新抗生素胞变菌素的制备方法

本发明涉及新抗生素胞变菌素（Blebomycin，代号SR-44B）及其制备方法。本发明所述的抗生素是由链霉菌属的抗生素胞变菌素生产菌的培养液中分离而得，是一种未见文献报道的新抗生素。本抗生素胞变菌素与本申请相应的日本专利申请中的Blebomycin（代号RS-44B）是同一物质。

近年来，抗生素不仅在医药方面，而且在农药方面也正在被广泛应用。本发明者为了寻找出比以往更为有效的新抗生素，从多种土壤中分离出微生物来培养抗生素。然后对这些抗生素分别进行精制、鉴定和开发应用。

其结果是本发明者首先从链霉素SR-44（streptomyces    sp·SR-44）的培养物中成功地分离和精制出新抗生素制黄肝菌素。经过进一步的研究，又从上述SR-44菌株的培养物中成功地分离并精制出新抗生素胞变菌素。胞变菌素在理化及生物上均具有与制黄肝菌素完全不同的性质。

本发明的目的在于提供一种新抗生素，并提供一种从链霉菌属的微生物中分离、制取该抗生素的方法。

以下对本发明进行详细的说明。

使用的微生物

用来生产本发明所述的抗生素胞变菌素的微生物是一种属于链霉菌属的菌种，其具有生产抗生素胞变菌素的能力。

链霉菌SP·SR-44（Streptomyces    SP·SR-44）（中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心的保藏号CGMCC-0092）（以下简称为“SR-44菌株”）就是其中一例。

该微生物具有上述特性，适于生产本发明所述的抗生素SR-44B，因而能有效地使用于本发明所述的制备方法中。

同时，上述“SR-44菌株”的自然及其人工变异菌株也均属于链霉菌属的菌种。凡具有生产后述抗生素胞变菌素能力的微生物均可应用本发明所述的方法。

上述“SR-44菌株”是从中国江苏省的土壤中分离而得，其具有下述性质：

1.形态特征：

在用含有葡萄糖、酵母浸膏的菌体分析用培养基上培养本菌株“SR-44菌株”，然后进行菌体分离干燥，再用6N盐酸在110℃、加热水解20小时。用纸层析法检测细胞壁的氨基酸组分时，可以发现L、L-二氨基庚二酸。

此外，在琼脂平板上生长的气生菌丝呈现出螺旋状，可以看出这种螺旋状菌丝是由数十个孢子所组成，但是却看不到孢子囊和运动性的孢子。

以上可以说明，本菌株属于链霉菌属。孢子的形态呈园柱状、表面平滑。

2.在各种培养基上的生长状态（于27℃培养三周，颜色按照“颜色名称描述词典”（Descriptive    color    names    diotionary）记述。

（1）蔗糖硝酸盐琼脂培养基

生长    不生长

（2）葡萄糖-天冬酰胺琼脂培养基

生长    不生长

气生菌丝    微量    b灰乳色（oyster    white）

基内    b灰乳色（oyster    white）

色素    无

（3）甘油-天冬酰胺琼脂培养基

生长    普通

气生菌丝    微量    b灰乳色（oyster    white）

基内    b灰乳色（oyster    white）

色素    无

（4）淀粉-无机盐琼脂培养基

生长    良好

气生菌丝    多量    2ge柏氏色（Bergey）

基内    2ie淡芥色（light    mustard）

色素    无

（5）酪氨酸琼脂培养基

生长    良好

气生菌丝    多量    3dc自然色（natural）

基内    2le芥色（mustard）

色素    2ea亮黄色（light    maize）

（6）营养琼脂培养基

生长    良好

气生菌丝    无

基内 1 1/2 Ca乳色（cream）

色素    无

（7）酵母-麦芽琼脂培养基

生长    良好

气生菌丝    多量    5fe灰色（ash）

基内    2lg芥黄褐色（mustard    tan）

色素    无

（8）麦片琼脂培养基

生长    不良

气生菌丝    无

基内    不明

色素    无

（9）胨-酵母-铁琼脂培养基

生长    良好

气生菌丝    无

基内 1 1/2 ea淡黄色（light yellow）

色素    无

3.碳源的利用性（普戈琼脂培养基）

L-阿拉伯糖    -

D-木糖    +

D-葡萄糖    +

D-果糖    -

蔗糖    -

肌醇    -

L-鼠李糖    -

棉子糖    -

D-甘露醇    -

+……生长    -……不生长

4.其它生理性质

（1）合适温度    25～30℃

（2）明胶的液化    液化

（葡萄糖-胨-明胶培养基）

（3）淀粉水解    水解

（淀粉-无机盐琼脂培养基）

（4）脱脂乳的凝固    凝固

（5）脱脂乳的液化    液化

（6）黑色素的生成

（酪氨酸琼脂培养基）    不生成

（胨-酵母铁琼脂培养基）    不生成

具有上述各性质的链霉菌属菌种按柏氏细菌学鉴定手册第八版（Bergey′s    Manual    of    Determinative    Bacteriology    8    th    ed.）分类法，本菌种应属于WISIC-ISM群，从色调、孢子形态来看，最近缘可可链霉菌。由此可以推断本菌种属可可链霉菌或其极近缘菌。

SR-44菌株的培养及胞变菌素的制取和提纯

用链霉菌属的上述抗生素生产菌，通过常规的抗生素生产方法，可以培养“SR-44菌株”并制得本发明所述的抗生素胞变菌素，培养方式既可为液体培养也可为固体培养。但为了有利于工业性生产时的培养，宜将上述生产菌的孢子悬浮液或培养液接种到培养基上并进行通气搅拌培养。

对培养基中的营养源并无特殊的规定，可含有常用于微生物培养的碳源，氮源及其它营养源。其中碳源可为淀粉、糊精、甘油、葡萄糖、蔗糖、乳糖、肌醇、甘露醇等，氮源可为胨、大豆粉、肉膏、米糠、麦皮、尿素、玉米浆、铵盐、硝酸盐，以及其它有机或无机含氮化合物。对于其它营养源来讲，可适当添加一些无机盐类，例如食盐、磷酸盐类 及钾、钙、锌、锰、铁之类的金属盐，必要时也可添加些动、植、矿物油等作为消泡剂。

对培养时的温度、时间等培养条件并无严格的限制，以适于使用菌的发育为准，并以选择胞变菌素产量最高的条件为好。例如，培养基的PH范围可为4～9，以接近中性为好。培养温度、搅拌条件等均应根据所使用菌株的种类及外部条件等进行适当的调节，以获得最好的效果。

由上述所得的培养物出发，通过一些适当的方法就能制得胞变菌素这是些常用于提取代谢产物的常规方法。例如，可利用胞变菌素与不纯物在溶解度、离子结合力、吸附亲和力及分子量等方面的差别进行提取，具体地讲，胞变菌素大部分存在于培养滤液中。将培养液调整到偏酸性，譬如调整到PH4.0，再用醋酸乙酯之类的有机溶剂进行提取，所得的浓缩油状物通过吸附层析、硅胶层析、液相层析、离子交换层析、凝胶层析等组合精制后，即可得到含有胞变菌素及其它活性成分的组份。例如，将油状物进行硅胶层析后在氯仿-甲醇中展开得到活性组份。然后通过高速液相层析〔例如，充填剂选用Nucleosi15C18，展开剂为甲醇-水（8∶2）〕收集SR-44B的活性部分，然后用甲醇进行重结晶，即可得到胞变菌素的无色结晶。

如此所制取的新抗生素胞变菌素具有下述理化性质及生物性质。

抗生素胞变菌素的理化性质及生物性质

形状：无色结晶

熔点：157～160℃

元素分析：碳58.14%、氢6.77%、氮10.70%、氧24.13%

分子量：895（按FD质谱）

比旋度：〔α〕25D-76°（C＝0.5甲醇）

紫外吸收光谱：λ （E1%1cm）230（90）、265肩峰（7.3）、268肩峰（8.1）、274（8.5）、282（7.1）（参照图1）

红外吸收光谱：νkBrmaxcm-13300、2950、1725、1630、1525、1500、1450、1400、1295、1245、1195、1080、1050、1020、825、745、695（参照图2）

酸性水解：酸性水解可得丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、酪氨酸及其他氨基酸。

显色反应：与Dragendolf及Rydon·Smith呈阳性反应

溶解性：易溶于甲醇、醋酸乙酯、氯仿，难溶于水、戊烷、己烷、苯。

薄层分析：（美国Merck公司制造的0.25mm硅薄层板）

溶剂    Rf值

氯仿∶甲醇＝10∶1    0.57

醋酸乙酯∶苯＝4∶1    0.13

抗菌谱：采用通常的琼脂平板稀释法，求出最低抑制浓度（MIC）。（真菌使用马铃薯、蔗糖琼脂培养基，细菌使用肉汤琼脂培养基。）结果，胞变菌素对黄单胞菌（Xantho-monas）属的细菌显示出特异的强生长抑制作用，而对通常的细菌、霉菌却几乎无生长抑制作用。

测试菌    MIC（mcg/ml）

水稻黄单胞菌    2

（Xanthomonas    oryzae）

柑枯黄单胞菌    4

（Xanthomonas    citri）

大肠埃希氏菌    ＞1000

（Escherichia    coli）

鼠伤寒沙门氏杆菌    ＞1000

（Salmonella    typhimurium）

金色葡萄球菌209P    ＞1000

（Staphylococcus    aureus    209P）

枯草杆菌    ＞1000

（Bacillus    subtilis）

胞变菌素从其理化性质上看属于肽类抗生素。由于在此以前尚未发现过肽类抗生素中有对黄单胞菌属的细菌具有特异的强生长抑制作用的物质，由此可以推断胞变菌素是一种新抗生素。

综上所述，胞变菌素因对黄单胞菌属的细菌显示出强生长抑制功能，故而将可望被用作为农业用抗生素。

制造例：

以葡萄糖2%、可溶性淀粉1%、肉汁浸膏0.1%、干酵母0.4%、大豆粉2.5%、食盐0.2%、磷酸二氢钾0.005%的配比制成培养基，将上述SR-44菌株（CGMCC-0092）接种于该培养基中，置于28℃振荡培养96小时。取其培养液25升，于PH＝4的条件下用醋酸乙酯进行抽提。提取液经减压浓缩后，即得4.8g油状物，然后将该油状物置于200ml甲醇中，升温至60℃使其溶解后，再降至0℃使其结晶，经过滤、甲醇洗涤，即可得到400mg无色结晶体。

将上述结晶体用高速液相色谱进行精制。色谱柱为核苷5C18，直 径为20mm，长度为250mm。溶剂选用甲醇∶水＝8∶2，流速为6.0ml/分，压力为180Kg/cm2，在保留时间为12分钟时出现胞变菌素的活性峰。收集上述活性峰，减压浓缩直至除尽甲醇为止。过滤后沉淀用甲醇重结晶，即可得到150mg胞变菌素的无色结晶状纯品。

附图说明

图1为本发明所述的抗生素胞变菌素的紫外吸收光谱图。图2为抗生素胞变菌素的红外吸收光谱图。