一种具有含氮杂环结构药物的氧化代谢产物的合成方法 |
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| 申请号 | CN202410034588.6 | 申请日 | 2024-01-10 | 公开(公告)号 | CN117887781A | 公开(公告)日 | 2024-04-16 |
| 申请人 | 南京药明康德新药开发有限公司; 上海药明康德新药开发有限公司; | 发明人 | 李瑞兴; 陆亦宽; 虞瑞军; 曹卫群; 陶怡; 沈良; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种具有含氮杂环结构药物的 氧 化代谢产物的合成方法，包括如下步骤：S1，将具有含氮杂环结构药物加入 生物 基质溶液中孵育，得到低浓度氧化代谢产物；S2，将S1得到的低浓度氧化代谢产物通过SPE柱纯化，得到高浓度氧化代谢产物；S3，将S2得到的高浓度氧化代谢产物通过高效液相色谱分离纯化，得到氧化代谢产物的纯品。本发明采用体外孵育方法合成具有含氮杂环结构药物的氧化代谢产物，模拟了体内或体外化合物的代谢情况，可以有效获得目标产物，解决了体内体外实验中难以获得代谢产物纯品的难题，为药物后续研究提供便利。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种具有含氮杂环结构药物的氧化代谢产物的合成方法，其特征在于，包括如下步骤： |
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| 说明书全文 | 一种具有含氮杂环结构药物的氧化代谢产物的合成方法技术领域[0001] 本发明涉及药物代谢技术领域，具体为涉及一种具有含氮杂环结构药物的氧化代谢产物的合成方法。 背景技术[0002] 在早期药物候选化合物的结构设计优化中，药化学家们致力于对化合物结构进行修饰，以期避免化合物被CYPs酶(细胞色素P450酶)代谢，其中一种常用的策略为引入含氮杂环类结构，从而提高化合物的溶解性、降低脂溶性来增加药物面对CYPs酶的代谢稳定性。然而，含氮杂环结构较易被醛氧化酶所代谢，因此由醛氧化酶所引发的药物代谢开始逐渐受到关注。醛氧化酶广泛分布于人体各处，在肝脏中丰度最高，其代谢产生的氧化产物，可能会产生药理活性，也可能会引起毒性，这将会导致药物申报或是上市推迟或是失败，如何在药物研发早期获得这类氧化产物的标准品，进而评估其药理活性或毒性对药物研发具有重要作用。 [0003] 申请号200910041118.8公开了“一种乙酰甲喹代谢产物及其制备方法和应用”，该方法以乙酰甲喹为原料，在溶剂存在下进行还原反应，对反应产物进行重结晶从而获得乙酰甲喹代谢产物。上述制备代谢产物的方法为化学合成法，该方法首先需要预测反应发生的位点，根据预测结果合成多个可能结构的分子，然后再与生物样品中的代谢产物通过LC‑nUV‑MS(液相色谱高分辨质谱联用)技术匹配，以确定合成的物质是否为目标产物。 [0004] 化学合成法的难点在于潜在的目标产物比较多，工作量大，成本高；而且，化学合成难度大，难以实现定向合成；即使合成了产物，但通过LC‑MS很难实现对同分异构体的完全区分，因此化学合成得到的产物可能是目标产物的同分异构体，而非目标代谢产物。 [0005] 因此，探索体外通过生物基质定向合成代谢产物，显得尤为重要。 发明内容[0006] 有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明提供一种具有含氮杂环结构药物的氧化代谢产物的合成方法，通过体外孵育体系，定向合成氧化代谢产物，经过SPE柱纯化、高效液相色谱分离纯化，得到氧化代谢产物的纯品，为药物后续研究提供便利。 [0007] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种具有含氮杂环结构药物的氧化代谢产物的合成方法，包括如下步骤： [0008] S1，将具有含氮杂环结构药物加入生物基质溶液中孵育，得到低浓度氧化代谢产物； [0009] S2，将S1得到的低浓度氧化代谢产物通过SPE柱纯化，得到高浓度氧化代谢产物； [0010] S3，将S2得到的高浓度氧化代谢产物通过高效液相色谱分离纯化，得到氧化代谢产物的纯品。 [0011] 作为优选的实施例，所述的含氮杂环结构选自如下结构中的任意一种或多种的组合： [0012] [0013] 作为更为优选的实施例，所述的药物为酞嗪类药物、嘌呤类药物、喹唑啉类药物或嘧啶类药物。 [0014] 作为优选的实施例，所述的药物浓度为0.36‑7.2mg/mL。 [0015] 作为优选的实施例，所述的孵育时间为1‑24h。 [0016] 上述的氧化代谢产物为经醛氧化酶催化产生的代谢产物。 [0017] 作为优选的实施例，所述的生物基质为肝S9或肝细胞液。 [0018] 作为优选的实施例，所述的生物基质种属为小鼠、大鼠、迷你猪、猴或人中的任意一种。 [0019] 作为优选的实施例，所述的生物基质的终浓度为0.5‑2.0mg/mL。 [0020] 作为优选的实施例，所述药物浓度为7.2mg/mL，孵育基质为猴肝Cytosol，孵育基质的终浓度为2mg/mL，孵育时间为24h。 [0022] 作为更为优选的实施例，具有含氮杂环结构的药物在生物基质溶液中孵育包括如下步骤：将药物加入生物基质溶液中，再加入MgCl2溶液，于37℃的恒温水浴锅中以50‑600rpm孵育1‑24h。 [0023] 作为优选的实施例，所述MgCl2溶液的浓度为100‑300mM。 [0026] 作为优选的实施例，所述SPE柱中的填料选自十八烷基键合硅胶、氧化铝、改性聚苯乙烯‑二乙烯苯共聚物(如：Waters Oasia HLB)、硅胶键合苯磺酸基(如：Waters Oasia MCX)、硅胶键合季氨基(如：Waters Oasis WAX；Waters Oasia MAX)中的一种或多种的组合。 [0027] 其中，S3步骤得到的纯品用氘代有机试剂溶解，通过核磁共振确认结构。 [0029] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果： [0030] (1)本发明的合成方法采用体外孵育体系，模拟体内或体外药物代谢情况，有效地获得了目标产物，经过纯化步骤，目标产物的纯度可达到90％以上，解决了体内体外实验中难以获得代谢产物纯品的难题，为药物后续研究提供便利。 [0031] (2)本发明采用体外孵育方法合成具有含氮杂环结构药物的氧化代谢产物，通过对孵育体系进行优化，将产生ng(纳克)级别的代谢产物提升至mg(毫克)级别，有助于后续代谢产物结构的精确鉴定与毒理实验进行。 [0032] (3)本发明采用体外孵育方法合成具有含氮杂环结构药物的氧化代谢产物，通过对孵育体系进行优化，实现代谢产物产量的大幅度提升(从1.6mg/L提升至30.33mg/L)，而与此同时，生物基质的用量反而降低至原用量的5％(从11.4g降低至0.6g)，显著降低了生产成本。 [0033] (4)本发明采用体外孵育方法定向合成代谢产物，降低了获取代谢产物的成本和时间，确保了代谢产物结构的准确性，为其他种类药物获取代谢产物提供了新思路。 附图说明[0035] 图1是实施例5中卡巴折伦标准品在不同孵育基质中的孵育结果示意图； [0036] 图2是实施例6中卡巴折伦标准品在不同种属孵育基质中孵育结果示意图； [0037] 图3是实施例7中卡巴折伦标准品在不同浓度的孵育基质中孵育结果示意图； [0038] 图4是实施例8中卡巴折伦标准品在不同药物浓度和孵育时间下孵育结果示意图； [0039] 图5是卡巴折伦标准品氧化代谢产物的液相色谱图； [0040] 图6是卡巴折伦及其氧化代谢产物的二级质谱图； [0041] 图7是卡巴折伦的1H NMR谱图； [0042] 图8是卡巴折伦氧化代谢产物的1H NMR谱图。 具体实施方式[0043] 为了使发明实现的技术手段、创造特征、达成目的和功效易于明白了解，下结合具体图示，进一步阐述本发明。但本发明不仅限于以下实施的案例。 [0044] 须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。 [0045] 下述实施例中，孵育后的溶液经LC‑UV‑MSn检测，其氧化代谢产物的产率和产量计算公式如下： [0046] [0047] 产量(mg/L)＝孵育浓度*产率 [0048] 一、具有含氮杂环结构药物的氧化代谢产物的合成 [0049] 实施例1卡巴折伦(酞嗪类药物)氧化代谢产物的合成 [0050] 取3.0mL浓度为7.2mg/mL的卡巴折伦标准品溶液，加入2.24mg/mL猴肝Cytosol(细胞液)的磷酸盐缓冲溶液(猴肝Cytosol(细胞液)的磷酸盐缓冲溶液总体积为267mL)中，随后加入300mM的MgCl2溶液30mL，于37℃的恒温水浴锅中以150rpm孵育2h，孵育结束后随即加入含0.1％甲酸的乙腈溶液(此百分数为体积百分数)终止反应。反应终止后，将样品板置于摇扳机上震摇，之后以不小于10000×g的离心力离心至少10min。离心后，移取少量上清n液进LC‑UV‑MS(n＝1～2)分析，经计算，氧化代谢产物的产率为40±3％。 [0051] 实施例2 6‑巯基嘌呤(嘌呤类药物)氧化代谢产物的合成 [0052] 取1.0mL浓度为1.5mg/mL的6‑巯基嘌呤标准品溶液，加入1.12mg/mL人肝Cytosol的磷酸盐缓冲溶液(人肝Cytosol的磷酸盐缓冲溶液总体积为89mL)中，随后加入300mM的MgCl2溶液10mL，于37℃的恒温水浴锅中以300rpm孵育12h，孵育结束后随即加入含0.1％甲酸(此百分数为体积百分数)的乙腈溶液终止反应。反应终止后，将样品板置于摇扳机上震n摇，之后以不小于10000×g的离心力离心至少10min。离心后，移取少量上清液进LC‑UV‑MS(n＝1～2)分析，经计算，氧化代谢产物的产率为33±3％。 [0053] 实施例3唑尼哌利(喹唑啉类药物)氧化代谢产物的合成 [0054] 取0.5mL浓度为0.5mg/mL的唑尼哌利标准品溶液，加入2.24mg/mL迷你猪肝Cytosol的磷酸盐缓冲溶液(迷你猪肝Cytosol的磷酸盐缓冲溶液的总体积为44.5mL)中，随后加入300mM的MgCl2溶液5mL，于37℃的恒温水浴锅中以200rpm孵育6h，孵育结束后随即加入含0.1％甲酸(此百分数为体积百分数)的乙腈溶液终止反应。反应终止后，将样品板置于摇扳机上震摇，之后以不小于10000×g的离心力离心至少10min。离心后，移取少量上清液n进LC‑UV‑MS(n＝1～2)分析，经计算，氧化产物的产率为63±4％。 [0055] 实施例4BIBX1382(嘧啶类药物)氧化代谢产物的合成 [0056] 取5mL浓度为3.9mg/mL的BIBX1382标准品溶液，加入1.68mg/mL猴肝S9的磷酸盐缓冲溶液(猴肝S9的磷酸盐缓冲溶液的总体积为445mL)中，随后加入300mM的MgCl2溶液50mL，于37℃的恒温水浴锅中以150rpm孵育4h，孵育结束后随即加入含0.1％甲酸(此百分数为体积百分数)的乙腈溶液终止反应。反应终止后，将样品板置于摇扳机上震摇，之后以不小于n10000×g的离心力离心至少10min。离心后，移取少量上清液进LC‑UV‑MS (n＝1～2)分析，经计算，氧化产物的产率为86±5％。 [0057] 二、孵育条件的优化 [0058] 以卡巴折伦为例，进行孵育条件的优化过程。 [0059] 实施例5孵育基质种类的优化 [0060] 取4μL浓度为0.36mg/mL卡巴折伦标准品溶液，分别加入356μL浓度为1.12mg/mL的猴肝Cytosol(细胞液)、猴肝细胞、猴肝S9的磷酸盐缓冲溶液中，随后加入300mM MgCl2溶液40μL，于37℃的恒温水浴锅中以150rpm孵育2h，孵育结束后随即加入含0.1％甲酸的乙腈溶液(此百分数为体积百分数)终止反应。反应终止后，将样品板置于摇扳机上震摇，之后以不n 小于10000×g的离心力离心至少10min。离心后，移取少量上清液进LC‑UV‑MS(n＝1～2)分析，结果如图1所示，其中A、B、C分别为卡巴折伦标准品在猴肝细胞、猴肝Cytosol、猴肝S9中的孵育结果。 [0061] 从图1中可知，卡巴折伦在猴肝细胞中孵育后，得到的代谢产物干扰较多，而在猴肝Cytosol、猴肝S9中干扰较少，因此后续选择此两种基质进一步优化。 [0062] 实施例6孵育基质种属优化 [0063] 取4μL浓度为0.36mg/mL卡巴折伦标准品溶液，分别加入356μL浓度为1.12mg/mL肝Cytosol(大鼠、猴和人种属)和肝S9(大鼠、猴和人种属)的磷酸盐缓冲溶液中，后续处理方法同实施例5，孵育结果如图2所示。 [0064] 从图2中可知，卡巴折伦在猴肝Cytosol中孵育，有着最高的产率，氧化代谢产物的产率可达30.11％。 [0065] 实施例7孵育基质浓度优化 [0066] 取4μL浓度为0.36mg/mL卡巴折伦标准品溶液，分别加入356μL浓度为0.56mg/mL，1.12mg/mL和2.24mg/mL猴肝Cytosol的磷酸盐缓冲溶液中，后续处理方法同实施例5，孵育结果如图3所示。因356μL的孵育基质溶液中加入4μL卡巴折伦标准品溶液和40μLMgCl2溶液，使得孵育体系的总体积由356μL增加至400μL，故0.56mg/mL，1.12mg/mL和2.24mg/mL的孵育基质，其终浓度依次变化为0.5mg/mL，1mg/mL和2mg/mL。 [0067] 从图3中可知，随着孵育基质浓度的增加，目标产物的产率随之增加，当孵育基质终浓度为2mg/mL，氧化代谢产物的产率可达44.36％。 [0068] 实施例8药物浓度及时间优化 [0069] 分别取4μL浓度为1.8，3.6，7.2mg/mL卡巴折伦标准品溶液，加入356μL浓度为2.24mg/mL猴肝Cytosol的磷酸盐缓冲溶液中，后续处理方法同实施例5。 [0070] 分别取4μL浓度为1.8，3.6，7.2mg/mL卡巴折伦标准品溶液，加入356μL浓度为2.24mg/mL猴肝Cytosol的磷酸盐缓冲溶液中，除设置孵育时间为1，4，24h外，其余处理方法同实施例5。 [0071] 不同药物浓度和孵育时间下的产率、产量结果如图4所示，其中图4(A)为目标产物在不同药物浓度、不同孵育时间下的产率，图4(B)为目标产物在不同药物浓度、不同孵育时间下的产量。 [0072] 从图4中可以看出，药物浓度为1.8mg/mL，孵育时间为24h，氧化代谢产物的产率最高，可达92.35％；药物浓度为7.2mg/mL，孵育时间为24h，氧化代谢产物的产量最高可达30.33mg/L。 [0073] 对比例 [0074] 为了比较优化条件和普通条件下孵育时，所得氧化代谢产物的不同，进行了如下对比实验。 [0075] A组：选取卡巴折伦标准品溶液的浓度为7.2mg/mL，孵育基质为猴肝Cytosol，孵育基质的终浓度为2mg/mL，孵育时间为24h，孵育总体积300mL，其余操作与实施例5相同，得到氧化代谢产物的产量为30.33mg/L。 [0076] B组：选取卡巴折伦标准品溶液的浓度为0.36mg/mL，孵育基质为猴肝Cytosol，孵育基质的终浓度为2mg/mL，孵育时间为2h，孵育总体积为400μL，其余操作与实施例5相同，得到氧化代谢产物的产量为1.6mg/L。 [0077] 以获得9mg左右的氧化代谢产物纯品粉末计，通过重复实验发现，A组孵育体积需从400μL增加至300mL，而B组孵育体积需从400μL增加至5700mL，可以看到，若欲获得相同的产量，B组孵育体积将远大于A组。 [0078] 综上，通过调整药物浓度、孵育时间，可显著提升氧化代谢产物的产量，氧化代谢产物的产量从1.6mg/L提升到30.33mg/L，而基质用量却从15g(B组基质浓度2mg/mL，孵育体积5700mL，基质用量5700mL*2mg/mL＝11.4g)降低到0.6g(A组基质浓度2mg/mL，孵育体积300mL，基质用量300mL*2mg/mL＝0.6g)，基质成本降低了95％。 [0079] 三、具有含氮杂环结构药物的氧化代谢产物的纯化 [0080] 以卡巴折伦为例，进行氧化代谢产物的纯化过程。 [0081] 取实施例1离心后的上清液，上样于改性聚苯乙烯‑二乙烯苯填料的SPE柱中，经含0.1％甲酸(此百分数为体积百分数)的甲酸‑乙腈‑水(乙腈与水的体积比为1:9)淋洗后，用含0.1％甲酸(此百分数为体积百分数)的甲酸‑乙腈‑水(乙腈与水的体积比为8:2)洗脱代谢产物，收集洗脱液。洗脱液经旋转蒸发、高效液相分离(高效液相分离条件如表1)后，经冷冻干燥，获得氧化代谢产物的纯品粉末5.03mg(纯化过程损失约4mg)，纯度为93.93％，其液相色谱图如图5所示。 [0082] 表1 [0083] [0084] 将上述的纯品粉末溶解于氘代的二甲基亚砜溶液中，经高分辨质谱和NMR分析，卡巴折伦及其氧化代谢产物的二级质谱图如图6所示，其中图6(A)为卡巴折伦的二级质谱图，图6(B)为其氧化代谢产物的二级质谱图。卡巴折伦的核磁图如图7所示，其氧化代谢产物的核磁图如图8所示。 [0085] 对比卡巴折伦及其氧化代谢产物的二级质谱图及1H NMR谱图(如图6‑8)。 [0086] 卡巴折伦(图6A)的准分子离子峰为m/z 361.1862，产生的主要离子碎片有m/z 272.1387和m/z 218.0920。其氧化代谢产物(图6B)的准分子离子峰为m/z 377.1823。通过比对二级主要碎片，代谢产物产生的主要碎片为m/z 288.1337和m/z 234.0870，与药物原料卡巴折伦相比，为在离子碎片m/z 272.1387和m/z218.0920的基础上增加了一个氧原子， 1 因此推测该氧化位点位于卡巴折伦结构的苯并哒嗪环部分。结合卡巴折伦的结构和H NMR谱图(图7)，该氧化产物中吡啶‑4‑氨乙基甲酸酯部分结构无变化(图8)，而哒嗪部分增加了一个N‑H(11.98ppm)信号，减少了一个C‑H(9.11ppm)信号，从而推测7号位的氢被氧取代，变成了羰基，而7位的叔胺变成了仲胺，形成了一个内酰胺结构，由此可推断出氧化代谢产物的具体结构。 [0087] 本发明采用体外孵育方法合成具有含氮杂环结构药物的氧化代谢产物，其纯品可达到mg级别，便于对代谢产物结构进行精确鉴定及后续的毒理实验研究。 |
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