一种具有抗精神类疾病的栀子蓝色素及其制备方法与应用 |
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| 申请号 | CN202110505136.8 | 申请日 | 2021-05-10 | 公开(公告)号 | CN113402460B | 公开(公告)日 | 2022-08-26 |
| 申请人 | 南京中医药大学; | 发明人 | 陶伟伟; 赵明; 蒋启航; 姚广大; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了具有MAO‑B抑制活性的栀子蓝色素类化合物A、D、E、G、H，并提供了上述化合物在制备方法，本发明通过大量实验筛选得到最佳的栀子 苷元 和6β‑羟基京尼平苷元与 氨 基酸合成得到产率和纯度高的具有显著 生物 活性的栀子蓝色素A、D、E、G、H化合物。实验结果表明，本发明得到的蓝色素类化合物可用于制备抗老年痴呆、 抑郁症 等精神类 疾病 药物。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种具有抗精神疾病的栀子蓝色素，其特征在于，栀子蓝色素为以下化合物： |
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| 说明书全文 | 一种具有抗精神类疾病的栀子蓝色素及其制备方法与应用技术领域[0001] 本发明属于医药领域，具体涉及具有MAO‑B抑制作用的栀子蓝色素化合物及其制备方法与应用。 背景技术[0002] 栀子蓝色素(gardenia blue pigment)是以栀子果实中的环烯醚萜类成分为原料，利用其水解后的苷元与氨基酸反应而制得的色素类产品。我国于1990年将其列入食品添加剂，用于蛋白质、糖和淀粉等食品染色，特别是在配制酒的生产中，桅子蓝是石榴红等复配色素中不可缺的成分，其具有安全性高，着色力好等优点，在食品加工中有较广阔的应用范围。基于文献研究和市场调研发现，栀子蓝色素类产品的应用目前仍存在两个问题：一是结构认识尚不清晰，虽然目前对于栀子蓝的形成机制已有部分研究，但其具体结构仍未有定论，有观点认为栀子蓝是一种分子量在500kDa附近的聚合物，但聚合方式未知；二是产品用途单一，栀子蓝色素多用于蛋白质、糖和淀粉等食品染色，经济效益有限。 [0003] 单胺氧化酶(monoamine oxidase,MAO)是结合在线粒体外膜的一种黄素蛋白酶，可以催化机体各种内源性或外源性单胺类物质发生氧化脱氨反应，具有 MAO‑A和MAO‑B两种亚型。MAO‑A主要分布在儿茶酚胺能神经元中，若抑制MAO‑A的活性，提高神经内5‑HT的浓度，可治疗焦虑症和抑郁症。MAO‑B 主要分布在神经胶质细胞和组胺能神经元中，若抑制MAO‑B的活性，可提高底部神经中枢中多巴胺(DA)的浓度，可治疗帕金森氏病和阿尔茨海默氏病。 [0004] 现代药理研究结合临床经验表明，栀子环烯醚萜类成分具有保肝、抗抑郁、抗老年痴呆、抗炎等多种生物活性，作用范围涉及到消化系统、神经中枢系统、心脑血管系统等多个方面。但关于其衍生品栀子蓝色素相关研究较少，通过对栀子蓝色素进行单胺氧化酶B(MAO‑B)的抑制活性评价，进行栀子蓝色素类化合物的神经活性优选，可以扩大栀子蓝色素的应用范围，对提升栀子资源综合利用水平具有重要意义。 发明内容[0005] 发明目的：本发明的目的是，通过栀子苷和6β‑羟基京尼平苷酶水解后，与氨基酸反应制得具MAO‑B抑制活性的栀子蓝色素化合物。本发明另外一个目的是提供栀子蓝色素化合物的制备方法。 [0006] 技术方案：为实现以上目的，本发明采用的技术方案为： [0007] 一种具有抗精神疾病的栀子蓝色素，栀子蓝色素为以下化合物： [0008] [0009] 作为本发明的进一步优选方案，栀子蓝色素的制备方法，包括以下步骤： [0011] (2)取栀子苷酶解后的浸膏，用磷酸缓冲液溶解后分成3份，分别加入适量的甘氨酸、L‑色氨酸、L‑半胱氨酸，加热搅拌反应，取出反应液，上D101大孔树脂柱层析，先用纯水洗脱，再用50％乙醇水溶液洗脱并收集蓝色组分，继而使用高效液相制备色谱对各组分进行进一步纯化，分别得到栀子蓝色素A、栀子蓝色素D和栀子蓝色素E； [0012] (3)取6β‑羟基京尼平苷酶解后的浸膏，用磷酸缓冲液溶解后，分成两份，分别加入适量的L‑苏氨酸、L‑色氨酸，加热搅拌反应；取出反应液，上D101大孔树脂柱层析，先用纯水洗脱，再用乙醇水溶液洗脱并收集蓝色组分，继而使用高效液相制备色谱对组分进行进一步纯化，得到栀子蓝色素G、栀子蓝色素H。 [0013] 作为本发明的进一步优选方案，栀子蓝色素的制备方法，包括以下步骤： [0014] (1)分别称取栀子苷和6β‑羟基京尼平苷，分别加水溶解，并按重量比2:1 加入纤维素酶，于40～50℃水解24～48h后结束反应，减压浓缩，得栀子苷和6β‑ 羟基京尼平苷酶解后的浸膏； [0015] (2)取栀子苷酶解后的浸膏，用pH 7.3的磷酸缓冲液溶解后分成3份，分别加入适量的甘氨酸、L‑色氨酸、L‑半胱氨酸，75℃加热搅拌反应5h，取出反应液，上D101大孔树脂柱层析，先用纯水洗脱3个柱体积后，再用50％乙醇水溶液洗脱并收集蓝色组分，继而使用高效液相制备色谱，C18半制备柱；流动相为甲醇和水；流速3ml/min，对各组分进行进一步纯化，分别得到栀子蓝色素A、栀子蓝色素D和栀子蓝色素E； [0016] (3)取6β‑羟基京尼平苷酶解后的浸膏，用pH 7.3的磷酸缓冲液溶解后，分成两份，分别加入适量的L‑苏氨酸、L‑色氨酸，75℃加热搅拌5h；取出反应液，上D101大孔树脂柱层析，先用纯水洗脱3个柱体积后，再用50％乙醇水溶液洗脱并收集蓝色组分，继而使用高效液相制备色谱，C18半制备柱；流动相为甲醇和水，流速3ml/min，对组分进行进一步纯化，得到栀子蓝色素G、栀子蓝色素H。 [0017] 作为本发明的进一步优选方案，具有抗精神疾病的栀子蓝色素在制备抗精神疾病的药物中的应用。 [0018] 作为本发明的进一步优选方案，具有抗精神疾病的栀子蓝色素在制备治疗焦虑症、抑郁症、帕金森氏病和阿尔茨海默氏病的药物中的应用。 [0019] 有益效果：本发明实验结果表明，栀子蓝色素A、栀子蓝色素D、栀子蓝色素E、栀子蓝色素G和栀子蓝色素H对MAO‑B具有显著的抑制活性，可发挥治疗帕金森氏病和阿尔茨海默氏病等精神类疾病的作用。 [0020] 本发明通过大量实验筛选得到最佳的栀子苷和6β‑羟基京尼平苷水解条件得到栀子苷元和6β‑羟基京尼平苷元，然后与特定的氨基酸合成得到产率和纯度高的具有显著生物活性的栀子蓝色素A、D、E、G、H化合物。附图说明 [0021] 图1为各化合物对MAO‑B的抑制活性结果。 具体实施方式[0022] 实施例1 [0023] 1材料 [0024] 1.1仪器 [0025] Sartorius BT125D电子分析天平(德国赛利多斯公司)；超净工作台(美国 Thermo公司)；HH‑4数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)；EPED超纯水系统(南京易普达易科技发展有限公司)；Waters 2695高效液相色谱仪(美国 Waters公司)；Triple Tof高分辨质谱系统(AB SCIEX Triple TOFTM 5600 system)；制备型液相色谱仪(美国Waters公司)；Brucker AV500型核磁共振仪(德国 Brucker公司)。 [0026] 1.2试剂 [0027] 苯甲胺盐酸盐，购自德国默克公司；苯甲醛购自国药集团化学试剂有限公司；磷酸钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、甘氨酸、L‑苏氨酸、L‑组氨酸、L‑色氨酸、 L‑半胱氨酸均购自上海麦克林生化科技有限公司；D101型大孔吸附树脂购自北京索莱宝科技有限公司；甲酸、甲醇均为色谱纯，购自德国默克公司；超纯水经 Mili‑Q超纯水制备系统自制，其他试剂均为分析纯，购自南京化学试剂有限公司。 [0028] 2方法与结果 [0029] 2.1栀子蓝合成 [0030] 2.1.1底物栀子苷、6β‑羟基京尼平苷的制备 [0031] 栀子(Gardenia jasminosides Ellis)的干燥成熟果实(50kg)，用8倍量75％乙醇水溶液加热回流提取三次，每次两小时。提取液浓缩至无醇味后，溶解于 15L水中，依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取三次，分别得到石油醚溶解性、乙酸乙酯溶解性、正丁醇溶解性及水溶解性样品。减压浓缩正丁醇溶解性样品，得稠浸膏3.1kg，加水溶解，D101大孔树脂柱层析，依次用水、 20％乙醇水、40％乙醇水、70％乙醇水依次洗脱，减压浓缩分别得水部位浸膏(1 kg)、20％醇部位浸膏(500g)、40％醇部位浸膏(1kg)以及70％醇部位浸膏(500 g)。取20％醇部位浸膏(50g)，经汉邦DAC‑HB 50制备液相色谱分离(C18半制备柱；80％甲醇水等度洗脱；流速40ml/min)，得10个馏分(Fr20‑1～10)。取Fr20‑10，经制备型液相色谱纯化(C18半制备柱；流动相70％甲醇水等度；流速3ml/min)，得化合物(1)栀子苷(5g)； 取Fr20‑8，经Sephadex LH‑20凝胶柱层析(甲醇洗脱)得到两个亚组分Fr20‑8‑1和Fr20‑8‑2。 Fr20‑8‑1经制备型液相色谱仪纯化(C18半制备柱；流动相85％甲醇水等度；流速3ml/min)，得到化合物(2)6β‑羟基京尼平苷(500mg)。 [0032] 2.1.2栀子苷、6β‑羟基京尼平苷的结构鉴定 [0033] 栀子苷(1)：白色固体，易溶于甲醇。HRESIMS:m/z389.1486[M+H]‑(calcd for + 1C17H25O10 ，计算值389.1448)。H‑NMR(500MHz,DMSO‑d6):δppm7.47(1H,d, J＝1.2Hz,H‑3), 5.68(1H,brs,H‑7),5.12(1H,d,J＝6.9Hz,H‑1'),5.07(1H,d,J＝ 5.3Hz,H‑1),4.13(1H,d,J＝14.0Hz,H‑10a),3.97(1H,ddd,J＝15.1,5.6,2.7Hz, H‑10b),3.67(1H,m,H‑6'a),3.64(3H,s,H‑OCH3),3.41(1H,dt,J＝11.6,5.7Hz, H‑6'b),3.06～3.15(4H,m,H‑2'～5’),2.98(1H,m,H‑5),2.69(1H,dd,J＝16.0,8.1Hz, H‑6a),2.63(1H,t,J＝7.5Hz,H‑9),2.05(1H,m,H‑6b)。经与文献报道对照，数据基本符合，鉴定化合物为栀子苷。 [0034] 6β‑羟基京尼平苷(2)：白色固体，易溶于甲醇。HRESIMS:m/z403.1248 [M‑H]‑‑ 1(calcd for C17H23O11 ，403.1240)。H‑NMR(500MHz,DMSO‑d6):δppm 7.37 (1H,d,J＝1.1Hz,H‑3),5.65(1H,p,J＝1.8Hz,H‑7),5.28(1H,d,J＝4.7Hz,H‑1), 4.46(1H,d,J＝7.9Hz,H‑ 1'),4.35(1H,ddp,J＝5.0,3.3,1.6Hz,H‑6),4.10(1H,m, H‑10a),3.99(1H,ddd,J＝15.3, 5.6,1.6Hz,H‑10b),3.68(1H,m,H‑6'a),3.65(1H,s, ‑OCH3),3.43(1H,dt,J＝11.6,5.7Hz H‑6'b),3.04～3.17(3H,m,H‑3'～5'),3.02(1H, m,H‑9),2.95(1H,m,H‑2'),2.87(1H,ddd, 13 J＝7.4,3.1,1.2Hz,H‑5)；C‑NMR(125 MHz,DMSO‑d6):δppm 94.77(C‑1),151.56(C‑3), 109.39(C‑4),42.77(C‑5),79.30 (C‑6),128.88(C‑7),145.74(C‑8),45.58(C‑9),58.89(C‑10),167.39(C‑11),51.18 (‑OCH3),98.49(C‑1'),73.17(C‑2'),77.26(C‑3'),69.97(C‑4'),77.26(C‑5'),61.02 (C‑6')。经与文献报道对照，数据基本符合，鉴定化合物为6β‑羟基京尼平苷。 [0035] 2.1.3栀子蓝色素A、D、E、G、H(3―7)的合成 [0036] 称取以上制备得到的或市售的栀子苷(600mg)和6β‑羟基京尼平苷(200 mg)，分别加水溶解，按重量2:1(样品：酶)的比例分别加入纤维素酶，于40℃水解48h后结束反应，减压浓缩，分别得栀子苷和6β‑羟基京尼平苷酶解后的浸膏。 [0037] 取栀子苷反应后浸膏，pH 7.3的磷酸缓冲液溶解后分成3份，分别加入适量的甘氨酸、L‑色氨酸、L‑半胱氨酸，75℃加热搅拌反应5h，取出反应液，上 D101大孔树脂柱层析，先用纯水洗脱3个柱体积后，再用体积浓度50％乙醇水溶液洗脱并收集蓝色组分，继而使用高效液相制备色谱(C18半制备柱，流动相为甲醇和水，流速3ml/min)对各组分进行进一步纯化，分别得到栀子蓝色素A (10mg，20％甲醇水洗脱)、栀子蓝色素D(12mg，15％甲醇水洗脱)和栀子蓝色素E(9mg，35％甲醇水洗脱)。 [0038] 取6β‑羟基京尼平苷反应后浸膏，pH 7.3的磷酸缓冲液溶解后，分成两份，分别加入适量的L‑苏氨酸、L‑色氨酸，75℃加热搅拌5h。取出反应液，D101 大孔树脂柱层析。先用纯水洗脱3个柱体积后，再用体积浓度50％乙醇水溶液洗脱并收集蓝色组分，继而使用高效液相制备色谱(C18半制备柱；流动相甲醇和水；流速3ml/min)对组分进行进一步纯化，得到栀子蓝色素G(10mg，25％甲醇水洗脱)、栀子蓝色素H(15mg，30％甲醇水洗脱)。 [0039] 2.1.4栀子蓝色素A、D、E、G、H的结构鉴定 [0040] 栀子蓝色素A：蓝色粉末。HRESIMS m/z:266.1027[M‑H]‑(calcd for C13H16NO5‑，理1 论值266.1028)。化合物 H‑NMR图谱中，可以观察到一个甲氧基质子信号3.65(3H,s,11‑OCH3)，三对亚甲基质子信号3.24(1H,dd,J＝12.3,5.1 Hz,H‑1a)，2.76(1H,m,H‑1b)，2.73(1H,m,H‑6a)，1.90(1H,dd,J＝16.2,9.3Hz, H‑6b)和4.07(1H,d,J＝17.9Hz,H‑12a)，4.00(1H,d,J＝17.9Hz,H‑12b)。四个烯氢质子信号7.54(1H,s,H‑3)，2.99(1H,q,J＝8.2Hz,H‑ 13 5)，5.73(1H,s,H‑7)和2.62 (1H,q,J＝11.0,8.4Hz)。结合HSQC、DEPT及 C‑NMR谱，可以发现一个甲氧基碳信号51.08(11‑OCH3)，四个亚甲基碳信号47.58(C‑1)，38.65(C‑6)，59.44 (C‑10)和56.49(C‑12)，两个烯碳信号148.36(C‑3)和127.30(C‑7)，和两个羰基碳信号 1 1 172.01(C‑11)和174.65(12‑COOH)。H‑‑H COSY谱图显示四组相关信号， H‑1/H‑9，H‑5/H‑ 6，H‑6/H‑7和H‑5/H‑9，结合HMBC谱主要相关峰：H‑3与C‑5、 C‑12，H‑10与C‑8、C‑9，H‑OCH3与C‑11和H‑12与C‑1、C‑COOH，推断出化合物的平面结构。化合物的立体构型通过NOESY确定，图谱显示H‑5与H‑9存在NOE相关，与已知化合物京尼平的立体构型一致。综上所述，鉴定化合物3 为栀子蓝色素A。 [0041] 运用类似方法，基于各化合物一维、二维核磁数据，其余化合物被鉴定为栀子蓝色素D、E、G、H，化合物结构数据归属如下： [0042] 栀子蓝色素D：蓝色粉末，HRESIMS:m/z 393.1448[M‑H]‑(calcd for C22H21N2O5‑，理1 论值393.1450)。H‑NMR(500MHz,D2O):δppm 7.74(1H,s,H‑3), 7.55(1H,d,J＝7.8Hz,H‑19), 7.40(1H,d,J＝8.1Hz,H‑22),7.17(1H,t,J＝7.6Hz, H‑21),7.11(1H,t,J＝7.4Hz,H‑20), 6.05(1H,s,H‑7),4.53(1H,d,J＝7.9Hz,H‑1), 4.37(1H,d,J＝5.4Hz,H‑12),4.16(1H,d,J＝13.5Hz,H‑10a),3.95(1H,d,J＝13.5 Hz,H‑10b),3.65(3H,s,11‑OCH3),3.36(1H,d,J＝ 15.2Hz,H‑13a),3.12(1H,q,J＝ 7.2Hz,H‑5),3.01(1H,dd,J＝15.2,5.7Hz,H‑13b),2.78(1H,dd,J＝16.2,8.5Hz, H‑6a),2.56(1H,t,J＝7.4Hz,H‑9),2.21(1H,dd,J＝16.4,7.7Hz, 13 H‑6b)；C‑NMR (125MHz,D2O):δppm 51.17(C‑1),149.65(C‑3),99.26(C‑4),38.99(C‑5), 38.74 (C‑6),131.78(C‑7),143.74(C‑8),47.41(C‑9),59.93(C‑10),171.83(C‑11),51.09 (11‑OCH3),64.76(C‑12),178.41(12‑COOH),24.19(C‑13),106.84(C‑14),132.79 (C‑15), 131.78(C‑17),126.43(C‑18),117.94(C‑19),119.39(C‑20),121.65(C‑21), 119.65(C‑ 22)。 [0043] 栀子蓝色素E：蓝色粉末。HRESIMS:m/z 310.0732[M‑H]‑(calcd for C14H16NO5S‑，1 理论值310.0749)。H‑NMR(500MHz,D2O):δppm 7.70(1H,s,H‑3), 5.86(1H,m,H‑7),4.56(1H,dd,J＝6.9,4.1Hz,H‑12),4.24(2H,m,H‑10),4.17(1H, d,J＝9.7Hz,H‑1),3.67(1H,d,J＝ 1.3Hz,11‑OCH3),3.33(1H,dd,J＝11.2,6.8Hz, H‑13a),3.18(1H,dd,J＝11.1,4.1Hz,H‑ 13b),3.10(1H,q,J＝8.4Hz,H‑5),2.75 (1H,m,H‑6a),2.36(1H,m,H‑9),1.94(1H,m,H‑6b) 13 ；C‑NMR(125MHz,D2O): δppm 62.14(C‑1),143.39(C‑3),99.27(C‑4),37.80(C‑5),38.42(C‑6),128.86(C‑7), 144.06(C‑8),46.97(C‑9),59.94(C‑10),171.6(C‑11),51.20(11‑OCH3),68.73 (C‑12),177.47(12‑COOH),32.65(C‑13)。 [0044] 栀子蓝色素G：蓝色粉末。HRESIMS:m/z 326.1256[M+H]‑(calcd for C15H20NO7+，理1 论值326.1240)。H‑NMR(500MHz,D2O):δppm 7.78(1H,s,H‑3), 5.90(1H,d,J＝1.7Hz,H‑7), 4.59(1H,m,H‑6),4.45(1H,d,J＝8.3Hz,H‑1),4.40 (2H,m,H‑10),4.36(1H,m,H‑13),4.12(1H,d,J＝7.3Hz,H‑12),3.80(3H,s, 11‑OCH3),3.23(1H,t,J＝7.7Hz,H‑5),2.54(1H,t,J 13 ＝8.1Hz,H‑9),1.58(3H,d,J ＝6.1Hz,11‑CH3)；C‑NMR(125MHz,D2O):δppm 89.99(C‑1), 141.86(C‑3),97.67 (C‑4),45.97(C‑5),82.18(C‑6),128.44(C‑7),146.81(C‑8),44.64(C‑9),59.79 (C‑10),171.72(C‑11),51.43(11‑OCH3),66.84(C‑12),174.73(12‑COOH), 78.22 (C‑13),18.29(13‑CH3)。 [0045] 栀子蓝色素H：蓝色粉末。HRESIMS:m/z 411.1563[M+H]‑(calcd for C22H23N2O6，计1 算值411.1556)。H‑NMR(500MHz,DMSO‑d6):δppm 7.47(1H,d,J ＝1.1Hz,H‑3),7.39(1H,m,H‑ 19),7.30(1H,m,H‑22),7.05(1H,ddd,J＝8.2,7.0, 1.2Hz,H‑21),6.97(1H,m,H‑20),5.76(1H,t,J＝1.9Hz,H‑7),4.76(1H,d,J＝6.8 Hz,H‑12),4.69(1H,m,H‑1),4.26(1H,d,J＝ 15.0Hz,H‑10a),4.08(1H,d,J＝15.0 Hz,H‑10b),3.58(1H,t,J＝4.8Hz,H‑5),3.55(1H,s, 11‑OCH3),3.24(1H,d,J＝ 15.6Hz,H‑13a),2.92(1H,ddd,J＝15.6,6.9,2.2Hz,H‑13b), 13 2.73(1H,m,H‑9)；C‑NMR(125MHz,DMSO‑d6):δppm 50.01(C‑1),147.13(C‑3),100.90(C‑4), 44.70 (C‑5),79.24(C‑6),129.20(C‑7),148.17(C‑8),44.15(C‑9),58.59(C‑10),168.06 (C‑11),50.49(11‑OCH3),61.26(C‑12),172.27(12‑COOH),23.43(C‑13),105.38 (C‑14), 135.99(C‑15),132.63(C‑17),126.62(C‑18),17.63(C‑19),118.68(C‑20), 120.99(C‑ 21),111.28(C‑22)。 [0046] 实施例2 MAO‑B活性抑制试验 [0047] 1、实验动物 [0048] SD大鼠，220g‑250g，雄性，由上海西普尔‑必凯实验动物有限公司提供，许可证编号：SCXK(沪)2018‑0006。 [0049] 2、MAO的制备 [0050] 选取3只体重约220‑250g的SD雄性大鼠，脱颈致死，于紫外灭菌的超净台中迅速取出肝脏，用0.9％的生理盐水洗涤3次，拭干，保存于‑80℃，备用。制备MAO方法：取肝组织5g，置于0.3mol/L蔗糖溶液175mL中匀浆，将肝匀浆置于高速低温(0～4℃)冷冻离心机中，以1500rpm离心10min，弃去沉淀，取上清液，以10000rpm离心30min，弃去上清，取沉淀混悬于 0.3mol/L 蔗糖溶液4mL中，再加入到1.2mol/L蔗糖溶液40mL中，以10500rpm离心 40min，弃去上清液，所得沉淀为MAO。再用100mmol/L磷酸钾缓冲液(pH7.6) 洗涤1次，加入100mmol/L磷酸钾缓冲液40mL使沉淀混悬，分装成每支EP 管1mL，于‑80℃储存，备用。 [0051] 3、供试品的制备 [0052] 采用100mmol/L磷酸钾缓冲液(pH7.6)将MAO‑B稀释至75mg/mL。待测的栀子蓝色素A、D、E、G、H、栀子苷和6β‑羟基京尼平苷均配置为1mmol/L，分别吸取100ul的MAO‑B和1mmol/L药物(阴性对照为等体积缓冲液)置于1.5 mL离心管中，涡旋混匀，低速离心使反应体系集中于离心管底部，于37℃孵育10min后，同时加入底物2.5mg/mL苄胺50uL，涡旋混匀，低速离心，再 37℃孵育60min后结束反应，立即加入150ul甲醇(此体系产物苯甲醛可充分混溶)停止反应，涡旋混匀，经0.22μm微孔滤膜过滤后，液相检测，色谱条件为：色谱柱：Tnature C18柱(4.6mm×250mm,5μm)；流动相：甲醇(A)‑50mmol/L pH 3.2的磷酸钾缓冲溶液(B)；等度洗脱：0～20min，40％A；柱温35℃；流速：1ml/min，进样体积20uL，检测波长245nm。 [0053] 4、MAO‑B抑制活性比较 [0054] 通过计算给药组苯甲醛吸收峰面积与阴性对照组苯甲醛峰面积的比值表示相对剩余活性以判断药物对MAO‑B抑制活性的强弱，相对剩余活性越小，酶抑制活性越大，具体的实验结果见图1，通过图1的实验结果表明，栀子蓝色素D、 E相比栀子具有显著的MAO‑B酶抑制活性(*表示P＜0.05)，栀子蓝色素G、 H相比6β‑羟基京尼平苷具有显著的MAO‑B酶抑制活性(#表示P＜0.05，##表示＜0.01)。表明本发明制备得到的栀子蓝色素D、E、G、H具有更好的MAO‑B 抑制活性，取得了很好的改进。 [0055] 相对剩余活性＝MAO‑B抑制药物的峰面积/无药阳性对照峰面积×100％ [0056] 5、统计学分析 [0058] 以上实施方式只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人了解本发明内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。 |
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