作为FLT3抑制剂的蝶啶酮衍生物及应用 |
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| 申请号 | CN201610125930.9 | 申请日 | 2016-03-04 | 公开(公告)号 | CN107151249B | 公开(公告)日 | 2020-08-14 |
| 申请人 | 华东理工大学; | 发明人 | 李洪林; 徐玉芳; 陈卓; 孙德恒; 吕剑昆; 赵振江; 宋文琳; 周伟; 杨宇; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及作为FLT3 抑制剂 的蝶啶 酮 衍 生物 及其应用。具体而言，本发明涉及下式I所示的化合物、含有下式I化合物的药物组合物及所述化合物在制备 治疗 FLT3介导的 疾病 或抑制FLT3的药物中的用途： | ||||||
| 权利要求 | 1.以下的化合物或其药学上可接受的盐： |
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| 说明书全文 | 作为FLT3抑制剂的蝶啶酮衍生物及应用技术领域背景技术[0002] 蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase)是一类催化ATP上γ-磷酸转移到蛋白特定氨基酸残基上的蛋白，在细胞内信号转导通路中占有非常重要的地位，并且调节着细胞生长、分化、死亡等一系列生理过程。已有资料表明，超过50％的原癌基因及其产物都具有蛋白酪氨酸激酶活性，它们的异常表达将导致细胞生命周期的紊乱，进而导致肿瘤的发生。此外，酪氨酸激酶的异常表达还与肿瘤的转移、化疗抗性等密切相关。 [0003] FMS样酪氨酸激酶3(FMS-like tyrosine kinase 3，FLT3)属于III型受体酪氨酸激酶家族，FLT3在造血细胞的增殖、分化及凋亡过程中起着重要作用(Oncogene,1993,8,815-822)。FLT3与FLT3配体结合之后，激活多个下游信号通路，包括STAT5、Ras/MAPK及PI3K/AKT通路。在大约三分之一的急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia，AML)患者中存在FLT3突变(Blood,2002,100,1532-1542)，包括近膜结构域14和(或)15号外显子的内部串联重复序列(FLT3-ITD)突变、酪氨酸激酶结构域的激活环中氨基酸的缺失或插入(FLT3-TKD)突变。此外，在急性白血病病例中存在FLT3高表达现象(Blood,2004,103, 1901)，FLT3的过表达、FLT3-ITD突变及FLT3-TKD突变均会导致AML患者预后不良。因此，FLT3成为AML治疗的重要靶标。到目前为止，尚无FLT3抑制剂被批准用于临床使用，众多处于临床试验阶段的FLT3抑制剂的临床效果仍不够理想。 [0004] 因此，提高小分子激酶抑制剂临床有效率正成为当前抗肿瘤靶向药物研发的热点，最有前景的策略即为，开发同时靶向多个与疾病(肿瘤)发生相关的激酶的多靶点抑制剂。 发明内容[0005] 本发明的目的在于提供一种能够抑制FLT3的化合物，所述化合物或含有所述化合物的药物组合物能够用于制备治疗FLT3介导的疾病或抑制FLT3的药物。 [0006] 在第一方面，本发明涉及一种具有通式I所示结构的化合物或其药学上可接受的盐： [0007] [0008] 式中， [0009] X选自：N、CH； [0010] Y选自：O、S和Se； [0011] A选自各种取代的苯环、含氮五元环、含氮六元环，例如 [0012] [0013] R1独立选自：氢、卤素、C1-C8烷基、C3-C6环烷基、含氟C1-C8烷基、任选取代的苯基； [0014] R2选自：氢、任选取代的C1-C6烷基、卤素、任选取代的C1-C6烷氧基、氨基、-NRaRb、羧基、任选取代的烷氧甲酰基、任选取代的N-烷基哌嗪-1-基、任选取代的吗啉-4-基、任选取代的哌啶-1-基、任选取代的吡咯-1-基、任选取代的吡咯烷-1-基、任选取代的芳基或任选取代的芳基甲基、任选取代的哌啶基氧基、任选取代的N,N',N'-三烷基乙二胺基； [0015] Ra和Rb各自独立选自：氢、C1-C6烷基和链烯基；和 [0016] n为0、1、2、3或4； [0017] R3各自独立选自：氢、卤素、羟基、氨基、-NRcRd、C1-C2酰基氨基、任选取代的C1-C6烷基、C1-C3磺酰基氨基、CN、氨基甲酰基、羧基、C1-C6烷氧甲酰基、任选取代的苯基、任选取代的哌嗪基、任选取代的吗啉-4-基、任选取代的吡咯-1-基、任选取代的吡咯烷-1-基； [0018] Rc和Rd各自独立选自：氢、C1-C6烷基和链烯基；和 [0019] m为0、1、2、3或4； [0020] 其中，当n和m均为1时，且R2为C1-C6烷氧基时，R3不为氨基。 [0021] 在具体的实施方式中，所述化合物具有通式II所示结构： [0022] [0023] 式中， [0024] A选自各种取代的苯环； [0025] R1为氢； [0026] R2选自：氢、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C1-C6烷氧基、卤素、氨基、-NRaRb、任选取代的哌嗪基、任选取代的N-烷基哌嗪-1-基、任选取代的哌啶基氧基； [0027] Ra和Rb各自独立选自：氢、C1-C6烷基和链烯基；和 [0028] n为1、2、或3； [0029] R3各自独立选自：氢、卤素、C1-C2酰基氨基、羟基、氨基、-NRcRd、甲磺酰氨基、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的哌嗪基； [0030] Rc和Rd各自独立选自：氢、C1-C3烷基和链烯基；和 [0031] m为1、2、或3。 [0032] 在具体的实施方式中，所述化合物具有通式III所示结构： [0033] [0034] 式中， [0035] R4选自：氢、卤素、任选取代的C1-C6烷氧基、任选取代的C1-C6烷基； [0036] R5选自：任选取代的N-烷基哌嗪-1-基、任选取代的哌啶基氧基； [0037] R6选自：氨基、任选取代的哌嗪基、-NReRf； [0038] Re和Rf各自独立选自：氢、C1-C3烷基和链烯基。 [0039] 在具体的实施方式中，R4选自任选取代的C1-C6烷基，优选C1-C3烷基；R5选自任选取代的N-烷基哌嗪-1-基；R6选自氨基、或-NReRf；Re和Rf各自独立选自氢、和C1-C3烷基。 [0040] 在第二方面，本发明提供选自下组的具体化合物或其药学上可接受的盐： [0041] [0042] [0043] [0044] [0045] 在第三方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物含有本发明第一或第二方面所述的化合物或其药学上可接受的盐，和药学上可接受的载体或赋形剂。 [0046] 在第四方面，本发明提供本发明第一或第二方面所述的化合物在制备治疗FLT3介导的疾病，或抑制FLT3的药物中的用途。 [0048] 在进一步的具体实施方式中，所述癌症选自急性骨髓性白血病(AML)、混合系白血病(MLL)、T-细胞急性白血病(T-ALL)、B细胞急性白血病(B-ALL)、慢性骨髓单细胞性白血病(CMML)、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞白血病、慢性中性粒细胞白血病。 [0049] 在进一步的具体实施方式中，所述免疫性疾病选自关节炎、狼疮、炎性肠病、类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、骨关节炎、斯蒂尔病、青少年关节炎、糖尿病、重症肌无力症、桥本甲状腺炎、奥德甲状腺炎、格雷夫斯病、类风湿性关节炎综合征、多发性硬化症、传染性神经元炎、急性传播性脑脊髓炎、阿狄森病、再生障碍性贫血、自身免疫性肝炎、视神经炎、银血病、移植物抗宿主病、移植、输血过敏反应、变态反应、I型超敏反应、过敏性结膜炎、过敏性鼻炎、特应性皮炎。 [0051] 图1A显示了用Western blot分析法测定到化合物F-8可以使FLT3自磷酸化并抑制下游信号通路的磷酸化作用；图1B显示了通过48小时的细胞培养，在不同浓度下化合物20诱导的MV4-11细胞凋亡；图1C显示了在48小时培养后，用特定浓度的化合物20来抑制G1期的细胞生长； [0052] 图2显示了MV4-11移植瘤模型中的肿瘤体积变化； [0053] 图3显示了MV4-11移植瘤模型中的肿瘤重量变化。 具体实施方式[0054] 发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现一批结构全新的蝶啶酮衍生物，这些衍生物对FLT3的抑制活性IC50值达到nM级别；对相关细胞的抑制活性IC50值达到μM级别。在此基础上完成了本发明。 [0055] 本发明人合成了一系列具有FLT3抑制活性的未见文献报道的蝶啶酮衍生物，并对这些化合物进行了结构表征。对此系列化合物进行了分子水平和细胞水平的活性测试，得到一批具有抑制FLT3活性的化合物。其中多个化合物，例如F-8和F-16对FLT3的抑制活性IC50值低于10nM，远优于阳性对照MLN518。 [0056] 术语定义 [0057] 对于本文中涉及到的一些术语作如下说明： [0058] 本文中，“烷基”指碳链长度为1-10个碳原子的饱和的支链或直链烷基，优选的烷基包括长2-8个碳原子、1-6个、1-4个碳原子、3-8个碳原子、1-3个碳原子不等的烷基。烷基的例子包括但不限于：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、庚基等。本发明的烷基可以被1个或多个取代基取代，例如被卤素或卤代烷基取代。例如，烷基可以是被1-4个氟原子取代的烷基，或者烷基可以是被氟代烷基取代的烷基。 [0059] 本文中，“烷氧基”指被烷基取代的氧基。优选的烷氧基是长1-6个碳原子的烷氧基，更优选为长1-4个碳原子的烷氧基。烷氧基的例子包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基等。 [0060] 本文中，“链烯基”通常表示具有至少一个双键的单价烃基，通常含有2-8个碳原子，优选含有2-6个碳原子，可以是直链或支链。链烯基的例子包括但不限于乙烯基、丙烯基、异丙烯基、丁烯基、异丁烯基、己烯基等等。 [0061] 本文中，“卤素原子”或“卤素”指氟、氯、溴和碘。 [0062] “芳基”是指含有6到14个碳原子的单环、双环或三环芳族基团，包括苯基、萘基、菲基、蒽基、茚基、茀基、四氢化萘基、二氢化茚基等。芳基可任选地被1-5个(例如，1、2、3、4或5个)选自以下的取代基取代：卤素、C1-4醛基、C1-6烷基、氰基、硝基、氨基、羟基、羟甲基、卤素取代的烷基(例如三氟甲基)、卤素取代的烷氧基(例如三氟甲氧基)、羧基、C1-4烷氧基、乙氧甲酰基、N(CH3)和C1-4酰基等、杂环基或杂芳基等。 [0063] 本文中，“芳烷基”指被芳基取代的烷基，例如被苯基取代的C1-C6烷基。芳烷基的例子包括但不限于芳基甲基、芳基乙基等，例如苄基、苯乙基等。 [0064] 例如，芳基可以被1-3个选自以下的基团取代：卤素、-OH、C1-4烷氧基、C1-4烷基、-NO2、-NH2、-N(CH3)2、羧基和乙氧甲酰基等。 [0065] 本文所用的“5元或6元杂环”包括但不限于含有1-3个选自O、S和N的杂原子的杂环基团，包括但不限于呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡咯烷基、吡唑基、咪唑基、三唑基、噁唑基、吡喃基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哌啶基、吗啉基等。 [0066] 本文所用“杂芳基”是指含有5-14个环原子，并且有6个、10个或14个电子在环体系上共用。而且所含环原子是碳原子和从氧、氮、硫中任选的1-3个杂原子。可用于本发明的杂芳基包括哌嗪基、吗啉基、哌啶基、吡咯烷基、噻吩基、呋喃基、吡喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、包括但不限制于2-吡啶基、3-吡啶基和4-吡啶基、吡嗪基、嘧啶基等。 [0067] 杂芳基或5元或6元杂环可任选地被1-5个(例如，1、2、3、4或5个)选自以下的取代基取代：卤素、C1-4醛基、C1-6直链或支链烷基、氰基、硝基、氨基、羟基、羟甲基、卤素取代的烷基(例如三氟甲基)、卤素取代的烷氧基(例如三氟甲氧基)、羧基、C1-4烷氧基、乙氧甲酰基、N(CH3)和C1-4酰基。 [0068] 本文中，“酰氧基”指结构式为“-O-C(O)-R”的基团，其中，R可选自烷基、链烯基和炔基。所述R可任选地被取代。 [0069] 本文中，“酰氨基”指结构式为“-R’-NH-C(O)-R”的基团，其中，R’可选自键或烷基，R可选自烷基、链烯基、炔基、被NRaRb取代的烷基、被NRaRb取代的链烯基和NRaRb取代的炔基、被卤素取代的烷基、被氰基取代的链烯基、 其中，Ra和Rb可选自烷基和链烯基。 [0070] 本文中，“任选取代的”指其所修饰的取代基可任选地被1-5个(例如，1、2、3、4或5个)选自以下的取代基取代：卤素、C1-4醛基、C1-6直链或支链烷基、氰基、硝基、氨基、羟基、羟甲基、卤素取代的烷基(例如三氟甲基)、卤素取代的烷氧基(例如三氟甲氧基)、羧基、C1-4烷氧基、乙氧甲酰基、N(CH3)和C1-4酰基。 [0071] 本发明的化合物 [0072] 本发明的化合物是具有通式I所示结构的化合物或其药学上可接受的盐： [0073] [0074] 式中， [0075] X选自N、CH； [0076] Y选自O、S和Se； [0077] A选自各种取代的苯环、含氮五元环、含氮六元环，例如 [0078] [0079] R1独立选自氢、卤素、C1-C8烷基、C3-C6环烷基、含氟C1-C8烷基、任选取代的苯基； [0080] R2选自氢、任选取代的C1-C6烷基、卤素、任选取代的C1-C6烷氧基、氨基、-NRaRb、羧基、任选取代的烷氧甲酰基、任选取代的N-烷基哌嗪-1-基、任选取代的吗啉-4-基、任选取代的哌啶-1-基(优选哌嗪取代的哌啶-1-基)、任选取代的吡咯-1-基、任选取代的吡咯烷-1-基、任选取代的芳基或任选取代的芳基甲基、任选取代的哌啶基氧基、任选取代的N,N',N'-三烷基乙二胺基； [0081] Ra和Rb各自独立选自氢、C1-C6烷基和链烯基；和 [0082] n为0、1、2、3或4； [0083] R3各自独立选自氢、卤素、羟基、氨基、-NRcRd、C1-C2酰基氨基、任选取代的C1-C6烷基、C1-C3磺酰基氨基、CN、氨基甲酰基、羧基、C1-C6烷氧甲酰基、任选取代的苯基、任选取代的哌嗪基、任选取代的吗啉-4-基、任选取代的吡咯-1-基、任选取代的吡咯烷-1-基； [0084] Rc和Rd各自独立选自：氢、C1-C6烷基和链烯基；和 [0085] m为0、1、2、3或4； [0086] 其中，当n和m均为1时，且R2为C1-C6烷氧基时，R3不为氨基。 [0087] 在具体的实施方式中，所述化合物具有通式II所示结构： [0088] [0089] 式中， [0090] A选自各种取代的苯环； [0091] R1为氢； [0092] R2选自氢、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C1-C6烷氧基、卤素、氨基、-NRaRb、任选取代的哌嗪基、任选取代的N-烷基哌嗪-1-基、任选取代的哌啶基氧基； [0093] Ra和Rb各自独立选自氢、C1-C6烷基和链烯基；和 [0094] n为1、2、或3； [0095] R3各自独立选自氢、卤素、C1-C2酰基氨基、羟基、氨基、-NRcRd、C1-C3磺酰基氨基(优选甲磺酰氨基)、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的哌嗪基、任选取代的N-烷基哌嗪-1-基； [0096] Rc和Rd各自独立选自氢、C1-C3烷基和链烯基；和 [0097] m为1、2、或3。 [0098] 在优选的实施方式中，所述化合物具有通式III所示结构： [0099] [0100] 式中， [0101] R4选自氢、卤素、任选取代的C1-C6烷氧基、任选取代的C1-C6烷基； [0102] R5选自任选取代的N-烷基哌嗪-1-基、任选取代的哌啶基氧基； [0103] R6选自氨基、任选取代的哌嗪基、-NReRf； [0104] Re和Rf各自独立选自氢、C1-C3烷基和链烯基。 [0105] 在进一步优选的实施方式中： [0106] R4选自任选取代的C1-C6烷基，优选C1-C3烷基； [0107] R5选自任选取代的N-烷基哌嗪-1-基； [0108] R6选自氨基、或-NReRf； [0109] Re和Rf各自独立选自氢、和C1-C3烷基。 [0110] 本发明人合成得到了一系列结构未见文献报道的蝶啶酮类化合物；具体地说，本发明人合成得到了选自下组的化合物或其药学上可接受的盐： [0111] [0112] [0113] [0114] [0115] 在优选的实施方式中，本发明人合成得到选自下组的化合物或其药学上可接受的盐： [0116] [0117] 在进一步优选的实施方式中，本发明人合成得到选自下组的化合物或其药学上可接受的盐： [0118] [0119] 在本发明的化合物的基础上，本发明提供一种药物组合物，该组合物含有治疗有效量的本发明的化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体或赋形剂。 [0120] 本发明化合物的药学上可接受的盐的例子包括但不限于无机和有机酸盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、富马酸盐、扁桃酸盐和草酸盐；以及与碱例如钠羟基、三(羟基甲基)胺基甲烷(TRIS,胺丁三醇)和N-甲基葡糖胺形成的无机和有机碱盐。 [0121] 虽然每个人的需求各不相同，本领域技术人员可确定本发明药物组合物中每种活性成分的最佳剂量。一般情况下，本发明的化合物或其药学上可接受的盐，对哺乳动物每天口服给药，药量按照约0.0025到50毫克/公斤体重。但最好是每公斤口服给药约0.01到10毫克。例如，单位口服剂量可以包括约0.01到50毫克，最好是约0.1到10毫克的本发明化合物。单位剂量可给予一次或多次，每天为一片或多片，每片含有约0.1到50毫克，合宜地约0.25到10毫克的本发明化合物或其溶剂化物。 [0122] 本发明的药物组合物可被配制成适合各种给药途径的制剂形式，包括但不限于被配制成用于肠外，皮下，静脉，肌肉，腹腔内，透皮，口腔，鞘内，颅内，鼻腔或外用途径给药的形式，用于治疗肿瘤和其他疾病。给药量是有效地改善或消除一个或多个病症的药量。对于特定疾病的治疗，有效量是足以改善或以某些方式减轻与疾病有关的症状的药量。这样的药量可作为单一剂量施用，或者可依据有效的治疗方案给药。给药量也许可治愈疾病，但是给药通常是为了改善疾病的症状。一般需要反复给药来实现所需的症状改善。药的剂量将根据病人的年龄，健康与体重，并行治疗的种类，治疗的频率，以及所需治疗效益来决定。 [0123] 本发明的药物制剂可以给予任何哺乳动物，只要他们能获得本发明化合物的治疗效果。在这些哺乳动物中最为重要的是人。 [0124] 本发明的化合物或其药物组合物可用于治疗各种由FMS样酪氨酸激酶3(FLT3)介导的疾病。在本文中，所述FLT3介导的疾病为血液病，如骨髓增殖性疾病，癌症，免疫性疾病，以及皮肤病，如银屑病和特应性皮炎。 [0125] 在具体的实施方式中，所述癌症选自急性骨髓性白血病(AML)、混合系白血病(MLL)、T-细胞急性白血病(T-ALL)、B细胞急性白血病(B-ALL)、慢性骨髓单细胞性白血病(CMML)、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞白血病、慢性中性粒细胞白血病。 [0126] 在其它实施方式中，所述免疫性疾病选自关节炎、狼疮、炎性肠病、类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、骨关节炎、斯蒂尔病、青少年关节炎、糖尿病、重症肌无力症、桥本甲状腺炎、奥德甲状腺炎、格雷夫斯病、类风湿性关节炎综合征、多发性硬化症、传染性神经元炎、急性传播性脑脊髓炎、阿狄森病、再生障碍性贫血、自身免疫性肝炎、视神经炎、银血病、移植物抗宿主病、移植、输血过敏反应、变态反应、I型超敏反应、过敏性结膜炎、过敏性鼻炎、特应性皮炎。 [0127] 本发明的药物制剂可用已知的方式制造。例如，由传统的混合，制粒，制锭，溶解，或冷冻干燥过程制造。制造口服制剂时，可结合固体辅料和活性化合物，选择性研磨混合物。如果需要或必要时加入适量助剂后，加工颗粒混合物，获得片剂或锭剂芯。 [0128] 合适的辅料特别是填料，例如糖类如乳糖或蔗糖，甘露醇或山梨醇；纤维素制剂或钙磷酸盐，例如磷酸三钙或磷酸氢钙；以及粘结剂，例如淀粉糊，包括玉米淀粉，小麦淀粉，大米淀粉，马铃薯淀粉，明胶，黄芪胶，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，羧甲基纤维素钠，或聚乙烯吡咯烷酮。如果需要，可增加崩解剂，比如上面提到的淀粉，以及羧甲基淀粉，交联聚乙烯吡咯烷酮，琼脂，或褐藻酸或其盐，如海藻酸钠.辅助剂特别是流动调节剂和润滑剂，例如，硅石，滑石，硬脂酸盐类，如镁硬脂酸钙，硬脂酸或聚乙二醇。如果需要，可以給锭剂核芯提供可以抵抗胃液的合适包衣。为此，可以应用浓缩糖类溶液。这个溶液可以含有阿拉伯树胶，滑石，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙二醇和/或二氧化钛，漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。为了制备耐胃液的包衣，可使用适当的纤维素溶液，例如醋酸纤维素邻苯二甲酸或羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸。可向药片或锭剂核芯的包衣加入染料或色素。例如，用于识别或为了表征活性成分剂量的组合。 [0129] 基于上述化合物和药物组合物，本发明进一步提供一种治疗FLT3介导的疾病的方法，该方法包括给予需要的对象以本发明的化合物或药物组合物。 [0130] 给药方法包括但不限于本领域周知的各种给药方法，可根据患者的实际情况加以确定。这些方法包括但不限于肠外，皮下，静脉，肌肉，腹腔内，透皮，口腔，鞘内，颅内，鼻腔或外用途径给药。 [0131] 本发明也包括本发明化合物在制备治疗FLT3介导的疾病，或抑制FLT3的药物中的用途。 [0132] 本发明的优点： [0133] 1.本发明提供的化合物是一种结构全新的蝶啶酮衍生物； [0134] 2.本发明提供的化合物对FLT3具有优异的抑制活性； [0135] 3.本发明提供的化合物为开发能抑制FLT3的靶向药物奠定了基础，具备极大的产业化和商品化前景以及市场价值，经济效益显著。 [0136] 以下结合具体实施案例对本发明的技术方案进一步描述，但以下实施案例不构成对本发明的限制，所有依据本发明的原理和技术手段采用的各种施用方法，均属于本发明范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。 [0137] 抑制剂合成部分 [0138] 在以下的实施例中将进一步举例说明本发明。这些实施例仅用于说明本发明，但不以任何方式限制本发明。 [0139] [0140] 蝶啶酮母核衍生物的合成路线 [0141] 上述制备流程中，R1-R4的定义如上文所述。本领域技术人员可根据实际制备需要，采用本领域常规获得的各种起始化合物为原料，制备本发明的化合物。 [0142] 实施例1 [0143] 1)8-(4-氨基苯基)-2-(4-甲氧基-2-甲基苯基)-7(8H)-蝶啶酮(F-1)的合成[0144] ①(4-氨基苯基)氨基甲酸叔丁酯的合成 [0145] [0146] 称取对苯二胺(890mg，8.23mmol)置于100mL圆底烧瓶中，加入40mL二氯甲烷，冰浴下搅拌，另取二碳酸二叔丁酯(449mg，2.06mmol)溶于二氯甲烷当中，滴加到上述反应液当中，然后继续在室温下搅拌过夜。反应结束，旋转蒸发除溶剂，粗品经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝3:1，v/v)分离，得到(4-氨基苯基)氨基甲酸叔丁酯398mg，产率93％。 [0147] 1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.14(d,J＝8.0Hz,2H),6.65(d,J＝8.4Hz,2H),6.26(s,1H),1.52(s,9H).熔点112-113℃，文献值[97]112-114℃。 [0148] ②(4-(2-氯-5-硝基嘧啶-4-氨基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(B-1)的合成 [0149] [0150] 称取2,4-二氯-5-硝基嘧啶(190mg，0.98mmol)，加入6mL1,4-二氧六环，置于25mL圆底烧瓶中，室温下搅拌，取(4-氨基苯基)氨基甲酸叔丁酯(200mg，0.96mmol)、N,N-二异丙基乙胺(137mg，1.06mmol)溶于4mL 1,4-二氧六环，缓慢滴加到上述反应液中，滴加完后继续在室温下搅拌1小时左右，TLC监测反应完全转化。旋转蒸发除溶剂，粗品经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝10:1，v/v)分离，得到(4-(2-氯-5-硝基嘧啶-4-氨基)苯基)氨基甲酸叔丁酯橙色固体301mg，产率82％。 [0151] 1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.38(s,1H),9.47(s,1H),9.12(s,1H),7.49(d,J＝+8.4Hz,2H),7.39(d,J＝8.4Hz,2H),1.49(s,9H).LC-MS计算值C15H17ClN5O4[M+H]366.09,实验值366.00。 [0152] ③(4-(2-(4-甲氧基-2-甲基苯基氨基)-5-硝基嘧啶-4-氨基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(C-1)的合成 [0153] [0154] 称取(4-(2-氯-5-硝基嘧啶-4-氨基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(150mg，0.41mmol)、4-甲氧基-2-甲基苯胺(51mg，0.37mmol)、N,N-二异丙基乙胺(145mg，1.12mmol)置于25mL圆底烧瓶中，加入10mL 1,4-二氧六环，室温搅拌过夜。反应结束后，旋转蒸发除去溶剂，粗品经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝5:1，v/v)纯化，得到(4-(2-(4-甲氧基-2-甲基苯基氨基)-5-硝基嘧啶-4-氨基)苯基)氨基甲酸叔丁酯黄色固体148mg，产率85％。 [0155] 1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.22(s,1H),9.86(s,1H),9.33(s,1H),9.06(s,1H),7.60(s,1H),7.36(d,J＝8.4Hz,2H),7.27-7.23(m,2H),6.85(s,1H),6.79(d,J＝7.6Hz, 1H),3.82(s,3H),2.15(s,3H),1.48(s,9H).ESI计算值C23H27N6O5[M+H]+467.20,实验值 467.20。 [0156] ④(4-(2-(4-甲氧基-2-甲基苯基氨基)-7-氧代-8(7H)-蝶啶基)苯基)氨基甲酸叔丁酯的合成(E-1)的合成 [0157] [0158] 称取(4-(2-(4-甲氧基-2-甲基苯基氨基)-5-硝基嘧啶-4-氨基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(100mg，0.21mmol)置于250mL圆底烧瓶中，加入100mL甲醇、100mL二氯甲烷和20mg钯碳(10％Pd)，通入氢气，室温搅拌过夜。反应结束后，抽滤，将滤液旋干，得粗产品88mg，产品未经纯化，直接用于下一步反应。 [0159] 将上一步反应得到的产品置于50mL圆底烧瓶中，加入0.6mL冰醋酸、10mL无水乙醇，然后加入乙醛酸乙酯(50％甲苯溶液)(0.044mL,0.22mmol)，加热至回流搅拌过夜。反应结束后，有固体析出，抽滤，滤饼用乙醇洗涤，烘干。粗产物经硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝50:1，v/v)分离纯化，得到(4-(2-(4-甲氧基-2-甲基苯基氨基)-7-氧代-8(7H)-蝶啶基)苯基)氨基甲酸叔丁酯黄色固体61mg，产率64％。 [0160] 1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.55(s,1H),9.17(s,1H),8.76(s,1H),7.98(s,1H),7.56(d,J＝8.8Hz,2H),7.22(d,J＝7.6Hz,2H),7.16(s,1H),6.69(s,1H),6.54(s,1H),3.70(s,3H),2.11(s,3H),1.51(s,9H).ESI计算值C25H27N6O4[M+H]+475.20,实验值475.20。 [0161] ⑤8-(4-氨基苯基)-2-(4-甲氧基-2-甲基苯基)-7(8H)-蝶啶酮(F-1)的合成[0162] [0163] 称取(4-(2-(4-甲氧基-2-甲基苯基氨基)-7-氧代-8(7H)-蝶啶基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(50mg,0.11mmol)置于25mL圆底烧瓶中,加入6mL二氯甲烷，0℃下搅拌，加入1.5mL三氟乙酸。继续在0℃下搅拌1小时，后室温下搅拌2小时。反应结束后，加入饱和碳酸氢钠溶液中和至溶液偏碱性，用二氯甲烷萃取，有机相用去离子水洗涤，无水硫酸钠干燥，将溶剂旋干。粗产物经硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝30:1，v/v)分离纯化，得到8-(4-氨基苯基)-2-(4-甲氧基-2-甲基苯基)-7(8H)-蝶啶酮黄色固体32mg，产率82％,mp 149.1-149.3℃。 [0164] 1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.13(s,1H),8.72(s,1H),7.95(s,1H),7.21(s,1H),6.94(d,J＝8.0Hz,2H),6.72(s,1H),6.65(d,J＝8.4Hz,2H),6.60(s,1H),5.33(br,2H), 3.72(s,3H),2.13(s,3H).HRMS(ESI)计算值C20H19N6O2[M+H]+375.1569,实验值375.1573。 HPLC purity:96.0％，retention time＝11.68min. [0165] 2)8-(4-氨基苯基)-2-(3-氯-4-甲氧基苯基)-7(8H)-蝶啶酮(F-2)的合成[0166] [0167] 合成方法参照F-1，得黄色固体，产率75％，mp>300℃。 [0168] 1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.13(s,1H),8.84(s,1H),8.03(s,1H),7.60(s,1H),7.38(s,1H),6.98(d,J＝8.4Hz,2H),6.87(s,1H),6.72(d,J＝8.4Hz,2H),5.39(br,2H), 3.79(s,3H).HRMS(ESI)计算值C19H16ClN6O2[M+H]+395.1023,实验值395.1027。HPLC purity:97.0％，retention time＝11.55min. [0169] 3)8-(4-氨基苯基)-2-(3-氟-4-甲氧基苯基)-7(8H)-蝶啶酮(F-3)的合成[0170] [0171] 合成方法参照F-1，得黄色固体，产率73％，mp>300℃。 [0172] 1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.14(s,1H),8.85(s,1H),8.03(s,1H),7.42(s,1H),7.19(s,1H),6.98(d,J＝8.4Hz,2H),6.89(s,1H),6.72(d,J＝8.4Hz,2H),5.38(br,2H), 3.77(s,3H).HRMS(ESI)计算值C19H16FN6O2[M+H]+379.1319,实验值379.1323。HPLC purity: 96.3％，retention time＝11.68min. [0173] 4)N-(4-(2-(4-甲氧基苯基氨基)-7-氧代-8(7H)-蝶啶基)苯基)乙酰胺(E-4)的合成 [0174] [0175] 合成方法参照E-1，得黄色固体，产率62％，mp>300℃。 [0176] 1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.23(s,1H),10.10(s,1H),8.85(s,1H),8.04(s,1H),7.78(d,J＝7.2Hz,2H),7.34(d,J＝7.6Hz,4H),6.61(s,2H),3.67(s,3H),2.13(s,3H).HRMS(ESI)计算值C21H19N6O3[M+H]+403.1519,实验值403.1500。HPLC purity:97.5％，retention time＝10.54min. [0177] 5)N-(4-(2-((4-甲基苯基)氨基)-7-氧代-8(7H)蝶啶基)苯基)甲基磺酰胺(G-5)的合成 [0178] [0179] 称取8-(4-氨基苯基)-2-(4-甲氧基苯基)-7(8H)-蝶啶酮(100mg,0.277mmol)，三乙胺(0.232mL，1.662mmol)置于25mL圆底烧瓶中，加入15mL无水二氯甲烷，冰浴下搅拌。称取甲基磺酰氯(0.172mL，2.216mmol)溶于2mL的二氯甲烷中，将其缓慢滴加到上述反应液当中，滴加完后冰浴下继续搅拌1小时，室温搅拌过夜。TLC跟踪至原料完全转化。旋干溶剂，加入饱和碳酸氢钠溶液中和至溶液偏碱性，用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥。粗品经硅胶柱层析(二氯甲烷/乙酸乙酯/甲醇＝100:50:1，v/v)纯化，得到N-(4-(2-((4-甲基苯基)氨基)-7-氧代-8(7H)蝶啶基)苯基)甲基磺酰胺黄色固体54mg，产率47％，mp>300℃。 [0180] 1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.11(br,1H),8.84(s,1H),8.03(s,1H),7.40(s,4H),7.31(br,2H),6.66(br,2H),3.69(s,3H),3.12(s,3H).HRMS(ESI)计算值C20H19N6O4S[M+H]+ 439.1189,实验值439.1187。HPLC purity:95.4％，retention time＝11.70min.[0181] 6)8-(4-氨基苯基)-2-((3-氯-4-(4-甲基-1-哌嗪基)苯基)氨基)-7(8H)蝶啶酮(F-6)的合成 [0182] [0183] 合成方法参照F-1，得黄色固体，产率62％，mp>300℃。 [0184] 1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.13(br,1H),8.85(s,1H),8.03(s,1H),7.60(s,1H),7.37(d,J＝7.6Hz,1H),6.97(d,J＝8.4Hz,2H),6.89(d,J＝7.6Hz,1H),6.71(d,J＝8.4Hz, 2H),5.38(s,2H),2.89(br,4H),2.47(br,4H),2.34(s,3H).HRMS(ESI)计算值C23H24ClN8O[M+H]+463.1762,实验值463.1710。HPLC purity:98.7％，retention time＝9.64min.[0185] 7)8-(4-氨基苯基)-2-((3-氟-4-(4-甲基-1-哌嗪基)苯基)氨基)-7(8H)蝶啶酮(F-7)的合成 [0186] [0187] 合成方法参照F-1，得黄色固体，产率64％，mp 238.2-238.7℃。 [0188] 1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.13(br,1H),8.84(s,1H),8.02(s,1H),7.32(d,J＝12.4Hz,1H),7.19(d,J＝7.2Hz,1H),6.97(d,J＝8.4Hz,2H),6.77(br,1H),6.72(d,J＝ 8.4Hz,2H),5.39(s,2H),2.92-2.90(m,4H),2.45(br,4H),2.22(s,3H).HRMS(ESI)计算值+ C23H24FN8O[M+H] 447.2057,实验值447.2057。HPLC purity:96.9％,retention time＝ 9.12min. [0189] 8)8-(4-氨基苯基)-2-((3-甲基-4-(4-甲基-1-哌嗪基)苯基)氨基)-7(8H)蝶啶酮(F-8)的合成 [0190] [0191] 合成方法参照F-1，得黄色固体，产率74％，mp 255.6-256.3℃。 [0192] 1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.94(br,1H),8.80(s,1H),7.99(s,1H),7.36(br,1H),7.18(d,J＝6.4Hz,1H),6.97(d,J＝8.4Hz,2H),6.79(d,J＝8.4Hz,1H),6.71(d,J＝8.4Hz, 2H),5.37(s,2H),2.76-2.74(m,4H),2.47(br,4H),2.24(s,3H),2.06(s,3H).HRMS(ESI)计算值C24H27N8O[M+H]+443.2308，实验值443.2301。HPLC purity:99.2％,retention time＝ 9.44min. [0193] 9)8-(4-氨基苯基)-2-((3-甲氧基-4-(4-甲基-1-哌嗪基)苯基)氨基)-7(8H)蝶啶酮(F-9)的合成 [0194] [0195] 合成方法参照F-1，得橙黄色固体，产率63％，mp 147.4-147.9℃。 [0196] 1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.94(br,1H),8.81(s,1H),7.99(s,1H),7.09(s,2H),6.97(d,J＝8.4Hz,2H),6.70(d,J＝8.4Hz,2H),6.60(br,1H),5.41(s,2H),3.56(s,3H), 2.87(br,4H),2.43(br,4H),2.21(s,3H).HRMS(ESI)计算值C24H27N8O2[M+H]+459.2257,实验值459.2256。HPLC purity:98.0％,retention time＝8.75min. [0197] 10)8-(4-氨基苯基)-2-((3-甲基-4-(1-甲基-4-氧代哌啶基)苯基)氨基)-7(8H)蝶啶酮(F-10)的合成 [0198] [0199] 合成方法参照F-1，得黄色固体，产率52％，mp 228.9-229.4℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.97(br,1H),8.81(s,1H),7.99(s,1H),7.36(d,J＝2.0Hz,1H),7.16(br,1H),6.97(d,J＝8.8Hz,2H),6.70(d,J＝8.4Hz,3H),5.39(s,2H),4.37(s,1H),2.92(s,2H),2.75(s,2H),2.01(s,6H),1.81-1.71(m,2H),1.34-1.19(m,1H).HRMS(ESI)计算值C25H28N7O2[M+H]+458.2304,实验值458.2289。HPLC purity:99.3％,retention time＝10.29min.[0200] 11)N-(4-(2-(4-(4-甲基-1-哌嗪基)氨基)-7-氧代-8(7H)-蝶啶酮)苯基)乙酰胺(E-11)的合成 [0201] [0202] 合成方法参照E-1，得橙红色固体，产率58％，mp 288.0-288.7℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.44(s,1H),10.05(s,1H),8.82(s,1H),8.02(s,1H),7.80(d,J＝8.0Hz,2H),7.32(d,J＝8.4Hz,2H),7.25(br,2H),6.64(br,2H),3.24(br,4H),3.05(br,4H),2.64(s, 3H),2.15(s,3H).HRMS(ESI)计算值C25H27N8O2[M+H]+471.2257,实验值471.2213。HPLC purity:97.3％,retention time＝8.17min. [0203] 12)N-(4-(2-((4-(4-甲基-1-哌嗪基)苯基)氨基)-7-氧代-8(7H)蝶啶基)苯基)甲基磺酰胺(G-12)的合成 [0204] [0205] 合成方法参照F-1，得橙红色固体，产率86％。 [0206] 1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.98(s,1H),8.78(s,1H),7.98(s,1H),7.32(d,J＝6.4Hz,2H),6.97(d,J＝8.8Hz,2H),6.74(d,J＝8.0Hz,2H),6.67(br,2H),3.04-3.02(m, 4H),2.45-2.43(m,4H),2.22(s,3H).HRMS(ESI)计算值C23H25N8O[M+H]+429.2151,实验值 429.2153。 [0207] ①N-(4-(2-((4-(4-甲基-1-哌嗪基)苯基)氨基)-7-氧代-8(7H)蝶啶基)苯基)甲基磺酰胺(G-12)的合成 [0208] [0209] 合成方法参照G-5，得黄色固体，产率50％，mp>300℃。 [0210] 1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.02(s,1H),8.82(s,1H),8.02(s,1H),7.42-7.37(m,4H),7.26(br,2H),6.66(br,2H),3.13(s,3H),3.07(br,4H),2.54(br,4H),2.29(s,3H)。 + HRMS(ESI)计算值C24H27N8O3S[M+H] 507.1927,实验值507.1926。HPLC purity:99.0％,retention time＝8.53min. [0211] 13)8-(4-氨基苯基)-2-((4-(4-甲基-1-哌嗪基)苄基)氨基)-7(8H)蝶啶酮(F-13)的合成 [0212] [0213] 合成方法参照F-1，得黄色固体，产率65％，mp 216.2-216.8℃。 [0214] 1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.99(s,1H),8.82(s,1H),8.01(s,1H),7.55(d,J＝8.0Hz,2H),7.32(d,J＝8.4Hz,2H),7.20(s,2H),6.59(s,2H),3.86(s,2H),3.00-2.99(m, 4H),2.44-2.41(m,4H),2.21(s,3H).HRMS(ESI)计算值C24H27N8O[M+H]+443.2308,实验值 443.2304。HPLC purity:97.4％,retention time＝6.92min. [0215] 14)2-((4-(4-甲基-1-哌嗪基)苯基)氨基)-8-(4-(1-哌嗪基)苯基)-7(8H)蝶啶酮(F-14)的合成 [0216] [0217] 合成方法参照F-1，得黄色固体，产率72％，mp 276.6-277.2℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.01(s,1H),8.81(s,1H),8.00(s,1H),7.26(d,J＝6.8Hz,2H),7.20(d,J＝8.8Hz,2H),7.12(d,J＝8.8Hz,2H),6.58(s,2H),3.19-3.17(m,4H),3.02-3.00(m,4H), 2.90-2.88(m,4H),2.45-2.43(m,4H),2.22(s,3H).HRMS(ESI)计算值C27H32N9O[M+H]+ 498.2730,实验值498.2728。HPLC purity:98.6％,retention time＝7.86min. [0218] 15)8-(3-氨基苯基)-2-((4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)氨基)蝶啶-7(8H)-酮.(F-15) [0219] [0220] 合成方法参照F-1，得黄色固体，收率70％,mp 262.5-262.9℃. [0221] 1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.01(s,1H),8.81(s,1H),7.99(s,1H),7.35(d,J＝7.2Hz,2H),7.22(t,J＝8.0Hz,1H),6.75(d,J＝7.2Hz,1H),6.66(br,2H),6.52(br,1H), 6.48(d,J＝8.0Hz,1H),5.35(s,2H),3.02(br,4H),2.46-2.44(m,4H),2.23(s,3H).HPLC purity:99.5％,retention time＝8.57min.HRMS(ESI)(m/z):[M+H]+calcd for C23H25N8O, 429.2151；found,429.2151. [0222] 16)8-(4-N,N-二甲氨基苯基)-2-((3-甲基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)氨基)蝶啶-7(8H)-酮.(F-16) [0223] [0224] 将原料1置于250ml圆底烧瓶中，加入DCM和MeOH溶解，称取100mg钯碳(10％Pd)，通入氢气，室温下反应约10h后，抽滤，滤液减压蒸去溶剂，产品未经纯化，直接用于下一步。称取原料2(0.3g,0.69mmol)于50ml圆底烧瓶，加入适量乙醇溶解，搅拌下加入乙醛酸乙酯(50％甲苯溶液)0.21ml(1.04mmol)与0.6ml冰醋酸，升温至回流，TLC跟踪反应至原料2转化完全，将反应液冷却至室温后抽滤，滤饼硅胶柱层析(DCM:MeOH＝80:1)，得黄色粉末状固体120mg。 [0225] 1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.02(br,1H),8.83(s,1H),8.01(s,1H),7.28(s,1H),7.15(d,J＝8.8Hz,3H),6.87(d,J＝8.8Hz,2H),6.69-6.67(m,1H),3.01(s,6H),2.71(m,4H),2.44(m,4H),2.22(s,3H),1.96(s,3H).MS(ESI)(m/z):[M+H]+calcd for C26H30N8O， 470.25；found,470.21. [0226] 实施例2 [0227] 化合物1的合成步骤如下所述，而化合物2-31的合成参照化合物1的合成进行： [0228] (S)-3-((2-氯-5-硝基嘧啶)4-氨基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯的合成 [0229] [0230] 称取2,4-二氯-5-硝基嘧啶(3.23g，16.28mmol)置于250mL低温反应瓶中，加入80mL二氯甲烷溶解，-70℃下搅拌冷却，另取(S)-1-叔丁氧羰基-3-氨基吡咯烷(3.03g， 16.28mmol)、N,N-二异丙基乙胺(2.52g，19.53mmol)溶于20mL二氯甲烷，并滴加到上述反应液中，滴加完成后，继续在-70℃下搅拌0.5小时，TLC跟踪至原料完全转化。旋转蒸发除去溶剂，粗品经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝12:1，v/v)分离，得到S1黄色油状液体5.54g，产率99％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.07(s,1H),8.41(d,J＝6.4Hz,1H),4.87-4.84(m,1H), 3.81(dd,J＝11.6Hz,6.4Hz,1H),3.54(t,J＝6.4Hz,1H),3.36(br,1H),2.40-2.31(m,1H), 2.06-1.98(m,1H),1.48(s,9H). [0231] 1-甲基-4-(2-甲基-4-硝基苯基)哌嗪的合成 [0232] [0233] 称取3-甲基-4-氟-1-硝基苯(2.67g,17.21mmol)以及N-甲基哌嗪(1.72g,17.21mmol)于50ml圆底烧瓶中，加入DMSO溶解，加入K2CO34.76g,90℃加热搅拌9h,TLC跟踪至原料完全转化,抽滤除去K2CO3，乙酸乙酯洗涤后，取滤液加入少量乙酸乙酯稀释，饱和氯化钠萃取，有机层干燥，旋转蒸发除去溶剂，粗品经硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝60:1，v/v)分离，得到S2褐色固体3.92g，产率96.8％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.88(d,J＝4.8Hz, 1H),6.60(dd,J＝9.6Hz,2.4Hz,1H),6.53(s,1H),3.91(s,3H),3.44(br,4H),2.42(br,4H), 2.22(s,3H). [0234] 3-甲基-4-(4-甲基哌嗪基)苯胺的合成 [0235] [0236] 称取S2(1.96g,8.33mmol)于250ml圆底烧瓶中，加入乙酸乙酯/甲醇(1:1)溶解，加入100mg 10％Pd/C,通入氢气，室温搅拌4h,TLC跟踪至原料完全转化,反应液抽滤后旋转蒸发除去溶剂，得到S3黄色固体1.68g，产率98.2％。产品未经纯化，直接用于下步反应。 [0237] (S)-3-((2-((3-甲基-4-(4-甲基-1-哌嗪基)苯基)氨基)-5-硝基-4-嘧啶基)氨基)吡咯烷基-1-叔丁基甲酸酯的合成 [0238] [0239] 称取S1(2.84g,8.26mmol),S2(1.70g,8.26mmol),DIPEA(2.13g,16.52mmol)于250ml圆底烧瓶中，加入THF溶解，氩气保护下搅拌过夜。TLC跟踪至原料完全转化,，旋转蒸发除去溶剂，加水稀释后用乙酸乙酯萃取(100mL×2)，有机相经饱和氯化铵溶液(50mL× 2)、饱和氯化钠溶液洗涤后，加入无水硫酸钠干燥。粗品经硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝ 40:1，v/v)分离，得到S4黄色固体3.45g，产率81.5％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.35(s, 1H),8.95(s,1H),8.57(s,1H),7.69(s,1H),7.44(d,J＝7.6Hz,1H),6.98(d,J＝8.8Hz,1H), 4.65-4.62(m,1H),4.12(s,0.4H),3.72(dd,J＝10.8Hz,6.8Hz),3.57-3.27(m,4.31H),3.18(s,1H),2.80(br,4H),2.45(br,4H),2.22(s,3H),2.21(s,3H),1.42(s,9H)。 [0240] (S)-3-((5-氨基-2-((3-甲基-4-(4-甲基-1-哌嗪基苯基)氨基)4-嘧啶基)氨基)吡咯烷基)-1-甲酸叔丁酯 [0241] [0242] 称取S4(3.45g,6.73mmol)于250ml圆底烧瓶中，加入无水乙醇溶解，加入100mg Pd/C(10％),通入氢气，室温下搅拌过夜8h.反应结束后，抽滤，将滤液旋干，产品未经纯化，直接用于下一步反应。 [0243] (S)-3-(6-异丙基-2-((3-甲基-4-(4-甲基-1-哌嗪基)苯基)氨基)-7-氧代-8(7H)-蝶啶基)吡咯烷基-1-甲酸叔丁酯 [0244] [0245] 取上一步产物S5(1.61g,3.33mmol)于25ml圆底烧瓶中，加入10ml无水乙醇，0.6ml冰醋酸，加入二甲基丙酮酸乙酯(721mg,5.00mmol),氩气保护下加热回流，搅拌过夜。TLC跟踪至原料完全转化，旋转蒸发除去溶剂，加水稀释后用二氯甲烷萃取(100mL×2)，有机相经饱和碳酸氢钠溶液(50mL×2)、饱和氯化钠溶液洗涤后，加入无水硫酸钠干燥。粗品经硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇/氨水＝50:1:1，v/v/v)分离，得到S6黄色固体1.34g，产率71.4％。lc-ms [0246] (S)-6-异丙基-2-((3-甲基-4-(4-甲基-1-哌嗪基)苯基)氨基)-8-(3-吡咯烷基)-7(8H)蝶啶酮的合成 [0247] [0248] 称取S6(1.20g,2.13mmol)于25ml圆底烧瓶中，加入二氯甲烷溶解，在冰浴中冷却后滴加4ml三氟乙酸，室温反应3h,TLC跟踪至原料完全转化,，反应液倒入烧杯，二氯甲烷稀释，边搅拌边滴加氢氧化钠溶液至溶液分层，上层pH约为9，加二氯甲烷稀释，饱和氯化钠溶液萃取，无水硫酸钠干燥。粗品经硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝20:1，v/v)分离，得到S7黄1 色固体0.89g，产率90.2％。H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.85(s,1H),8.74(s,1H),7.51(s, 1H),7.43(d,J＝8.4Hz,1H),7.02(d,J＝8.4Hz,1H),5.85-5.77(m,1H),3.42-3.36(m,1H), 2.96-2.91(m,1H),2.82(br,4Hz),2.78-2.73(m,1H),2.47(br,4H),2.24(s,3H),2.23(s, 3H),2.17-2.09(m,1H),1.99-1.91(m,1H),1.19(d,J＝6.8Hz,6H)。 [0249] 实施例3 [0250] 生物活性测试部分 [0251] 激酶测试方法 [0252] 通过Mobility shift assay方法测试而成，激酶缓冲液(50mM HEPES,pH 7.5,0.01％Brij-35,10mM MgCl2,2mM DTT)，终止缓冲液(100mM HEPES,pH 7.5,0.015％Brij- 35,0.2％Coating Reagent#3,50mM EDTA)。用100％的DMSO将化合物稀释到所需要的浓度，并将配好的化合物转移到96孔板中，稀释的浓度从20μl至60μl不等并以一定的浓度梯度配成10个浓度。以100μl的100％DMSO浓度作为空白对照。后将96孔板的药物的5μl转移到384孔板中重复试验。激酶在28℃下以特定的方式进行培养。最后通过标准曲线计算出IC50值。 [0253] 细胞测试方法 [0254] 细胞培养：细胞株由美国菌种保藏中心获得。细胞在RPMI-1640或者MEM培养基中培养，其在5％的CO2中含10％的胎牛血清，在37℃下进行。MV4-11细胞在IMDM培养基中培养。 [0255] 细胞活性测定方法：悬浮细胞的活性测试主要是MTT测试方法测定，而贴壁细胞的测试主要是SRB测试方法。悬浮细胞在每孔3-8×103细胞的96孔板上进行培养，每个孔中加入100μL的培养基，然后加入10μL的化合物(一式三份)，在37℃下培养72h。细胞培养完以后，在每一孔板中加入20μL的5mg/mL MTT试剂再继续培养4h，加入50μL三种混合溶剂(5％异丙醇-10％SDS-12mmol/L HCl)来溶解氧化产物。OD值用多功能检测仪Synergy 2在570nm处测定。贴壁细胞在每孔2-7×103细胞的96孔板上进行培养24h，同样在培养基中加入相同当量的化合物。72h培养以后，移除培养液，菌种用TCA固定1h。干燥的孔板染上磺酰罗丹明B，然后加入150μL 10mM Tris-HCl。最后，溶解细胞的光吸收用Synergy 2微分光光度计在560nm处检测。所有的实验都进行三次平行反应。 [0256] 免疫沉淀反应和蛋白质印迹实验：用不同浓度的化合物去培养细胞2h，然后用RIPA溶解缓冲液将细胞进一步地溶解，随后在4℃下离心分离，取上清液进行相关实验。蛋白质用SDS-PAGE进行分离，然后转移到硝酸纤维膜中用于抗体的检测。主要抗体作用于FLT3,AKT,p-AKT,STAT5,p-STAT5和p44/42MAPK，抗GAPDH用推荐的浓度进行培养。可视化的信号在用了HRP共聚抗体后用Tanon 5200多捕获系统来检测提高的ECL基质。细胞溶解产物用FLT3抗体和蛋白A凝胶进行免疫沉淀反应，煮熟的样品用6％凝胶进行电泳电极化，然后用4G10抗体进行标记，用此方法来检测FLT3磷酸化水平。 [0257] 流式细胞实验：细胞用膜联蛋白V和碘化丙啶来染色，用于检测化合物的细胞凋亡活性。MV4-11细胞在6个孔板中用密度为1×105细胞/mL进行培养，然后加入不同浓度的化合物培养48h。将细胞分割并用冷的PBS缓冲溶液洗涤两次。样品在结合缓冲液中重新悬浮，在光照的保护下用膜联蛋白V和碘化丙啶培养。细胞周期试验根据PI/Rnase染色溶剂产品说明书进行操作。分裂细胞在70％的乙醇中固定1h。然后所有的细胞都在非光照室温的条件下用碘化丙啶染色30min。细胞凋亡和细胞周期都用FACS流式细胞仪进行检测。 [0258] 化合物的测试结果(测试以AC220、MLN518作为阳性对照药)如下表所示，细胞测试结果如附图所示。 [0259] 表1.化合物的激酶测试和细胞测试结果 [0260] [0261] MV4-11移植瘤模型测试 [0262] 发明人进一步在MV4-11移植瘤模型中测试了本发明化合物对肿瘤的抑制活性。 [0263] 结果如图2-3所示，本发明化合物对肿瘤体积以及重量的影响与阳性对照AC220相似，从而进一步证实本发明化合物在抑制肿瘤方面的潜能。 [0264] 讨论： [0265] 发明人经过广泛而深入的研究，设计并合成得到了一系列未见文献报道的蝶啶酮衍生物，对得到的化合物进行了分子水平和细胞水平的活性测试，得到一批能够抑制FLT3的化合物。这些化合物对FLT3的抑制活性IC50值达到nM级别；对相关细胞的抑制活性IC50值达到μM级别。其中多个化合物，例如F-8和F-16对FLT3的抑制活性IC50值低于10nM，远优于阳性对照MLN518。而进一步的肿瘤模型测试显示本发明的化合物在体内同样具备优异的抑制肿瘤活性。因此，本发明非化合物有可能成为抑制FLT3的靶向药物，或者作为经进一步修饰得到活性更佳和/或毒性更低的化合物的基础。 |
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