新的免疫效应化合物

本发明的领域

本发明一般涉及免疫效应化合物，其在药物组合物中的用途，和用 于其生产的方法和其在预防和/或治疗性接种中的应用。更尤其，本发明 涉及包含以糖苷键连接到环状氨基烷基(糖苷配基)基团上的2-脱氧-2- 氨基-β-D-吡喃葡萄糖(葡糖胺)的新型化合物，和其在药物佐剂体系中 的用途。

本发明的背景

体液免疫和细胞介导的免疫是哺乳动物免疫反应的两个主要分支。 体液免疫包括生成相对外来抗原的抗体。抗体由B-淋巴细胞产生。以细 胞为媒介的免疫包括活化T-淋巴细胞，后者对载有外来抗原的受感染细 胞起作用或激发其它细胞对受感染细胞起作用。哺乳动物免疫系统的这 两个分支对于战胜疾病是重要的。体液免疫是针对细菌性病原体的主要 防线。在病毒疾病的情况下，细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)的诱导作用似乎 对于保护性免疫是决定性的。因此，有效的疫苗优选刺激免疫系统的这 两个分支以预防疾病。

疫苗使来自致病剂的外来抗原呈递给宿主，这样宿主可产生保护免 疫反应。通常，疫苗抗原是引起疾病的微生物的灭活或减毒形式。这些 灭活或者减毒疫苗中非必要组分和抗原的存在已促进更加努力地改进 疫苗组分，包括使用化学和重组技术开发非常明确的合成抗原。但微生 物疫苗的改进和简单化已导致效力的相应损失。尽管缺少可能有害的污 染物，但低分子量合成抗原本身通常不是充分免疫原性的。这些观察结 果已引导研究人员将称作佐剂的免疫系统刺激物加到疫苗组合物中以 加强疫苗组分的活性。

免疫佐剂是在向个体给药或体外试验时在被供给抗原的主体中增 加对抗原的免疫反应，或增加免疫系统的细胞的某些活性。许多具有不 同程度佐剂活性的化合物已被制备和试验(参见，例如，Shimizu等人 1985，Bulusu等人1992，Ikeda等人1993，Shimizu等人1994，Shimizu等人 1995，Miyajima等人1996)。但这些和其它先有佐剂体系通常具有毒性， 不稳定和/或具有不可接受的低免疫刺激性作用。

目前，在美国唯一许可用于人的佐剂是明矾，即其中配制疫苗抗原 的一组铝盐(如，氢氧化铝，磷酸铝)。颗粒载体如明矾据报道促进巨噬细 胞对可溶性抗原的吸收，处理和呈递。但明矾并非没有副作用，并且遗憾 地被限于仅体液(抗体)免疫。

有效佐剂体系的发现和研制对于提高现有和未来疫苗的效力和安 全是必要的。因此，不断需要新的和改进的佐剂体系，尤其能够激励免疫 系统的这两个效应分支的那些，以更好地促进下一代合成疫苗的研制。 本发明实现了这些和其它的需求。

本发明的综述

本发明化合物是能够增强对疫苗抗原的体液和细胞介导的免疫反 应的免疫效应分子(immunoeffector molecules)。该化合物一般可被 描述为属于环状AGP化合物种类，其中AGP表示氨基烷基氨基葡糖苷磷酸 酯。术语″环状AGP″是指氮杂环烷基或(氮杂环烷基)烷基氨基葡糖苷磷 酸酯，其中2-脱氧-2-氨基-b-D-吡喃葡萄糖(葡糖胺)被以糖苷键连接到 氮杂环烷基或(氮杂环烷基)烷基(糖苷配基)基团上。

本发明的化合物包含以糖苷键连接到环状氨基烷基(糖苷配基)基 团上的2-脱氧-2-氨基-β-D-吡喃葡萄糖(葡糖胺)。该化合物在葡糖胺 环的4或6-位上被磷酸化和在糖苷配基氮和葡糖胺环的2和3-位上被烷 酰基氧基十四酰基残基酰化。本发明化合物一般表示为结构式(I)：

和其药物可接受盐，其中X是-O-或-NH-和Y是-O-或-S-；R1，R2，和R3 分别独立地为(C9-C14)酰基基团，包括饱和，不饱和和支化的酰基基团；R4 是-H或-PO3R7R8，其中R7和R8分别独立地为H或(C1-C4)脂族基团；R5是 -H，-CH3或-PO3R9R10，其中R9和R10分别独立地选自-H和(C1-C4)脂族基团；R6 独立地选自H，OH，(C1-C4)氧基脂族基 团，-PO3R11R12，-OPO3R11R12，-SO3R11，-OSO3R11，-NR11R12，-SR11，-CN，-NO2，-CHO， -CO2R11，和-CONR11R12，其中R11和R12分别独立地选自H和(C1-C4)脂族基团； 前提是R4和R5之一是含磷的基团且如果R4是-PO3R7R8，则R5不是-PO3R9R10， 其中″*1-3″和″**″表示手性中心；

其中n，m，p和q分别独立地是整数0-6，前提是p和m的总和是0-6。

在本发明化合物的某些实施方案中，X和Y分别为氧，R4是PO3R7R8，R5 和R6是H，和n，m，p，和q是整数0-3。在更优选的实施方案中，R7和R8是-H。 在甚至更优选的实施方案中，n是1，m是2，且下标p和q是0。在甚至更优选 的实施方案中，R1，R2，和R3是C9-C13酰基基团，最优选C10-C12酰基基团。在进 一步更优选的实施方案中，*1-3是R构型，Y处于平伏位置，和**是S构型。尤 其优选的是(N-[(R)-3-十四酰基氧基十四酰基]-(S)-2-吡咯烷基甲基 2-脱氧-4-O-膦酰基-2-[(R)-3-十四酰基氧基十四酰基氨 基]-3-O-[(R)-3-十四酰基氧基十四酰基]-β-D-吡喃葡萄糖苷，结构式 (II)，

(N-[(R)-3-十二酰基氧基十四酰基]-(S)-2-吡咯烷基甲基2-脱氧 -4-O-膦酰基-2-[(R)-3-十二酰基氧基十四酰基氨基]-3-O-[(R)-3-十 二酰基氧基十四酰基]-β-D-吡喃葡萄糖苷，结构式(III)，

和(N-[(R)-3-癸酰基氧基十四酰基]-(S)-2-吡咯烷基甲基2-脱氧 -4-O-膦酰基-2-[(R)-3-癸酰基氧基十四酰基氨基]-3-O-[(R)-3-癸酰 基氧基十四酰基]-β-D-吡喃葡萄糖苷，结构式(IV)，

和其药物可接受盐。

本发明还提供包含具有以上通式和特定结构式的化合物的药物组 合物。该药物组合物可与各种抗原在本领域熟练技术人员已知的各种配 方中结合。

本发明化合物还可用于诱导主体的免疫反应的方法中。该方法要求 向主体供给治疗有效量的一种或多种本发明化合物，优选为还包含药物 可接受载体的药物组合物。

本发明还包括治疗患有病原性感染，癌或自身免疫疾病或对此易感 的哺乳动物的方法。该方法要求向该哺乳动物供给治疗有效量的一种或 多种本发明化合物，优选为还包含药物可接受载体的药物组合物。

更进一步，本发明包括一种用于在主体中治疗通过产生一氧化氮而 改善的疾病或病症的方法。该方法要求使该主体与有效量的一种或多种 本发明化合物，或与有效量的包含一种或多种本发明化合物和药物可接 受载体的组合物接触。在一些实施方案中，本发明化合物可在缺血之前 48小时，不超过缺血，和缺血过程中给药。

本发明的详细描述

定义

术语″酰基″是指通过去除酸的羟基部分而衍生自有机酸的那些基 团。因此，酰基意味着包括，例如，乙酰基，丙酰基，丁酰基，癸酰基，和新 戊酰。例如，″(C9-C14)酰基″，是指具有9-14碳的酰基基团。

除非另有说明，术语″脂族″本身或作为另一取代基的一部分是指直 或支化链，或环状，烃部分，包括包含环状和链成分两者的部分，它可以 是完全饱和或单-或多不饱和的，具有规定的碳原子数(即C1-C4是指1-4 个碳)。饱和烃基团的例子包括基团如甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁 基，叔丁基，异丁基，仲-丁基，环丙基，环丙基甲基，亚甲基，亚乙基，和正 亚丁基。不饱和烷基基团是具有一个或多个双键和/或三键的基团。不 饱和脂族基团的例子包括乙烯基，2-丙烯基，巴豆基，-2-(丁二烯基)，1- 丙炔基和3-丙炔基。

术语″氧基脂族″是指具有通过氧原子连接到分子的其余部分上的 脂族基团的那些基团。

以上术语(如，″烷基″，″酰基″)分别意味着包括所指部分的取代的 和未取代的形式两者。

用于脂族基团的取代基可以是各种基团，选 自：-OR′，＝O，＝S，＝NR′，＝N-OR′，-NR′R″，-SR′，-卤素，-SiR′R″R， -OC(O)R′，-C(O)R′，-CO2R′，-CONR′R″，-OC(O)NR′R″，-NR″C(O)R′， -NR′-C(O)NR″R，-NR″C(O)2R′，-NH-C(NH2)＝NH，-NR′C(NH2)＝NH，-NH-C(NH2)＝NR′，-S(O)R′，-S(O)2R′，-S(O)2NR′R″，-CN和-NO2，数目为零至(2m′+1)，其 中m′是这些基团中的碳原子的总数。R′，R″和R分别独立地是指氢和未 取代的(C1-C4)脂族基团。根据以上对取代基的讨论，本领域熟练技术人 员可以理解，术语″烷基″意味着包括卤代烷基(如，-CF3和-CH2CF3)之类 的基团和类似物。

除非另有说明，术语″卤代″或″卤素″本身或作为另一取代基的一部 分是指氟，氯，溴，或碘原子。在具有多个卤素取代基的化合物中，卤素可 以是相同或不同的。

术语″药物可接受盐″意味着包括使用相对非毒性酸或碱制备的活 性化合物的盐，这取决于本文所述化合物上的特定取代基。如果本发明 化合物包含相对酸性的官能度，碱加成盐可通过纯净地或在合适的惰性 溶剂中加入所需碱而得到。药物可接受的碱加成盐的例子包括钠，钾，钙， 铵，有机氨基，或镁盐，或类似盐。如果本发明化合物包含相对碱性的官 能度，酸加成盐可通过纯净地或在合适的惰性溶剂中加入所需酸而得 到。药物可接受的酸加成盐的例子包括衍生自无机酸如氢氯酸，氢溴酸， 硝酸，碳酸，单氢碳酸，磷酸，单氢磷酸，二氢磷酸，硫酸，单氢硫酸，氢碘 酸，或亚磷酸和类似物的那些，以及衍生自相对非毒性有机酸如乙酸，丙 酸，异丁酸，草酸，马来酸，丙二酸，苯甲酸，琥珀酸，辛二酸，富马酸，扁桃 酸，邻苯二甲酸，苯磺酸，p-甲苯基磺酸，柠檬酸，酒石酸，甲烷磺酸，和类 似物的盐。还包括氨基酸的盐如精氨酸盐和类似物，和有机酸如葡萄糖 醛酸或半乳糖醛酸的盐和类似物(参见，例如，Berge，S.M.，等人，″药物 盐″，药物科学杂志，1977，66，1-19)。本发明某些特定化合物包含碱性和 酸性官能度两者，使得该化合物能够转化成碱或酸加成盐。

这些化合物的中性形式可通过使该盐与碱或酸接触和以常规方式 分离母化合物而再生。就本发明而言，化合物的母型在某些物理性能，如 在极性溶剂中的溶解度方面不同于各种盐形式，但在其它方面这些盐等 同于化合物的母型。

除了盐形式，本发明提供前药形式的化合物。本文所述化合物的前 药是在生理条件下容易经历化学改变以提供本发明化合物的那些化合 物。另外，前药可通过化学或生化方法在离体环境中转化成本发明化合 物。例如，前药在与合适的酶或化学试剂放入透皮贴储器中时慢慢转化 成本发明化合物。

本发明某些化合物可以未溶剂化形式以及溶剂化形式(包括水合形 式)存在。一般来说，溶剂化形式等同于未溶剂化形式和被确定为包括在 本发明范围内。本发明化合物某些可以多个结晶或无定形形式存在。一 般来说，所有的物理形式对于本发明所涉及的用途是等同的且被包括在 本发明范围内。

本发明某些化合物具有非对称的碳原子(光学中心)或双键；外消旋 物，非对映体，几何异构体和单个异构体都被包括在本发明范围内。

本发明化合物也可在构成这些化合物的一个或多个原子上包含异 常比例的原子同位素。例如，化合物可被放射性同位素，例如氚(3H)，碘 -125(125I)或碳-14(14C)进行放射性标记。本发明化合物的所有的同位素 变型无论是否具有放射性都被包括在本发明范围内。

介绍

为了提高疫苗的安全性，制造商正在避免全细胞灭活疫苗，和生产 重组体或亚单位疫苗。在制备这些较安全的疫苗时，额外细菌或病毒组 分被消除，同时留下被认为为保护性免疫所需的最小结构或抗原表位。 这些疫苗的安全由于消除了通常被证明是毒性和致热的额外细菌或病 毒组分而得到改进。但导致毒性的相同组分提供非特异性免疫刺激，使 得全细胞疫苗非常有效。如果没有额外的免疫刺激，包含最小结构和抗 原表位的重组体和亚单位疫苗通常具有不好的免疫原性。

衍生自Salmonella minnesota R595的LPS的一种二糖分子，MPL免 疫刺激剂(Corixa Corp.)具有免疫刺激性能。MPL免疫刺激剂，单磷酰 基脂类A，是脂类A(或LPS)的一种结构衍生物和相对脂类A具有改进的治 疗指数(参见U.S.专利4,987,237的单磷酰基脂类A的结构；U.S.专利 Nos.4,436,727和4,436,728，其中描述单磷酰基脂类A的制备)。其它有 用的免疫刺激剂包括描述于U.S.专利No.4,912,094的3-脱-O-酰基化单 磷酰基脂类A(3D-MPL)。该化合物可以最高至少20μg/kg的剂量向人安 全地给药，但在剂量水平≥10μg/kg下某些病人会出现温度升高，流感 样症状，增加心率和适度的血压下降。细胞培养和动物评估证实MPL免 疫刺激剂仍然保持母体LPS的一些免疫刺激性活性，因为保留了致热性 和诱导促炎症细胞因子如TNF和IL-8的能力，尽管剂量水平较高。因此， 对有效的疫苗佐剂的需求得到充分认定。理想地，这些佐剂将加强保护 性免疫反应而不会诱导不希望有的毒性和致热性。

为了得到具有低致热性的免疫刺激剂，已经制备出结构上与MPL免 疫刺激剂类似的合成分子。这些新分子通称氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯 (AGPs)，由键接到酰基化氨基烷基基团上的酰基化葡萄糖部分组成 (Johnson等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.9：2273-2278(1999)和 PCT/WO98/50399和其中参考文件)。每个分子具有6个脂肪酸尾，这被认 为是峰值佐剂活性的最佳数。氨基烷基结构内的不同化学部分的取代被 设计到AGPs中以优化稳定性和溶解性能。因此AGPs可广义上根据其氨基 烷基基团的结构被分成几个系列。在最初的生物学评做之后，清楚地发 现，氨基烷基基序能够显著地影响AGP的致热性(见1998年5月7日提交 的美国专利申请No.09/074,720和US专利No.6,113,918和6,303,347)。 作为对合成佐剂化合物的起始筛选工艺的一部分，测定兔子致热性数 据。可以看出，几种化合物在剂量10μg/kg下静脉内给药时没有引起发 热反应。一般来说，这些相同的化合物在对人外周血单核细胞离体细胞 因子诱导分析中不能诱导可检测水平的炎症细胞因子TNF-α或IL-1β。 在此，我们根据对在兔子热原试验和离体细胞因子分析两者中诱导最小 活性的一类AGPs的佐剂性能的研究进行报道。

化合物和组合物

本发明提供一般表示为结构式(I)的化合物：

和其药物可接受盐，其中X是-O-或-NH-和Y是-O-或-S-；R1，R2，和R3 分别独立地是(C9-C14)酰基基团，包括饱和，不饱和和支化的酰基基团；R4 是-H或-PO3R7R8，其中R7和R8分别独立地是H或(C1-C4)脂族基团；R5是 -H，--CH3或-PO3R9R10，其中R9和R10分别独立地选自-H和(C1-C4)脂族基团；R6 独立地选自H，OH，(C1-C4)氧基脂族基团，-PO3R11R12，-OPO3R11R12， -SO3R11，-OSO3R11，-NR11R12，-SR11，-CN，-NO2，-CHO，-CO2R11，和-CONR11R12，其 中R11和R12分别独立地选自H和(C1-C4)脂族基团；前提是R4和R5之一是含磷 的基团且如果R4是-PO3R7R8，R5不是-PO3R9R10，其中″*1-3″和″**″表示手性中 心；

其中n，m，p和q分别独立地是整数0-6，前提是p和m的总和是0-6。

尽管结构式I中的吡喃己糖苷(hexopyranoside)以葡萄糖构型给 出，其它糖苷在本发明的范围内。例如吡喃葡萄糖苷，包括其它吡喃己糖 苷(如，阿洛糖苷，阿卓糖甘，甘露糖苷，古洛糖苷，艾杜糖苷，半乳糖苷， 塔罗糖苷)，在本发明的范围内。

在以上的通式中，标为″*1″，″*2″和″3″的其上连接有正常脂肪酰基残 基的3′-立体中心(Stereogenic centers)的构型是R或S，但优选R。其 上直接或间接连接R6和葡糖胺单元的环状糖苷配基单元的碳原子(标为 ″**″)的绝对立体化学可以是R或S。在以上通式中，Y可以是平伏或直立位 置，但优选为平伏的。所有的立体异构体，对映体，非对映体和其混合物 被认为在本发明的范围内。

在本发明优选的实施方案中，X和Y是-O-，R4是膦酰基，R5和R6是H，和 n，m，p，和q是整数0-3，和更优选0-2。最优选整数n是1，整数m是2，和整数 p和q是0。在该优选的实施方案中，本发明的化合物是具有通式(V)的2- 吡咯烷基甲基β-D-氨基葡糖苷4-磷酸酯：

在本发明的一个优选实施方案中，它们所连接的3′-立体中心(″*1-3″) 的构型是R，Y处于平伏位置，和吡咯烷立体中心(″**″)的绝对立体化学是 S。

尤其优选的实施方案是N-[(R)-3-十四酰基氧基十四酰基]-(S)-2- 吡咯烷基甲基2-脱氧-4-O-膦酰基-2-[(R)-3-十四酰基氧基十四酰基氨 基]-3-O-[(R)-3-十四酰基氧基十四酰基]-β-D-吡喃葡萄糖苷，和其药 物可接受盐，描绘于结构式(II)：

(N-[(R)-3-十二酰基氧基十四酰基]-(S)-2-吡咯烷基甲基2-脱氧 -4-O-膦酰基-2-[(R)-3-十二酰基氧基十四酰基氨基]-3-O-[(R)-3-十 二酰基氧基十四酰基]-β-D-吡喃葡萄糖苷和其药物可接受盐；结构式 (III)，

和(N-[(R)-3-癸酰基氧基十四酰基]-(S)-2-吡咯烷基甲基2-脱氧 -4-O-膦酰基-2-[(R)-3-癸酰基氧基十四酰基氨基]-3-O-[(R)-3-癸酰 基氧基十四酰基]-β-D-吡喃葡萄糖苷和其药物可接受盐；结构式(IV)，

化合物的制备

本发明化合物可使用描述于Johnson等 人，Bioorg.Med.Chem.Lett.9：2273-2278(1999)和PCT/WO98/50399和其 中参考文件的方法而制备。一般来说，描述于上述参考文件的合成方法 广泛适用于制备具有不同酰基基团和取代的化合物。本领域熟练技术人 员可以理解，其中描述的各种方法可改变以使用替代的酰基化剂，或可 用连接有合适酰基基团的市售物质开始。

化合物的评估

本文提供的化合物可按照各种分析形式进行评估以选择具有合适 的药效团分布的化合物。例如，U.S.专利No.6,013,640描述了适用于评 估这里所述化合物的心脏保护作用的动物模型。以下实施例还提供用于 评估主体化合物的致热性的分析，和用于评估该化合物的促炎症作用的 其它分析。

本发明进一步提供包含本文所提供的化合物与一种或多种药物可 接受载体混合的药物组合物。合适的载体取决于所要治疗的病症以及给 药途径。因此，以下和使用方法一起提供对载体的讨论。

药物组合物和其用途

在一个实施方案中，本发明提供包含本发明化合物和药物可接受载 体的药物组合物。化合物以治疗有效量存在，该量是化合物为了实现在 治疗疾病，病症，或获得生物学事件方面所需效果所需的。药物组合物可 在与抗原共同给药时用作佐剂。

本发明组合物包括与疫苗或其它活性剂结合，或单独地被配制成向 病人直接供给该活性化合物而不稀释的组合物，以及可配制用于以后稀 释以避免运输和/或储存大量稀释剂(如水，盐水或含水物质)的该化合 物的更浓缩的组合物。一般来说，用于直接或立即向主体给药(即，不稀 释)的本发明药物组合物包含一种或多种治疗有效量的该化合物。该量 根据特定治疗化合物和所需的治疗效果而改变。更浓缩的组合物包含其 量对这些组合物来说合适的一种或多种本发明化合物。

为了制备药物组合物，药物可接受载体可以是固体或液体。固体形 式制剂包括粉末，片剂，药丸，胶囊，扁囊剂，栓剂，和可分散粒剂。固体载 体可以是一种或多种也可用作稀释剂，增香剂，粘接剂，防腐剂，片剂崩 解剂，或包封材料的物质。

在粉末中，载体是与细分活性组分混合的细分固体。在片剂中，活性 组分与具有必需结合性能的载体以合适的比例混合和压实成所需的形 状和尺寸。

固体形式的组合物还可通过喷雾干燥活性佐剂(如盐的形式)的含 水配方或通过冻干和与赋形剂研磨而制成。

适用于本发明固体组合物的载体包括，例如，碳酸镁，硬脂酸镁，滑 石，糖，乳糖，果胶，糊精，淀粉，明胶，黄芪胶，甲基纤维素，羧甲基纤维素 钠，低熔点蜡，可可脂，和类似物。术语″制剂″意味着包括以胶囊化材料 作为载体而提供胶囊的活性化合物的配方，其中有或没有其它载体的活 性组分被载体包围，因此两者相关联。类似地包括扁囊剂和糖淀。片剂， 粉末，胶囊，药丸，扁囊剂，和糖淀可用作适用于口服的固体剂型。

为了制备栓剂，低熔点蜡，如脂肪酸甘油酯或可可脂的混合物首先 被熔化并例如通过搅拌将活性组分均匀分散其中。熔融均相混合物随后 被倒入尺寸合适的模具中，冷却，这样凝固。

液体形式的制剂包括溶液，悬浮液，和乳液，例如，水或水/丙二醇溶 液。对于胃肠外注射，液体制备可在含水聚乙二醇溶液中配制成溶液。 在某些实施方案，药物组合物被配制成稳定的乳剂配方(如，油包水乳液 或水包油乳液)或优选包含一种或多种表面活性剂的含水配方。本领域 熟练技术人员熟知的合适表面活性剂可用于这些乳剂。在一个实施方案 中，组合物是包含至少一种合适的表面活性剂的胶束分散体的形式。可 用于这些胶束分散体的表面活性剂包括磷脂。磷脂类的例子包括：二酰 基磷脂酰甘油，如：二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油(DPMG)，二棕榈酰基磷脂酰 甘油(DPPG)，和二硬脂酰基磷脂酰甘油(DSPG)；二酰基磷脂酰胆碱，如： 二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DPMC)，二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)，和二 硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)；二酰基磷脂酸，如：二肉豆蔻酰基磷脂酸 (DPMA)，二棕榈酰基磷脂酸(DPPA)，和二硬脂酰基磷脂酸(DSPA)；和二酰 基磷脂酰乙醇胺如：二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DPME)，二棕榈酰基磷 脂酰乙醇胺(DPPE)，和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)。其它例子包括， 但不限于此，乙醇胺(如磷脂酰乙醇胺，如上所述，或脑磷脂)，丝氨酸(如 磷脂酰丝氨酸)和3′-O-赖氨酰甘油(如3′-O-赖氨酰-磷脂酰甘油)的衍 生物。

适用于口服的水溶液可通过将活性组分溶解在水中和根据需要加 入合适的着色剂，香料，稳定化剂，和增稠剂而制成。适用于口服的含水 悬浮液可通过将细分活性组分与粘稠材料，如天然或合成树胶，树脂，甲 基纤维素，羧甲基纤维素钠，和其它熟知的悬浮剂一起分散在水中而制 成。

也包括在使用之前不久转化成液体形式制剂用于口服的固体形式 制剂。这些液体形式包括溶液，悬浮液，和乳剂。除了活性组分，这些制 剂可包含着色剂，香料，稳定化剂，缓冲剂，人造和天然甜味料，分散剂， 增稠剂，增溶剂，和类似物。

药物制剂优选为单位剂型。在这些形式中，制剂被细分为包含合适 量的活性组分的单位剂量。单位剂型可以是包装制剂，包含独立量的制 剂的包装，如在小瓶或安瓿瓶中的包装片剂，胶囊，和粉末。另外，单位剂 型可以是胶囊，片剂，扁囊剂，或糖淀自身，或它可以是包装形式的合适 数目的任何这些。

因此，本发明的佐剂体系特别有利地用于制造和使用疫苗和其它免 疫刺激剂组合物治疗或预防疾病，例如诱导哺乳动物，优选人对抗原的 自动免疫。疫苗制剂是一项得到很好发展的技术，且对制备和配制疫苗 的一般指导容易得自任何的各种资料。这样的一个例子是《疫苗的新趋 势和发展》(Voller等人编辑，University Park Press，Baltimore，Md.，U.S.A.1978)。

在一个说明性的实施方案中，本发明疫苗组合物中的抗原是肽，多 肽，或其免疫原性部分。本文所用的″免疫原性部分″是被B-细胞和/或T- 细胞表面抗原受体识别(即，具体地是结合)的蛋白质的部分。这些免疫 原性部分一般包含抗原性蛋白质或其变型的至少5个氨基酸残基，更优 选至少10，和进一步更优选至少20个氨基酸残基。

抗原多肽的免疫原性部分一般使用熟知的技术，如汇总于Paul，《基 础免疫学》，第三版，243-247(Raven Press，1993)和其中引用的参考文 件的那些技术进行鉴定。这些技术包括根据与抗原特异性抗体，抗血清 和/或T-细胞系或克隆反应的能力而筛选多肽。作为使用本文所用的抗 血清和抗体是″抗原特异性的″，如果它们特异地结合到抗原上(即，它们 在ELISA或其它免疫分析中与该蛋白质反应，和不与无关蛋白质可检测 地反应)。这些抗血清和抗体可如本文所述，和使用熟知的技术而制成。 蛋白质的免疫原性部分是与这些抗血清和/或T-细胞反应的部分，其反 应水平不明显低于全长多肽(如，在ELISA和/或T-细胞反应性分析中)的 反应性。这些免疫原部分可在这些分析内以类似于或高于全长多肽的反 应性的水平进行反应。这些筛选一般可使用本领域普通技术人员熟知的 方法，这些例如描述于Harlow和Lane，《抗体：实验室手册》，Cold Spring Harbor实验室，1988的那些方法而进行。例如，多肽可被固定到固体载体 上和与病人血清接触以使血清内的抗体结合到固定的多肽上。未结合的 血清可随后被去除并使用，例如，125I-标记蛋白质A检测结合的抗体。

肽和多肽抗原使用任何各种熟知的技术而制成。DNA序列编码的重 组体多肽可容易地由分离的DNA序列使用任何的本领域普通技术人员已 知的各种表达载体而制成。表达可在任何已被表达载体所转化或转染的 合适宿主细胞中实现，所述表达载体包含编码重组体多肽的DNA分子。合 适的宿主细胞包括原核生物，酵母，和高级真核细胞，如哺乳动物细胞和 植物细胞。优选，所用的宿主细胞是大肠杆菌，酵母或哺乳动物细胞系如 COS或CHO。

具有低于约100个氨基酸，和一般低于约50个氨基酸的蛋白质抗原 的部分和其它变型也可通过合成方式，使用本领域普通技术人员熟知的 技术而生成。例如，这些多肽可使用任何市售固相技术，如Merrifield固 相合成方法而合成，其中氨基酸被顺序加入正生长的氨基酸链。参见 Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85：2149-2146，1963。用于自动化合成多肽 的设备可购自供应商如Perkin Elmer/Applied Biosystem Division(Foster City，CA)，和可根据制造商的指示操作。

在某些特定实施方案内，用于本发明疫苗组合物的多肽抗原可以是 包含两个或多个不同多肽的融合蛋白质。融合参与体可，例如，有助于提 供T辅助细胞表位(免疫学融合参与体)，优选被人识别的T辅助细胞表位， 或可有助于以高于原来的重组蛋白质的产率表达蛋白质(表达增强剂)。 某些优选的融合参与体是免疫学和表达增强性融合参与体两者。可选择 其它融合参与体以增加蛋白质的溶解度或使得该蛋白质能够被靶向至 所需细胞间隔室。其它的融合参与体包括有助于纯化蛋白质的亲和标记 物。

融合蛋白质一般可使用标准技术，包括化学缀合作用而制成。优选， 融合蛋白质被表达为重组蛋白质，使得在表达系统中产生相对非融合蛋 白质而言增加的水平。简要地说，编码多肽组分的DNA序列可分开组装， 并连接到合适的表达载体中。编码一种多肽组分的DNA序列的3′端在有 或没有肽连接体的情况下连接到编码第二多肽组分的DNA序列的5′端上， 这样该序列的阅读框架是同相的。这样能够翻译成保持这两种组分多肽 的生物活性的单一融合蛋白质。

肽连接体序列可用于使第一和第二多肽组分以足够距离分开，这样 确保每种多肽折叠成其二级和三级结构。这种肽连接体序列使用本领域 熟知的标准技术被引入融合蛋白质中。合适的肽连接体序列可基于以下 因素而选择：(1)其呈现柔性延伸构象的能力；(2)其不呈现可与第一和 第二多肽上的功能性抗原表位相互作用的二级结构的能力；和(3)缺少 可与多肽功能性抗原表位反应的憎水或带电残基。优选的肽连接体序列 包含Gly，Asn和Ser残基。其它近中性氨基酸，如Thr和Ala也可用于连接 体序列。可有利地用作连接体的氨基酸序列包括公开于Maratea等 人，Gene 40：39-46，1985；Murphy等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：8258-8262，1986；U.S.专利No.4,935,233和U.S.专利No.4,751,180 的那些。连接体序列的长度一般可具有1-约50个氨基酸。如果第一和第 二多肽具有可用于分离功能域和阻止位阻干扰的非必要的N-端氨基酸 区域，无需连接体序列。

在优选的实施方案内，免疫学融合参与体衍生自蛋白质D，革兰氏阴 性细菌流感嗜血杆菌B的表面蛋白质(WO 91/18926)。优选，蛋白质D衍生 物包含约头三分之一的蛋白质(如，N-端的头100-110个氨基酸)，和蛋白 质D衍生物可被脂质化。在某些优选的实施方案内，脂蛋白D融合参与体 的头109个残基被包括在N-端上以提供具有其它外原性T-细胞抗原表位 的多肽和增加大肠杆菌中的表达水平(因此用作表达增强剂)。脂类尾确 保抗原最佳地呈递给抗原呈递细胞。其它融合参与体包括来自流感病毒 的非结构蛋白质，NS1(血球凝集素)。通常，使用N-端81个氨基酸，但可以 使用包括T-辅助细胞抗原表位的不同片断。

在另一实施方案中，免疫学融合参与体是称作LYTA的蛋白质，或其 部分(优选C-端部分)。LYTA衍生自肺炎链球菌，它合成一种称作酰胺酶 LYTA的N-乙酰基-L-丙氨酸酰胺酶(通过LytA基因编码；Gene 43：265-292，1986)。LYTA是一种特异地降解肽聚糖主链中的某些键的自 溶菌素。LYTA蛋白质的C-端区负责对胆碱或对一些胆碱类似物如DEAE的 亲和性。该性能已被用于开发大肠杆菌C-LYTA表达性质粒以表达融合蛋 白质。已经描述了在氨基端上包含C-LYTA片段的杂合蛋白的纯化(参见 生物技术10：795-798，1992)。在一个优选实施方案内，LYTA的重复部分 可被引入融合蛋白质。重复部分存在于起始自残基178的C-端区域中。 尤其优选的重复部分包含残基188-305。

在本发明另一实施方案中，本文所述的佐剂体系用于制备基于DNA 的疫苗组合物。这种类型的说明性疫苗包含编码一种或多种多肽抗原的 DNA，使得抗原现场生成。DNA可存在于任何的本领域普通技术人员已知 的各种递送体系中，包括核酸表达体系，细菌和病毒表达体系。许多基 因递送技术是本领域熟知的，如Rolland，Crit.Rev.Tlaerap.药物载体 体系15：143-198，1998，和其中引用的参考文件所述的那些。合适的核酸 表达系统包含用于病人中表达所需的DNA序列(如合适的启动区和终止 信号)。细菌递送系统包括在其细胞表面上表达多肽的免疫原部分或分 泌这种抗原表位的细菌(如Bacillus-Calmette-Guerrin)的供给。在一 优选实施方案，DNA使用病毒表达体系(如，牛痘或其它痘病毒，反转录病 毒，或腺病毒)被引入，通常包括使用非病原性(缺陷性)，有复制能力的 病毒。说明性的体系例如公开于Fisher-Hoch等人，Proc.Natl. Acad.Sci.USA 86：317-321，1989；Flexner等人，Ann.N.Y.Acad.Sci. 569：86-103，1989；Flexner等人，疫苗8：17-21，1990；U.S.专利 Nos.4,603,112，4,769,330，和5,017,487；WO 89/01973；U.S.专利 No.4,777,127；GB 2,200,651；EP 0,345,242；WO 91/02805；Berkner，生 物技术6：616-627，1988；Rosenfeld等人，科学252：431-434，1991；Kolls 等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：215-219，1994；Kass-Eisler等 人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：11498-11502，1993；Guzman等人，循环 88：2838-2848，1993；和Guzman等人，Cir.Res.73：1202-1207，1993。用于 将DNA引入这些表达体系的技术是本领域普通技术人员熟知的。

另外，DNA可以是″裸露的，″例如由Ulmer等人，科学 259：1745-1749，1993描述和由Cohen，科学259：1691-1692，1993评述。对 裸DNA的吸收可通过将DNA涂覆到被有效传输至细胞中的可生物降解的 珠粒上而增加。显然，疫苗可根据需要包含多核苷酸和多肽组分两者。

另外，疫苗显然可包含所需多核苷酸，多肽和/或碳水化合物抗原的 药物可接受盐。例如，这些盐可由药物可接受的非毒性碱，包括有机碱 (如，伯，仲和叔胺和碱性氨基酸的盐)和无机碱(如，钠，钾，锂，铵，钙和 镁盐)制成。

当在宽剂量范围和比率下给药时，本发明的佐剂系统具有强佐剂作 用。

抗原在每种疫苗剂量中的量一般选择为在典型疫苗中诱导免疫保 护反应而没有明显的不良副作用的量。这些量取决于使用何种特定免疫 原和它如何呈递。一般，每个剂量预期包含约1-1000μg蛋白质，最通常 约2-100μg，优选约5-50μg。当然，所给的剂量可取决于年龄，重量， 同时治疗的种类(如果有的话)和所施用的抗原的性质。

给定量的本发明疫苗组合物的免疫原活性可容易地例如通过监控 对用于疫苗组合物中的抗原的抗体效价增加而确定 (Dalsgaard，K.ActaVeterinia Scandinavica 69：1-40(1978))。另一普 通方法包括用各种量的疫苗组合物的皮内注射CD-1鼠，随后采集该鼠的 血清并通过例如ELISA测试抗免疫原抗体。这些和其它类似方法是熟练 技术人员显而易见的。

抗原可来自和/或分离自基本上任何所需来源，这取决于传染病，自 身免疫病，病症，癌症，病原体，或待用给定疫苗组合物治疗的疾病。例如， 抗原可衍生自病毒来源，如流感病毒，猫白血病毒，猫免疫缺陷病毒，人 HIV-1，HIV-2，单纯疱疹2型病毒，人巨细胞病毒，A，B，C或E型肝炎，呼吸 道合胞病毒，人乳头瘤病毒，狂犬病，麻疹病，或口蹄疫病毒。说明性的 抗原也可衍生自细菌来源，如炭疽病，百日咳，Lyme疾病，疟疾，结核，利 什曼病，T.cruzi，埃里希氏体属，念珠菌属等，或衍生自原虫如Babeosis bovis或疟原虫属。抗原通常由天然或合成氨基酸组成，如，肽，多肽，或 蛋白质的形式，可由多糖组成，或可以是其混合物。说明性的抗原可分离 自天然来源，利用固相合成而合成，或可利用重组DNA技术而得到。

在另一实施方案中，肿瘤抗原用于本发明疫苗组合物以预防和/或 治疗癌。癌细胞通常在其表面上具有特殊抗原，如截短的表皮生长因子， 叶酸结合蛋白，上皮粘蛋白，melanoferrin，癌胚抗原，前列腺特异性膜 抗原，HER2-neu，这些用于治疗性癌疫苗的候选物。因为肿瘤抗原是正常 的或与身体的正常组分有关，免疫系统通常不能针对那些抗原产生有效 的免疫反应以驱除肿瘤细胞。为了实现这种反应，可以使用本文所述的 佐剂体系。结果，外原性蛋白质可进入用于处理内原性抗原的途径，导致 产生细胞溶解性或细胞毒性T细胞(CTL)。该佐剂作用有助于产生抗原特 异性CTLs，它们寻找和破坏在其表面上携带用于免疫的肿瘤抗原的那些 肿瘤细胞。可以使用这种途径的说明性的癌类型包括前列腺，结肠，乳腺， 卵巢，胰腺，脑，头和颈，黑素瘤，白血病，淋巴瘤，等。

在本发明另一实施方案中，本发明的佐剂体系可单独给药，即，没有 共给药的抗原，这样加强免疫系统以治疗慢性传染病，尤其是免疫缺损 病人。可以使用该途径用于治疗或预防的传染病的说明性的例子可在 U.S.Pat.No.5,508,310中找到。如此对免疫系统的加强作用也可用作预 防措施以限制医院和/或术后感染的危险。

在另一实施方案中，存在于疫苗组合物中的抗原不是外来抗原，而 是一种自体抗原，如，疫苗组合物针对自身免疫病如1型糖尿病，常规器 官特异性自身免疫病，神经系统疾病，风湿性疾病，银屑癣，结缔组织疾 病，自身免疫性血细胞减少，和其它自身免疫病。这些常规器官特异性自 体免疫可包括甲状腺炎(Graves+Hashimoto′s)，胃炎，肾上腺炎 (Addison′s)，卵巢炎，原发性胆汁性肝硬化，重症肌无力，生殖腺衰竭 (gonadal failure)，甲状旁腺功能减退，秃头症，吸收不良综合征，恶 性贫血，肝炎，抗受体抗体疾病和白癜风。这些神经系统疾病可包括精神 分裂症，Alzheimer′s疾病，忧郁症，垂体功能减退，尿崩症，干燥综合征 和多发性硬化。这些风湿性疾病/结缔组织疾病可包括类风湿性关节炎， 全身性红斑狼疮(SLE)或狼疮，硬皮症，多肌炎，炎症性肠病，皮肤肌炎， 溃疡性结肠炎，Crohn′s疾病，血管炎，牛皮癣关节炎，剥脱性牛皮癣皮炎， 寻常天疱疮，Sjogren′s综合症。其它自身免疫有关的疾病可包括自身免 疫uvoretinitis，肾小球肾炎，心肌后壁梗塞，心切开术综合症，肺含铁 血黄素沉积，淀粉样变性，结节病，口疮性口炎，和其它免疫有关的疾病， 例如在本文中给出和为相关领域所已知的。

尽管本领域普通技术人员已知的任何合适的载体可用于本发明疫 苗组合物，载体的种类通常根据所需的给药方式而改变。本发明组合物 可配制用于任何合适的给药方式，包括例如，局部，口服，鼻，静脉内，颅 内，腹内，皮内，皮下或肌内给药。对于肠胃外投药，如皮下注射，载体通 常包含水，盐水，醇，脂肪，蜡或缓冲剂。对于口服，通常使用以上载体，或 也可采用固体载体如甘露糖醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，滑石，纤 维素，葡萄糖，蔗糖，和碳酸镁。可生物降解的微球体(如，聚乳酸聚羟乙 酸)也可用作本发明组合物的载体。合适的可生物降解的微球体例如，公 开于U.S.专利Nos.4,897,268；5,075,109；5,928,647；5,811,128； 5,820,883；5,853,763；5,814,344和5,942,252,在此将其公开内容作为 参考完全并入本发明。修饰的乙型肝炎核心蛋白质载体体系也是合适的， 如描述于WO/99 40934，和其中引用的参考文件的那些，都在此引以参 考。也可采用包含颗粒-蛋白质复合物的载体，如描述于U.S.专利 No.5,928,647的那些，在此将其公开内容完全引以参考，它们能够诱导 主体的I类限制的细胞毒性T淋巴细胞反应。

在一个说明性的实施方案中，疫苗制剂被供给粘膜，尤其是口腔，和 优选供给舌下位，用于引起免疫反应。口腔给药在许多情况下由于非侵 入性给药技术所带来的容易和方便而相对传统非经肠传输是优选的。另 外，该方案进一步提供了一种用于引起粘膜免疫性的方式，这是传统的 非经肠传输所难以实现的，而且可提供针对空气传播病原体和/或过敏 原的保护。口腔给药的其它优点在于，病人适应性可使用舌下疫苗传输 而改善，尤其是对于儿科场合，或对于通常需要在较长时间内多次注射 的场合，例如对于过敏性脱敏疗法。

疫苗组合物也可包含缓冲剂(如，中性缓冲盐水，磷酸缓冲盐水或磷 酸缓冲剂w/o盐水)，碳水化合物(如，葡萄糖，甘露糖，蔗糖或右旋糖酐)， 甘露糖醇，蛋白质，多肽或氨基酸如甘氨酸，抗氧化剂，抑菌药，螯合剂如 EDTA或谷胱甘肽，佐剂(如，氢氧化铝)，使得配方与受体血液等渗压，低 渗，或弱高渗的溶质，悬浮剂，增稠剂和/或防腐剂。另外，本发明组合物 也可被配制成冻干体。组合物也可使用熟知的技术被包封在脂质体内。

因此，在一个实施方案中，疫苗组合物是包含有效量的一种或多种 表面活性剂的含水配方。例如，组合物可以是包含至少一种合适的表面 活性剂，如，磷脂类表面活性剂的胶束分散体的形式。磷脂类的说明性的 例子包括二酰基磷脂酰甘油，如二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油(DPMG)，二棕 榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)，和二硬脂酰基磷脂酰甘油(DSPG)，二酰基磷 脂酰胆碱，如二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DPMC)，二棕榈酰基磷脂酰胆碱 (DPPC)，和二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)；二酰基磷脂酸，如二肉豆蔻酰 基磷脂酸(DPMA)，二棕榈酰基磷脂酸(DPPA)，和二硬脂酰基磷脂酸 (DSPA)；和二酰基磷脂酰乙醇胺如二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DPME)， 二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)。通 常，含水配方中的表面活性剂：佐剂摩尔比是约10∶1-约1∶10，更通常约 5∶1-约1∶5，但任何有效量的表面活性剂可用于含水配方以最佳地适应 所关心的特定目标。

在另一实施方案中，组合物是乳剂，如油包水乳剂或水包油乳剂。这 些乳剂一般是本领域熟练技术人员熟知的。

本发明的佐剂体系可用作唯一的佐剂体系，或作为替代方案，可与 其它佐剂或免疫效应物一起给药。例如，这些佐剂可包括油-基佐剂(例 如，弗氏完全和不完全佐剂)，脂质体，矿物盐(例 如，AlK(SO4)2，AlNa(SO4)2，AlNH4(SO4)，硅石，明矾，Al(OH)3，Ca3(PO4)2，高 岭土，和碳)，多核苷酸(例如，聚IC和聚AU酸)，聚合物(例如，非离子嵌段 聚合物，聚磷腈，氰基丙烯酸酯，聚合酶-(DL-lactide-co-glycoside)， 和其它，以及某些天然物质(例如，脂类A和其衍生物，来自结核分枝杆菌 的蜡D，以及存在于小棒杆菌，百日咳杆菌，和布鲁氏菌属细菌的物质)， 牛血清清蛋白，白喉类毒素，破伤风类毒素，麻黄球蛋白，匙孔-血蓝蛋 白，假单胞毒素A，霍乱类菌素，霍乱毒素，百日咳毒素，病毒蛋白质，和真 核生物蛋白质如干扰素，白介素，或肿瘤坏死因子。这些蛋白质可根据本 领域熟练技术人员熟知的方法得自天然或重组来源。如果得自重组来源， 佐剂可包含蛋白质片断，其中至少包含该分子的免疫刺激性部分。可用 于本发明的其它已知的免疫刺激性大分子包括，但不限于，多糖，tRNA， 非代谢性合成聚合物如聚乙烯基胺，聚甲基丙烯酸，聚乙烯基吡咯烷 酮，4′，4-二氨基二苯基甲烷-3，3′-二羧酸和4-硝基-2-氨基苯甲酸的混 合缩聚物(具有相对高分子量)(参见Sela，M.，科学 166：1365-1374(1969))或糖脂类，脂类或碳水化合物。

在一个实施方案中，佐剂体系优选被设计成诱导主要为Th1型的免 疫反应。高水平的Th1-型细胞因子(如，IFN-γ，TNFα，IL-2和IL-12)往 往有利于诱导对给药抗原的细胞介导的免疫反应。相反，高水平的Th2- 型细胞因子(如，IL-4，IL-5，IL-6和IL-10)往往有利于诱导体液免疫反 应。在应用本文所提供的疫苗之后，病人会支持免疫反应，包括Th1-和 Th2-型反应。在一个优选实施方案内，其中反应主要是Th1-型，Th1-型细 胞因子的水平增加至高于Th2-型细胞因子水平的程度。这些细胞因子的 水平可容易地使用标准分析而评估。有关细胞因子类的评述，参见 Mosmann和Coffman，Ann.Rev.Immunol 1.7：145-173，1989。

例如，用于引起主要为Th1-型的反应的其它佐剂包括，例如，单磷酰 基脂类A，如3-脱-O-酰基化单磷酰基脂类A(3D-MPL)，与铝盐的组合。MPL 佐剂得自Corixa公司(西雅图，WA；参见US专利 Nos.4,436,727；4,877,611；4,866,034和4,912,094)。含CpG的寡聚核苷 酸(其中CpG二核苷酸是未甲基化的)也诱导主要为Th1的反应。这些寡聚 核苷酸是熟知的和例如，描述于WO 96/02555，WO99/33488和U.S.专利 Nos.6,008,200和5,856,462。免疫刺激性DNA序列也例如描述于Sato等 人，科学273：352,1996。可包括在疫苗组合物中的其它说明性的佐剂包 括Montanide ISA 720(Seppic，France)，SAF(Chiron，California，美 国)，ISCOMS(CSL)，MF-59(Chiron)，DetoxTM佐剂(Corixa，Hamilton，MT)。

本文所述的组合物可作为持续释放配方(即，在给药之后缓释化合 物的配方如胶囊，海绵或凝胶(例如由多糖组成))的一部分给药。这些配 方一般使用熟知的技术(参见，如，Coombes等人，疫苗 14：1429-1438，1996)制备和例如，经口服，直肠或皮下植入，或通过在所 需靶位上植入而给药。持续释放配方可包含分散在载体基质中和/或包 含在包围有速率控制膜的储器内的多肽，多核苷酸或抗体。在这些配方 内使用的载体是生物相容的，和也可是可生物降解的；优选该配方提供 相对恒定活性组分释放水平。这些载体包括聚(lactide-co-glycolide)， 聚丙烯酸酯，胶乳，淀粉，纤维素，右旋糖酐和类似物的微颗粒。其它延迟 释放载体包括超分子biovectors，它包含非液体亲水核(如，交联多糖或 低聚糖)和，视需要，包含两亲化合物，如磷脂类的外层(参见如，U.S.专 利No.5,151,254和PCT申请WO 94/20078，WO/94/23701和WO 96/06638)。 包含在持续释放配方内的活性化合物的量根据植入位，释放的速率和预 期持续时间以及所要治疗或预防的病症的性质而变化。

任何的各种已知的传输载体可在药物组合物和疫苗内使用以有助 于产生以细胞为靶的抗原特异性免疫反应。传输载体包括抗原呈递细胞 (APCs)，如树突细胞，巨噬细胞，B细胞，单核细胞和其它可被设计成有效 APCs的细胞。这些细胞可，但不必，被基因改造以增加用于呈递抗原的能 力，提高T细胞反应的活化和/或维持，本身具有抗目标作用和/或与受体 (即，匹配的HLA单元型)免疫相容。APCs一般可从任何各种生物流体和器 官(包括肿瘤和肿瘤周围组织)中分离，和可以是自体同源，同种异体，同 系基因或异种细胞。

本发明的某些优选的实施方案使用树突细胞或其原型作为抗原呈 递细胞。树突细胞是高度有效的APCs(Banchereau和Steinman，Nature 392：245-251，1998)且已被证实是用于引起预防或治疗性抗肿瘤免疫性 的有效生理佐剂(参见Timmerman和Levy，Ann.Rev.Med. 50：507-529，1999)。一般来说，树突细胞可根据其典型形状(在原位呈星 形，体外可见明显的胞质突(树突))，其吸收能力，具有高效率的加工和 呈递抗原和其活化幼稚T细胞反应的能力而确定。

树突细胞当然可被设计成表达通常在体内或体外在树突细胞上不 存在的特定的细胞表面受体或配体，且本发明可考虑这些修饰的树突细 胞。作为树突细胞的替代物，可在疫苗内使用载有分泌囊抗原的树突细 胞(称作外来体)(参见Zitvogel等人，Nature Med.4：594-600，1998)。

树突细胞和前体可得自外周血液，骨髓，肿瘤侵润性细胞，肿瘤周围 组织侵润性细胞，淋巴结，脾，皮肤，脐带血液或任何其它合适的组织或 流体。例如，树突细胞可通过将细胞因子如GM-CSF，IL-4，IL-13和/或TNF α的组合加入从周围血液获得的单核细胞的培养物中而离体分化。或者， 从周围血液，脐带血液或骨髓获得的CD34阳性细胞可通过向培养介质中 加入GM-CSF，IL-3，TNFα，CD40配体，LPS，f1t3配体和/或诱导树突细胞 的分化，成熟和增殖的其它化合物的组合而分化成树突细胞。

树突细胞被方便地分类成″不成熟的″和″成熟的″细胞，这样能够以 简单方式辩别两种得到很好表征的表型。但这种命名法则不应理解为排 除所有的可能中间分化阶段。不成熟的树突细胞特征在于APC具有用于 抗原吸收和处理的高能力，这与Fcr受体和甘露糖受体的高表达有关。成 熟的表型通常特征在于较低地表达这些标记，但高度地表达与T细胞活 化有关的细胞表面分子如I类和II类MHC，粘着分子(如，CD54和CD11)和 共刺激性分子(如，CD40，CD80，CD86和4-1BB)。

APCs一般可被为抗原多肽编码多核苷酸(或其部分或其它变型)所 转染，使得抗原多肽，或其免疫原性部分在细胞表面上被表达。这些转染 离体发生，且包含这些转染细胞，和本文所述佐剂的组合物或疫苗可随 后用于治疗目的。

或者，以树突细胞或其它抗原呈递细胞为靶的基因传输载体可向病 人给药，导致在转染在体内发生。树突细胞的体内和体外转染例如一般 可使用本领域已知的任何方法，这些例如描述于WO 97/24447的那些，或 描述于Mahvi等人，免疫学和细胞生物学75：456-460，1997的基因枪方法 而进行。树突细胞的抗原加载可通过将树突细胞或祖细胞用抗原多 肽，DNA(裸露的或在质粒载体内)或RNA；或用抗原表达性重组细菌或病 毒(如，痘苗，禽痘，腺病毒或慢病毒属载体)培育而实现。在负荷之前，多 肽可共价连接到提供T细胞辅助的免疫学参与体(如，载体分子)上。另外， 树突细胞可单独地或在多肽的存在下用非缀合免疫学参与体脉冲。

对一氧化氮相关病症的治疗

一方面，本发明提供了用于治疗由一氧化氮介导的疾病或病症，尤 其是缺血和再灌注损伤的方法。该方法包括向需要这种治疗的主体供给 有效量的本发明化合物。一般认为，iNOS基因转录和蛋白质合成的诱导 剂是促炎症和因此稍微″毒性″的或在动物和人中不容易耐受。内毒素 (LPS)和促炎细胞因子如IL-1，TNF-α和IFN-γ是已知的iNOS诱导剂。它 们都本身是毒性的且在向动物给药时能够诱导全身性炎症反应，成人呼 吸窘迫综合征，多脏器衰竭和心血管破裂。

对MPL免疫刺激剂的心脏保护活性的研究表明，一氧化氮合酶 (iNOS)的诱导在该化合物的延迟心脏保护作用中是重要的。另外，估计 通过NOS的组成库而进行的一氧化氮(NO)信号传导在该化合物的急性心 脏保护作用中是重要的。考虑到MPL免疫刺激剂的残余内毒素状活性， 不令人惊讶的是，该化合物能够诱导一氧化氮信号传导。另外，一氧化氮 信号传导已被认为是一种可能的方法，通过该方法缺血性预调理引起心 脏保护。考虑到一氧化氮给体是心脏保护性的，该观察结果提供了 NOS/NO途径是MPL免疫刺激剂心脏保护的途径的进一步支持。

本发明化合物可用于治疗受一氧化氮调整或改善的疾病或病症，尤 其是缺血和再灌注损伤的方法(参见，U.S.专利申请系列 No.：09/8 08669，2001年3月14日递交，其中描述了氨基烷基氨基葡糖苷 磷酸酯的心脏保护性能和用于分析心脏保护性能的方法)。

实施例

以下实施例用于说明而非限定所要求保护的发明。

实施例1-制备N-[(R)-3-十四酰基氧基十四酰基]-(S)-2-吡咯烷基 甲基2-脱氧-4-O-膦酰基-2-[(R)-3-十四酰基氧基十四酰基氨 基]-3-O-[(R)-3-十四酰基氧基十四酰基]-β-D-吡喃葡萄糖苷三乙基 铵盐：具有结构式(II)的化合物的三乙基铵盐

(1a)向2-脱氧-4-O-二苯基膦酰基-3-O-[(R)-3-十四酰基氧基十四 酰基]-6-O-(2，2，2-三氯-1，1-二甲基乙氧基羰基)-2-(2，2，2-三氯乙氧 基羰基氨基)-β-D-吡喃葡萄糖基溴(1.05g，0.81mmol)在无水1，2-二 氯乙烷(10mL)中的溶液加入4分子筛(0.5g)，无水CaSO4(2.2g，16 mmol)，和N-[(R)-3-十四酰基氧基十四酰基]-(S)-2-吡咯烷甲醇(0.40 g，0.75mmol)。所得混合物在室温下搅拌1h，用Hg(CN)2(1.02 g，4.05mmol)处理，和在黑暗中加热回流16h。将冷却的反应混合物用 CH2Cl2稀释并过滤。滤液用1N aq KI洗涤，干燥(Na2SO4)，和浓缩。在硅 胶(梯度洗脱，15→20％EtOAc/己烷)上急骤色谱处理，得到0.605g(43 ％)N-[(R)-3-十四酰基氧基十四酰基]-(S)-2-吡咯烷基甲基2-脱氧 -4-O-二苯基膦酰基-3-O-[(R)-3-十四酰基氧基十四酰 基]-6-O-(2，2，2-三氯-1，1-二甲基乙氧基羰基)-2-(2，2，2-三氯乙氧基 羰基氨基)-β-D-吡喃葡萄糖苷，一种无定形固体。

(1b)将在以上(1a)中制备的化合物(0.50g，0.29mmol)在AcOH(10 mL)中的溶液在60℃下用锌粉(0.98g，15mmol)分三个相等的部分在1-h 内处理。将冷却的反应混合物超声处理，通过Celite垫过滤，和浓缩。所 得残余物在CH2Cl2和饱和aq NaHCO3之间分配，并分层。将有机层干燥 (Na2SO4)和浓缩。所得粗氨基醇和(R)-3-十四酰基氧基十四酸(0.155 g，0.34mmol)在CH2Cl2(3.5mL)中的溶液与粉状4分子筛(0.25g)一起 搅拌0.5h并随后用2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1，2-二氢喹啉(0.11 g，0.44mmol)处理。所得混合物在室温下搅拌8h，通过Celite过滤，和浓 缩。在硅胶上使用50％EtOAc/己烷进行急骤色谱处理，得到0.355g(68 ％)N-[(R)-3-十四酰基氧基十四酰基]-(S)-2-吡咯烷基甲基2-脱氧 -4-O-二苯基膦酰基-2-[(R)-3-十四酰基氧基十四酰基氨 基]-3-O-[(R)-3-十四酰基氧基十四酰基]-β-D-吡喃葡萄糖苷，一种无 色糖浆。

(1c)将在以上(1b)中制成的化合物(0.300g，0.166mmol)在AcOH(1 mL)和四氢呋喃(9mL)的混合物中的溶液在PtO2(0.15g)的存在下在室 温和70psig下氢化18h。反应混合物用2∶1CHCl3-MeOH(50mL)稀释并 简单超声处理。收集催化剂并用2∶1CHCl3-MeOH洗涤，然后将合并的滤液 和洗涤物浓缩。在硅胶上使用CHCl3-MeOH-H2O-Et3N(90∶10∶0.5∶0.5)进 行急骤色谱，得到部分纯化产物，然后将它溶解在冰冷2∶1 CHCl3-MeOH(30mL)中并用冰冷0.1N aq HCl(12mL)洗涤。有机相被过 滤并从2％aq Et3N(5mL，无热原)中冻干，得到0.228g(79％)N-[(R)-3- 十四酰基氧基十四酰基]-(S)-2-吡咯烷基甲基2-脱氧-4-O-膦酰基 -2-[(R)-3-十四酰基氧基十四酰基氨基]-3-O-[(R)-3-十四酰基氧基十 四酰基]-β-D-吡喃葡萄糖苷三乙基铵盐，一种无色粉末：

mp 67-70℃；IR(膜)3306，2955，2923，2853，1736，1732，1644， 1548，1466，1378，1245，1177，1110，1053，844 cm-1；1H NMR(CDCl3-CD3OD)δ0.88 (m，18H)，1.0-1.2.05(mH)，2.20-2.70(m，12H)，3.06(q，6H，J＝7.2Hz)，3.3-325 (mH)，4.52(d，1H，J＝8Hz)，5.05-5.28(m，4H)，7.44(d，1H，J＝9Hz)；13C NMR (CDCl3)δ173.3，173.0，170.3，169.6，168.6，101.8，100.4，75.8，72.5，72.4，70.9，70.8， 70.3，70.2，69.9，69.3，67.9，66.6，56.5，56.3，54.5，47.4，45.8，44.6，41.4，41.0，39.7，39.2， 39.0，34.5，34.3，34.1，32.0，29.7，29.4，28.1，27.3，25.7，25.3，25.2，25.1，24.0，22.7，21.6， 14.1，8.6.

理论计算值C101H194N3O17P·H2O：C，68.47；H，11.15；N，2.37；P，

1.75.实测值C，68.79；H，11.00；N，2.24；P，1.97.

实施例2：制备N-[(R)-3-十二酰基氧基十四酰基]-(S)-2-吡咯烷基 甲基2-脱氧-4-O-膦酰基-2-[(R)-3-十二酰基氧基十四酰基氨 基]-3-O-[(R)-3-十二酰基氧基十四酰基]-β-D-吡喃葡萄糖苷三乙基 铵盐)；化合物(III)的三乙基铵盐。

(2a)向2-脱氧-4-O-二苯基膦酰基-3-O-[(R)-3-十二酰基氧基十四 酰基]-6-O-(2，2，2-三氯-1，1-二甲基乙氧基羰基)-2-(2，2，2-三氯乙氧 基羰基氨基)-α-(D-吡喃葡萄糖基溴(1.60g，1.27mmol)在无水1，2- 二氯乙烷(3.2mL)中的溶液加入4分子筛(0.6g)，无水CaSO4(1.0 g，7.3mmol)，和N-[(R)-3-十二酰基氧基十四酰基]-(S)-2-吡咯烷甲醇 (0.58g，1.14mmol)。所得混合物在室温下搅拌1h，用Hg(CN)2(0.58 g，2.3mmol)处理，和在黑暗中加热回流6h。将冷却的反应混合物用 CH2Cl2稀释和滤过celite床。滤液用1N aq KI洗涤，干燥(Na2SO4)，和浓 缩。在硅胶上急骤色谱(梯度洗脱，25→35％EtOAc/己烷)处理得到1.72 g(82％)N-[(R)-3-十二酰基氧基十四酰基]-(S)-2-吡咯烷基甲基2-脱 氧-4-O-二苯基膦酰基-3-O-[(R)-3-十二酰基氧基十四酰 基]-6-O-(2，2，2-三氯-1，1-二甲基乙氧基羰基)-2-(2，2，2-三氯乙氧基 羰基氨基)-β-D-吡喃葡萄糖苷，一种无色油。

(2b)将在以上(2a)中制成的化合物(1.58g，0.806mmol)在AcOH(40 mL)中的溶液于60℃下用锌粉(2.6g，40mmol)分三个相等的部分在1小 时内进行处理。将冷却的反应混合物超声处理，滤过Celite垫，和浓缩。 所得残余物在EtOAc和饱和aq NaHCO3之间分配并分层。有机层用盐水洗 涤，干燥(Na2SO4)，和浓缩得到1.3g白色固体。所得的粗氨基醇和(R)-3- 十二酰基氧基十四酸(0.45g，1.05mmol)在CH2Cl2(20mL)中的溶液用2- 乙氧基-1-乙氧基羰基-1，2-二氢喹啉(0.30g，1.21mmol)处理。所得混 合物在室温下搅拌18h和浓缩。在硅胶上用40→50％EtOAc/己烷进行急 骤色谱处理，得到0.89g(56％)N-[(R)-3-十二酰基氧基十四酰 基]-(S)-2-吡咯烷基甲基2-脱氧-4-O-二苯基膦酰基-2-[(R)-3-十二酰 基氧基十四酰基氨基]-3-O-[(R)-3-十二酰基氧基十四酰基]-β-D-吡 喃葡萄糖苷，一种白色泡沫材料。

(2c)在以上(2b)中制成的化合物(0.75g，0.44mmol)在AcOH(4.5 mL)和四氢呋喃(45mL)的混合物中的溶液在PtO2(0.45g)的存在下在室 温和70psig下氢化18h。反应混合物用2∶1CHCl3-MeOH(35mL)稀释和 简单地超声处理。收集催化剂并用2∶1CHCl3-MeOH洗涤，然后将合并的滤 液和洗涤物浓缩。在硅胶上用CHCl3-MeOH-H2O-Et3N(梯度洗 脱；96∶4∶0.3∶0.3→90∶10∶0.5∶0.5)进行急骤色谱处理，得到部分纯化 产物(0.51g)，将它溶解在冰冷2∶1CHCl3-MeOH(50mL)中并用冰冷0.1N aq HCl(20mL)洗涤。有机相被过滤和浓缩。将所得白色蜡从2％aq Et3N(70mL，无热原)中冻干，得到0.54g(78％)N-[(R)-3-十二酰基氧基 十四酰基]-(S)-2-吡咯烷基甲基2-脱氧-4-O-膦酰基-2-[(R)-3-十二酰 基氧基十四酰基氨基]-3-O-[(R)-3-十二酰基氧基十四酰基]-β-D-吡 喃葡萄糖苷三乙基铵盐，一种白色粉末：

mp 146-151℃；IR(膜)3292，3100，2958，2922，2852，1739，1731，1659， 1651，1644，1562，1555，1468，1455，1433，1377，1339，1310，1253，1238，1183，1 160， 1107，1080，1047，960，856，722cm-1；1H NMR(CDCl3-CD3OD)δ 0.88(m，18H)，1.0- 2.10(mH)，2.20-2.75(m，12H)，3.04(q，6 H，J＝7.2Hz)，3.3-4.3(mH)，4.45(d，1H，J ＝8.5Hz)，5.0-5.28(m，4H)；13C NMR(CDCl3)δ173.9，173.4，173.2，170.6，170.1， 169.2，101.4，75.5，74.0，70.8，70.7，70.2，68.5，60.5，56.6，53.6，47.4，45.6，40.9，39.6， 38.8，34.5，34.3，34.2，34.1，31.9，29.7，29.6，29.5，29.4，29.4，29.3，29.2，27.3，25.2，25.0， 23.6，22.7，21.6，14.0，8.3.

MALDI-MS计算值[M+Na]+1590.1900，实测值1590.1866；理论计算值

C95H182N3O17P·3H2O：C，66.20；H，10.99；N，2.44.实测值C，66.36；H， 10.69；N，2.15.

实施例3：制备N-[(R)-3-癸酰基氧基十四酰基]-(S)-2-吡咯烷基甲 基2-脱氧-4-O-膦酰基-2-[(R)-3-癸酰基氧基十四酰基氨 基]-3-O-[(R)-3-癸酰基氧基十四酰基]-β-D-吡喃葡萄糖苷三乙基铵 盐)；化合物(IV)的三乙基铵盐。

(3a)向2-脱氧-4-O-二苯基膦酰基-3-O-[(R)-3-癸酰基氧基十四酰 基]-6-O-(2，2，2-三氯-1，1-二甲基乙氧基羰基)-2-(2，2，2-三氯乙氧基 羰基氨基)-α-D-吡喃葡萄糖基溴(1.70g，1.38mmol)在无水1，2-二氯 乙烷(3.5mL)中的溶液加入4分子筛(0.6g)，无水CaSO4(1.2g，8.8 mmol)，和N-[(R)-3-癸酰基氧基十四酰基]-(S)-2-吡咯烷甲醇(0.60 g，1.24mmol)。所得混合物在室温下搅拌1h，用Hg(CN)2(0.63g，2.5 mmol)处理，和在黑暗中加热回流6h。将冷却的反应混合物用CH2Cl2稀释 和滤过celite床。滤液用1N aq KI洗涤，干燥(Na2SO4)，和浓缩。在硅胶 (梯度洗脱，25→40％EtOAc/己烷)上进行急骤色谱处理，得到1.82g(80 ％)N-[(R)-3-癸酰基氧基十四酰基]-(S)-2-吡咯烷基甲基2-脱氧-4-O- 二苯基膦酰基-3-O-[(R)-3-癸酰基氧基十四酰基]-6-O-(2，2，2-三氯 -1，1-二甲基乙氧基羰基)-2-(2，2，2-三氨乙氧基羰基氨基)-β-D-吡喃 葡萄糖苷，一种无色油。

(3b)将在以上(3a)中制备的化合物(1.67g，1.02mmol)在 AcOH(50mL)中的溶液在60C下用锌粉(3.33g，51mmol)分三个相等的部 分在1h内处理。将冷却的反应混合物超声处理，通过Celite垫过滤，和 浓缩。所得残余物在EtOAc和饱和aq NaHCO3之间分配并分层。将有机层 用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，和浓缩得到1.25g白色固体。将所得粗氨基 醇和(R)-3-癸酰基氧基十四酸(0.53g，1.33mmol)在CH2Cl2(20mL)中的 溶液用2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1，2-二氢喹啉(0.38g，1.53mmol)处 理。所得混合物在室温下搅拌18h和浓缩。在硅胶上用40→50％EtOAc/ 己烷进行急骤色谱处理，得到1.23g(74％)N-[(R)-3-癸酰基氧基十四 酰基]-(S)-2-吡咯烷基甲基2-脱氧-4-O-二苯基膦酰基-2-[(R)-3-癸酰 基氧基十四酰基氨基]-3-O-[(R)-3-癸酰基氧基十四酰基]-β-D-吡喃 葡萄糖苷，一种白色泡沫材料。

(3c)将在以上(3b)中制成的化合物(1.07g，0.654mmol)在 AcOH(6.5mL)和四氢呋喃(65mL)的混合物中的溶液在PtO2(0.66g)的 存在下在室温和70psig下氢化18h。反应混合物用2∶1CHCl3-MeOH(50mL) 稀释并简单地超声处理。收集催化剂并用2∶1CHCl3-MeOH洗涤，然后将合 并的滤液和洗涤物浓缩。将所得所得蜡状固体从2％aq三乙基胺中冻干， 得到约1g粗三乙基铵盐，一种白色粉末。在硅胶上用 CHCl3-MeOH-H2O-Et3N(梯度洗脱；96∶4∶0.3∶0.3→88∶12∶1∶0.6)进行急 骤色谱处理，得到部分纯化产物(0.84g)，将它溶解在冰冷 2∶1CHCl3-MeOH(168mL)中并用冰冷0.1N aq HCl(67mL)洗涤。有机相 被过滤和浓缩。所得白色蜡(约0.7g)从2％aq Et3N(70mL，无热原)中 冻干，得到0.79g(79％)N-[(R)-3-癸酰基氧基十四酰基]-(S)-2-吡咯 烷基甲基2-脱氧-4-O-膦酰基-2-[(R)-3-癸酰基氧基十四酰基氨 基]-3-O-[(R)-3-癸酰基氧基十四酰基]-β-D-吡喃葡萄糖苷三乙基铵 盐，一种白色粉末：mp 121-122C；IR(膜)

3287，3093，2961，2913，2850，1745，1738，1732，1716，1666，1660，1651，1644，1635， 1565，1556，1538，1470，1455，1434，1416，1378，1337，1311，1248，1184，1104，1081， 1021，964，721cm-1；1H NMR(CDCl3-CD3OD)δ0.88(m，18H)，1.0-2.05(mH)，2.20- 2.75(m，12H)，3.04(q，6H，J＝7.2Hz)，3.3-4.3(mH)，4.45(d，1H，J＝8.5Hz)，5.0- 5.28(m，4H)；13C NMR(CDCl3)δ173.7，173.4，173.2，170.5，170.1，169.1，101.4，75.6， 74.0，70.8，70.2，68.7，60.4，56.6，53.8，47.4，45.6，41.0，39.6，38.9，34.5，34.3，34.2，34.1， 31.9，29.7，29.6，29.5，29.4，29.4，29.3，29.2，27.3，25.3，25.0，23.7，22.7，21.6，14.1，8.4.

MALDI-MS计算值[M+Na]+1506.0961，实测值1506.1008；理论计算值

C89H170N3O17P：C，67.43；H，10.81；N，2.65.实测值C，67.26；H，10.85；N， 2.47.

实施例4-8

实施例4-8的主要目的是确定在实施例1中制备的具有结构式(II) 的化合物(作为三乙基胺盐)(以下称″化合物II ″)是否能够刺激最小的 致热性和在与疫苗抗原配制时介导佐剂活性。

实施例4-对HbsAg(乙型肝炎表面抗原)的佐剂活性

将若干组6-8周的BALB/c小鼠(Jackson Laboratories Bar Harbor，Maine)用2μg HBsAg(Laboratorio Pablo Cassara)±20μg 佐剂(MPL免疫刺激剂或化合物II)在第0天和第21天s.c.注射。疫苗通 过将含佐剂的TEoA(三乙醇胺)配方与重组HBsAg混合而制成。对HBsAg 的效价通过来自在二次接种之后21天时收集的混合血清(5个鼠/组)的 ELISA确定(表1)。非免疫对照物没有接种疫苗。

接受化合物II的小鼠的血清效价具有明显高于仅接受抗原的对照 血清的抗HBsAg反应(表1)。尤其令人注目的是IgG2a和IgG2b同种型的效 价值的增加。这些效价与由接受MPL免疫刺激剂的对照组所表现的相 当。

表1.用于HBsAg的低致热原佐剂的比较

                           血清效价

组          致热性*        IgG       IgG1       IgG2a      IgG2b

未免疫      ---             ＜100     ＜100      ＜100      ＜100

TEoA载体    N.T.            51,200    102,400    25,600     1600

MPL-TEoA  2-3             409,600   204,800    204,800    51,200

Cpd.II-TEoA 0.3             409,600   204,800    409,600    51,200

a.致热性数据表示3只兔子在i.v.给药10μg/Kg剂量之后总升高 值(摄氏度)。在致热原分析中，化合物以100μg/ml溶解在10％ EtOH/WFI(用于注射的USP水)中并随后用5％葡萄糖水溶液稀释。N.T. 是指该化合物没有被试验。

实施例5--对FluZone流感疫苗中的血凝素蛋白质的佐剂活性

6-8周的BALB/c小鼠组(Jackson Laboratories Bar Harbor，Maine) 用在FluZone流感疫苗(Connaught Laboratories，Swiftwater，PA)中的 0.2μg血凝素蛋白质±20μg佐剂(MPL免疫刺激剂或化合物II)在第0 天和第14天皮下注射。对FluZone的效价通过来自在二次接种之后第14 天时收集的5只鼠的混合血清的FluZone ELISA测定(表2)。非免疫对照 物没有接种疫苗。试验组的用于血清的起始稀释度是1∶1600。

结果类似于以前实施例。同样，化合物II具有明显高于仅接受抗原 的对照血清的效价(表2)。效价的增加还反映在增强的IgG2a和IgG2b反 应上。这些效价与由接受MPL免疫刺激剂的对照组所表现的相当。

表2.和流感疫苗一起使用的低致热原佐剂的比较

                               血清效价

组          致热性*        IgG         IgG1        IgG2a       IgG2b

未免疫      ---             ＜100       ＜100       ＜100       ＜100

TEoA载体    N.T.            12,800      51,200      1600        ＜1600

MPL-TEoA  2-3             102,400     102,400     25,600      12,800

Cpd.II-TEoA 0.3             51,200      102,400     25,600      6400

a.致热性数据表示3只兔子在i.v.给药10μg/Kg剂量之后总升高 值(摄氏度)。在致热原分析中，化合物以100μg/ml溶解在10％ EtOH/WFI(用于注射的USP水)中并随后用5％葡萄糖水溶液稀释。N.T. 是指该化合物没有被试验。

实施例6-对HBsAg的佐剂活性

BALB/c鼠组在第0天和第21天用2.0μg HBsAg(Rhein Americana， & Rhein Biotech)±25μg佐剂(MPL免疫刺激剂或化合物II)皮下注 射。对HBsAg的IgG1和IgG2a同型效价通过来自在二次接种之后第21天时 收集的混合血清的ELISA而测定(表3)。非免疫对照物没有接种疫苗。在 该实验中，化合物II与接受在PBS中的抗原的对照组相比介导了增加的 效价。RC-553刺激的效价和阳性对照物，MPL免疫刺激剂相等(表3)。

表3.与HBsAg一起使用的低热原佐剂的比较

                             血清效价

组            致热性*           IgG1          IgG2a

未免疫        ---                ＜100         ＜100

PBS对照       N.T.               64,000        4000

MPL-TEoA    2-3                128,000       1,024,000

Cpd.II-TEoA   0.3                32,000        2,048,000

a.致热性数据表示3只兔子在i.v.给药10μg/Kg剂量之后总升高 值(摄氏度)。在致热原分析中，化合物以100μg/ml溶解在10％ EtOH/WFI(用于注射的USP水)中并随后用5％葡萄糖水溶液稀释。N.T. 是指该化合物没有被试验。

实施例7-化合物II增加对HBsAg免疫鼠的CTL活性

来自实施例4的每个组的一些鼠另外用作脾细胞供体以评估CTL活 性。指向HBsAg的特异溶解作用在标准四小时51Cr-释放分析中评估 (Moore等人，(1988)Cell 55：777-785)。单个细胞悬浮液由疫苗接种之 后第9天的鼠的脾制成。脾细胞用tris-缓冲NH4Cl处理以去除红血球和 在浓度7.5×106/ml下再悬浮在补充有5mM HEPES，4mM L-谷氨酰 胺，0.05mM 2-巯基乙醇和抗菌素的RPMI/10％FCS中。将代表已知的MHC I类，Ld-受限的CTL抗原表位的合成肽(IPQSLDSWWTSL)以最终浓度75nM 加入细胞中。在四天孵育之后，细胞被取出并评估CTL活性。特异性杀伤 针对表达Ld-受限的抗原表位的51Cr-标记的转染P815S细胞测定。靶细胞 是表达Ld-受限的CTL抗原表位的转染P815细胞系(P815S)。非特异溶解 作用在E∶T 50∶1下，针对P815靶小于10％(表4)。不同于抗体反应，RC-553 与相比仅有抗原的对照物相比刺激明显升高的CTL活性水平(表4)。

表4.和HbsAg一起使用的低致热原佐剂的比较

              百分特异性杀伤(效应物：靶比率)

组            致热性*           50∶1       25∶1       12.3∶1       6.25∶1

非免疫        ---                6           3           1             0

PBS           N.T.               29          20          11            7

MPL-TEoA    2-3                80          71          47            32

Cpd.II-TEoA   0.3                85          77          53            37

a.致热性数据表示3只兔子在i.v.给药10μg/Kg剂量之后总升高 值(摄氏度)。在致热原分析中，化合物以100μg/ml溶解在10％ EtOH/WFI(用于注射的USP水)中并随后用5％葡萄糖水溶液稀释。N.T. 是指该化合物没有被试验。

实施例8-化合物II的离体细胞因子诱导

化合物II对TNF-α和IL-1β的产生的影响在离体条件下针对人外 周血液单个核细胞测定。MPL免疫刺激剂和化合物II在0.2％TEoA/WFI 的水溶液中配制。

人全血用于评估糖脂(AGPs)诱导促炎细胞因子的能力。人全血被收 集到肝素化管中并将0.45ml全血与包含糖脂(即，试验化合物)的0.05 ml磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH7.4)混合。管在37摄氏度下在振荡器装置中 孵育4hr。样品随后用1.5ml无菌PBS稀释并离心处理。上层清液被取 出并通过夹层ELISA使用用于人TNF-α和IL-1β的R & D Systems′ Quantinkine免疫分析试剂盒分析与细胞相关的TNF-α和IL-1β。

在1、5和10μg/ml的分析中，化合物I I没有产生在分析条件下可被 测出的TNF-α水平。相反，阳性对照LPS在1ng/mL下是从细胞分泌TNF- α的有效刺激剂。MPL)免疫刺激剂在浓度范围100-10,000ng/mL内有效 地诱导TNF-α。

类似地，化合物II(在1、5和10μg/ml下)没有产生可测出水平的 IL-1β。为了比较该化合物的作用，用MPL免疫刺激剂诱导的IL-1β的 水平被规定为数值1且化合物II的相对诱导能力为≤0.05。

实施例4-8的讨论

来自这些研究的数据表明，化合物II能够增加对疫苗抗原的免疫。 该化合物增加对两种不同的疫苗抗原(流感和肝炎表面抗原)的血清效 价。如同MPL免疫刺激剂，它介导抗体分布从IgG1同种型主导的反应至 有高水平IgG2a抗体的反应移动。除了增加抗体反应，该化合物是用于诱 导CTL活性的良好佐剂。

该研究的结果的一个显著特点在于，化合物II似乎影响反应而不会 诱导可测水平的炎症细胞因子TNF-α或IL-1β。这些细胞因子都由天生 免疫系统中的细胞响应包括脂类A的细菌细胞壁产物而产生。因为该化 合物和脂类A有结构相似性，可以设想，它将也会刺激TNF-α或IL-1β， 而且许多AGP分子的确如此。

作为炎症细胞因子，TNF-α和IL-1β刺激用于活化吞噬细胞细胞和 调动特异性免疫性的其它细胞因子介体系列的释放。IL-1起始被称作内 源性致热原，因为它诱导发热反应。因此，在给药化合物II之后可检测的 IL-1的缺乏与兔子热原试验中明显缺少的发热一致。

仍可能的是，在这些研究中，该化合物实际的刺激TNF-α和IL-1β 以足够高的水平分泌以介导特异免疫性的活化，但太低而不能在体外细 胞素分析中被测出。另一选择可以是，该化合物刺激导致对共给药疫苗 抗原的特异性免疫应答的除TNF-α和IL-1β之外的细胞因子介体。似乎 产生IFNγ。该细胞素被认为可用于诱导同型转到IgG2a子类的抗体以及 是TH-1驱动的CTL反应的促进剂。因此增加的IgG2a效价和活性CTL群都 反映了IFNγ的产生。

实施例9-化合物II对可诱导性一氧化氮合酶(iNOS)的刺激

该实施例说明各种糖脂在J774鼠科巨噬细胞中对iNOS诱导的作用。 鼠科巨噬细胞系J774可通过IFN-γ体外致敏和对随后iNOS上调的LPS刺 激非常敏感，例如通过标准Greiss试剂ELISA分析步骤而测定。该分析采 用30mL/烧瓶的在1×106/mL下接种的J774细胞并加入IFN-γ至100个单 位/mL持续16-24hrs。细胞随后被收集和洗涤并在2×105/孔下在96- 孔板中再悬浮并贴壁。对于实验组，将糖脂化合物系列稀释到孔中，并 将所得培养物再温育36-40小时，然后将亚硝酸盐释放的Greiss试剂分 析中收集培养物上清。亚硝酸盐含量与iNOS功能密切相关。

效力被确定为糖脂在培养物中能够诱导亚硝酸盐最大诱导的一半 的浓度(ng/mL)(ED50)。ED50数越低，iNOS诱导的效力越大。ED50根据 Johnson等人，(1999)J.Med.Chem.42：4640-4649中给出的方法计算。

MPL免疫刺激剂被发现具有ED50约2ng/mL，导致高水平的亚硝酸盐 产生，而化合物II具有标定ED50约≥3000(ng/ml)。

该化合物中所观察到的非常低的最大iNOS活性表明，它在该体系中 对iNOS诱导基本上是无效的。

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