一种先导化合物、其制备方法、以及其在制备抗流感病毒药物方面的应用 |
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| 申请号 | CN202310304628.X | 申请日 | 2023-03-27 | 公开(公告)号 | CN116003486B | 公开(公告)日 | 2023-08-01 |
| 申请人 | 北京天之泰生物科技有限公司; 中国科学院微生物研究所; | 发明人 | 吕迅; 程晨曦; 汪念; 李学兵; 吴培星; | ||||
| 摘要 | 本 发明 一种先导化合物、其制备方法、以及其在制备抗流感病毒药物方面的应用属于化学药物领域。所述先导化合物为N‑乙酰神经 氨 酸类似化合物的9位修饰有R基团的N‑乙酰神经氨酸类似物；所述R基团选自：、、、、、；所述N‑乙酰神经氨酸类似化合物具有式II所示的结构；式II：。本发明的先导化合物是一种N‑乙酰神经氨酸类似物，可直接作为药物的活性成分、进入体内以其本身的结构抑制流感病毒。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种先导化合物，其特征在于，具有如下式I所示的结构： |
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| 说明书全文 | 一种先导化合物、其制备方法、以及其在制备抗流感病毒药物方面的应用 技术领域[0001] 本发明属于化学药物领域，具体涉及一种先导化合物、其制备方法、以及其在制备抗流感病毒药物方面的应用。 背景技术[0002] 目前市场上治疗流感的主要临床药物为流感病毒神经氨酸酶（NA，neuraminidase）抑制剂，例如扎那米韦（Zanamivir）和达菲（Oseltamivir）。随着这类NA抑制剂的广泛使用和用药剂量的增加，其药效正受到耐药流感病毒的严重威胁，因此针对新靶点开发新一代抗流感药物，对于现行流感的治疗以及新发流感的防控都具有重要意义。 [0003] 流感病毒血凝素蛋白（HA，hemagglutinin）存在于流感病毒的囊膜表面，通过与唾液酸（Sialic acid）配体特异性结合，帮助病毒定植于宿主表面进而侵入宿主细胞，是发现抗病毒药物的理想靶点。通过解析HA与其天然底物N‑乙酰神经氨酸配体的复合物晶体（PDB：1HGI）发现，N‑乙酰神经氨酸9位羟基邻近处存在四个丝氨酸（Ser）残基（图1）。 [0004] 目前市面上尚未出现以HA为靶点的化学药物，以HA为靶点的抑制剂虽有一些报道，但大多与靶点HA之间的结合能力较弱，无法成药。其中，N‑乙酰神经氨酸作为典型的以HA为靶点的抑制剂之一，其虽然可发挥显著的抑制流感病毒的作用，但因其对靶位点HA蛋白的亲和力不足，结合力太弱，仍然难以成药。 发明内容[0005] 出于解决本领域存在的上述N‑乙酰神经氨酸与HA靶点亲和力低、结合力弱、难以成药等技术问题的目的，本发明提供一种以N‑乙酰神经氨酸类似物为基础的先导化合物、其制备方法、以及其在制备抗流感病毒药物方面的应用。 [0006] 本发明的技术方案如下： [0007] 一种先导化合物，其特征在于，为N‑乙酰神经氨酸类似化合物的9位修饰有R基团的N‑乙酰神经氨酸类似物； [0008] 所述R基团选自 ： 、 、 、、 、 ； [0009] 所述N‑乙酰神经氨酸类似化合物具有式II所示的结构； [0010] 式II： 。 [0011] 图1显示的靶位点HA的4个Ser残基与SA的9位羟基并不存在相互作用，只是空间距离较近。本发明的先导化合物系在N‑乙酰神经氨酸（类似物，例如，化合物II）的9位上修饰上述R基团，上述R基团可能与HA的4个Ser残基产生相互作用，导致修饰后的SA类似物与HA的相互结合力增强。鉴于以目前已有的技术手段无法进行实验获取确切的实验数据来证明二者之间增强的结合力到底是哪种作用力，基于化学领域的一般基本原理进行推导，这些相互作用可能是共价结合（与Ser生成共价键），也可能是非共价（氢键、范德华力等）结合。 [0012] 所述的一种先导化合物具有如下式I所示的结构： [0013] 式I： ； [0014] 其 中 ，R 选 自 ： 、 、 、、 、 。 [0015] 所述先导化合物可与血凝素蛋白H1、H5结合； [0016] 优选地，所述先导化合物以流感病毒血凝素蛋白为靶点抑制流感病毒。 [0017] 一种先导化合物在制备抗流感病毒药物方面的应用，所述一种先导化合物具有如下式I所示的结构： [0018] 式I： ； [0019] 其 中 ，R 选 自 ： 、 、 、、 、 。 [0020] 所述抗流感病毒药物的靶点为流感病毒血凝素蛋白； [0021] 优选地，所述抗流感病毒药物包括：活性成分；所述活性成分包括：所述先导化合物； [0022] 优选地，所述抗流感病毒药物还包括：辅料。 [0023] 一种先导化合物的制备方法，用R基团修饰式II所示的N‑乙酰神经氨酸类似化合物II； [0024] 式II： ； [0025] 所述R基团选自 ： 、 、 、、 、 。 [0026] 所述修饰的位置为N‑乙酰神经氨酸类似化合物II的9位。 [0027] N‑乙酰神经氨酸类似化合物II系以N‑乙酰神经氨酸为原料，经Tetrahedron, 1994, 50, 7445‑7460一文记载的方法合成得到。 [0028] N‑乙酰神经氨酸类似化合物II与化合物IIIA还原胺化反应制得；或，化合物IIIB和N‑羟基琥珀酰亚胺经羧基活化后再与化合物II经酰胺化反应制得。 [0029] 所述化合物IIIA选自：化合物III‑1、化合物III‑2、化合物III‑3、化合物III‑4； [0030] 化合物III‑1的结构式为： ； [0031] 化合物III‑2的结构式为： ； [0032] 化合物III‑3的结构式为： ； [0033] 化合物III‑4的结构式为： ； [0034] 优选地，所述化合物IIIB选自：化合物III‑5、化合物III‑6； [0035] 化合物III‑5的结构式为： ； [0036] 化合物III‑6的结构式为： ； [0037] 优选地，所述还原胺化反应指：化合物II和化合物IIIA溶于溶剂后再加入胺化还原剂； [0038] 优选地，所述化合物II、化合物IIIA、溶剂、胺化还原剂的用量比例为：1mmol∶1.2mmol∶50mL∶1.2mmol； [0039] 优选地，溶于溶剂后置于室温下搅拌反应1小时； [0040] 优选地，加入胺化还原剂后室温下搅拌反应12小时； [0042] 优选地，所述胺化还原剂为氰基硼氢化钠； [0043] 优选地，所述羧基活化指：化合物IIIB与N‑羟基琥珀酰亚胺溶于溶剂后加入DCC反应2h； [0044] 优选地，化合物IIIB、N‑羟基琥珀酰亚胺、溶剂、DCC的用量比例为1.5mmol∶1.5mmol∶20mL∶3mmol； [0045] 优选地，反应2h后浓缩得到浓缩物； [0046] 优选地，所述酰胺化反应指：浓缩物溶于溶剂加入化合物II室温反应16小时； [0047] 优选地，浓缩物、溶剂、化合物II的用量比例为：1.5mmol∶20mL∶1.0mmol； [0048] 优选地，室温反应16小时后浓缩； [0049] 优选地，所述溶剂选自：干燥甲醇、无水四氢呋喃、N,N‑二甲基甲酰胺； [0050] 优选地，所述浓缩指真空浓缩。 [0051] 本发明的有益效果如下： [0052] 本发明在N‑乙酰神经氨酸（或其类似物，例如，化合物II）的9位设计引入修饰基团R，如图2所示，得到先导化合物（式I）。本发明基于化学领域的一般原理推测，所选择的六个R修饰基团与Ser中的羟基产生共价结合，形成共价键，使得先导化合物本身与HA之间的相互作用大幅提高，增加成药性。本发明对所述先导化合物进行了亲和力实验并证实了上述推测，R基团修饰后的先导化合物与HA的亲和力大大提高，使药物与靶点的结合力增加。 [0053] 本发明的所述先导化合物以流感病毒HA结合位点附近的特定氨基酸残基为靶点，对唾液酸分子进行基团修饰，预期修饰基团与HA中的Ser之间产生相互作用，从而提高二者的相互作用力。 [0054] 所述先导化合物是一种N‑乙酰神经氨酸类似物，该化合物可与HA底物结合位点中的Ser残基发生相互作用，通过干扰HA的功能阻止病毒侵入细胞，进而抑制流感病毒。本发明得到的先导化合物（N‑乙酰神经氨酸类似物）可直接作为药物的活性成分、进入体内以其本身的结构抑制流感病毒。附图说明 [0055] 图1为本发明背景技术记载的HA配体结合位点上的丝氨酸残基结构示意图。 [0056] 图2为本发明的一些实施例提供的先导化合物的结构图。 具体实施方式[0057] 下面结合具体实施例和实验例对本发明的内容做进一步详细说明，但并不以此限制本发明的保护范围。 [0058] 第1组实施例、本发明的先导化合物 [0059] 本组实施例提供一种先导化合物。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述先导化合物为N‑乙酰神经氨酸类似化合物的9位修饰有R基团的N‑乙酰神经氨酸类似物； [0060] 所述R基团选自 ： 、 、 、、 、 ； [0061] 所述N‑乙酰神经氨酸类似化合物具有式II所示的结构； [0062] 式II： 。 [0063] 本领域技术人员根据上述各结构式所示R基团的教导和启发，基于化学领域的一般原理，可选择除“ 、 、 、、 、 ”以外的R基团替换上述R基团修饰N‑乙 酰神经氨酸或N‑乙酰神经氨酸类似化合物并反应、制备、合成、生产出其他与上式I所示的化合物的结构或性质相似的先导化合物。 [0064] 本领域技术人员出于本发明的教导，结合化学领域常见的技术手段，选择合适的化学反应条件，将可与丝氨酸发生相互作用的R基团与N‑乙酰神经氨酸或N‑乙酰神经氨酸类似化合物连接起来。任何用将与丝氨酸发生相互作用的R基团与N‑乙酰神经氨酸或N‑乙酰神经氨酸类似化合物连接和/或合成、制作、使用、销售、许诺销售、生产、进口、出口、反应生成所述先导化合物的行为均落入本发明的保护范围。 [0065] 本领域技术人员还可根据上述式II的教导和启发，基于化学领域的一般原理，可选择其他结构或性质相似的化合物或与N‑乙酰神经氨酸类似的化合物作为先导化合物的制备原料和修饰基础。 [0066] 在更具体的实施例中，所述的一种先导化合物具有如下式I所示的结构： [0067] 式I： ； [0068] 其中，R选自： 、 、 、、 、 。 [0069] 本领域技术人员根据上述各结构式所示R基团的教导和启发，基于化学领域的一般原理，可选择除“ 、 、 、、 、 ”以外的R基团替换上述R基团修饰N‑乙 酰神经氨酸或N‑乙酰神经氨酸类似化合物并反应、制备、合成、生产出其他与上式I所示的化合物的结构或性质相似的先导化合物。 [0070] 在一些实施例中，所述先导化合物可与血凝素蛋白H1、H5结合； [0071] 优选地，所述先导化合物以流感病毒血凝素蛋白为靶点抑制流感病毒。 [0072] 第2组实施例、本发明的先导化合物的制药用途 [0073] 本组实施例提供一种先导化合物在制备抗流感病毒药物方面的应用。 [0074] 本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述先导化合物为N‑乙酰神经氨酸或N‑乙酰神经氨酸类似化合物的9位修饰有R基团的N‑乙酰神经氨酸类似物； [0075] 所述R基团选自 ： 、 、 、、 、 。 [0076] 本领域技术人员根据上述各结构式所示R基团的教导和启发，基于化学领域的一般原理，可选择除“ 、 、 、、 、 ”以外的R基团替换上述R基团修饰N‑乙 酰神经氨酸或N‑乙酰神经氨酸类似化合物并反应、制备、合成、生产出其他与上式I所示的化合物的结构或性质相似的先导化合物。 [0077] 本领域技术人员出于本发明的教导，结合化学领域常见的技术手段，选择合适的化学反应条件，将可与丝氨酸发生相互作用的R基团与N‑乙酰神经氨酸或N‑乙酰神经氨酸类似化合物连接起来。任何用将与丝氨酸发生相互作用的R基团与N‑乙酰神经氨酸或N‑乙酰神经氨酸类似化合物连接和/或合成、制作、使用、销售、许诺销售、生产、进口、出口、反应生成所述先导化合物的行为均落入本发明的保护范围。 [0078] 在具体的实施例中，所述N‑乙酰神经氨酸类似化合物具有式II所示的结构； [0079] 式II： 。 [0080] 本领域技术人员根据上述式II的教导和启发，基于化学领域的一般原理，可选择其他结构或性质相似的化合物或与N‑乙酰神经氨酸类似的化合物作为先导化合物的制备原料和修饰基础。 [0081] 在一些具体的实施例中，所述一种先导化合物具有如下式I所示的结构： [0082] 式I： ； [0083] 其 中 ，R 选 自 ： 、 、 、、 、 。 [0084] 本领域技术人员根据上述各结构式所示R基团的教导和启发，基于化学领域的一般原理，可选择除“ 、 、 、、 、 ”以外的R基团替换上述R基团修饰N‑乙 酰神经氨酸或N‑乙酰神经氨酸类似化合物并反应、制备、合成、生产出其他与上式I所示的化合物的结构或性质相似的先导化合物。 [0085] 在一些实施例中，所述抗流感病毒药物的靶点为流感病毒血凝素蛋白； [0086] 优选地，所述抗流感病毒药物包括活性成分；所述活性成分包括所述先导化合物；优选地，所述抗流感病毒药物还包括辅料。 [0087] 在具体的实施例中，所述辅料为药用辅料或药学上可接受的辅料。 [0088] 在更具体的实施例中，所述药用辅料或药物学上可接受的辅料选自：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂。 [0089] 根据本发明的内容，出于实际生产应用中的不同需求，再结合药物制备领域的常规技术手段（例如，《制剂技术百科全书》、《药物制剂技术》等），本领域技术人员可对上述辅料进行选择和调配，并将本发明的先导化合物制成不同的剂型，例如口服液、粉剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、汤剂、丸剂、喷剂、吸入剂、雾化剂、注射剂等。 [0090] 第3组实施例、本发明的先导化合物的制备方法 [0091] 本组实施例提供一种先导化合物的制备方法。本组所有的实施例都具备如下共同特征：用R基团修饰式II所示的N‑乙酰神经氨酸类似化合物II； [0092] 式II： ； [0093] 所述R基团选自 ： 、 、 、、 、 。 [0094] 本领域技术人员根据上述式II的教导和启发，基于化学领域的一般原理，可选择其他结构或性质相似的化合物或与N‑乙酰神经氨酸类似的化合物作为先导化合物的制备原料和修饰基础。 [0095] 本领域技术人员根据上述各结构式所示R基团的教导和启发，基于化学领域的一般原理，可选择除“ 、 、 、、 、 ”以外的R基团替换上述R基团修饰N‑乙 酰神经氨酸或上述式II 的N‑乙酰神经氨酸类似化合物或结构/性质与式II化合物类似的N‑乙酰神经氨酸类似化合物并反应、制备、合成、生产出其他与上式I所示的化合物的结构或性质相似的先导化合物。 [0096] 在一些实施例中，所述修饰的位置为N‑乙酰神经氨酸类似化合物II的9位。 [0097] 在另一些实施例中，N‑乙酰神经氨酸类似化合物II系以N‑乙酰神经氨酸为原料，经Tetrahedron, 1994, 50, 7445‑7460一文记载的方法合成得到。 [0098] 在具体的实施例中，N‑乙酰神经氨酸类似化合物II与化合物IIIA还原胺化反应制得；或，化合物IIIB和N‑羟基琥珀酰亚胺经羧基活化后再与化合物II经酰胺化反应制得。 [0099] 在更具体的实施例中，所述化合物IIIA选自：化合物III‑1、化合物III‑2、化合物III‑3、化合物III‑4； [0100] 化合物III‑1的结构式为： ； [0101] 化合物III‑2的结构式为： ； [0102] 化合物III‑3的结构式为： ； [0103] 化合物III‑4的结构式为： ； [0104] 优选地，所述化合物IIIB选自：化合物III‑5、化合物III‑6； [0105] 化合物III‑5的结构式为： ； [0106] 化合物III‑6的结构式为： ； [0107] 优选地，所述还原胺化反应指：化合物II和化合物IIIA溶于溶剂后再加入胺化还原剂； [0108] 优选地，所述化合物II、化合物IIIA、溶剂、胺化还原剂的用量比例为：1mmol∶1.2mmol∶50mL∶1.2mmol； [0109] 优选地，溶于溶剂后置于室温下搅拌反应1小时； [0110] 优选地，加入胺化还原剂后室温下搅拌反应12小时； [0111] 优选地，反应12小时后浓缩得到的浓缩物经硅胶层析柱分离； [0112] 优选地，所述胺化还原剂为氰基硼氢化钠； [0113] 优选地，所述羧基活化指：化合物IIIB与N‑羟基琥珀酰亚胺溶于溶剂后加入DCC反应2h； [0114] 优选地，化合物IIIB、N‑羟基琥珀酰亚胺、溶剂、DCC的用量比例为1.5mmol∶1.5mmol∶20mL∶3mmol； [0115] 优选地，反应2h后浓缩得到浓缩物； [0116] 优选地，所述酰胺化反应指：浓缩物溶于溶剂加入化合物II室温反应16小时； [0117] 优选地，浓缩物、溶剂、化合物II的用量比例为：1.5mmol∶20mL∶1.0mmol； [0118] 优选地，室温反应16小时后浓缩； [0119] 优选地，所述溶剂选自：干燥甲醇、无水四氢呋喃、N,N‑二甲基甲酰胺； [0120] 优选地，所述浓缩指真空浓缩。 [0121] 实验例1、本发明N‑乙酰神经氨酸类似物的合成方法 [0123] （1）化合物I‑1的合成 [0124] 通用方法一：化合物II（1mmol）和化合物III（III‑1–III‑4，1.2mmol）溶于干燥甲醇（DMF，50mL），室温下搅拌反应1小时，再加入氰基硼氢化钠（1.2mmol）室温下搅拌反应12小时，用薄层硅胶色谱（TLC）监测。反应完毕后，真空浓缩反应液，浓缩物经硅胶层析柱分离得得到白色固体化合物I（I‑1–I‑4）。产率为9–23%。 [0125] 按照通用方法一，化合物II（合成方法参考文献：Tetrahedron, 1994, 50, 7445‑7460）和化合物III‑1（CAS：88654‑54‑0）反应得到化合物I‑1（59 mg，产率12%）。 [0126] 1H NMR (500 MHz, D2O):δ7.60‑7.87 (m, 4H), 3.90‑3.97 (m, 2H), 3.82 (t,J =10.0 Hz, 1H), 3.71 (d,J =10.2 Hz, 1H), 3.42 (d,J =9.0 Hz, 1H), 3.24 (dd,J =12.8, 3.2 Hz, 1H), 3.11 (s, 3H), 2.87 (dd,J =13.2, 8.1 Hz, 1H), 2.22 (dd,J = 13.2, 5.1 Hz, 1H), 1.96 (s, 3H), 1.53‑1.59 (m, 1H). ESI‑HRMS:m/zcalculated + for C19H27FN2O10S [M + H]: 495.1449, Found: 495.1452. [0127] （2）化合物I‑2的合成 [0128] 按照通用方法一，化合物II和化合物III‑2（CAS：87199‑17‑5）反应得到化合物I‑21 （64mg，产率14%）。H NMR (500 MHz, D2O):δ7.20‑7.64 (m, 4H), 3.92‑3.99 (m, 2H), 3.80 (t,J =10.5 Hz, 1H), 3.70 (d,J =10.0 Hz, 1H), 3.44 (d,J =9.1 Hz, 1H), 3.22‑3.28 (m, 1H), 3.19 (s, 3H), 2.82 (dd,J =13.0, 8.4 Hz, 1H), 2.18 (dd,J = 13.0, 5.2 Hz, 1H), 1.99 (s, 3H), 1.53‑1.57 (m, 1H). ESI‑HRMS:m/zcalculated + for C19H29BN2O10[M + H]: 457.1994, Found: 457.1990. [0129] （3）化合物I‑3的合成 [0130] 按照通用方法一，化合物II和化合物III‑3（CAS：616‑76‑2）反应得到化合物I‑31 （109mg，产率23%）。H NMR (500 MHz, D2O):δ7.68 (d,J =8.8 Hz, 1H), 7.46 (d,J =3.1 Hz, 1H), 7.22 (dd,J =8.8, 3.2 Hz, 1H), 3.91‑3.99 (m, 2H), 3.77 (t,J =10.3 Hz, 1H), 3.71 (d,J =10.1 Hz, 1H), 3.42 (d,J =9.0 Hz, 1H), 3.20‑3.29 (m, 1H), 3.17 (s, 3H), 2.80 (dd,J =13.2, 8.4 Hz, 1H), 2.18 (dd,J =13.2, 5.2 Hz, 1H), 1.94 + (s, 3H), 1.51‑1.56 (m, 1H). ESI‑HRMS:m/zcalculated for C20H28N2O11[M + H] : 473.1771, Found: 473.1772. [0131] （4）化合物I‑4的合成 [0132] 化合物I‑4的合成： [0133] 氟磷酸单乙酯（CAS：371‑68‑6，1mmol）和羟基乙醛（CAS：141‑46‑8，1mmol）溶于无水四氢呋喃（20mL），加入N,N'‑二环己基碳酰亚胺（DCC，CAS:538‑75‑0，3mmol）和4‑二甲氨基吡啶（DMAP，0.1mmol），反应2h后真空浓缩反应液，得化合物III‑4粗品。 [0134] 按照通用方法一，化合物II和化合物III‑4反应得到化合物I‑4（43mg，产率9%）。1H NMR (500 MHz, D2O):δ4.19‑4.24 (m, 2H), 3.92‑3.98 (m, 2H), 3.69‑3.79 (m, 4H), 3.41 (d,J =9.2 Hz, 1H), 3.22‑3.29 (m, 1H), 3.14 (s, 3H), 2.80‑2.92 (m, 3H), 2.16 (dd,J =13.0, 5.1 Hz, 1H), 1.96 (s, 3H), 1.52‑1.59 (m, 1H), 1.30 (t,J =+ 7.1 Hz, 3H). ESI‑HRMS:m/zcalculated for C16H30FN2O11P [M + H]: 477.1649, Found: 477.1651. [0135] （5）化合物I‑5的合成 [0136] 通用方法二：化合物III‑5或III‑6（1.5mmol）和N‑羟基琥珀酰亚胺（NHS，CAS：6066‑82‑6，1.5mmol）溶于无水四氢呋喃（20mL），加入DCC（二环己基碳二亚胺）（3mmol），反应2h后真空浓缩反应液，浓缩物溶于N,N‑二甲基甲酰胺（DMF，20mL），加入化合物II（1.0mmol），室温反应16小时，用薄层硅胶色谱（TLC）监测。反应完毕后，真空浓缩反应液，浓缩物经硅胶层析柱分离得得到白色固体化合物I（I‑5或I‑6）。产率为11–32%。 [0137] 化合物I‑5的合成： [0138] 按照通用方法二，化合物II和化合物III‑5（CAS：600‑23‑7）反应得到化合物I‑51 （131mg，产率32%）。H NMR (500 MHz, D2O): 3.82‑3.96 (m, 5H), 3.74 (t,J =10.1 Hz, 1H), 3.64 (d,J =10.2 Hz, 1H), 3.40 (d,J =9.1 Hz, 1H), 3.22‑3.28 (m, 1H), 3.14 (s, 3H), 2.76 (dd,J =13.0, 8.2 Hz, 1H), 2.12 (dd,J =13.0, 5.4 Hz, 1H), 1.95 + (s, 3H), 1.50‑1.55 (m, 1H). ESI‑HRMS:m/zcalculated for C15H24N2O11[M + H] : 409.1458, Found: 409.1466. [0139] （6）化合物I‑6的合成 [0140] 化合物I‑6的合成： [0141] 丙二酸（CAS：141‑82‑2，1mmol）溶于干燥N，N‑二甲基甲酰胺（DMF，20mL），加入1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐（EDCI，3mmol）和4‑二甲氨基吡啶（DMAP，0.1mmol），室温下搅拌1小时。将反应液逐滴加入水杨醛（CAS：90‑02‑8，1mmol）的DMF溶液中（20mL），反应2h，用薄层硅胶色谱（TLC）监测。反应完毕后，真空浓缩反应液，浓缩物为化合物III‑6的粗品。 [0142] 按照通用方法二，化合物II和化合物III‑6反应得到化合物I‑6（56mg，产率11%）。1 H NMR (500 MHz, D2O):δ7.42‑7.92 (m, 4H), 3.90‑3.99 (m, 2H), 3.71‑3.79 (m, 4H), 3.44 (d,J =9.1 Hz, 1H), 3.20‑3.29 (m, 1H), 3.14 (s, 3H), 2.82 (dd,J = 13.1, 8.5 Hz, 1H), 2.14 (dd,J =13.1, 5.2 Hz, 1H), 1.97 (s, 3H), 1.51‑1.56 (m, 1H). [0143] ESI‑HRMS:m/zcalculated for C22H28N2O12[M + H]+: 513.1720, Found: 513.1709. [0144] 实验例2、本发明N‑乙酰神经氨酸类似物的活性评价 [0145] 生物材料来源：血凝素蛋白（H1、H5）与流感病毒（包括H1N1，H3N2，H5N1）均保存自中国科学院微生物研究所，蛋白表达和病毒培养的具体方法见参考文献（ACS nano 2014, 8, 4600–4607；Biosensors and Bioelectronics 2017, 91, 46‑52.）。已知上述流感病毒HA蛋白及其毒株识别的配体均为N‑乙酰神经氨酸。 [0146] 1．蛋白水平实验：表面等离子激光共振（SPR）实验 [0147] 用PH 4.5的醋酸/醋酸钠缓冲液10倍稀释0.5mg/mL的 H1和H5蛋白后，用 BIAcore 3000 system（GE Healthcare, Sweden）通过经典的氨基偶联方法将其固定在superCM5芯片上。用PBS溶液分别配置化合物在12.5μM，25μM，50μM，100μM，200μM，400μM浓度的溶液，以−1 40 μL min 流速按从低浓度到高浓度的顺序依次在CM5 芯片表面进样。其中每个抑制剂浓度的结合时间为60s，总解离时间为120s。所得到的结果用 BIAcore 3000分析软件通过拟合计算出不同抑制剂的KD值，可以通过SPR实验可以分析出化合物与靶蛋白的作用方式和亲和力大小。 [0148] 表1. 化合物与H1、H5蛋白的亲和力K（DμM） [0149] [0150] 注：Neu5Ac为N‑乙酰神经氨酸，与HA结合能力较弱（KD值为毫摩尔水平）；2,3‑SLN为2,3连接的唾液酸乳糖胺，与HA结合能力较强（KD值为微摩尔水平）；N.D.表示无结合能力。 [0151] 本领域一般认为，KD值越小越好，KD值越小说明结合力越强。 [0152] 由蛋白水平实验结果可知，阳性对照唾液酸乳糖胺（2,3‑SLN）的结合力最强，KD值可达20μM左右，而天然底物Neu5Ac在SPR水平上没有显示出与HA有结合，此结果与文献报道相符。而本发明合成的6种N‑乙酰神经氨酸类似物KD值均强于天然底物Neu5Ac，其中有3种化合物与HA的亲和力比2,3‑SLN强，表明本发明所设计的化合物可与HA竞争性结合，从而干扰HA功能，阻止病毒侵入细胞。 [0153] 2. 细胞水平实验：流感病毒抑制试验 [0154] 将通过鸡胚繁殖得到的流感病毒（包括H1N1，H3N2，H5N1）按照10倍梯度用DMEM 稀释成不同浓度的病毒溶液。在96孔细胞培养板中接种MDCK细胞，20 h后（待细胞长满培养板底部）后，吸除含有血清双抗的DMEM培养基，用灭菌后的PBS溶液冲洗2遍后，加入事前稀释好的病毒溶液100 μL。然后将96孔细胞培养板放入37 °C含有5% CO2的细胞培养箱中培养48 h。每个病毒浓度重复4次。倒置显微镜观察细胞状态，并对每个孔进行ELISA检测试验，所得结果利用Reed‑Muench法计算出流感病毒的TCID50。 [0155] 将11mM的抑制剂母液用0.22μm 的无菌滤器过滤后，加入DMEM培养基按照10倍梯度稀释成合适浓度范围的抑制剂溶液。另外，在96孔细胞培养板中接种MDCK细胞，20 h后待细胞长满培养板底部后，吸除含有血清双抗的DMEM 培养基，用灭菌后的PBS 溶液冲洗2遍后，加入事前稀释好的100倍TCID50的病毒溶液100 μL。然后将96孔细胞培养板放入37°C含有5% CO2的细胞培养箱中孵浴1h后，吸除病毒溶液，用灭菌后的PBS溶液冲洗1遍后，加入不同浓度的抑制剂溶液，然后将96孔细胞培养板放入37 °C含有5% CO2的细胞培养箱中培养72 h。每个抑制剂浓度重复4次。倒置显微镜观察细胞状态，并对每个孔进行ELISA检测试验，所得结果利用Reed‑Muench 法计算出不同抑制剂分子针对不同流感病毒的EC50。 [0156] 表2. 化合物抑制流感病毒感染MDCK细胞的EC50值 [0157] [0158] 注：Neu5Ac为N‑乙酰神经氨酸，OSV为抗流感上市药物达菲；H1N1，H3N2，H5N1为野生型流感毒株，H1N1 275Y为耐达菲型流感毒株。 [0159] 在本领域的一般认知中，EC50值越小越好，EC50值越小说明抑制活性越强。 [0160] 由上述结果可以看出，本发明提供的6种N‑乙酰神经氨酸类似物在细胞水平上对流感病毒具有明显的抑制作用，EC50值均强于天然底物Neu5Ac，特别是对耐药流感病毒抑制效果显著，具有开发成为抗流感药物的潜力。 [0161] 综上所述，本发明提供了一种针对流感病毒血凝素HA的药物设计方法，提供的6种N‑乙酰神经氨酸类似物与天然底物相比，与HA的结合力显著提高，细胞水平上的流感病毒抑制活性明显增强，可作为先导化合物进一步开发抗流感药物。 |
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