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n-3PUFA磷脂酰糖苷在制备改善血脑屏障损伤药品中的应用
申请号	CN202010419026.5	申请日	2020-05-18	公开(公告)号	CN111514152B	公开(公告)日	2021-09-14
申请人	中国海洋大学; 青岛海洋食品营养与健康创新研究院;			发明人	王玉明; 王成成; 张恬恬; 薛长湖; 薛勇; 李兆杰; 徐杰; 王静凤; 常耀光; 唐庆娟; 毛相朝; 姜晓明; 丛培旭;
摘要	本发明涉及n‑3PUFA磷脂酰糖苷的新用途，具体涉及n‑3PUFA磷脂酰糖苷在改善血脑屏障损伤制品中的应用。所述n‑3PUFA磷脂酰糖苷包括含有DHA和EPA的磷脂酰葡萄糖苷、磷脂酰半乳糖苷、磷脂酰果糖苷、磷脂酰核糖苷、磷脂酰甘露糖苷，以及含有以上化合物及其组合物的制品。
权利要求	1.n‑3PUFA磷脂酰糖苷在制备改善缺血再灌注导致的血脑屏障损伤和醋酸铅导致的血脑屏障损伤的药品中的应用；上述n‑3PUFA磷脂酰糖苷制备方法，包括以下步骤： (1)以鱿鱼卵为原料提取n‑3PUFA磷脂酰胆碱：冷冻的鱿鱼卵经干燥、粉碎后加入氯仿：甲醇(2:1，v/v)溶液；搅拌浸泡24h后，过滤得提取液，加入1/4滤液体积的0.9％氯化钾溶液充分混合后静置分层，将下层分离并旋转蒸发至干，经硅胶柱层析，以氯仿、丙酮、甲醇梯度洗脱，收集甲醇部分减压浓缩后即得n‑3PUFA磷脂酰胆碱； (2)以n‑3PUFA磷脂酰胆碱制备n‑3PUFA磷脂酰糖苷：将n‑3PUFA磷脂酰胆碱溶于乙醚中，将葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖和核糖分别溶解在醋酸钠缓冲溶液中，并加入适量磷脂酶D；然后将各糖溶液分别与n‑3PUFA磷脂酰胆碱乙醚溶液混合，在氮气保护的密封容器内搅拌反应8h；反应结束后，萃取有机相，经硅胶柱层析纯化得，n‑3PUFA磷脂酰糖苷。 2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述n‑3PUFA磷脂酰糖苷包括含有DHA和EPA的磷脂酰葡萄糖苷、磷脂酰半乳糖苷、磷脂酰果糖苷、磷脂酰核糖苷、磷脂酰甘露糖苷中的一种或一种以上的组合物。 3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的药品包含有药理有效浓度的n‑3PUFA磷脂酰糖苷。
说明书全文	n‑3PUFA磷脂酰糖苷在制备改善血脑屏障损伤药品中的应用技术领域： [0001] 本发明涉及n‑3PUFA磷脂酰糖苷的新用途，具体涉及n‑3PUFA磷脂酰糖苷在改善血脑屏障损伤制品中的应用。背景技术： [0002] 血脑屏障损伤是脑卒中的主要病理特征，是血管源性脑水肿和脑出血的元凶，同时与阿尔兹海默症等神经退行性疾病密切相关。目前临床上尚没有能有效保护血脑屏障的药物。近年来，已有越来越多的研究表明血脑屏障损伤与紧密连接蛋白功能障碍和氧化应激有关。重要的是，紧密连接蛋白功能与细胞膜磷脂和脂肪酸组成密切相关。研究表明，n‑3PUFA磷脂酰糖苷能显著改善细胞膜结构和功能，从而影响膜蛋白结构和功能，影响各种化合物的跨膜运输。 [0003] 磷脂酰糖苷是一种含糖的亲水性头部，已被发现在细胞中起着锚定作用，有助于各种化合物运输的跨膜。其存在于细胞膜中，是细胞膜的结构成分，影响各种化合物的跨膜运输。2015年Science首次证明PtdGlc富集在动物大脑皮层的星形胶质细胞中，与神经胶质细胞‑神经元的信号系统的传递相关；另外，XiaWu等人发现其与脂肪酸代谢相关，但还其在改善血脑屏障损伤中的作用还未见报道。发明内容： [0004] 本发明要解决的技术问题是目前仍没有关于n‑3PUFA磷脂酰糖苷在改善血脑屏障损伤的研究。 [0005] 为解决上述问题，本发明证实了n‑3PUFA磷脂酰糖苷在改善血脑屏障损伤方面具有显著作用。 [0006] 为达到上述目的，本发明具体通过以下技术方案实现：n‑3PUFA磷脂酰糖苷在改善血脑屏障损伤制品中的应用。 [0007] 进一步的，所述n‑3PUFA磷脂酰糖苷包括含有DHA和EPA的磷脂酰葡萄糖苷、磷脂酰半乳糖苷、磷脂酰果糖苷、磷脂酰核糖苷、磷脂酰甘露糖苷中的一种或一种以上的组合物，以及含有以上化合物及其组合物的制品。其化学式见附图1。 [0008] 首先，结构上n‑3PUFA磷脂酰糖苷与甘油三酯型或乙酯型等非极性n‑3PUFA有本质区别。甘油三酯型或乙酯型等非极性n‑3PUFA为中性脂，具有极强的疏水性；而本申请所述磷脂酰糖苷为极性脂，具有双亲性。其结构特殊性在于甘油骨架sn‑1/2位为EPA/DHA等脂肪酸，sn‑3位被磷酸酯化，并在磷酸上键合不同单糖取代基形成极性基团，如葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、核糖等；其结构既不同于甘油三酯型或乙酯型n‑3PUFA，也不同于不含n‑3PUFA的普通磷脂酰糖苷。 [0009] 结构上的本质区别导致在消化吸收、体内转运、利用等方面也不同，这进一步影响其具体代谢及功能。n‑3PUFA磷脂酰糖苷在血液中部分以溶血磷脂酰糖苷形式存在，其由载脂蛋白转运至血脑屏障，与转运蛋白Mfsd2a结合。而Mfsd2a不仅是n‑3PUFA以溶血磷脂形式进入脑内的转运蛋白，也是调节血脑屏障功能的重要蛋白。Mfsd2a在中枢神经系统中只特异性地表达在含有血脑屏障上，剔除Mfsd2a可导致血脑屏障通透性增加。因此，Mfsd2a是n‑3PUFA磷脂酰糖苷作用于血脑屏障的一个重要靶点。 [0010] 另外，n‑3PUFA磷脂酰糖苷结构不同于其他n‑3PUFA磷脂，如磷脂酰胆碱。研究表明，sn‑3位极性基团不同的n‑3PUFA磷脂具有不同的作用。n‑3PUFA磷脂酰糖苷在改善血脑屏障损伤方面不同于其他n‑3PUFA磷脂在于其在细胞信号转导方面的重要作用，这是因为分布在生物膜外侧磷脂层的糖酯具有重要的识别和传递信息功能，参与控制细胞膜通透性的信号转导，从而影响其通透性。而磷脂酰糖苷最早是从胎鼠脑的脂筏上被检测出来，对脂筏功能具有重要作用。血脑屏障上有大量的脂筏存在，紧密连接结构蛋白分布于脂筏中，其功能受其脂质组成的影响，进而影响血脑屏障的通透性。因此，n‑3PUFA磷脂酰糖苷基于脂筏调节保护血脑屏障损伤。 [0011] 并且血脑屏障结构主要有三层，由管内到外依次为毛细血管内皮细胞间的紧密连接、毛细血管内皮细胞外基底膜和毛细血管壁外表面。重要的是，毛细血管壁外表面积的85％都被神经胶质细胞的终足所包围。而胶质细胞是磷脂酰糖苷的富集区域，对胶质细胞功能具有重要影响。因此，n‑3PUFA磷脂酰糖苷还通过胶质细胞影响血脑屏障通透性。 [0012] 进一步的，所述制品为药品或特医食品，保健品以及生物制剂，优选为药品或特医食品。 [0013] 进一步的，所述n‑3PUFA磷脂酰糖苷的制备方法包括以下步骤： [0014] (1)以鱿鱼卵为原料提取n‑3PUFA磷脂酰胆碱：冷冻的鱿鱼卵经干燥、粉碎后加入氯仿：甲醇(2:1，v/v)溶液；搅拌浸泡24h后，过滤得提取液，加入1/4滤液体积的0.9％氯化钾溶液充分混合后静置分层，将下层分离并旋转蒸发至干。经硅胶柱层析，以氯仿、丙酮、甲醇梯度洗脱，收集甲醇部分减压浓缩后即得n‑3PUFA磷脂酰胆碱； [0015] (2)以n‑3PUFA磷脂酰胆碱制备n‑3PUFA磷脂酰糖苷：将n‑3PUFA磷脂酰胆碱溶于乙醚中，将葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖和核糖分别溶解在醋酸钠缓冲溶液中，并加入适量磷脂酶D；然后将各糖溶液分别与n‑3PUFA磷脂酰胆碱乙醚溶液混合，在氮气保护的密封容器内搅拌反应8h；反应结束后，萃取有机相，经硅胶柱层析纯化得，n‑3PUFA磷脂酰糖苷。 [0016] 本发明的有益效果在于： [0017] (1)通过实验证明了不同分子形式n‑3PUFA磷脂酰糖苷显著降低了缺血再灌注导致的血脑屏障损伤；不同分子形式n‑3PUFA磷脂酰糖苷显著降低了醋酸铅导致的血脑屏障损伤，首次验证了n‑3PUFA磷脂酰糖苷在改善血脑屏障中的作用，为血脑屏障的治疗提供了新的途径。 [0018] (2)给出了n‑3PUFA磷脂酰糖苷在改善血脑屏障制品中的应用给出了合理的指导，具有广阔的市场前景。附图说明 [0019] 图1为本发明n‑3PUFA磷脂酰糖苷的化学结构图； [0020] 图2为实施例1的数据图； [0021] 图3为实施例2的数据图。具体实施方式： [0022] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。 [0023] 实施例1：n‑3PUFA磷脂酰糖苷在改善缺血再灌注诱导的血脑屏障损伤中的效果[0024] 1.1实验方法 [0025] 1.1.1实验设计 [0026] 实验动物为雄性Balb/c小鼠，体重22‑23g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。将小鼠分为7个组：假手术组(N)、模型组(M)、磷脂酰葡萄糖苷组(PtdGlc)、磷脂酰半乳糖苷组(PtdGal)、磷脂酰果糖苷组(PtdFru)、磷脂酰甘露糖苷组(PtdMan)及磷脂酰核糖苷组(PtdRib)。假手术组和模型组小鼠喂食改良AIN‑93G啮齿动物饲料。其他小鼠分别喂食添加0.5％对应受试物的饲料。三周后，进行缺血再灌注诱导血脑屏障损伤。 [0027] 2.1.2缺血再灌注及血脑屏障损伤检测 [0028] 5％水合氯醛麻醉(7mL/kg)后，置于36.5～37.5℃恒温台上，取仰卧位，颈部正中切口，钝性分离皮下组织，分离双侧颈总动脉并结扎，缺血30min后，松开动脉夹使血流恢复再灌注。松开动脉夹1h后，尾静脉注射2.5％伊文思蓝(EB)(0.1mL/10g)。一小时后处死，用生理盐水进行心脏灌流冲出脑内血液。将大脑取出，放入甲酰胺溶液(每100毫克脑组织加入1mL甲酰胺)中匀浆后，于45℃孵育72h，15000rpm离心20min，取上清液。波长为620nm处测吸光度。 [0029] 1.2实验结果 [0030] n‑3PUFA磷脂酰糖苷在改善缺血再灌注诱导的血脑屏障损伤中的效果如图2所示。与假手术组相比，缺血再灌注导致脑内伊文思蓝水平显著增加，表明血脑屏障损伤。但是，预干预三周不同分子形式n‑3PUFA磷脂酰糖苷显著降低了缺血再灌注导致的血脑屏障损伤。 [0031] 实施例2：n‑3PUFA磷脂酰糖苷在改善醋酸铅诱导的血脑屏障损伤中的效果[0032] 2.1实验方法 [0033] 2.1.1实验设计 [0034] 实验动物为雄性Balb/c小鼠，体重22‑23g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。将小鼠分为7个组：正常组(N)、模型组(M)、磷脂酰葡萄糖苷组(PtdGlc)、磷脂酰半乳糖苷组(PtdGal)、磷脂酰果糖苷组(PtdFru)、磷脂酰甘露糖苷组(PtdMan)及磷脂酰核糖苷组(PtdRib)。除正常组外，所有小鼠每天灌胃50mg/kg醋酸铅9周。同时，小鼠喂食改良AIN‑93G啮齿动物饲料。6周后，磷脂酰葡萄糖苷组(PtdGlc)、磷脂酰半乳糖苷组(PtdGal)、磷脂酰果糖苷组(PtdFru)、磷脂酰甘露糖苷组(PtdMan)及磷脂酰核糖苷组(PtdRib)分别喂食添加0.5％对应受试物的饲料。3周后，采用尾静脉注射荧光素钠评价血脑屏障损伤情况。 [0035] 2.1.2荧光素钠评价血脑屏障损伤情况 [0036] 小鼠尾静脉注射50ul/只2％荧光素钠溶液，一小时后处死，用生理盐水进行心脏灌流冲出脑内血液。将大脑取出，加入0.75mlPBS和0.25ml100％(w/v)三氯乙酸溶液匀浆后，置于4摄氏度过夜。然后于4℃，1000g离心30min，取上清液100ul，加入等体积的PBS，混匀后于酶标仪测定荧光值。酶标仪增益值80，激发波长460nm，发射波长515nm。 [0037] 2.2实验结果 [0038] n‑3PUFA磷脂酰糖苷在改善醋酸铅诱导的血脑屏障损伤中的效果如图3所示。与正常组相比，灌胃醋酸铅导致脑内荧光素钠水平显著增加，表明血脑屏障损伤。但是，干预三周不同分子形式n‑3PUFA磷脂酰糖苷显著降低了醋酸铅导致的血脑屏障损伤。 [0039] 综上，不同分子形式n‑3PUFA磷脂酰糖苷对血脑屏障具有显著保护作用。 [0040] 以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可以利用上述技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

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