1(C‑6),106.3(C‑7),127.9(C‑8),118.4(C‑9),119.7(C‑10),122.0(C‑11),111.3(C‑12),136.5(C‑13),
30.8(C‑14),33.3(C‑15),49.0(C‑16),62.7(C‑17),13.3(C‑18),22.8(C‑19),29.9(C‑20),
51.2(C‑21),174.4(C‑22),171.2(C‑23),19.2(C‑24),51.5(C‑25)。

[0139]

[0140] 化合物14:ESI‑MS(m/z:399[M+H]+)。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ:4.47(1H,brs,H‑3),3.27(2H,m,H‑5),2.56(1H,overlapped,H‑6α),3.01(1H,overlapped,H‑6β),7.49(1H,d,J＝7.3Hz,H‑9),7.12(1H,dd,J＝7.3,7.3Hz,H‑10),7.17(1H,dd,J＝7.3,7.3Hz,H‑11),7.37(1H,d,J＝7.3Hz,H‑12),2.04(1H,overlapped,H‑14α),2.29(1H,overlapped,H‑14β),1.44(1H,m,H‑15),2.97(1H,overlapped,H‑16),4.91(1H,d,J＝8.8Hz,H‑17),5.05(2H,m,H‑
18),5.36(1H,m,H‑19),2.27(1H,overlapped,H‑20),2.62(2H,overlapped,H‑21),3.71
13
(3H,s,H‑23),3.38(3H,s,H‑24),3.16(3H,s,H‑25)。C NMR(CDCl3,100MHz)δ:132.7(C‑2),
53.7(C‑3),50.8(C‑5),17.0(C‑6),107.8(C‑7),126.2(C‑8),118.0(C‑9),119.4(C‑10),
121.5(C‑11),111.0(C‑12),136.0(C‑13),28.2(C‑14),34.6(C‑15),47.7(C‑16),102.3(C‑
17),117.9(C‑18),137.9(C‑19),44.0(C‑20),51.0(C‑21),171.8(C‑22),51.5(C‑23),55.7(C‑24),50.0(C‑25)。

[0141]

[0142] 化合物15:ESI‑MS(m/z:401[M+H]+)。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ:4.47(1H,brs,H‑3),3.50(1H,m,H‑5α),3.31(1H,m,H‑5β),2.99(1H,m,H‑6α),2.65(1H,m,H‑6β),7.49(1H,d,J＝
7.8Hz,H‑9),7.12(1H,ddd,J＝7.8,7.8,1.2Hz,H‑10),7.17(1H,ddd,J＝7.8,7.8,1.2Hz,H‑
11),7.37(1H,d,J＝7.8Hz,H‑12),2.27(1H,m,H‑14α),2.09(1H,m,H‑14β),1.35(1H,m,H‑
15),3.04(1H,m,H‑16),4.97(1H,d,J＝8.8Hz,H‑17),0.79(3H,t,J＝6.9Hz,H‑18),1.74(1H,m,H‑19a),0.91(1H,m,H‑19b),1.48(1H,m,H‑20),2.40(1H,m,H‑21α),2.84(1H,m,H‑21
13
β),3.72(3H,s,H‑23),3.41(3H,s,H‑24),3.18(3H,s,H‑25)。C NMR(CDCl3,100MHz)δ:
133.0(C‑2),54.0(C‑3),51.0(C‑5),17.1(C‑6),107.6(C‑7),127.7(C‑8),118.1(C‑9),
119.5(C‑10),121.6(C‑11),111.0(C‑12),136.1(C‑13),28.3(C‑14),35.0(C‑15),46.9(C‑
16),102.3(C‑17),10.8(C‑18),22.8(C‑19),39.4(C‑20),50.3(C‑21),171.6(C‑22),51.7(C‑23),55.9(C‑24),49.6(C‑25)。

[0143]

[0144] 化合物16:ESI‑MS(m/z:381[M+H]+)。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ:3.60(1H,m,H‑3),2.71(1H,m,H‑5α),3.08(1H,m,H‑5β),2.76(1H,m,H‑6α),2.97(1H,m,H‑6β),7.47(1H,d,J＝
7.4Hz,H‑9),7.06(1H,dd,J＝7.4,7.4Hz,H‑10),7.13(1H,dd,J＝7.4,7.4Hz,H‑11),7.27(1H,d,J＝7.4Hz,H‑12),1.89(1H,ddd,J＝12.6,4.9,2.7Hz,H‑14α),2.36(1H,m,H‑14β),
3.74(1H,m,H‑15),7.43(1H,s,H‑17),1.56(3H,d,J＝6.9Hz,H‑18),5.43(1H,q,J＝6.9Hz,H‑19),3.20(1H,brd,J＝12.3Hz,H‑21α),3.48(1H,m,H‑21β),3.71(3H,s,H‑23),4.05(2H,
13
q,J＝7.1Hz,H‑24),1.31(3H,t,J＝7.1Hz,H‑25)。C NMR(CDCl3,100MHz)δ:134.2(C‑2),
58.6(C‑3),51.5(C‑5),21.4(C‑6),108.4(C‑7),127.4(C‑8),118.2(C‑9),119.3(C‑10),
120.8(C‑11),110.7(C‑12),136.0(C‑13),34.2(C‑14),36.4(C‑15),110.7(C‑16),158.4(C‑17),13.0(C‑18),121.3(C‑19),134.8(C‑20),64.3(C‑21),168.8(C‑22),51.4(C‑23),
70.5(C‑24),15.5(C‑25)。

[0145]

[0146] 化合物17:ESI‑MS(m/z:383[M+H]+)。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ:4.59(1H,brs,H‑3),3.37(2H,m,H‑5),2.68(1H,m,H‑6α),3.03(1H,m,H‑6β),7.50(1H,d,J＝7.4Hz,H‑9),7.12(1H,dd,J＝7.4,7.4Hz,H‑10),7.17(1H,dd,J＝7.4,7.4Hz,H‑11),7.41(1H,d,J＝7.4Hz,H‑
12),2.25(1H,m,H‑14α),2.06(1H,overlapped,H‑14β),2.31(1H,m,H‑15),7.39(1H,s,H‑
17),0.76(3H,m,H‑18),1.32(2H,m,H‑19),2.43(1H,m,H‑20),2.90(1H,m,H‑21α),2.51(1H,
13
m,H‑21β),3.69(3H,s,H‑23),4.01(2H,q,J＝7.0Hz,H‑24),1.29(3H,m,H‑25)。C NMR(CDCl3,100MHz)δ:131.3(C‑2),54.9(C‑3),51.5(C‑5),16.9(C‑6),107.4(C‑7),127.6(C‑
8),118.0(C‑9),119.5(C‑10),121.6(C‑11),111.3(C‑12),136.1(C‑13),31.1(C‑14),38.5(C‑15),110.9(C‑16),158.7(C‑17),11.2(C‑18),22.0(C‑19),24.3(C‑20),50.5(C‑21),
176.0(C‑22),51.3(C‑23),70.5(C‑24),15.5(C‑25)。

[0147]

[0148] 化合物18:ESI‑MS(m/z:341[M+H]+)。1H NMR(CD3OD,400MHz)δ:4.60(1H,brs,H‑3),3.41(1H,m,H‑5α),3.47(1H,m,H‑5β),2.86(1H,m,H‑6α),3.14(1H,m,H‑6β),7.46(1H,d,J＝
7.7Hz,H‑9),7.04(1H,ddd,J＝7.7,7.7,1.0Hz,H‑10),7.12(1H,ddd,J＝7.7,7.7,1.0Hz,H‑
11),7.35(1H,d,J＝7.7Hz,H‑12),2.36(2H,m,H‑14),3.03(1H,m,H‑15),1.34(1H,m,H‑
16a),1.66(1H,m,H‑16b),4.23(1H,dd,J＝7.0,4.6Hz,H‑17),1.72(3H,d,J＝6.7Hz,H‑18),
5.71(1H,q,J＝6.7Hz,H‑19),3.86(1H,brd,J＝12.8Hz,H‑21α),3.35(1H,m,H‑21β),3.13
13
(3H,s,H‑22),3.25(3H,s,H‑23)。C NMR(CD3OD,100MHz)δ:131.6(C‑2),55.0(C‑3),51.6(C‑5),18.2(C‑6),106.7(C‑7),128.0(C‑8),118.9(C‑9),120.3(C‑10),122.9(C‑11),
112.2(C‑12),138.0(C‑13),32.5(C‑14),30.9(C‑15),36.4(C‑16),104.1(C‑17),13.2(C‑
18),126.1(C‑19),134.7(C‑20),53.1(C‑21),52.7(C‑22),53.5(C‑23)。

[0149]

[0150] 化合物19:ESI‑MS(m/z:371[M+H]+)。1H NMR(CD3OD,400MHz)δ:4.49(1H,brs,H‑3),3.27(2H,m,H‑5),3.05(1H,overlapped,H‑6α),2.63(1H,m,H‑6β),7.40(1H,d,J＝7.8Hz,H‑
9),7.00(1H,dd,J＝7.8,7.8Hz,H‑10),7.07(1H,dd,J＝7.8,7.8Hz,H‑11),7.32(1H,d,J＝
7.8Hz,H‑12),2.44(1H,m,H‑14α),1.78(1H,m,H‑14β),1.19(1H,m,H‑15),2.13(1H,overlapped,H‑16),3.06(1H,m,H‑17),1.94(1H,overlapped,H‑18α),2.16(1H,overlapped,H‑18β),3.77(1H,overlapped,H‑19),3.16(1H,overlapped,H‑21α),2.42(1H,
13
m,H‑21β),3.72(3H,s,H‑23)。C NMR(CD3OD,100MHz)δ:132.4(C‑2),55.3(C‑3),52.2(C‑
5),17.6(C‑6),107.6(C‑7),128.7(C‑8),118.6(C‑9),119.9(C‑10),122.2(C‑11),112.1(C‑12),137.8(C‑13),31.8(C‑14),34.2(C‑15),42.1(C‑16),71.4(C‑17),39.2(C‑18),
69.2(C‑19),51.9(C‑20),49.9(C‑21),174.0(C‑22),51.6(C‑23)。

[0151]

[0152] 化合物20:ESI‑MS(m/z:471[M+H]+)。1H NMR(CD3OD,400MHz)δ:4.39(1H,brs,H‑3),3.30(1H,overlapped,H‑5α),3.21(1H,overlapped,H‑5β),3.06(1H,m,H‑6α),2.70(1H,overlapped,H‑6β),7.41(1H,d,J＝7.6Hz,H‑9),7.00(1H,dd,J＝7.6,7.6Hz,H‑10),7.08(1H,dd,J＝7.6,7.6Hz,H‑11),7.34(1H,d,J＝7.6Hz,H‑12),2.39(1H,m,H‑14α),2.25(1H,m,H‑14β),3.10(1H,m,H‑15),1.50(1H,m,H‑16a),1.63(1H,m,H‑16b),4.34(1H,dd,J＝7.3,
3.0Hz,H‑17),1.69(3H,d,J＝6.9Hz,H‑18),5.61(1H,q,J＝6.9Hz,H‑19),3.74(1H,m,H‑21α),3.07(1H,overlapped,H‑21β),3.39(3H,s,H‑23),4.65(1H,d,J＝3.8Hz,H‑1'),3.37(1H,m,H‑2'),3.63(1H,m,H‑3'),3.08(1H,overlapped,H‑4'),3.53(1H,m,H‑5'),4.06(1H,
13
dd,J＝10.0,4.7Hz,H‑6'α),3.41(1H,m,H‑6'β)。C NMR(CD3OD,100MHz)δ:133.5(C‑2),
54.4(C‑3),52.0(C‑5),18.2(C‑6),106.8(C‑7),128.4(C‑8),118.7(C‑9),120.0(C‑10),
122.3(C‑11),112.2(C‑12),137.9(C‑13),33.0(C‑14),30.5(C‑15),37.9(C‑16),102.4(C‑
17),13.1(C‑18),123.8(C‑19),136.6(C‑20),52.7(C‑21),55.7(C‑22),101.9(C‑1'),74.0(C‑2'),71.8(C‑3'),82.6(C‑4'),63.9(C‑5'),69.5(C‑6')。

[0153]

[0154] 化合物21:ESI‑MS(m/z:485[M+H]+)。1H NMR(CD3OD,400MHz)δ:4.47(1H,brs,H‑3),3.38(1H,overlapped,H‑5α),3.26(1H,m,H‑5β),3.06(1H,m,H‑6α),2.75(1H,m,H‑6β),7.42(1H,d,J＝7.8Hz,H‑9),7.01(1H,dd,J＝7.8,7.8Hz,H‑10),7.09(1H,dd,J＝7.8,7.8Hz,H‑
11),7.34(1H,d,J＝7.8Hz,H‑12),2.42(1H,m,H‑14α),2.28(1H,m,H‑14β),3.12(1H,overlapped,H‑15),1.64(1H,m,H‑16a),1.50(1H,m,H‑16b),4.35(1H,dd,J＝7.3,3.2Hz,H‑
17),1.70(3H,d,J＝6.8Hz,H‑18),5.61(1H,q,J＝6.8Hz,H‑19),3.18(1H,m,H‑21α),3.81(1H,overlapped,H‑21β),3.75(1H,m,H‑22α),3.51(1H,m,H‑21β),1.25(3H,t,J＝7.1Hz,H‑
23),4.77(1H,d,J＝3.8Hz,H‑1'),3.38(1H,m,H‑2'),3.65(1H,m,H‑3'),3.08(1H,overlapped,H‑4'),3.58(1H,m,H‑5'),4.05(1H,dd,J＝10.1,4.8Hz,H‑6'α),3.40(1H,
13
overlapped,H‑6'β)。C NMR(CD3OD,100MHz)δ:132.9(C‑2),54.6(C‑3),51.9(C‑5),18.2(C‑6),106.8(C‑7),128.3(C‑8),118.8(C‑9),120.1(C‑10),122.5(C‑11),112.2(C‑12),
137.9(C‑13),32.8(C‑14),30.5(C‑15),37.9(C‑16),102.3(C‑17),13.1(C‑18),124.6(C‑
19),135.9(C‑20),52.7(C‑21),64.9(C‑22),15.3(C‑23),100.6(C‑1'),74.0(C‑2'),71.9(C‑3'),82.6(C‑4'),64.0(C‑5'),69.5(C‑6')。

[0155]

[0156] 化合物22:ESI‑MS(m/z:385[M+H]+)。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ:4.59(1H,brs,H‑3),3.73(1H,m,H‑5α),3.71(1H,m,H‑5β),3.18(1H,m,H‑6α),3.07(1H,m,H‑6β),7.41(1H,d,J＝
7.9Hz,H‑9),7.00(1H,dd,J＝7.9,7.9Hz,H‑10),7.09(1H,dd,J＝7.9,7.9Hz,H‑11),7.31(1H,d,J＝7.9Hz,H‑12),3.01(1H,m,H‑14α),2.12(1H,m,H‑14β),2.94(1H,m,H‑15),7.43(1H,s,H‑17),0.85(3H,m,H‑18),1.29(1H,m,H‑19a),1.21(1H,m,H‑19b),3.14(1H,m,H‑
13
20),3.18(1H,m,H‑21α),3.12(1H,m,H‑21β),3.62(3H,s,H‑23),3.83(3H,s,H‑24)。C NMR(CDCl3,100MHz)δ:130.7(C‑2),69.7(C‑3),63.9(C‑5),20.7(C‑6),106.5(C‑7),127.6(C‑
8),119.0(C‑9),120.5(C‑10),122.5(C‑11),112.5(C‑12),138.9(C‑13),28.0(C‑14),39.8(C‑15),111.2(C‑16),162.5(C‑17),10.9(C‑18),24.4(C‑19),34.5(C‑20),71.8(C‑21),
169.2(C‑22),51.5(C‑23),62.5(C‑24)。

[0157]

[0158] 化合物23:ESI‑MS(m/z:383[M+H]+)。1H NMR(CD3OD,400MHz)δ:4.34(1H,d,J＝11.4Hz,H‑3),3.72(1H,m,H‑5α),3.61(1H,m,H‑5β),3.29(1H,m,H‑6α),2.92(1H,m,H‑6β),
7.47(1H,d,J＝7.8Hz,H‑9),7.03(1H,dd,J＝7.8,7.8Hz,H‑10),7.10(1H,dd,J＝7.8,
7.8Hz,H‑11),7.30(1H,d,J＝7.8Hz,H‑12),2.35(1H,ddd,J＝14.9,6.7,2.4Hz,H‑14α),
2.23(1H,m,H‑14β),4.16(1H,dd,J＝10.0,6.9Hz,H‑15),7.48(1H,s,H‑17),1.66(3H,d,J＝
6.8Hz,H‑18),5.81(1H,q,J＝6.8Hz,H‑19),4.94(1H,d,J＝13.0Hz,H‑21α),3.81(1H,d,J＝
13
13.0Hz,H‑21β),3.67(3H,s,H‑23),3.89(3H,s,H‑24)。C NMR(CD3OD,100MHz)δ:130.4(C‑
2),74.2(C‑3),63.0(C‑5),18.5(C‑6),106.6(C‑7),127.3(C‑8),119.1(C‑9),120.2(C‑
10),122.9(C‑11),112.1(C‑12),138.4(C‑13),33.4(C‑14),34.2(C‑15),111.8(C‑16),
161.5(C‑17),13.7(C‑18),130.9(C‑19),131.7(C‑20),77.2(C‑21),169.2(C‑22),51.7(C‑
23),62.4(C‑24)。

[0159]

[0160] 化合物24:ESI‑MS(m/z:383[M+H]+)。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ:4.80(1H,brs,H‑3),3.31(2H,m,H‑5),3.24(2H,m,H‑6),7.49(1H,d,J＝7.9Hz,H‑9),7.23(1H,dd,J＝7.9,
7.9Hz,H‑10),7.15(1H,dd,J＝7.9,7.9Hz,H‑11),7.46(1H,d,J＝7.9Hz,H‑12),2.00(1H,overlapped,H‑14α),2.44(1H,m,H‑14β),2.18(1H,overlapped,H‑15),7.30(1H,s,H‑17),
5.02(1H,d,J＝17.0Hz,H‑18a),4.94(1H,d,J＝10.3Hz,H‑18b),5.27(1H,m,H‑19),2.96
13
(1H,m,H‑20),3.84(2H,m,H‑21),3.67(3H,s,H‑23),3.79(3H,s,H‑24)。C NMR(CDCl3,
100MHz)δ:129.7(C‑2),70.0(C‑3),67.9(C‑5),19.8(C‑6),105.9(C‑7),126.4(C‑8),118.1(C‑9),119.9(C‑10),122.6(C‑11),112.0(C‑12),137.4(C‑13),26.7(C‑14),37.2(C‑15),
109.5(C‑16),160.4(C‑17),117.6(C‑18),136.5(C‑19),22.6(C‑20),61.8(C‑21),172.5(C‑22),51.4(C‑23),62.5(C‑24)。

[0161]

[0162] 化合物25:ESI‑MS(m/z:383[M+H]+)。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ:4.80(1H,brs,H‑3),3.31(2H,m,H‑5),3.24(2H,m,H‑6),7.49(1H,d,J＝7.9Hz,H‑9),7.23(1H,dd,J＝7.9,
7.9Hz,H‑10),7.15(1H,dd,J＝7.9,7.9Hz,H‑11),7.46(1H,d,J＝7.9Hz,H‑12),2.00(1H,overlapped,H‑14α),2.44(1H,m,H‑14β),2.18(1H,overlapped,H‑15),7.30(1H,s,H‑17),
5.02(1H,d,J＝17.0Hz,H‑18a),4.94(1H,d,J＝10.3Hz,H‑18b),5.27(1H,m,H‑19),2.96
13
(1H,m,H‑20),3.84(2H,m,H‑21),3.67(3H,s,H‑23),3.79(3H,s,H‑24)。C NMR(CDCl3,
100MHz)δ:129.7(C‑2),70.0(C‑3),67.9(C‑5),19.8(C‑6),105.9(C‑7),126.4(C‑8),118.1(C‑9),119.9(C‑10),122.6(C‑11),112.0(C‑12),137.4(C‑13),26.7(C‑14),37.2(C‑15),
109.5(C‑16),160.4(C‑17),117.6(C‑18),136.5(C‑19),22.6(C‑20),61.8(C‑21),172.5(C‑22),51.4(C‑23),62.5(C‑24)。

[0163]

[0164] 化合物26:ESI‑MS(m/z:547[M+H]+)。1H NMR(CD3OD,400MHz)δ:4.54(1H,brs,H‑3),3.11(1H,overlapped,H‑5α),2.66(1H,overlapped,H‑5β),2.60(1H,overlapped,H‑6α),
3.28(1H,overlapped,H‑6β),7.42(1H,d,J＝7.6Hz,H‑9),7.00(1H,dd,J＝7.6,7.6Hz,H‑
10),7.08(1H,dd,J＝7.6,7.6Hz,H‑11),7.37(1H,d,J＝7.6Hz,H‑12),1.94(1H,m,H‑14α),
2.47(1H,overlapped,H‑14β),2.53(1H,overlapped,H‑15),7.53(1H,s,H‑17),3.96(1H,m,H‑18a),4.04(1H,m,H‑18b),3.24(1H,overlapped,H‑19),2.10(1H,m,H‑20),6.07(1H,d,J＝8.8Hz,H‑21),3.76(3H,s,H‑23),4.85(1H,overlapped,H‑1'),3.20～3.46(4H,m,H‑2'～
13
H‑5'),3.69(1H,overlapped,H‑6'a),3.91(1H,dd,J＝12.0,2.0Hz,H‑6'b)。C NMR(CD3OD,
100MHz)δ:132.8(C‑2),49.4(C‑5),17.9(C‑6),108.8(C‑7),128.5(C‑8),118.6(C‑9),
119.9(C‑10),122.1(C‑11),112.2(C‑12),137.7(C‑13),31.1(C‑14),29.1(C‑15),111.8(C‑16),154.2(C‑17),62.6(C‑18),57.3(C‑19),38.9(C‑20),96.3(C‑21),168.7(C‑22),
51.9(C‑23),99.8(C‑1'),74.9(C‑2'),78.8(C‑3'),71.9(C‑4'),77.7(C‑5'),63.2(C‑6')。

[0165]

[0166] 化合物27:ESI‑MS(m/z:499[M+H]+)。1H NMR(CD3OD,400MHz)δ:4.92(1H,m,H‑3),2.93(1H,m,H‑5α),5.07(1H,m,H‑5β),2.76(2H,overlapped,H‑6),7.42(1H,d,J＝7.8Hz,H‑
9),7.00(1H,ddd,J＝7.8,7.8,1.0Hz,H‑10),7.09(1H,ddd,J＝7.8,7.8,1.0Hz,H‑11),7.32(1H,d,J＝7.8Hz,H‑12),1.46(1H,m,H‑14α),2.47(1H,dt,J＝7.6,3.6Hz,H‑14β),3.42(1H,m,H‑15),7.47(1H,d,J＝2.4Hz,H‑17),5.19(1H,dd,J＝10.0,1.8Hz,H‑18a),5.30(1H,dd,J＝17.2,1.8Hz,H‑18b),5.54(1H,overlapped,H‑19),2.72(1H,overlapped,H‑20),5.51(1H,overlapped,H‑21),4.73(1H,d,J＝8.0Hz,H‑1'),3.23(1H,brd,J＝8.8Hz,H‑2'),3.28～3.37(3H,m,H‑3'～H‑5'),3.71(1H,dd,J＝12.0,5.2Hz,H‑6'a),3.93(1H,dd,J＝12.0,
13
1.6Hz,H‑6'b)。C NMR(CD3OD,100MHz)δ:134.5(C‑2),54.8(C‑3),41.2(C‑5),22.0(C‑6),
109.3(C‑7),127.9(C‑8),118.8(C‑9),120.0(C‑10),122.5(C‑11),112.0(C‑12),134.2(C‑
13),32.6(C‑14),27.3(C‑15),109.0(C‑16),149.0(C‑17),120.5(C‑18),133.9(C‑19),
44.5(C‑20),97.4(C‑21),166.0(C‑22),99.6(C‑1'),74.8(C‑2'),78.3(C‑3'),71.6(C‑
4'),78.0(C‑5'),62.7(C‑6')。

[0167]

[0168] 化合物28:ESI‑MS(m/z:547[M+H]+)。1H NMR(CD3OD,700MHz)δ:3.87(1H,brd,J＝9.8Hz,H‑3),3.14(2H,overlapped,H‑5),2.94(1H,m,H‑6α),2.73(1H,brd,J＝14.7Hz,H‑6β),7.39(1H,d,J＝7.7Hz,H‑9),6.98(1H,dd,J＝7.7,7.7Hz,H‑10),7.05(1H,dd,J＝7.7,
7.7Hz,H‑11),7.30(1H,d,J＝7.7Hz,H‑12),1.80(1H,m,H‑14α),2.38(1H,d,J＝14.7Hz,H‑
14β),3.16(1H,overlapped,H‑15),7.56(1H,s,H‑17),3.28(1H,overlapped,H‑18a),3.17(1H,overlapped,H‑18b),4.34(1H,t,J＝7.7Hz,H‑19),2.09(1H,m,H‑20),5.59(1H,d,J＝
9.1Hz,H‑21),3.81(3H,s,H‑23),4.81(1H,d,J＝4.8Hz,H‑1'),3.32(1H,overlapped,H‑
2'),3.28(1H,m,H‑3'),3.39(1H,overlapped,H‑4'),3.41(1H,overlapped,H‑5'),3.83
13
(1H,overlapped,H‑6'a),3.69(1H,dd,J＝11.9,4.9Hz,H‑6'b)。C NMR(CD3OD,175MHz)δ:
135.8(C‑2),64.2(C‑3),56.1(C‑5),23.3(C‑6),108.7(C‑7),128.2(C‑8),118.6(C‑9),
119.8(C‑10),122.1(C‑11),112.1(C‑12),138.2(C‑13),37.3(C‑14),34.1(C‑15),111.2(C‑16),153.6(C‑17),59.5(C‑18),66.6(C‑19),44.6(C‑20),97.6(C‑21),169.4(C‑22),
52.0(C‑23),100.9(C‑1'),74.6(C‑2'),78.3(C‑3'),71.0(C‑4'),78.0(C‑5'),62.3(C‑
6')。

[0169] 实施例

[0170] 一、脑缺血再灌注损伤模型的制备(一)氧糖剥夺/再灌注损伤细胞模型的制备[0171] 1.实验动物

[0172] 新生24h内SD大鼠，SPF级，由斯贝福(北京)生物技术有限公司提供。

[0173] 2.氧糖剥夺/再灌注损伤细胞模型的制备

[0174] (1)原代皮层神经元的分离与培养

[0175] 取新生24h内的SD乳鼠，固定乳鼠暴露头顶部，消毒后分层剪开头皮和颅骨，用无齿镊取两侧大脑皮层，放入盛有DMEM培养基的培养皿中，剔除大脑皮层上残留脑膜和血管，2
并将脑组织剪碎成1mm 的组织碎块转移至盛有木瓜蛋白酶及DNA酶的细胞培养皿中，轻柔吹打消化，放入37℃培养箱中，静置25分钟后，加入10％胎牛血清的DMEM终止消化。取上清液转移至盛有DMEM液的离心管Ⅰ中，剩余的组织碎块加入DMEM高糖型培养基约5～6mL重悬，用无菌巴氏吸管吹打12次，静置2分钟后，收集离心管1/3体积的上清液继续转移至离心管Ⅰ中。再次加入5～6mL DMEM高糖型培养基重悬组织碎块，如此重复上述步骤3次，以便收集足量的细胞悬液。将得到的上清液经70μm滤膜过滤，将滤液1500r/min离心5分钟，弃去上清。
收集沉淀加入适当的含10％胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞，并用无菌的巴氏吸管轻轻吹
6
散、混匀，以1×10cell/mL的密度将细胞种植在预先包被多聚赖氨酸的培养孔板中，置培养箱内培养。4h后全部换液，以后视细胞的生长情况半量或全量换液，2～3天换液1次。

[0176] (2)连二亚硫酸钠造模条件的筛选

[0177] 将原代皮层神经元置于37℃、5％CO2培养箱中培养至第7天后，用不同浓度的含Na2S2O4的无糖Earle’s液(5、10、15、20、25、30、35、40、60mmol/L)替换原神经元培养液，并置于37℃、5％CO2培养箱内培养1h，进行缺糖缺氧损伤，1h后将其替换为原神经元培养液再置于培养箱内培养1h进行复糖复氧。通过MTT法对Na2S2O4造模条件进行筛选，根据实验结果，最终选取20mmol/L的Na2S2O4造模1h，细胞存活率在50％～60％之间，作为脑缺血再灌注损伤模型的条件，见表1。

[0178] 表1.不同浓度Na2S2O4造模1h对原代皮层神经元的影响(x±s，n＝4)

[0179]

[0180] 注：与正常组比较，*P<0.01，**P<0.001，***P<0.0001

[0181] (3)氧糖剥夺/再灌注损伤细胞模型的建立

[0182] 将原代皮层神经元置于37℃、5％CO2培养箱中培养至第7天后，采用含20mmol/L的Na2S2O4的无糖Earle’s液替换96孔细胞培养板中模型组的原代皮层神经元培养液，并置于37℃、5％CO2培养箱内培养1h，进行缺糖缺氧损伤，1h后将其替换为原代皮层神经元培养液再置于培养箱内分别培养1h进行复糖复氧，即为造模结束。

[0183] 二、化合物抗脑缺血再灌注损伤作用

[0184] 2.1实验方法

[0185] 将原代皮层神经元接种于96孔板上，置于37℃、5％CO2培养箱内培养。实验设置正常组、模型组与给药组。原代皮层神经细胞培养至第6天于造模前24h给药，正常组与模型组加入神经元培养基，给药组加入含不同浓度的化合物(0.1、0.5、1、3.25、6.25、12.5、25、50和100μM)的神经元培养基。给药24h后开始造模，模型组与给药组每孔加入含20mmol/L的Na2S2O4的无糖Earle’s液替换原神经元培养液，并置于37℃、5％CO2培养箱内培养1h，进行缺糖缺氧损伤，1h后将其替换为原代皮层神经元培养液再置于培养箱内培养1h进行复糖复氧。造模结束后，弃去培养液，每孔加入MTT溶液100μL(终浓度0.5mg/mL)，放入培养箱中孵育4h，然后弃去上清液，每孔加入DMSO溶液150μL后将培养板置于摇床上震荡10min左右，待MTT反应后的甲臜结晶充分溶解后用酶标仪测定各孔在490nm波长下的吸光度，计算细胞相对存活率。计算公式如下：

[0186] 细胞存活率(％)＝(实验组OD值‑空白OD值)/(正常组OD值‑空白OD值)×100％。

[0187] 2.2实验结果

[0188] 结果显示，本发明的衍生物对脑缺血再灌注损伤的原代皮层神经元具有较好的保护作用，可用于抗脑缺血再灌注损伤药物的制备，见表2。

[0189] 表2.化合物抗脑缺血再灌注损伤活性(x±s，n＝3)

[0190]

[0191] 从以上结果可以看出，本发明的衍生物，如化合物1～28等28个四环单萜吲哚类生物碱，具有显著的抗脑缺血再灌注损伤作用，在脑缺血再灌注损伤疾病的治疗方面具有较大的发展潜力，说明本发明的衍生物可用于制备脑缺血再灌注损伤的药物制剂，并为在预防和/或治疗脑缺血再灌注损伤药物中的应用提供了科学依据。

[0192] 本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。