康乐霉素C的生产方法 |
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| 申请号 | CN91101127.7 | 申请日 | 1991-03-01 | 公开(公告)号 | CN1037526C | 公开(公告)日 | 1998-02-25 |
| 申请人 | 中国医学科学院医药生物技术研究所; | 发明人 | 王南金; 李群; 杨贤树; | ||||
| 摘要 | 康乐霉素C是从一株奴卡氏菌的 发酵 液中，经过滤去菌丝，用酸调pH值至酸性，用有机酯类萃取，将萃取液浓缩后，在 硅 胶柱上分离用苯和甲醇 混合液 洗脱，收集活性部分并浓缩，在LH-20柱上纯化，用醇类 有机 溶剂 洗脱，收集活性成分并浓缩，用醇类 有机溶剂 重结晶即得纯品。该化合物溶于极性有机溶剂，免疫抑制作用与环孢菌素A相似，并有抗 肿瘤 作用，毒性很低。本 发明 提取工艺简单，化学合成及结构改造较方便。 | ||||||
| 权利要求 | 1、一种康乐霉素C的生产方法，其特征在于用一株地中海奴卡氏菌康乐变种(Nocardia mediterranei var.kanglensis)CGMCC 0163(1747-64)进行斜面培养、种子培养和发酵培 养，然后从培养液中分离和纯化康乐霉素C，其中所说到的康乐霉素C为黄色棒状结晶，在 170℃分解变成黑色，分子量为326，旋光度为+150°(10-4)，紫外光谱中在232纳米， 356纳米有最大吸收，溶于极性有机溶剂，不溶于水和非极性有机溶剂：其中所说的斜面培养是 在KNO3 0.1％，NaCl 0.5％，K2HPO4 0.05％，FeSO4 0.01％，淀粉2％，琼脂1.7％，冷开水 ，pH7.0中进行的；其中所说的种子培养是在葡萄糖2-5％，酵母粉0.1-1.5％，KCl 0.1-0.5％， 黄豆饼粉0.1-2.5％，K2HPO4 0.01-0.5％，(NH4)2SO4 0.1-2％，MgSO4 0.01-0.1％，CaCO30.1-1％，自来水100ml，自然pH值中进行的；其中所说的发酵培养是在葡萄糖2-5％，酵母粉 0.5-2％，黄豆饼粉0.1-1.5％，蛋白胨0.05-0.5％，CaCO3 0.01-1.0％，自来水100ml，自然pH中 进行的。 |
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| 说明书全文 | 本发明涉及一种用于自身免疫溶血性贫血、肾炎、结缔组织以及脏器 移植排斥反应的新免疫抑制剂康乐霉素C的生产方法。目前开发的免疫抑制剂，其药物选择性强，专一性地调节某-免疫细 胞的亚族。代表药物如环孢菌素A，能选择性抑制T辅助细胞的克隆(无性 繁殖系)的增殖，在器官移植方面取得了可喜的成绩，并已广泛用于临床 。然而，也发现一些副作用，如个别患者用药后出现急性和慢性肾中毒、 轻度震颤、神经病变、齿龈肥厚和多毛等副作用。最近发现的FK-506属 于大环内酯类抗生素(C44H19NO5)，虽然实验研究结果满意，但因生产 复杂，限制了临床上广泛应用。 本发明目的在于克服现有免疫抑制剂的各种缺点，寻找更理想替代药 物。康乐霉素C的化学结构新颖，有别于迄今所有的免疫抑制剂，分子量 小，结构简单，便于修饰。研究表明，康乐霉素C的免疫抑制作用与环孢菌 素A相似或稍强，同时有抑制肿瘤细胞的作用，有可能成为更有特点的新 一代免疫抑制剂。 本发明的特点是用一株奴卡氏菌进行培养发酵，然后用有机溶剂萃取、 柱层析分离和纯化，其中所说的奴卡氏菌是地中海奴卡氏菌康乐变种 (Nocardia mediterranei var.kanglensis)1747-64，该菌株已于1991年2月20日由中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为：CGMCC NO 0163。所述方法其培养基是： (1)菌种培养基(％)：KNO3 0.1、NaCl 0.5、K2HPO4 0.05、FeSO4 0.01、 淀粉2、琼脂1.7、冷开水、pH7.0、28℃培养5-7天； (2)种子培养基(％)：葡萄糖2-5、酵母粉0.1-1.5、KCl 0.1-0.5、黄豆 饼粉0.1-2.5、K2HPO4 0.01-0.5、(NH4)2SO4 0.1-2、MgSO4 0.01-0.1、CaCO20.1-1、自来水100ml、自然pH。 (3)发酵培养基(％)：葡萄糖2-5，酵母粉0.5-2、黄豆饼粉0.1-1.5、 蛋白胨0.05-0.5、CaCO2 0.01-1.0、自来水100ml、自然pH。 以上培养基均15磅消毒30分钟备用。将斜面挖块接种于种子培养基摇 瓶中(30-70ml装量/250ml)，置180-200转/(分钟)旋转摇床，25- 30℃培养24-55小时后，以5-15％接种量转入发酵培养基摇瓶(30-100 ml装量/500ml)，在180-200转/(分钟)旋转摇床25-32℃培养68-96小 时供提取用。将发酵液过滤后，用无机酸调pH值在1-5范围，再用乙酸丁 酯萃取，萃取液浓缩后，在硅胶柱上分离，用苯和甲醇混合液(30∶1)洗 脱，收集活性部分并浓缩，在LH-20柱上纯化用乙醇洗脱，收集活性部分 并浓缩，用乙醇重结晶，即得纯品。康乐霉素C为黄色棒状结晶，在170℃ 分解变成黑色，分子量为326，旋光度为+150°(10-4)，紫外光谱中在 232纳米，356纳米有最大吸收，红外光谱中在3400cm-1、1690cm-1、1650 cm-1、750cm-1等处有吸收。溶于极性有机溶剂，不溶于水和非极性有机溶剂。 0.5μg/ml的康乐霉素C对小鼠脾淋巴细胞转化的抑制率达96.9％。在 小鼠脾细胞培养时，康乐霉素C(40μg/ml)没有表现出毒性，在1mg/ml 浓度下，对精原细胞无作用。对小鼠静脉注射(2mg/kg)没有发生死亡现 象，证明毒性较低。抑制k562白血病细胞增值小于0.1μg/ml，对Hela S3 细胞的抑制浓度为1μg/ml。 本发明的优点和积极效果是，目前发现的免疫抑制剂中，康乐霉素C的 分子量最小，化学结构全新，提取工艺简单，化学合成及结构改造较方便， 免疫抑制作用强，毒性低，因而具有应用推广价值。 图1为康乐霉素C的紫外吸收光谱。 图2为康乐霉素C的红外吸收光谱。 实施例：用一株奴卡氏菌进行培养发酵，然后用有机溶剂萃取、柱层 析分离和纯化，其条件为： (1)菌种培养基(％)：KNO3 0.1、NaCl 0.5、K2HPO4 0.05、FeSO4 0.01、 淀粉2、琼脂1.7、冷开水、PH7.0、28℃培养5～7天； (2)种子培养基(％)：葡萄糖2.5、酵母粉0.5、KCl 0.25、黄豆饼粉0.5、 K2HPO4 0.02、(NH4)2SO4 0.5、MgSO4 0.02、CaCO3 0.5、自来水100ml、 自然PH； (3)发酵培养基(％)：葡萄糖3、酵母粉1、黄豆饼粉0.5、蛋白胨0.2、 CaCO3 0.1、自来水100ml、自然pH。 以上培养基均15磅消毒30分种备用。将斜面挖块接种于种子培养基摇瓶 中(50ml装量/250ml)，置180～200转/(分钟)旋转摇床，28℃培养48 小时后，以10％接种量转入发酵培养基摇瓶(50ml装量/500ml)，在180～ 200转/(分钟)旋转摇床28℃培养72小时供提取用。将发酵液过滤后， 用无机酸调pH值到4，再用乙酸丁酯萃取，萃取液浓缩后，在硅胶柱上分离， 用苯和甲醇混合液(30∶1)洗脱，收集活性部分并浓缩，在LH-20柱上纯 化用乙醇洗脱，收集活性部分并浓缩，用乙醇重结晶，即得纯品。康乐霉 素C为黄色棒状结晶，在170℃分解变成黑色，分子量为326，旋光度为+150° (10-4)，紫外光谱中在232纳米，356纳米有最大吸收，红外光谱中在 3400cm-1、1690cm-1、1650cm-1、750cm-1等处有吸收。溶于极性有机溶剂， 不溶于水和非极性有机溶剂。 |
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