一种酿酒单宁、葡萄酒的酿造方法和应用 |
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| 申请号 | CN202410098707.4 | 申请日 | 2024-01-24 | 公开(公告)号 | CN117986306A | 公开(公告)日 | 2024-05-07 |
| 申请人 | 宁夏大学; | 发明人 | 马雯; 张云伟; 金刚; 宋琳娜; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供了一种酿酒 单宁 、葡萄酒的 酿造 方法和应用，涉及酿酒技术领域。所述酿酒单宁来源于红葡萄皮、红葡萄籽、白葡萄皮和白葡萄籽中的一种或几种；当所述酿酒单宁来源于红葡萄皮时，所述酿酒单宁中总酚的含量为101.23mg/g，总单宁含量为17.18mg/g等。本发明以葡萄酒皮渣为研究对象，从中提取缩合单宁，开发外源酿酒单宁，能够将葡萄酒皮渣变废为宝，实现葡萄酒生产中单宁的自给自足，从而降低葡萄酒生产成本，具有重要的经济和社会意义。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种酿酒单宁，其特征在于，所述酿酒单宁来源于红葡萄皮、红葡萄籽、白葡萄皮和白葡萄籽中的一种或几种； |
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| 说明书全文 | 一种酿酒单宁、葡萄酒的酿造方法和应用技术领域[0001] 本发明涉及酿酒技术领域，特别是涉及一种酿酒单宁、葡萄酒的酿造方法和应用。 背景技术[0002] 近年来，随着我国葡萄酒产量和销量的逐渐上升，每年会产生约占葡萄加工质量25％的葡萄酒加工废弃物，主要包括葡萄皮、葡萄籽、葡萄果梗等。据统计，每生产6L葡萄酒就会产生约1kg葡萄酒皮渣。葡萄酒皮渣是葡萄酒生产过程排放的主要固体废弃物，主要由葡萄皮、葡萄梗、葡萄籽和少量果肉组成，葡萄皮约占皮渣湿重的50％～82％，葡萄籽约占皮渣湿重的24％～26％，它们均含有丰富的有机质，比如葡萄籽含有油(15‑17％)和脂肪酸(13％～20％)、多酚(4％～6％)和木质素(52‑60％)等，具有一定的潜在营养价值。葡萄加工后约70％的酚类化合物仍在皮渣中，尤其是红葡萄皮中的花色素和籽中的黄酮醇含量最高。而皮渣中的生物活性化合物的特性取决于葡萄品种、葡萄采收前后的条件以及加工条件，可作为抗氧化剂、抗突变药物、抗肿瘤药物及消炎调节剂。皮渣中同时含有丰富的纤维素、半纤维素、果胶等膳食纤维。它们均含有丰富的有机质。可作为生产原料进一步开发利用，既延伸了葡萄酒产业链条，又解决了葡萄酒皮渣对环境的污染，促进产业早日实现“碳达峰、碳中和”，使环境保护内部经济化，对于建立葡萄酒生态产业链与低碳可持续发展具有积极意义。然而，当前葡萄酒皮渣的利用仍停留在肥料、饲料、生物能源等粗加工层面，皮渣利用率较低。葡萄酒皮渣的综合开发利用还有待进一步深入，不仅需要对皮渣中的有益成分进行探索和成果转化，还要重视对皮渣进行多元化梯度开发利用，发挥不同需求的综合功能。同时，在葡萄酒皮渣的综合利用过程中，应注意结合其特点进行合理的质量安全监控。我国还未形成系统的葡萄酒皮渣综合利用链，造成资源浪费及环境污染。 [0003] 单宁是古代时期人们用来避免动物皮毛腐败的植物多酚次生代谢物，广泛存在于红豆草、油菜籽、葡萄以及高粱等植物的茎秆、树皮或籽中，其与胶原蛋白的相互作用，使胶原蛋白变得稳定，从而使动物皮毛鞣制转化为皮革。有学者根据化学结构将单宁分为四类，即缩合单宁、水解单宁、褐藻多酚、复合单宁。 [0004] 单宁也是决定葡萄酒质量的关键物质，直接或间接决定葡萄酒的色泽、香气、口感、稳定性和陈酿潜质。葡萄与橡木桶是葡萄酒中单宁的重要来源，分别贡献了缩合单宁与水解单宁。缩合单宁又称为原花青素，是C6‑C3‑C6黄烷醇聚合物，主要来源于葡萄果皮和种子，可以不同聚合单元、不同聚合方式形成聚合度多样的聚合态形式。水解单宁分子内具有酯键，属于C6‑C1型酚类，酸、热作用下不稳定，易于水解，又进一步分为没食子单宁和鞣花单宁(见图1)。外源酿酒单宁在葡萄酒酿造过程中的添加可以在酒体颜色稳定、防止氧化、增进骨架、稳定澄清等方面具有积极的作用。因此在葡萄酒酿造过程中，适量酿酒商业单宁的添加，对于弥补葡萄酒中天然单宁的不足和改善葡萄酒的感官质量至关重要。 发明内容[0005] 为了解决上述问题，本发明提供了一种酿酒单宁、葡萄酒的酿造方法和应用，本发明拟以葡萄酒皮渣为原料，开发制备外源酿酒单宁，应用于葡萄酒酿造过程，靶向提升葡萄酒品质。实现葡萄酒生产中单宁的自给自足，从而降低宁夏葡萄酒产区的生产成本，具有重要的经济和社会意义。 [0006] 为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案： [0007] 本发明提供了一种酿酒单宁，所述酿酒单宁来源于红葡萄皮、红葡萄籽、白葡萄皮和白葡萄籽中的一种或几种； [0008] 当所述酿酒单宁来源于红葡萄皮时，所述酿酒单宁中总酚的含量为101.23mg/g，总单宁含量为17.18mg/g； [0009] 当所述酿酒单宁来源于红葡萄籽时，所述酿酒单宁中总酚的含量为403.69mg/g，总单宁含量为51.8mg/g； [0010] 当所述酿酒单宁来源于白葡萄皮时，所述酿酒单宁中总酚的含量为243.36mg/g，总单宁含量为44.05mg/g； [0011] 当所述酿酒单宁来源于白葡萄籽时，所述酿酒单宁中总酚的含量为331.47mg/g，总单宁含量为57.35mg/g。 [0012] 优选的，当所述酿酒单宁来源于红葡萄皮时，所述酿酒单宁中儿茶素的含量为2.28mg/g，没食子酸的含量为4.83mg/g，没食子儿茶素的含量为5.61mg/g，表没食子儿茶素的含量为0.19mg/g，对羟基苯甲酸的含量为1.16mg/g，表儿茶素的含量为3.53mg/g，表没食子儿茶素没食子酸酯的含量为3.14mg/g。 [0013] 优选的，当所述酿酒单宁来源于红葡萄籽时，所述酿酒单宁中儿茶素的含量为5.07mg/g，没食子酸的含量为17.03mg/g，没食子儿茶素的含量为16.62mg/g，香草酸的含量为2.36mg/g，对羟基苯甲酸的含量为10.21mg/g，表儿茶素的含量为1.09mg/g，表没食子儿茶素没食子酸酯的含量为1.85mg/g。 [0014] 优选的，当所述酿酒单宁来源于白葡萄皮时，所述酿酒单宁中儿茶素的含量为0.86mg/g，没食子酸的含量为1.44mg/g，没食子儿茶素的含量为15.52mg/g，表没食子儿茶素的含量为0.25mg/g。 [0015] 优选的，当所述酿酒单宁来源于白葡萄籽时，所述酿酒单宁中儿茶素的含量为3.62mg/g，没食子酸的含量为6.25mg/g，没食子儿茶素的含量为7.06mg/g，对羟基苯甲酸的含量为7.18mg/g，香草酸的含量为1.30mg/g，表儿茶素的含量为0.05mg/g，表没食子儿茶素没食子酸酯的含量为1.53mg/g. [0016] 本发明还提供了一种葡萄酒的酿造方法，其特征在于，包括以下步骤： [0017] 1)将葡萄除梗破碎，得到葡萄醪； [0018] 2)将所述步骤1)得到的葡萄醪与偏重亚硫酸钾、果胶酶、酿酒酵母混合、发酵，当葡萄汁液比重为1.05时，加入权利要求1～5任一项所述的酿酒单宁后继续发酵，当葡萄汁液比重为0.996时，进行固液分离，得到发酵液； [0019] 3)将所述步骤2)得到的发酵液陈酿3～6个月，得到葡萄酒。 [0020] 优选的，所述步骤2)葡萄醪的体积与偏重亚硫酸钾的质量比为1L:60mg； [0021] 所述葡萄醪的体积与果胶酶的质量比为1L:40mg。 [0022] 优选的，所述步骤2)葡萄醪的体积与酿酒酵母的质量比为1L:0.25g； [0023] 所述葡萄醪的体积与酿酒单宁的质量比为4L:1.8g。 [0024] 优选的，所述步骤2)发酵的条件包括：温度为26～28℃，每日进行三次压帽和两次搅拌。 [0026] 本发明的有益效果为： [0027] (1)通过煎煮法以超纯水作为提取溶剂从红白葡萄酒皮渣中提取缩合单宁，并且对葡萄皮源的缩合单宁进行纯化，以去除糖酸，最终得到四种酿酒单宁，分别是红葡萄皮提取单宁(RSK)、红葡萄籽提取单宁(RSD)、白葡萄皮提取单宁(WSK)和白葡萄籽单宁(WSD)。RSK、RSD、WSK、WSD制备得率分别为5.12％、10.88％、2.28％和12.72％。 [0028] (2)通过福林肖卡法和TPI法测得的总酚含量中，RSD的总酚含量均显著高于其他单宁产品，分别为403.69mg/g和345.35mg/g；总单宁含量的测定中WSD的总单宁含量最大，为57.35mg/g；在抗氧化能力与澄清能力分析中，RSD的抗氧化能力和澄清能力均为最强；在酿酒单宁小分子检测中，WSK中的表没食子儿茶素浓度最大，为1.96mg/L，RSK中的表儿茶素和表没食子儿茶素没食子酸酯浓度均为最大，分别为28.22mg/L和25.09mg/L；通过对不同酿酒单宁进行组分检测，RSK中原花翠素的亚基含量最高，葡萄皮提取酿酒单宁中未检出表儿茶素香草酸酯单元含量；在平均聚合度检测中，WSK的平均聚合度均显著高于RSK、RSD、WSD。 [0029] (3)葡萄酒酿造试验中，酿酒单宁添加的葡萄酒色度和色调均高于无添加的葡萄酒，罐号WSD的色度及色调均为最高，分别为15.87和0.61；在浊度检测中罐号WSK的浊度最低，仅为5.99NTU，并与罐号TA不存在显著性差异；在氧化还原电位检测中罐号TA的ORP值最低，为153.0mv；在涩感评价中，添加酿酒单宁的葡萄酒涩感强度均高于未添加酿酒单宁的葡萄酒，罐号WSD的涩感强度最强，罐号CK最弱。五款酿酒单宁添加的葡萄酒涩感质量之间不具有显著性差异，罐号RSD的涩感质量显著低于未添加酿酒单宁的葡萄酒涩感质量。基于此，WSD在葡萄酒的护色及涩感强度方面表现最强；TA在葡萄酒的抗氧化方面表现最优；WSK在葡萄酒的澄清方面表现最优。附图说明 [0031] 图1为缩合单宁和水解单宁的结构图； [0032] 图2为本发明的技术路线图； [0033] 图3为酿酒单宁的总酚含量(Folin‑Ciocalteau法)； [0034] 图4为酿酒单宁的总酚含量(TPI法)； [0035] 图5为酿酒单宁的总单宁含量； [0036] 图6为酿酒单宁清除DPPH自由基能力； [0037] 图7为酿酒单宁的澄清能力； [0038] 图8为标准品各单元的BPC色谱图； [0039] 图9为酿酒单宁的平均聚合度； [0040] 图10为葡萄酒样涩感质量触摸板； [0041] 图11为不同酿酒单宁添加的葡萄酒色度分析； [0042] 图12为不同酿酒单宁添加的葡萄酒的色调分析； [0043] 图13为不同酿酒单宁添加的葡萄酒的浊度分析； [0044] 图14为不同酿酒单宁添加的葡萄酒氧化还原电位分析； [0045] 图15为不同酿酒单宁添加的葡萄酒涩感强度评价； [0046] 图16为不同酿酒单宁添加的葡萄酒涩感质量评价； [0047] 图17为不同酿酒单宁添加的葡萄酒品质综合评价。 具体实施方式[0048] 本发明提供了一种酿酒单宁，所述酿酒单宁来源于红葡萄皮、红葡萄籽、白葡萄皮和白葡萄籽中的一种或几种；当所述酿酒单宁来源于红葡萄皮时，所述酿酒单宁中总酚的含量为101.23mg/g，总单宁含量为17.18mg/g；当所述酿酒单宁来源于红葡萄籽时，所述酿酒单宁中总酚的含量为403.69mg/g，总单宁含量为51.8mg/g；当所述酿酒单宁来源于白葡萄皮时，所述酿酒单宁中总酚的含量为243.36mg/g，总单宁含量为44.05mg/g；当所述酿酒单宁来源于白葡萄籽时，所述酿酒单宁中总酚的含量为331.47mg/g，总单宁含量为57.35mg/g。 [0049] 在本发明中，当所述酿酒单宁优选来源于红葡萄皮时，所述酿酒单宁中儿茶素的含量为2.28mg/g，没食子酸的含量为4.83mg/g，没食子儿茶素的含量为5.61mg/g，表没食子儿茶素的含量为0.19mg/g，对羟基苯甲酸的含量为1.16mg/g，表儿茶素的含量为3.53mg/g，表没食子儿茶素没食子酸酯的含量为3.14mg/g。 [0050] 在本发明中，当所述酿酒单宁优选来源于红葡萄籽时，所述酿酒单宁中儿茶素的含量为5.07mg/g，没食子酸的含量为17.03mg/g，没食子儿茶素的含量为16.62mg/g，香草酸的含量为2.36mg/g，对羟基苯甲酸的含量为10.21mg/g，表儿茶素的含量为1.09mg/g，表没食子儿茶素没食子酸酯的含量为1.85mg/g。 [0051] 在本发明中，当所述酿酒单宁优选来源于白葡萄皮时，所述酿酒单宁中儿茶素的含量为0.86mg/g，没食子酸的含量为1.44mg/g，没食子儿茶素的含量为15.52mg/g，表没食子儿茶素的含量为0.25mg/g。 [0052] 在本发明中，当所述酿酒单宁优选来源于白葡萄籽时，所述酿酒单宁中儿茶素的含量为3.62mg/g，没食子酸的含量为6.25mg/g，没食子儿茶素的含量为7.06mg/g，对羟基苯甲酸的含量为7.18mg/g，香草酸的含量为1.30mg/g，表儿茶素的含量为0.05mg/g，表没食子儿茶素没食子酸酯的含量为1.53mg/g。 [0053] 本发明提供了一种葡萄酒的酿造方法，包括以下步骤： [0054] 1)将葡萄除梗破碎，得到葡萄醪； [0055] 2)将所述步骤1)得到的葡萄醪与偏重亚硫酸钾、果胶酶、酿酒酵母混合、发酵，当葡萄汁液比重为1.05时，加入上述技术方案所述的酿酒单宁后继续发酵，当葡萄汁液比重为0.996时，进行固液分离，得到发酵液； [0056] 3)将所述步骤2)得到的发酵液陈酿3～6个月，得到葡萄酒。 [0057] 本发明将葡萄除梗破碎，得到葡萄醪。本发明对所述葡萄的品种没有特殊限定，采用常规酿造葡萄酒使用的即可。本发明对所述葡萄破碎使用的方法没有特殊限定，采用常规即可。 [0058] 本发明将得到的葡萄醪与偏重亚硫酸钾、果胶酶、酿酒酵母混合、发酵，当葡萄汁液比重为1.05时，加入上述技术方案所述的酿酒单宁后继续发酵，当葡萄汁液比重为0.996时，进行固液分离，得到发酵液。在本发明中，所述葡萄醪的体积与偏重亚硫酸钾的质量比优选为1L:60mg。在本发明中，所述葡萄醪的体积与果胶酶的质量比优选为1L:40mg。在本发明中，所述葡萄醪的体积与酿酒酵母的质量比优选为1L:0.25g。在本发明中，所述葡萄醪的体积与酿酒单宁的质量比优选为4L:1.8g。在本发明中，所述发酵的条件优选包括：温度为26～28℃，每日进行三次压帽和两次搅拌。本发明对所述压帽和搅拌没有特殊限定，本领域技术人员依据常规操作即可。 [0059] 本发明还提供了上述技术方案所述酿酒单宁在降低葡萄酒中总硫含量中的应用。 [0060] 为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。 [0061] 表19略缩词表 [0062] [0063] [0064] 实施例1 [0065] 葡萄酒皮渣中酿酒单宁的提取与纯化 [0066] 1.1引言 [0067] 单宁的提取在国外已有大量研究，通常提取最简单、绿色、成本低的方法是以水作为提取溶剂进行固液提取。后来改用有机溶剂，以提高缩合单宁的提取率。由于单宁独特的结构使其易溶于水、丙酮、乙酸乙酯等极性溶剂，最为常见的有机提取剂是丙酮、甲醇。但是有机溶剂萃取成本高、有毒性、污染环境等因素，水依旧是可大量提取单宁的溶剂。从分离的红、白皮籽中提取的粗提物仍含有很多杂质，比如糖、脂类、色素等，需要进行纯化。大孔吸附树脂有较高的选择吸附性，吸附时间短、成本低、无污染、操作简单等优点，已成为黄酮类、生物碱类等物质的主要纯化方法，在医药生产领域广泛运用。本文选择水作为提取溶剂，再通过大孔吸附树脂进行纯化，以除掉糖类、脂类等。 [0068] 1.2试验材料、药品与仪器 [0069] 1.2.1试验材料 [0070] 葡萄酒皮渣：实验材料来自宁夏贺兰山东麓某酒庄，选择赤霞珠(北纬37°5′20″，东经105°30′27″)红葡萄酒皮渣，霞多丽(北纬38°2′30″，东经105°54′44″)白葡萄酒皮渣。均在2021年葡萄酒酿造过程中皮渣分离后收集，将收集的葡萄酒皮渣放入‑80℃冰箱中冷冻，每个品种的采摘量大概为20kg。 [0071] 1.2.2试验药品 [0072] 本实施例所使用的主要实验药品及试剂如表1所示。 [0073] 表1实验试剂与厂家 [0074] [0075] 注：“‑”表示无数据 [0076] 1.2.3试验仪器 [0077] 本实施例所使用的主要实验仪器如表2所示。 [0078] 表2实验仪器与厂家 [0079] [0080] [0081] 1.3试验方法 [0082] 1.3.1葡萄酒皮渣的处理及分离 [0083] 从‑80℃冰箱中将冷冻的红、白葡萄酒皮渣置于无阳光室温的地方溶解，溶解后使用自来水淘洗三遍，再用蒸馏水淘洗两遍以去除皮渣表面附着的大量糖等杂质，然后将其铺开在无阳光的地方阴干。阴干后再进行手动分离葡萄皮和籽并储存于塑封袋中，标记称重。 [0084] 1.3.2酿酒单宁的粗提取 [0085] 将红白葡萄皮和籽分别放到超纯水中进行水开煎煮1.5小时，待混合物冷却至室温后用网筛筛掉残渣，过滤，旋蒸浓缩，最后冷冻干燥，即得到酿酒单宁粗提物。如表3所示，为酿酒单宁粗提取的制备条件。 [0086] 表3酿酒单宁粗提取制备条件 [0087] 种类 原料质量(g) 溶剂(L) 煎煮时间(h) 温度 单宁水溶液*(L)白葡萄皮 50 2 1.5 100℃ 1.12 红葡萄皮 50 2 1.5 100℃ 1.30 白葡萄籽 50 2 1.5 100℃ 1.23 红葡萄籽 50 2 1.5 100℃ 1.50 [0088] *单宁水溶液是指煎煮后过滤得到的液体，需进一步旋蒸浓缩。 [0089] 1.3.3酿酒单宁粗提物的纯化 [0090] 将大孔吸附AB‑8型树脂预处理，称取400g置于烧杯中，加入蒸馏水使之充分浸泡，2小时后用蒸馏水对树脂不断抽滤至溶液澄清。再将大孔吸附树脂放入无水乙醇溶液中浸泡12h，使大孔树脂充分膨胀，撇掉上层漂浮的树脂，抽滤掉乙醇，用蒸馏水对大孔吸附树脂不断抽滤，直至树脂无乙醇气味。装入柱子中，第一步打开层析柱的活塞，使用玻璃棒引流在蒸馏水中浸泡的树脂。第二步将玻璃棒缓慢移出。若发现层析柱中有气泡，可用吸液球轻轻敲击有气泡的侧面。待液面高于树脂顶端0.5cm处立即关闭活塞。将5g不同提取物用蒸馏水溶解至浓度为150mg/mL，使用30cm胶头滴管将样品溶液沿着内测的玻璃壁缓缓流入，待样品溶液达到一定体积后，可加快上样的速度，并打开活塞。保持上样速度和蒸馏水流出速度相同，避免液面低于树脂而断层。随着蒸馏水的流出，样品也进入到大孔吸附树脂中，柱子的颜色因吸附单宁也由白色变为黄色或橘红色。待上样完成后，以蒸馏水作为洗脱液去除糖类等杂质，打开活塞，洗脱液也是通过30cm胶头滴管沿着玻璃内测缓慢滴入，以防止高速水流冲散树脂，破坏树脂床表面。洗去糖类等杂质后，加入不同浓度梯度的乙醇作为洗脱剂来收集纯化后的单宁，如表4所示。 [0091] 表4葡萄皮单宁粗提物的纯化 [0092] [0093] [0094] *BV为一个柱体积。 [0096] 利用Excel2021处理数据的平均值、标准偏差及柱状图；使用IBM SPSS沃勒‑邓肯(W)方法进行显著性分析。 [0097] 1.4结果分析与讨论 [0098] 1.4.1红葡萄酒皮渣皮与籽的单宁提取率 [0099] 使用煎煮法对葡萄酒皮渣中的单宁进行提取，再对葡萄皮单宁进行纯化，如表5所示。红葡萄籽的提取率较高，为10.88％。而红葡萄皮的提取率为8.77％。综上所示，红葡萄籽的提取率显著高于红葡萄皮，这可能与葡萄部位有关，研究发现葡萄籽中的单宁含量均高于葡萄皮中的单宁含量，因此葡萄籽的提取率要高于葡萄皮。 [0100] 表5红葡萄酒皮渣皮与籽单宁提取率 [0101] 种类 原料质量(g) 产物(g) 提取率(％)红葡萄皮 50 4.386±0.339 8.77 红葡萄籽 50 5.441±0.168 10.88 [0102] 1.4.2白葡萄酒皮渣皮与籽的单宁提取率 [0103] 如表6所示。白葡萄籽的提取率最高，为12.719％。白葡萄皮的提取率为12.00％。白葡萄籽的提取率显著大于白葡萄皮，这与红葡萄酒皮渣的结果一致，表明无论是红葡萄酒皮渣还是白葡萄酒皮渣，葡萄籽中的单宁含量均高于葡萄皮中的单宁含量，而且红葡萄酒皮渣比白葡萄酒皮渣含有更高的单宁含量。 [0104] 表6白葡萄酒皮渣皮与籽单宁提取率 [0105]种类 原料质量(g) 产物(g) 提取率(％) 白葡萄皮 50 5.998±0.159 12.00 白葡萄籽 50 6.360±0.063 12.72 [0106] 1.4.3葡萄皮单宁的纯化产率 [0107] 对红白葡萄酒皮渣中的葡萄皮提取单宁进行纯化，由表7可知，5g红葡萄皮粗提物经过大孔吸附树脂纯化，得到了2.558g红葡萄皮酿酒单宁，纯化率为55.10％。5g白葡萄皮粗提物通过大孔吸附树脂纯化后，得到了1.138g白葡萄皮酿酒单宁，纯化率为25.62％。因此，提取单宁纯化后比纯化前质量显著减少，去除了大量的糖酸，尤其是白葡萄皮中的糖酸含量。 [0108] 表7葡萄皮单宁的纯化产率 [0109] 种类 粗提物质量(g) 纯化后产物(g) 纯化率(％)红葡萄皮粗提物 5 2.558±0.197 55.10 白葡萄皮粗提物 5 1.138±0.143 25.62 [0110] 1.4.4基于葡萄酒皮渣的酿酒单宁制备得率 [0111] 最终从红白葡萄酒皮渣皮与籽中分别制备得到红皮酿酒单宁(RSK)，制备得率为5.12％；红籽酿酒单宁(RSD)，制备得率为10.88％；白皮酿酒单宁(WSK)，制备得率为 2.28％；白籽酿酒单宁(WSD)，制备得率为12.72％，如表8所示。综上所示，WSK制备得率最低，WSD制备得率最高。RSK的制备得率比WSK的制备得率高，参与葡萄酒发酵的葡萄酒皮渣单宁生产含量比未参与发酵的葡萄酒皮渣单宁产量高。 [0112] 表8酿酒单宁制备得率 [0113]原料种类 酿酒单宁 酿酒单宁制备得率(％) 红葡萄皮 RSK 5.12 红葡萄籽 RSD 10.88 白葡萄皮 WSK 2.28 白葡萄籽 WSD 12.72 [0114] 由以上实施例可以得出，通过煎煮法从葡萄酒皮渣提取酿酒单宁，并对红、白葡萄酒皮渣中葡萄皮与籽单宁的重复提取并计算可知，红葡萄皮单宁提取率为8.77％，红葡萄籽单宁提取率为10.88％，白葡萄皮单宁提取率为12.00％，白葡萄籽单宁提取率为12.72％。红白皮单宁经过纯化可知，红葡萄皮提取单宁的纯化率比白葡萄皮提取单宁纯化率高，红葡萄皮单宁的纯化率达到了55.10％，白葡萄皮单宁纯化率仅为25.62％。最终红葡萄籽酿酒单宁(RSD)、白葡萄籽酿酒单宁(WSD)、红葡萄皮酿酒单宁(RSK)及白葡萄皮酿酒单宁(WSK)制备得率分别为10.88％、12.72％、5.12％及2.28％。四类酿酒单宁中，RSD和WSD制备得率显著高于RSK和WSK，WSK制备得率最低。 [0115] 实施例2 [0116] 酿酒单宁的组分检测与酿酒性能评价 [0117] 1.1引言 [0118] 葡萄中的糖，酸，酚类物质及脂质等含量丰富，其中酚类成分是衡量葡萄果实品质的主要标准，也是决定葡萄酒颜色，口感等的重要因素。缩合单宁是葡萄果实最为主要的酚类物质，它可保护葡萄免受生物与非生物的侵害，因此在葡萄适应环境中起着重要作用。在葡萄酒的浸渍过程中将果实中的缩合单宁提取到酒中，包括黄烷‑3‑醇、儿茶素、表儿茶素等。葡萄酒中的单宁含量和成分受葡萄品种、酿造工艺、环境气候等影响。单宁的含量和组成决定葡萄酒的颜色、涩感、苦味、稳定性和陈酿能力。因此当葡萄的单宁含量低时，酿酒师们会在酿造阶段添加适量单宁。所以酿酒单宁的含量和组分对于葡萄酒的品质至关重要。 [0119] 本实施例以贺兰山东麓葡萄酒产区赤霞珠，霞多丽两种红、白色酿酒葡萄皮渣为研究对象，通过煎煮法将单宁从皮渣中提取出来，进而利用大孔吸附树脂去除糖分。采用常规的酚类成分化学检测方法探究酿酒单宁的成分和含量，并使用UHPLC‑ESI‑Q‑ToF(Agilengt1290‑G6546A)测定红、白皮籽单宁样品中缩合单宁含量。通过目前评价各部分缩合单宁平均聚合度及组分含量的手段，以期评价自提单宁与商业单宁的优劣及特征，为后续根据不同的酿酒需求选择合适的酿酒单宁提供参考。 [0120] 1.2试验材料、药品与仪器 [0121] 1.2.1试验材料 [0122] 酿酒单宁：实施例1中制备所得的外源酿酒单宁RSK、RSD、WSK、WSD。 [0123] 1.2.2试验药品 [0124] 本文所使用的主要实验药品及试剂如表9所示。 [0125] 表9实验试剂与厂家 [0126] [0127] 1.2.3试验仪器 [0128] 本文所使用的主要实验仪器如表10所示。 [0129] 表10实验仪器与厂家 [0130] [0131] 1.3试验方法 [0132] 1.3.1酿酒单宁的总酚与总单宁含量分析 [0133] 1.3.1.1酿酒单宁溶液浓度的配置 [0134] 红、白葡萄皮和籽单宁溶于蒸馏水中，相同部位的浓度配置相同，不同部位配成不同浓度进行单宁检测，如表11所示。 [0135] 表11待测葡萄皮籽水溶液浓度 [0136] [0137] 1.3.1.2酿酒单宁总酚的测定 [0138] (1)Folin‑Ciocalteau法 [0139] 称取一定量的单宁粗提物配置溶液成如下浓度，葡萄皮的单宁浓度为3g/L，籽的为1g/L，利用Folin‑Ciocalteau法测定总酚(Total Phenol Content)：以0.5g/L没食子酸标准溶液为母液，依次吸取1mL，2mL，3mL，4mL，6mL，8mL，10mL没食子酸标准溶液于10mL容量瓶中，补加水至刻度线，即配成7个浓度的没食子酸溶液，再分别取0.1mL于10mL容量瓶中，再加0.5mL的福林肖卡溶液，充分摇匀，配制浓度为20％的Na2CO3溶液，加入2mL的20％碳酸钠溶液，混匀，最后补加蒸馏水至刻度线，避光反应30min后于760nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线，得到计算公式。测定总酚时，分别取0.1mL葡萄皮单宁和葡萄籽单宁水溶液于10mL容量瓶中，接着添加0.5mL福林肖卡溶液，2mL Na2CO3溶液，补加水至10mL刻度。30min后，在紫外可见分光光度仪上760nm处测量吸光度，重复测三遍。 [0140] (2)TPI法 [0141] 用紫外分光光度计测量1:100稀释的单宁溶液280nm的吸光度，使用10mm石英比色皿，将吸光度乘以100。使用0.3g/L表儿茶素溶液梯度稀释制作标准曲线，将测得的吸光度带入曲线中，计算得到以表儿茶素计的总酚丰度，设定三个重复。 [0142] 1.3.1.3酿酒单宁总单宁的测定 [0143] 总单宁的测定是通过Bate‑Smith法进行检测。机理是在高温下，通过原花青素(单宁)的酸性水解测量总单宁含量，导致碳阳离子形成部分转化为红色花青素。首先提供两组试管，蒸馏水、37％的HCL、无水乙醇。两个试管分别加入6mL 37％的HCL，2mL蒸馏水及4mL待测单宁水溶液，一组在23℃下反应30min，另一组置于100℃水浴30min，至时间后，两组试管均加入1mL无水乙醇，并混匀。使用UV紫外分光光度计在550nm处测定混合物吸光值，并计算其差值，取差值的平均值，即为ΔA。通过计算获得浓度(g/L)：酿酒单宁总单宁含量为19.33/50×ΔA。 [0144] 1.3.2酿酒单宁的抗氧化性及澄清能力分析 [0145] 1.3.2.1酿酒单宁的抗氧化性分析 [0146] 通过清除DPPH自由基能力测定酿酒单宁的抗氧化性能，在23℃下配制10mL浓度为0.47g/L的DPPH甲醇混合溶液，取2mL的DPPH甲醇混合物溶于20mL的甲醇中得到DPPH试剂，注意：当日配当日用，避光保存。将酿酒单宁溶于甲醇溶液中，用超声仪将其充分溶解，并以 0.3g/L的Trolox为母液，配制依次为：0.15g/L，0.075g/L，0.0375g/L，0.01875g/L， 0.009375g/L，0.004688g/L，0.002344g/L的七个浓度梯度。分别吸取100μL七个浓度梯度的样品溶液和2mL DPPH试剂于5mL试管中，在37℃下反应10min后，将试管充分摇匀后并避光静置20min，使用UV紫外分光光度计测定混合物在515nm条件下的吸光值，将测得的吸光度带入标准曲线中，计算得到以Trolox当量的清除DPPH自由基能力，并平行测定三次。 [0147] 1.3.2.2酿酒单宁澄清能力分析 [0148] 通过甲基纤维素沉淀法(MCP)检测酿酒单宁的澄清能力。将酿酒单宁以2g/L溶解在模型酒溶液(12％乙醇、4g/L酒石酸，用氢氧化钠调节pH至3.5)中，得到酿酒单宁溶液。分别量取125μL酿酒单宁溶液置于两个离心管中。管A加入1mL甲基纤维素溶液(0.4％，w/v)和1mL饱和硫酸铵溶液，用蒸馏水定容至5mL。管B加入1mL饱和硫酸铵溶液，用蒸馏水定容至 5mL。在室温下静置20分钟，将样品离心，用分光光度计测280nm处的吸光度。管B和管A之间的吸光度差值(ΔA280nm)就是对应样品的单宁含量。使用0.3g/L表儿茶素溶液梯度稀释制作标准曲线，将测得的吸光度带入曲线中，计算得到以表儿茶素计的总酚丰度，总酚丰度越高代表澄清能力越强。 [0149] 1.3.3酿酒单宁HPLC和LC‑MS分子与组分分析 [0150] 1.3.3.1单宁小分子检测 [0151] 使用HPLC对不同酿酒单宁的单宁小分子含量进行测定：色谱柱为C18 UHPLC column(4.6×250mm，1.8μm，Agilent Zorbax eclipse plus)；LC的条件：流动相为含0.1％甲酸的水(洗脱液A)和含0.1％甲酸的甲醇(洗脱液B)，两者均含0.1％甲酸，流速为1mL/min。线性梯度为：0‑1min甲醇浓度保持5％，1‑12.5min甲醇浓度保持上升至20％，12.5‑64min甲醇浓度从梯度为20％上升到50％，64‑65.5min甲醇浓度上升至100％，100％的甲醇溶液洗柱子1min，在下一次进样前再用5％的甲醇水溶液平衡柱子2min；质谱仪工作在 10GHz扩展动态范围内(m/z3200Th)。Nebulizer压力为25psi，干燥气流量为9L/min，干燥气体温度设置为300℃。鞘气气体温度保持在350℃，流量设定为11L/min。Oct1，Fragmentor、Vcap、Skimmer电压分别为750v、150v、、4000v、750v。所有分析在负模式下进行。 [0152] 1.3.3.2酿酒单宁的组分和平均聚合度的检测 [0153] 根据Kennedy等人并做稍许改动，将酿酒单宁溶解于甲醇中，浓度为5g/L，然后配制反应液A：称取2.5g间苯三酚、0.5g抗坏血酸、量取493μL浓盐酸(37％)，定容在50mL甲醇中，充分混匀。终止液B：称取无水乙酸钠328mg，定容在100mL蒸馏水中，充分溶解。完成液C：吸取200μL样品与200μL反应液A混合，置于50℃烘箱中反应20min。反应结束后加入1mL终止液B，得到完成液C。将完成液C用0.22μm的滤膜过滤，使用电喷雾液质联用飞行时间质谱(LC‑MS，1290InfinityⅡ‑G6546A)进行测定。 [0154] 色谱柱型号为2.1×100mm 1.9Micron with Column ID；色谱柱填料：InfinityLab Poroshell；LC的条件：流动相A为1％甲酸水，流动相B为1％甲酸甲醇，流速为 0.3mL/min，进样量为1μL，紫外照射为208nm。线性梯度为：0‑1分钟甲醇浓度保持10％，1‑4分钟甲醇浓度保持上升至20％，4‑10分钟甲醇浓度从梯度为20％上升到32％，10‑14分钟甲醇浓度上升至100％，100％的甲醇溶液洗柱子3min，在下一次进样前再用5％的甲醇水溶液平衡柱子2min； [0155] 根据Kennedy和Jones进行mDP的计算，根据间苯三酚反应的原理，结合以下公式，可以得出不同单体的占比情况，公式如下所示。终结单元与延伸单元之和再除以终结单元的值，即为平均聚合度(如公式1)；原花翠素等于原花翠素除以终结单元与延伸单元之和(如公式2)；表儿茶素除以终结单元与延伸单元之和即得到，表儿茶素的含量(％EC)，如公示3所示；％表儿茶素香草酸酯(％ECV)与％表儿茶素没食子酸酯(％G)同理可得，如公式4、公式5所示。 [0156] [0157] [0158] [0159] [0160] [0161] [0162] 1.3.4数据处理 [0163] 利用Excel 2021处理数据的平均值、标准偏差及柱状图；使用IBM SPSS沃勒‑邓肯(W)方法进行显著性分析。 [0164] 1.4结果分析与讨论 [0165] 1.4.1酿酒单宁总酚含量分析 [0166] (1)Folin‑Ciocalteau法 [0167] 对不同酿酒单宁进行了总酚含量的测定，结果如图3所示：红籽单宁(RSD)、白皮单宁(WSK)及白籽单宁(WSD)的总酚含量显著高于红皮单宁(RSK)。其中RSD中的总酚含量最高，达到了403.69mg/g；其次是WSD中含总酚较高，为331.47mg/g；WSK中的总酚含量为243.36mg/g；而RSK中的总酚含量最少，为101.23mg/g；不同葡萄品种使得不同部位的总酚含量有所差异，红白葡萄酒皮渣中籽单宁总酚含量均显著高于皮单宁，葡萄籽中积累的总酚浓度高于葡萄皮中的。综上所述，葡萄酒皮渣中不同品种以及不同部位提取的单宁总酚含量之间存在差异，通过煎煮法葡萄籽比葡萄皮更易提取到高总酚含量的酿酒单宁，并且RSD、WSK与WSD表现出良好的总酚含量。 [0168] 红皮单宁(RSK)总酚含量为101.23mg/g，红籽单宁(RSD)总酚含量为403.69mg/g，白皮单宁(WSK)总酚含量为243.36mg/g，白籽单宁(WSD)总酚含量为331.47mg/g。 [0169] (2)TPI法 [0170] 使用TPI法测得结果如图4所示：RSK、RSD、WSK、WSD中总酚含量之间均具有显著性差异。总酚含量由高到低依次是RSD＞WSD＞WSK＞RSK，其中RSD的总酚含量最高，为345.35mg/g，RSK中的总酚含量最低，为156.59mg/g。这和Folin‑Ciocalteau法测得结果趋势一致，葡萄籽中所提取的酿酒单宁总酚含量均显著高于葡萄皮提取的酿酒单宁。 [0171] 1.4.2酿酒单宁总单宁含量分析 [0172] 对不同酿酒单宁的总单宁含量进行了测定，结果如图5所示：WSK中的总单宁含量与RSK、RSD、WSD之间均存在显著性差异。RSK是这四种酿酒单宁中总单宁含量最低的，为17.18mg/g；与有关研究结果相一致，无论品种、成熟度相同，葡萄皮中的总单宁含量均低于葡萄籽中的，因此使葡萄皮中的单宁提取量减少，进而影响RSK、WSK中的总单宁含量。WSD拥有最高含量的总单宁，为57.35mg/g；其次是RSD，总单宁含量为51.80mg/g。 [0173] 1.4.3酿酒单宁抗氧化能力分析 [0174] 通过清除DPPH自由基能力来检测不同酿酒单宁的抗氧化能力，以Trolox当量来表示，结果图6可知，清除DPPH自由基试验中，不同的酿酒单宁之间均存在显著性差异，而RSD的抗氧化能力最强，它的Trolox当量浓度为0.96g/L。其次是WSD和WSK，Trolox当量浓度分别为0.74g/L和0.39g/L。抗氧化能力最弱的是RSK，其Trolox当量浓度为0.16g/L。RSD和WSD抗氧化能力均表现良好。综合四种酿酒单宁抗氧化性能的检测结果，RSD、WSD和WSK在葡萄酒的抗氧化作用上有一定的效果。而RSK经过纯化后，其抗氧化能力较弱，但是生产应用中可将它作为单一组分原花青素纯化物的提取原材料，用以提取抗氧化能力更强的儿茶素与表儿茶素。 [0175] 1.4.4酿酒单宁澄清能力分析 [0176] 对酿酒单宁的澄清能力进行了检测，由图7可知，RSK与WSK之间的澄清能力不存在显著性差异，但是它们分别与RSD与WSD之间均具有显著性差异。其中，RSD的澄清能力最强，其次分别为WSD与WSK，RSK的澄清能力最弱，总单宁含量为34.85mg/L。综合四种酿酒单宁的澄清能力，可以明晰本文制备的四种酿酒单宁在澄清能力上与酿酒商业单宁存在一定差距。本文制备的四款酿酒单宁中，RSD的澄清能力最强，RSK的澄清能力最弱。通过分析可能是本研究提取制备的酿酒单宁在结合蛋白质的能力要弱于酿酒商业单宁，后续可进一步探究优化的方法。 [0177] 3.4.5酿酒单宁小分子分析 [0178] 通过HPLC对不同酿酒单宁进行检测，图8为HPLC对标准品检测的色谱图。由表12发现：四种酿酒单宁的儿茶素浓度在0.86mg/g～6.98mg/g之间，RSK、RSD、WSK、WSD的儿茶素浓度之间均有显著性差异，RSD的儿茶素浓度最大，为5.07mg/g，WSK的儿茶素浓度最小，为0.86mg/g；四种酿酒单宁的没食子酸浓度在1.44～17.03mg/g之间，它们的没食子浓度均存在显著性差异，其中RSD中没食子酸浓度最大，为17.03mg/g，WSK中的没食子酸浓度最小，为 1.44mg/g；RSD中没食子儿茶素浓度最大，为16.63mg/g，RSK中没食子儿茶素浓度最小，为 5.61mg/g；表没食子儿茶素浓度在0.19～0.25mg/g之间，WSK中的表没食子儿茶素浓度最大，为0.25mg/g，葡萄籽中均未检测到该物质；RSD中的对羟基苯甲酸浓度最大，为10.21mg/g，RSK中该物质的浓度最小，为1.16mg/g，WSK中未检测到对羟基苯甲酸；这四种酿酒单宁中，WSK未检出表儿茶素，RSK中表儿茶素浓度最大，为28.22mg/g，WSD中的表儿茶素最小，仅为0.38mg/g；WSK中未检出表没食子儿茶素没食子酸酯，其中RSK中的表没食子儿茶素没食子酸酯浓度最大，为3.53mg/g，WSD中表没食子儿茶素没食子酸酯浓度最小，为1.52mg/g。由此可知，RSD中的小分子单宁各项指标含量较高，WSK小分子单宁含量较低。 [0179] 表12单宁小分子含量分析 [0180] [0181] 注：1“./”表示未检测到相应物质；2.同列数据上角标小写字母表示不同酿酒单宁添加的葡萄酒之间相同指标的显著性差异(沃勒‑邓肯检验，p<0.05)。 [0182] 1.4.6酿酒单宁的组分分析 [0183] 使用UHPLC‑Q‑ToF对不同酿酒单宁进行组分检测，结果如表13所示，四种酿酒单宁表儿茶素没食子酸酯单元含量(％G)之间均具有显著性差异，G单元含量(％G)在1.14％～7.55％之间，葡萄籽提取酿酒单宁该单元亚基含量均高于葡萄皮提取酿酒单宁，其中RSD中该单元亚基含量最高，WSK最低；原花翠素单元含量(％P)在2.43％～22.67％之间，葡萄籽提取酿酒单宁中未检测到P的含量(％P)，儿茶素单元含量(％C)在56.71％～71.78％之间，这与酿酒单宁小分子检测的结果一致，WSD中儿茶素的含量(％C)与RSD、WSK之间不存在显著性差异；表儿茶素单元含量(％EC)在4.78％～34.85％之间，且籽提取酿酒单宁在该单元的亚基含量普遍高于皮提取酿酒单宁；表儿茶素香草酸酯单元含量(％ECV)在0.01％～ 0.08％之间，葡萄皮提取酿酒单宁中未检出表儿茶素香草酸酯单元含量(％ECV)，其中RSD与WSD之间没有显著性差异。综上所示，不同单元含量的高低会引起葡萄酒不同的感官特性，比如较高的没食子酸酰会引起葡萄酒的高涩感，同时可能贡献明显的苦味。 [0184] 表13酿酒单宁各单元组分含量 [0185] 编号 ％G ％P ％C ％EC ％ECVd a c d RSK 1.93±0.21 22.67±0.18 58.57±0.47 14.31±0.55 / a b c a RSD 7.55±0.02 / 70.59±0.16 21.75±0.17 0.08±0.00 e b a e WSK 1.14±0.04 19.94±0.31 71.78±0.19 4.78±0.15 / b ab b a WSD 4.53±0.28 / 71.23±0.22 24.13±0.06 0.07±0.01 [0186] 注：1“./”表示未检测到相应物质；2.同列数据上角标小写字母表示不同酿酒单宁添加的葡萄酒之间相同指标的显著性差异(沃勒‑邓肯检验，p<0.05)。 [0187] 1.4.7酿酒单宁的平均聚合度分析 [0188] 不同酿酒单宁平均聚合度的测定是通过间苯三酚法将高聚体单宁各单元产生酸解，使用高效液相色谱联用仪对每个单元进行定性定量测定。结果如图9所示：RSD与WSD之间不具有显著性差异，但是与其他三种酿酒单宁均存在显著性差异。其中皮提取酿酒单宁平均聚合度均高于籽提取酿酒单宁。其中WSK的平均聚合度最大，为3.46；其次是RSK，它的平均聚合度为2.25。从图中可以发现两款葡萄皮提取酿酒单宁(RSK、WSK)的mDP值均低于5，这可能是本研究酿酒单宁的提取方法提取到了ECG亚基，又或许是在纯化的过程中洗掉了某些延伸单元。有研究表明，平均聚合度越高，涩感就会越强烈。因此，在葡萄酒酿造中葡萄因气候、地理、种植技术等因素造成葡萄酒口感乏味寡淡，可在酒精发酵阶段加入酿酒单宁。 [0189] 由以上实施例可以得出，通过对RSK、RSD、WSK、WSD这四种酿酒单宁检测可知：Folin‑Ciocalteau法测得的总酚含量中，RSD的总酚含量最高，为403.69mg/g；总酚含量检测的另一种方法TPI中，RSD的总酚含量显著高于CT，RSD的总酚含量依旧是最高的，为 345.35mg/g；总单宁含量WSD的值最大，为57.35mg/g；酿酒单宁小分子检测中，CT中的儿茶素浓度最大，为6.98mg/g，其次是RSD，为5.07mg/g；同样CT中的没食子酸浓度是最大的，为 17.71mg/g，WSK中的没食子酸浓度最小，为1.44mg/g；RSD、WSD与CT中的没食子儿茶素之间均不具有显著性，CT中的没食子儿茶素浓度最大，为16.99mg/g；红白葡萄籽中均没有检测到表没食子儿茶素，其中WSK中表没食子儿茶素浓度最高，为0.25mg/g；CT中的对羟基苯甲酸浓度最大，为12.74mg/g，WSK中未检测到对羟基苯甲酸；香草酸在红白葡萄皮中未检出，RSD中香草酸浓度最高，为2.36mg/g；RSK中的表儿茶素浓度最大，为3.53mg/g；RSK中的表没食子儿茶素没食子酸酯浓度最大，为3.14mg/g，CT中的表没食子儿茶素没食子酸酯浓度最小，为1.43mg/g，WSK中未检出。在UHPLC‑Q‑Tof组分检测中，五种酿酒单宁表儿茶素没食子酸酯单元含量(％G)之间均存在显著性差异，其中RSD中表儿茶素没食子酸酯单元含量(％G)最高，为7.55％，WSK最低，为1.14％；RSK中原花翠素单元含量(％P)最高，为22.67％；WSD中C的含量(％C)与RSD、WSK之间不存在显著性差异，WSK中儿茶素单元含量(％C)最高，达到了71.78％；CT中表儿茶素单元含量(％EC)最高，为34.85％；RSD中ECV含量(％ECV)最大，为 0.08％，CT中ECV含量最小，仅为0.01％，葡萄皮提取酿酒单宁(RSK、WSK)中未检出ECV。在平均聚合度检测中，RSK、RSD、WSK、WSD的平均聚合度均显著高于CT，并且葡萄皮提取酿酒单宁的平均聚合度均高于葡萄籽提取酿酒单宁。 [0190] 实施例3 [0191] 酿酒过程添加酿酒单宁对葡萄酒品质的影响研究 [0192] 1.1引言 [0193] 经过第三章的检测，已经明确了本发明实施例1制备的四款外源酿酒单宁与进口酿酒单宁的总酚总单宁含量，以及抗氧化性和澄清能力。但在实际生产中不同酿酒单宁对葡萄酒的颜色、浊度、氧化还原电位及涩感的影响尚不明晰，考虑到外源酿酒单宁与进口酿酒单宁在实际生产中之间的优缺未知，故本实施例以贺兰山东麓葡萄酒产区红寺堡产区西夏王酒庄的赤霞珠红色酿酒葡萄作为酿酒原料，进行不同酿酒单宁添加的酿酒试验，通过常规的酿造工艺，于玻璃罐中酿了葡萄酒，并在酒精发酵中期添加本发明实施例1制备的四款外源酿酒单宁、进口酿酒单宁以及单宁酸，通过颜色分析、浊度、氧化还原电位及涩感评价进行不同添加葡萄酒对比，以期通过研究，明确外源酿酒单宁、进口酿酒单宁及单宁酸对葡萄酒的不同作用。 [0194] 1.2试验材料、药品与仪器 [0195] 1.2.1试验材料 [0196] 葡萄原料：实验材料采摘自宁夏贺兰山东麓某酒庄，选择赤霞珠(东经105°～106°，北纬37°～39°)作为酿酒原料，树龄均为3年，采摘时间为2022年9月30日。采摘时葡萄外观良好，成熟度中等，穗型标准且无病，采摘70kg。 [0197] 酿酒单宁：分为两类，一类是本发明实施例1制备所得的外源酿酒单宁，分别是RSK、RSD、WSK、WSD；未添加(CK)作为参考对照。 [0198] 1.2.2试验药品 [0199] 试剂及标准品同实施例2中的1.2.1.2。 [0200] 酿酒辅料如表14所示。 [0201] 表14酿酒辅料型号与厂家 [0202] [0203] 1.2.3试验仪器 [0204] 本实施例所使用的主要实验仪器如表15所示 [0205] 表15实验仪器与厂家 [0206] [0207] [0208] 1.3试验方法 [0209] 1.3.1葡萄酒的酿造 [0210] 采摘好的葡萄进行人工除梗、手动破碎，除梗破碎完成的葡萄醪中均匀的加入60mg/L偏重亚硫酸钾(用10倍蒸馏水溶解，一边搅拌一边加入)，40mg/L果胶酶(葡萄破碎1小时左右后加入用10倍蒸馏水溶解的果胶酶)。将葡萄醪平均分为14份，均转移到5L玻璃广口瓶中(入罐80％)。向每个5L玻璃广口瓶接入0.25g/L的酿酒酵母，酵母溶于10倍37‑38℃的蒸馏水中活化30min，使用等体积葡萄汁适应后，当温度和葡萄醪温度相差在10℃之内，全都接入葡萄醪中，用高1m，底部圆盘直径5cm(罐直径20cm)进行一次压帽，压帽2min。酒精发酵过程中，瓶口覆盖8层医用纱布，酒精发酵温度26‑28℃，每日8点和21点分别检测葡萄酒的比重和温度并做好记录。并且对葡萄醪进行压帽及搅拌，每日8点，12点半，21点半进行三次压帽，每次压3下；每日8点，21点半进行2次搅拌，每次搅5圈。检测到葡萄汁比重降为 1.05时，向每瓶加入1.8g的不同种类的酿酒单宁(用10倍的蒸馏水溶解)，每种酿酒单宁2个重复。葡萄汁液比重降到0.996，说明酒精发酵结束，然后进行皮渣分离(手动纱布过滤压榨分离)，总共14份。不进行苹乳接入含量为80mg/L的偏重亚硫酸钾以结束发酵进程。然后装入2L加州瓶中，共14瓶，做好标记。陈酿3个月后进行分析检测和涩感评价。 [0211] 1.3.2葡萄酒基本理化指标的测定 [0212] 参照GB/T15038‑2006《葡萄酒果酒分析方法》等的检测方法，对葡萄酒的酒精度进行检测，使用葡萄酒全自动分析仪对葡萄酒的总糖、总酸、总硫、游离硫、挥发酸进行检测，葡萄酒的pH使用pH计进行检测，葡萄酒的酒精度使用密度瓶法进行测定。 [0213] 1.3.3CIE Lab法测定葡萄酒的颜色 [0214] 参照OIV方法，将待测葡萄酒样品经过水系微孔滤膜(0.45μm)过滤，之后装入1mm石英比色皿，在380～780nmUV‑visible谱段连续扫描，扫描间隔1nm，蒸馏水为空白，每个酒样3个重复。计算选用OIV给定的方法，根据光谱值找出380～780nm处的吸光值，CIE Lab参数计算选用10°观察者视场，D65标准白光源。将吸收光谱中450、520、570、630nm波长处的吸光度校正到1cm光程后，参数L*、a*与b*计算公式为式(1)—(8)： [0215] L*＝116(Y/Yn)1/3－16式中Y/Yn＞0.008856 [0216] (1) [0217] L*＝903.3(Y/Yn)式中Y/Yn≤0.008856 [0218] (2) [0219] a*＝500[f(X/Xn)－f(Y/Yn)] [0220] (3) [0221] b*＝200[f(Y/Yn)－f(Z/Zn)] [0222] (4) [0223] 其中X＝19.717T450+1.884T520+42.539T570+32.474T630‑1.841 [0224] (5) [0225] Y＝7.950T450+34.764T520+42.736T570+15.759T630‑1.180 [0226] (6) [0227] Z＝103.518T450+4.190T520+0.251T570‑1.831T630+0.818 [0228] (7) [0229] Ti＝10‑Ai(i＝450、520、570、630) [0230] (8) [0231] 式中Ai—吸光度、Ti—透光率、XYZ—样品三刺激值。 [0232] 1.3.4葡萄酒色度与色调的测定 [0233] 使用TU‑1901型紫外分光光度计测定葡萄酒的色度及色调。分别取14罐葡萄酒2mL，用针管过0.45μm的滤膜对葡萄酒样进行过滤，打入10mm比色杯中，通过紫外分光光度计测定酒样在420nm、520nm及620nm下的吸光值，并将A420nm、A520nm、A620nm处的吸光值相加并乘以10作为该酒样的色度值。A420nm下的吸光值与A520nm下的吸光值得比值作为该葡萄酒的色调值，平行测定3次。 [0234] 1.3.5葡萄酒浊度的测定 [0235] 浊度的测定使用哈希浊度仪2100Q，整个测量过程均在15‑25℃之间进行，将浊度仪进行校准后，取15mL酒样加到试样容器中，手拿试样容器顶部，盖上容器盖。用一块不起毛的软布擦拭试样容器，将水点和手指印擦掉。涂抹一薄层硅油，用一块软布进行擦拭，以便在整个表面上形成一层均匀薄膜。按下电源键开启仪表，将仪器放在一个平坦、稳定的表面上。轻轻倒置试样容器，然后将试样容器插入仪器的容器室内，菱形或定向标记与容器室前面凸起的定向标记对齐，关上盖子。读取结果并记录，平行测定3次。 [0236] 1.3.6葡萄酒氧化还原电位的测定 [0237] 氧化还原电位的测定：采用氧化还原电位仪ORP复合电极测定ORP值，测定温度控制在20.0℃±1.0。在测定前对电位仪矫正，使ORP值保持在正确范围，测定时将探头伸入酒样中测量。从每个液面相同位点共测3次。 [0238] 1.3.7葡萄酒涩感的评价 [0239] 酒样涩感评价方法是感官评价法，通过专门训练有品酒经验的人员对酒样的涩感进行品尝并且做出评价。训练方法通过辨别涩感强度和质量的能力。结果通过感官评分和描述性分析法来表示。 [0240] (1)涩感的培训 [0241] 培训地点：宁夏大学科技楼品鉴室；培训时间：1.5小时/阶段；培训人数：10位，均为有品鉴经验的研究生，分别是6位女生，4位男生。 [0242] 培训分为二个阶段。第一阶段分别使用3g/L、0.3g/L的外源酿酒单宁、3g/L、0.3g/L的葡萄皮单宁、3g/L、0.3g/L的葡萄籽单宁来辨别涩感强度，并进行三角品尝。第二阶段分别使用不同目数的砂纸(60、100、180、320、600、1200、2000、4000、20000)进行涩感质量的培训，并盲品2款葡萄酒进行打分。 [0243] (2)实验打分表的设计 [0244] 根据实验要求设计相应的实验表格。做出相应的评分标准，针对涩感的培训、酒样的品尝以打分的形式记录。表16是葡萄酒涩感强度打分表，酒样编号是随机生成三位数数字，如下所示；图10是结合涩感触摸板为当前葡萄酒涩感质量，酒样编号是随机生成三位数数字，如下所示： [0245] 表16葡萄酒样涩感强度打分表 [0246] [0247] 注：0‑未感知到该类涩感；10‑该类涩感感知极强。(0→10：涩感依次递增)[0248] (3)酒样涩感强度及涩感质量评价 [0249] 七种酒样分别是四种外源酿酒单宁(RSK、RSD、WSK、WSD)、单宁酸。品尝分为六组进行(每款酒样二个重复)，每组品尝准备七个杯子，杯子采取随机编号。酒样编号为红葡萄皮单宁添加(675、520)、红葡萄籽单宁添加(584、199)、白葡萄皮单宁添加(924、144)、白葡萄籽单宁添加(927、132)、未添加(447、706)，每次品尝休息十分钟，组员用水漱口，并吃一块无盐饼干，以保证品尝结果的精准性。涩感强度及质量按每个人的最高或最低标准化：1＝一点都不涩，2＝刚能感觉到涩，3＝略微涩，4＝涩，5＝很涩，6＝非常涩，7＝极为涩；涩感质量评分标准：9＝20000目砂纸，8＝4000目砂纸，7＝2000目砂纸，6＝1200目砂纸，5＝600目砂纸，4＝320目砂纸，3＝180目砂纸，2＝100目砂纸，1＝60目砂纸。 [0250] 1.4结果分析与讨论 [0251] 1.4.1葡萄酒基本理化指标分析 [0252] 对每罐葡萄酒进行了不同基本理化指标的测定，主要包括总糖、总酸、总硫、酒精度、挥发酸、游离硫以及pH。依据国家GB15038‑2006《葡萄酒果酒分析方法》，结果如表17所示：14罐葡萄酒的总糖在0.57～0.71g/L之间，表明14罐葡萄酒发酵彻底；总酸在5.65～6.15g/L范围内，符合国家限量标准；总硫数值为31.5～43.5mg/L之间，符合国家限量标准(干型≤200mg/L)；酒精度值在12.62～15.02％之间，符合国家限量标准(≥7％)，且互相之间均存在显著性差异；挥发酸数值分布于0.08～0.12g/L之间，符合国家限量标准(≤1.2g/L)；游离硫在12.5～16.5mg/L之间，符合国家限量标准(≤50mg/L)；pH值在3.82～3.94之间，符合国家限量标准(≤4.5，≥2.5)；总体来看，本试验的14灌葡萄酒质量指标均符合葡萄酒相关国家标准。并且酿酒单宁添加的葡萄酒总硫显著低于未添加酿酒单宁的葡萄酒。 [0253] 表17葡萄酒基本理化指标分析 [0254] [0255] 注：同列数据上角标小写字母表示不同酿酒单宁添加的葡萄酒之间相同指标的显著性差异(沃勒‑邓肯检验，p<0.05)。 [0256] 1.4.2葡萄酒的颜色分析 [0257] 通过CIE Lab法对酒样的检测结果如表18所示。酒样L*值在60.36～67.49之间，酒样整体明度较高，酒体光泽较好。酒样间明度差异不显著，罐号WSK的明度值最高，颜色最*亮，为67.49；罐号WSD的明度值最低，颜色最暗，为60.36；不同处理的酒样红/绿色彩通道a值在32.67～38.12之间，表明酒体颜色中红色分量均较大。罐号WSK和WSD之间具有显著性* * 差异，其中罐号WSD的a值最大，为38.12，WSK最小，为32.67；酒样的黄/蓝色彩通道b在6.86～13.52之间，表明酒体颜色中的黄色分量较大，罐号RSK与WSD之间存在显著性差异，其中* * b值最大的是罐号WSD，最小的是RSK；色调Hab值在2.78～5.31之间，表明酒样整体呈现紫红或宝石红，酒样较新。罐号RSK与RSD、WSK、WSD、CT之间均具有显著性差异，其中罐号RSK的* * Hab值最大，WSD最小，分别为5.31和2.78。由此可知，CT、WSK、RSK对葡萄酒的a值贡献较为明显，RSK抑制葡萄酒黄化程度较为突出，WSD对酒样色调的提升较为明显。字母标记与显著性分析同表17。 [0258] 表18葡萄酒CIE Lab参数 [0259] 罐号 L* a* b* H*ab/(°)a ab b a RSK 63.45±1.89 36.44±0.86 6.86±0.76 5.31±0.47 a ab ab b RSD 65.48±1.67 34.10±0.25 10.72±0.64 3.08±0.17 a b ab b WSK 67.49±3.28 32.67±1.26 9.99±1.76 3.25±0.48 a a a b WSD 60.36±0.64 38.12±0.08 13.52±2.25 2.78±0.51 a ab ab ab CK 67.14±3.01 34.37±2.53 8.58±0.54 3.92±0.04 [0260] 1.4.3葡萄酒色度与色调分析 [0261] 对不同酿酒单宁添加的葡萄酒进行了颜色分析，色度与色调是评价葡萄酒颜色质量的重要标准。由图11可知，罐号WSD与CK具有显著性差异，不同酿酒单宁添加的葡萄酒色度值在11.53～15.87之间，色度值相差不大，它们之间均不具有显著性差异，可能是因为酿造的葡萄酒太新，没有足够的时间显现出差异，后续陈酿三个月再进行检测分析。色度值大小依次是WSD＞RSK＞RSD＞WSK＞CK。罐号WSD的色度值最大，为15.87，罐号CK的色度值最小，为11.53。其中罐号RSK、CT、RSD、TA、WSK的色度值分别为15.27、14.25、13.55、13.52、12.79。由于葡萄酒酿造过程中酒中的酚类物质相互结合，形成呈色强而稳定的化合物，因此WSD、RSK在增加葡萄酒色度的能力要强于CT，而在酿酒过程中添加了酿酒单宁的葡萄酒色度值普遍高于未添加酿酒单宁的葡萄酒，表明酿酒单宁对葡萄酒的色度具有保护和提升作用。 [0262] 由图12可知，不同酿酒单宁添加的葡萄酒色调值只有罐号为WSD与TA之间具有显著性差异。其中WSD罐号的葡萄酒色调值依旧是最高的，为0.61；其次依次是WSK、RSD、CT、RSK、CK、TA。而TA的纯度达到了98％，但是TA添加的葡萄酒色调值确是最低的，为0.56。由此可以看出：葡萄酒的色调值不单独受到酿酒单宁纯度的影响，与葡萄酒酿造的葡萄品种、存放时间及工艺等因素共同协调色调值的大小，并且其他酿酒单宁添加均无显著性差异，原因可能是酿造的葡萄酒是新酒，在外观上面没有显著差异，后续陈酿数月再进行色度和色调的检测。 [0263] 1.4.4葡萄酒浊度分析 [0264] 通过对不同酿酒单宁添加的葡萄酒浊度进行检测，结果如图13所示：罐号RSD、WSD、CT分别与罐号WSK、TA均存在显著性差异。罐号WSD葡萄酒的浊度最大，为12.25 NTU；罐号WSK葡萄酒的浊度最小，仅为5.99 NTU；罐号TA葡萄酒的浊度也比较低，为6.11 NTU；由此可知，WSK与TA添加的葡萄酒表现出更强的澄清能力，而RSK、RSD、WSD、CT添加的葡萄酒浊度反而比未添加酿酒单宁的浊度更大，尚不明确造成此情况的原因是什么，需进一步的进行探究。 [0265] 1.4.5葡萄酒氧化还原电位分析 [0266] 对14罐不同酿酒单宁添加的葡萄酒进行氧化还原电位的测定，结果由图14可知，罐号RSK、WSK、CT、TA之间具有显著性差异，罐号RSD与WSD、TA之间存在显著性差异。罐号WSK葡萄酒的ORP值是最高的，其ORP值为179.5 mv；罐号TA葡萄酒的ORP值最低，为153.0 mv。由此可知，TA、WSD可显著抑制葡萄酒的氧化还原程度，有助于葡萄酒的保存和质量。CT、RSK、RSD、WSK添加的葡萄酒与未添加酿酒单宁的葡萄酒相比，没有起到抑制氧化还原程度的作用。在实际生产中，若需要考虑到葡萄酒的抗氧化和长期保存，可添加WSD酿酒单宁。 [0267] 1.4.6葡萄酒涩感评价 [0268] 招募了10位品尝员并进行涩感强度与质量的培训，达到涩感品鉴的要求以后。对不同酿酒单宁添加的葡萄酒涩感强度、涩感质量进行打分，结果如图15所示：14个酒样的涩感强度在2.0‑9.0分之间，罐号RSK、RSD、WSK、WSD、CT、TA之间不存在显著性差异，罐号CK与5种酿酒单宁添加的葡萄酒均具有显著性差异。其中罐号WSD葡萄酒的涩感是最强的，涩感强度平均值为6.10分，其次依次是罐号RSD、WSK、RSK、CT、TA，罐号CK葡萄酒的涩感强度是最弱的，涩感强度平均值仅为3.25分。由此可知，葡萄籽提取酿酒单宁添加的葡萄酒涩感强度普遍高于葡萄皮提取酿酒单宁添加的葡萄酒。因此，对于口感寡淡，葡萄原料差的葡萄酒，可用这四种酿酒单宁来提升口感及结构感。 [0269] 通过培训的10位品尝员对这14个酒样的涩感质量进行了品鉴，触摸的目数表示涩感的质量。结果由图16所示：罐号RSD与CK具有显著性差异，其中罐号CK葡萄酒涩感质量最高，涩感质量平均目数为1200目，其次是罐号WSK、RSK、CT、WSD，罐号RSD的涩感质量最差，平均目数为320目。由此表明，涩感强度越高，涩感质量越差，葡萄皮提取酿酒单宁添加的葡萄酒在涩感质量中体现出比葡萄籽提取酿酒单宁添加的葡萄酒更大的优势。在实际生产中，将这四款酿酒单宁配合使用可发挥出它们最大的作用。 [0270] 1.4.7酿酒单宁添加工艺葡萄酒品质综合评价 [0271] 最后对不同酿酒单宁添加的葡萄酒色度及色调、浊度、氧化还原电位、涩感质量、涩感强度进行综合评价，由图17可知，罐号WSD葡萄酒的色度及色调、氧化还原电位、涩感质量、涩感强度中均表现出良好的效果，均优于罐号CT，但是浊度也是最大的；罐号RSK葡萄酒的色度及色调、涩感强度均强于罐号CT，涩感质量与CT相当；罐号RSD葡萄酒的涩感强度优于CT，其他作用差异不显著；罐号WSK葡萄酒的涩感质量、涩感强度、浊度、氧化还原电位均强于罐号CT；罐号TA涩感质量、浊度均由于CT，对葡萄酒的作用一般；而罐号CK在涩感质量及浊度优于罐号CT，其他对葡萄酒的作用是最低的。综上所示，添加酿酒单宁的葡萄酒在色度及色调、氧化还原电位、涩感质量、涩感强度均优于未添加酿酒单宁的葡萄酒。但是添加酿酒单宁的葡萄酒浊度反而比未添加酿酒单宁的葡萄酒大，造成此种原因尚不清楚，可能是浊度检测时间太早，未在陈酿时期检测造成，酿酒单宁与蛋白质的结合物未来得及沉淀，因此悬浮在葡萄酒中，导致添加了酿酒单宁的葡萄酒浊度反而高于未添加的葡萄酒。 [0272] 通过不同酿酒单宁添加工艺葡萄酒品质评价可知：罐号RSK、RSD、WSK、WSD的色度与罐号CK、TA均不具有显著性差异，罐号WSD的色度值最大，为15.87，罐号CK的色度值最小，为11.53；罐号RSK、RSD、WSK、WSD的色调与CT不存在显著性差异，罐号WSD的色调显著高于TA，罐号TA的色调最低，为0.56；浊度检测中，罐号RSK、RSD、WSD的色调与CT不存在显著性差异，罐号WSK的浊度显著低于CT，并与罐号TA没有显著性差异，罐号WSK的浊度最低，仅为5.99NTU；在氧化还原电位检测中，罐号WSD的ORP值显著低于CT，罐号RSD与CT不具有显著性差异，罐号TA的ORP值最低，为153.0mv；在涩感评价中，添加了酿酒单宁的葡萄酒涩感强度均显著高于未添加酿酒单宁的葡萄酒，罐号WSD的涩感强度最强，平均分值为6.10分，罐号CK最弱，为3.25分。五款酿酒单宁添加的葡萄酒涩感质量之间不具有显著性差异，罐号RSD的涩感质量显著低于未添加酿酒单宁的葡萄酒涩感质量，平均目数为320目，罐号CK的涩感质量最高，平均目数为1200目。 [0273] 由以上实施例可以得出： [0274] (1)本研究通过煎煮法从红白葡萄酒皮渣中提取酿酒单宁，提取工艺为：选择超纯水作为提取溶液、提取温度为100℃、料液比为1：40、提取时间为1.5h，红白葡萄皮提取单宁进一步纯化，最后得到四种酿酒单宁，分别是红葡萄皮提取单宁(RSK)，制备得率为5.12％、红葡萄籽提取单宁(RSD)，制备得率为10.88％、白葡萄皮提取单宁(WSK)，制备得率为2.28％、白葡萄籽单宁(WSD)，制备得率为12.72％。 [0275] (2)通过对五款酿酒单宁检测可知：Folin‑Ciocalteau法测得的总酚含量中，RSD的总酚含量最高，为403.69mg/g，RSK中的总酚含量最少，为101.23mg/g；TPI法测得的总酚含量中，RSD的总酚含量显著高于CT，其中RSD的总酚含量最高，为345.35mg/g，RSK中的总酚含量最少，为156.59mg/g；总单宁含量检测中RSD、WSD显著高于CT，WSK与CT不具有显著性差异，WSD中的总单宁含量最高，为57.35mg/g；抗氧化能力检测中，CT的抗氧化能力最强，其Trolox当量为1.94g/L，RSK的抗氧化能力最弱，其Trolox当量为0.16g/L；在澄清能力检测中，CT的澄清能力最强，其总单宁为264.38mg/L；在酿酒单宁小分子检测中，CT中儿茶素、没食子酸、没食子儿茶素、对羟基苯甲酸浓度均是最高的，分别为55.86mg/g、141.64mg/g、135.95mg/g、101.94mg/g，WSK中的表没食子儿茶素最大，为1.96mg/g，RSK中的表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯浓度均最大，分别为28.22mg/g、25.09mg/g。在平均聚合度检测中，RSK、RSD、WSK、WSD的平均聚合度均显著高于CT。 [0276] (3)通过对不同酿酒单宁添加葡萄酒的各项指标检测发现：酿酒单宁可显著降低葡萄酒中的总硫含量；罐号RSK、RSD、WSK、WSD的色度与罐号CK、TA均不具有显著性差异，罐号WSD的色度最大，为15.87，罐号CK葡萄酒的色度最低，为11.53；罐号RSK、RSD、WSK、WSD的色调与CT不存在显著性差异，罐号WSD的色度显著高于TA，TA的色调值为0.56；浊度检测中，罐号RSK、RSD、WSD的色调与CT不存在显著性差异，罐号WSK的浊度显著低于CT，并与罐号TA没有显著性差异，WSK的浊度为5.99NTU；在氧化还原电位检测中，罐号WSD的ORP值显著低于CT，罐号RSD与CT不具有显著性差异，罐号TA的ORP值最低，为153.0mv；在涩感评价中，添加了酿酒单宁的葡萄酒涩感强度均显著高于未添加酿酒单宁的葡萄酒，五款酿酒单宁添加的葡萄酒涩感质量之间不具有显著性差异，其中罐号WSD的涩感强度平均分最高，为6.10分；罐号RSD的涩感质量显著低于未添加酿酒单宁的葡萄酒涩感质量，其涩感质量平均目数为 320目，罐号CK的涩感质量最高，平均目数为1200目。 [0277] 尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。 |
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