用于寡核苷酸和蛋白标记的荧光染料及其制备方法和用途

申请号 CN200810116622.5 申请日 2008-07-14 公开(公告)号 CN101307226B 公开(公告)日 2010-12-01
申请人 无锡中德美联生物技术有限公司; 发明人 郑卫国;
摘要 本 发明 公开了一种用于寡核苷酸和蛋白标记的 荧光 染料及其制备方法和用途。主要包括以下的步骤:将 氨 基化的有短吸收 波长 的 荧光染料 和经活化的有较长吸收及发射波长的荧光染料的 琥珀酸 酯按摩尔比1-100∶1的比例反应得到反应产物;或将氨基化的有长吸收波长的荧光染料和经活化的有较短最大吸收及发射波长的荧光染料的琥珀酸酯按摩尔比1-100∶1的比例反应得到反应产物;反应产物采用 透析 、过柱、 超滤 或高压液相的方法除去反应副产物以及未反应的化合物,即得到一种新型有效的在较短波长吸收激光 能量 并在较长波长发射较强荧光的荧光染料。使用本发明的荧光染料能够达到多重实时定量荧光检测分析的目的,从而大大提高了检测的特异性,可靠性,均一性和灵敏度。
权利要求

1.一种用于寡核苷酸和蛋白标记的荧光染料,其特征在于:所述荧光染料组成的核心结构特征如下:
2.根据权利要求1所述的用于寡核苷酸和蛋白标记的荧光染料的制备方法,其特征在于:主要包括以下的步骤:
(1)、将带基的有较短最大吸收及发射波长的荧光染料和经活化的有较长吸收及发射波长的荧光染料的琥珀酸酯按摩尔比1-100∶1的比例反应得到反应产物;所述的反应是将上述一组物质按照上述的比例溶解于二甲基甲酰胺或二甲基亚砜中,加入三乙胺,在常温下进行反应,反应经过1-24小时后,在反应物中加入pH小于10的弱酸钠溶液,再在60℃反应1-24小时即得到反应产物,或将带氨基的有较短最大吸收及发射波长的荧光染料和经活化的有较长吸收及发射波长的荧光染料的琥珀酸酯按摩尔比1-100∶1,溶于pH小于10的弱碱性碳酸钠水溶液中并混合,在25-60℃,进行反应1-48小时即得到反应产物;
(2)、反应产物采用透析、过柱、超滤或高压液相的方法除去反应副产物以及未反应的化合物,即得到一种在较短波长吸收激光能量,并在较长波长发射较强荧光的荧光染料;
所述带氨基的有较短最大吸收及发射波长的荧光染料的结构为:
短波长荧光染料:
所述有较长吸收及发射波长的荧光染料的琥珀酸酯的结构为:
3.根据权利要求1所述荧光染料用于寡核苷酸和蛋白标记的用途。

说明书全文

用于寡核苷酸和蛋白标记的荧光染料及其制备方法和用途

技术领域

[0001] 本发明涉及一种荧光染料及其制备方法和用途,具体涉及一种用于寡核苷酸和蛋白标记的荧光染料及其制备方法和用途。

背景技术

[0002] 非放射性光标记方法作为现代生物及临床检测的工具,尤其是新型的荧光试剂,以其直观,低毒或无毒,高灵敏度以及可以同时进行多色示踪等显著优点,在生命科学,生物技术和临床医学等领域的应用中扮演越来越重要的色,并逐步取代同位素标记的放化试剂等的传统技术而成为不可少的有效工具。目前已广泛应用在基因自动测序,多重实时定量荧光检测PCR(DNA聚合酶链式反应),核酸杂交以及分子免疫学分析。
[0003] 在许多应用中,应用可分辨的多重荧光标记来同时检测一个或多个分析目标具有重要的意义。对同一个分析目标,可用多重荧光标记来同时检测和验证结果,因此避免了重复实验所带来的误差。对于不同的分析目标,如在临床血液检测中,可以同时在一个样品中检测多种遗传和传染疾病。多重实时定量荧光检测PCR的广泛普及就是对这一技术的肯定。但是,要达到有效的多重实时定量荧光检测存在许多技术难题,尤其是在要求用单一激光源的情况下,如在电泳分析或分离核酸的基因自动测序系统中。首先,较难发现一组五个以上在200nm光谱波段分辨很好的荧光染料,因为一般单一荧光的半蜂宽在40-80nm;第二,既使发现这样一组在光谱上分辨很好的荧光染料,往往由于单个荧光的能量吸收与发射能上的差异而不能有效的应用;第三,由于每个荧光分子的带电量,分子大小,形态及构型而影响电泳的分离效果;第四,每个荧光分子的化学性能与整个检测系统如标记条件等要求的相容性;第五,每个荧光分子必须同时满足激光照射时的稳定性。目前已有在基因自动测序中已经应用了一组四色的荧光系统,但还没有一组五色能同时满足上述要求的荧光系统存在。

发明内容

[0004] 本发明的目的是针对上述现有技术缺陷,提供了一种能够达到多重实时定量荧光检测分析,从而大大提高了检测的特异性,可靠性,均一性和灵敏度的用于寡核苷酸和蛋白标记的荧光染料及其用途。
[0005] 本发明还提供了一种上述荧光染料的制备方法。
[0006] 为了实现上述目的本发明采取的技术方案是:提供一种用于寡核苷酸和蛋白标记的荧光染料,所述荧光染料组成的核心结构特征如下:
[0007]
[0008] 本发明的另一个技术方案是提供上述荧光染料的制备方法,主要包括以下的步骤:
[0009] (1)、将带基的有较短最大吸收及发射波长的荧光染料和经活化的有较长吸收及发射波长的荧光染料的琥珀酸酯按摩尔比1-100∶1的比例反应得到反应产物;或将带氨基的有较长吸收及发射波长的荧光染料和经活化的有较短最大吸收及发射波长的荧光染料的琥珀酸酯按摩尔比1-100∶1的比例反应得到反应产物;所述的反应是将上述两组物质的任何一组,按照所述的比例溶解于二甲基甲酰胺或二甲基亚砜中,加入三乙胺,在常温或低于60℃,进行反应,反应经过1-24小时后,在反应物中加入pH7-10的弱酸钠溶夜,再在60℃反应1-24小时即得到反应产物;或将带氨基的有较短最大吸收及发射波长的荧光染料和经活化的有较长吸收及发射波长的荧光染料的琥珀酸酯按摩尔比,溶于pH7-10的弱碱性碳酸钠水溶夜并混合,在常温或低于60℃,进行反应1-48小时即得到反应产物。
[0010] (2)、反应产物采用透析、过柱、超滤或高压液相的方法除去反应副产物以及未反应的化学物,即得到一种新型有效的在较短波长吸收激光能量并在较长波长发射较强荧光的荧光染料。
[0011] 所述带氨基的有较短最大吸收及发射波长的荧光染料的结构为:
[0012] 短波长荧光染料:
[0013]
[0014] 所述有较长吸收及发射波长的荧光染料的琥珀酸酯的结构为:
[0015]
[0016] 所述的有较短最大吸收发射波长的荧光染料具有的结构特征为:该荧光染料为能在较短波长吸收较强激光能量的氨基化的或经琥珀酸活化的荧光素,是单异构体或其异构体混合物,吸收较强的激光能量波长为460-520nm。
[0017] 所述的有较长吸收及发射波长的荧光染料具有的结构特征为:该荧光染料为能在较长波长吸收并释放强度较高的荧光的氨基化的或经琥珀酸活化的荧光染料,在红及红外波长发射荧光,是单异构体或其异构体混合物,释放强度较高的荧光波长为550-750nm。
[0018] 本发明的荧光染料经琥珀酸活化后用于寡核苷酸和蛋白标记。
[0019] 本发明利用能量转换和传递的原理成功制备了可用于五色荧光系统的荧光染料,通过化学偶联的方法把在480-520nm波长具有最大吸收的荧光素和在650nm波长具有最大荧光释放的荧光分子DY-630或Bodipy-635合成一个复合荧光分子,使得该荧光分子在488nm波长吸收后在650nm波长的荧光效率有了十倍的提高。此方法尤其适用于荧光素在460-520nm波长下吸收激光能量,通过分子内能量转移的方法传给另一个分子内具有535-700nm波长下吸收能量并释放出550-750nm波长荧光较强的荧光分子。当这样的多个不同波长的荧光分子被标记在不同的核酸片段或蛋白分子上,就能达到多重实时定量检测分析,从而大大提高了检测的特异性,可靠性,均一性和灵敏度。此方法尤其适合于人类STR-PCR(短串联重复序列DNA聚合酶链式反应)DNA复合扩增基因分型,基因和蛋白芯片产品中。
附图说明
[0020] 图1是荧光发射定量分析图。
[0021] 如图1所示,长波长荧光染料DY-630荧光分子和氨基化短波长荧光素联接而成一个新的能在480-520nm波长高效吸收能量并在650nm波长释放荧光较强的荧光分子,使得该荧光分子在488nm波长吸收后在650nm波长的荧光释放效率有了十倍的提高。

具体实施方式

[0022] 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明,但不作为对本发明的限定。
[0023] 荧光染料组成的核心结构特征如下:新的荧光分子由短激发波长的荧光分子和长激发波长的荧光分子相连组成。
[0024]
[0025] 本发明荧光染料的制备反应原理如下:
[0026] 能量转换法合成红外波长荧光染料合成原理
[0027]
[0028] 或者
[0029]
[0030] 红外波长荧光分子合成机理:
[0031]
[0032] 长波长荧光染料DY-630琥珀酸酯和氨基化短波长荧光素溶于二甲基甲酰胺中,在三乙胺的催化作用下,联接而成一个新的能在480-520nm波长高效吸收能量并在650nm波长释放荧光较强的荧光分子
[0033] 实施例1
[0034] 氨基化短波长荧光素,波长460-520nm,为单异构体,和0.1mmole长波长荧光染料DY-630琥珀酸酯按摩尔比1∶1,溶于100μl二甲基甲酰胺中。加入10μl三乙胺并在其催化作用下,在常温进行反应,经过1小时的反应后,加入200μl的pH7-10弱碱性碳酸钠水溶夜并混合。再在60℃反应1小时。反应结束后,高速离心除去沉淀,上清液经减压浓缩后(可加热,但应低于60℃),溶于10ml 5%的甲醇在二氯甲烷中的溶液,并用1000ml5-30%(体积比浓度)的甲醇在二氯甲烷中的浓度梯度溶液经胶柱层析分离,除去反应副产物以及未反应的化合物,收集最后带色荧光组份,经减压浓缩(可加热,但低于60℃)后,即得到所要荧光染料。此荧光分子在488nm波长吸收后在650nm波长的荧光效率有了十倍的提高。
[0035] 实施例2
[0036] 氨基化短波长荧光素,为异构体混合物,和0.1mmole长波长荧光染料DY-630琥珀酸酯按摩尔比20∶1,溶于200μl二甲基甲酰胺中。加入20μl三乙胺在其催化作用下,在60℃以下,进行反应,经过12小时的反应后,加入500μl的pH7-10弱碱性碳酸钠水溶夜并混合。再在60℃反应24小时。反应结束后,高速离心除去沉淀,上清液经减压浓缩(可加热,但应低于60℃)后,溶于10ml 5%的甲醇在二氯甲烷中的溶液,并用1000ml 5-30%(体积比浓度)的甲醇在二氯甲烷中的浓度梯度溶液经硅胶柱层析分离,除去反应副产物以及未反应的化合物,收集最后带色荧光组份,经减压浓缩(可加热,但低于60℃)后,即得到所要荧光分子。此荧光分子在488nm波长吸收后在650nm波长的荧光效率有了十倍的提高。
[0037] 实施例3
[0038] 氨基化短波长荧光素,波长460-520nm,为异构体混合物,和0.1mmole长波长荧光染料DY-630琥珀酸酯按摩尔比100∶1,溶于1000μl二甲基亚砜中。加入50μl三乙胺并在其催化作用下,在60℃以下,进行反应,经过24小时的反应后,加入1000μl的pH7-10弱碱性碳酸钠水溶夜并混合。再在60℃反应12小时。反应结束后,高速离心除去沉淀,上清液经减压浓缩(可加热,但应低于60℃)后,溶于25ml 5%的甲醇在二氯甲烷中的溶液,并用2000ml 5-30%(体积比浓度)的甲醇在二氯甲烷中的浓度梯度溶液经硅胶柱层析分离,除去反应副产物以及未反应的化合物,收集最后带浅绿色荧光组份,经减压浓缩(可加热,但低于60℃)后,即得到所要荧光分子。此荧光分子在488nm波长吸收后在650nm波长的荧光效率有了十倍的提高。
[0039] 实施例4
[0040] 氨基化短波长荧光素,波长460-520nm,为异构体混合物,和0.1mmole长波长荧光染料DY-630琥珀酸酯按摩尔比10∶1,溶于100μl pH7-10弱碱性碳酸钠水溶夜并混合。在常温下,进行反应,经过24小时的反应后,高速离心除去沉淀,上清液经减压浓缩后,溶于25ml 5%的甲醇在二氯甲烷中的溶液,并用1500ml 5-30%(体积比浓度)的甲醇在二氯甲烷中的浓度梯度溶液经硅胶柱层析分离,除去反应副产物以及未反应的化合物,收集最后带浅绿色荧光组份,经减压浓缩(可加热,但低于60℃)后,即得到所要荧光分子。此荧光分子在488nm波长吸收后在650nm波长的荧光效率有了十倍的提高。
[0041] 实施例5
[0042] 氨基化短波长荧光素,波长460-520nm,为异构体混合物,和0.01mmole长波长荧光染料DY-630琥珀酸酯按摩尔比100∶1,溶于200μl pH7-10弱碱性碳酸钠水溶夜并混合。在25℃-60℃,进行反应.经过1小时的反应后,高速离心除去沉淀,上清液经减压浓缩后,溶于25ml 5%的甲醇在二氯甲烷中的溶液,并用1000ml 5-30%(体积比浓度)的甲醇在二氯甲烷中的浓度梯度溶液经硅胶柱层析分离,除去反应副产物以及未反应的化合物,收集最后带浅绿色荧光组份,经减压浓缩(可加热,但低于60℃)后,即得到所要荧光分子。此荧光分子在488nm波长吸收后在650nm波长的荧光效率有了十倍的提高。
[0043] 实施例6
[0044] 氨基化短波长荧光素,波长460-520nm,为异构体混合物,和0.001mmole长波长荧光染料DY-630琥珀酸酯,按摩尔比100∶1,溶于1000μl pH7-10弱碱性碳酸钠水溶夜并混合。低于60℃,进行反应,经过48小时的反应后,高速离心除去沉淀,上清液经减压浓缩后,溶于25ml 5%的甲醇在二氯甲烷中的溶液,并用2000ml 5-30%(体积比浓度)的甲醇在二氯甲烷中的浓度梯度溶液经硅胶柱层析分离,除去反应副产物以及未反应的化合物,收集最后带浅绿色荧光组份,经减压浓缩(可加热,但低于60℃)后,即得到所要荧光分子。此荧光分子在488nm波长吸收后在650nm波长的荧光效率有了十倍的提高。
[0045] 实施例7
[0046] 氨基化短波长荧光素,波长460-520nm,为单异构体,和0.1mmole长波长荧光染料Bodipy-635琥珀酸酯按摩尔比1∶1,溶于100μl二甲基甲酰胺中。加入10μl三乙胺并在其催化作用下,在常温进行反应,经过1小时的反应后,加入200μl的pH7-10弱碱性碳酸钠水溶夜并混合。再在60℃反应1小时后,高速离心除去沉淀,上清液经减压浓缩(可加热,但应低于60℃)后,溶于10ml 5%的甲醇在二氯甲烷中的溶液,并用1000ml 5-30%(体积比浓度)的甲醇在二氯甲烷中的浓度梯度溶液经硅胶柱层析分离,除去反应副产物以及未反应的化合物,收集最后带色荧光组份,经减压浓缩(可加热,但低于60℃)后,即得到所要荧光染料。此荧光分子在488nm波长吸收后在650nm波长的荧光效率有了十倍以上的提高。
[0047] 实施例8
[0048] 氨基化长波长荧光染料DY-630,和0.1mmole短波长荧光染料荧光素琥珀酸酯按摩尔比50∶1,溶于100μl二甲基甲酰胺中。加入10μl三乙胺并在其催化作用下,在常温进行反应,经过1小时的反应后,加入200μl的pH7-10弱碱性碳酸钠水溶夜并混合。再在60℃反应1小时。反应结束后,高速离心除去沉淀,上清液经减压浓缩(加热,但应低于60℃)后,溶于10ml 5%的甲醇在二氯甲烷中的溶液,并用1000ml 5-30%(体积比浓度)的甲醇在二氯甲烷中的浓度梯度溶液经硅胶柱层析分离,除去反应副产物以及未反应的化合物,收集最后带色荧光组份,经减压浓缩(可加热,但低于60℃)后,即得到所要荧光染料。此荧光分子在488nm波长吸收后在650nm波长的荧光效率有了十倍以上的提高。
[0049] 实施例9
[0050] 氨基化短波长荧光素,波长460-520nm,为单异构体,和0.1mmole长波长荧光染料Alexa-633琥珀酸酯按摩尔比2∶1,溶于100μl二甲基甲酰胺中。加入10μl三乙胺并在其催化作用下,在常温进行混合反应,经过1小时的反应后,加入200μl的pH7-10弱碱性碳酸钠水溶夜并混合。再在60℃反应1小时。反应结束后,高速离心除去沉淀,上清液经减压浓缩(可加热,但应低于60℃)后,溶于10ml 5%的甲醇在二氯甲烷中的溶液,并用1000ml 5-30%(体积比浓度)的甲醇在二氯甲烷中的浓度梯度溶液经硅胶柱层析分离,除去反应副产物以及未反应的化合物,收集最后带色荧光组份,经减压浓缩(可加热,但低于
60℃)后,即得到所要荧光染料。此荧光分子在488nm波长吸收后在650nm波长的荧光效率有了十倍以上的提高。
[0051] 实施例10
[0052] 氨基化短波长荧光素,波长460-520nm,为单异构体,和0.1mmole长波长荧光染料Bodipy-635琥珀酸酯按摩尔比5∶1,溶于100μl二甲基甲酰胺中。加入10μl三乙胺并在其催化作用下,在常温进行混合反应,经过1小时的反应后,加入200μl的pH7-10弱碱性碳酸钠水溶夜并混合。再在60℃反应1小时。反应结束后,高速离心除去沉淀,上清液经减压浓缩(可加热,但应低于60℃)后,溶于10ml 5%的甲醇在二氯甲烷中的溶液,并用1000ml 5-30%(体积比浓度)的甲醇在二氯甲烷中的浓度梯度溶液经硅胶柱层析分离,除去反应副产物以及未反应的化合物,收集最后带色荧光组份,经减压浓缩后,可加热,但低于60℃,即得到所要荧光染料。此荧光分子在488nm波长吸收后在650nm波长的荧光效率有了十倍以上的提高。
[0053] 经实施列1到10的上述方法得到的0.1mmole荧光染料和琥珀酸以摩尔比1∶1-100,溶于100μl二甲基甲酰胺中。加入10μl三乙胺碱并在其催化作用下,在常温或低于60℃,进行反应。经过1-24小时的反应,反应结束后,高速离心除去沉淀,上清液经减压浓缩(可加热,但低于60℃)后,溶于5ml 5%的甲醇在二氯甲烷中的有机溶剂中,并用300-500ml5-25%(体积比浓度)的甲醇在二氯甲烷中的浓度梯度溶液经硅胶柱层析分离,除去反应副产物以及未反应的化合物,收集最后带色荧光组份,经减压浓缩(可加热,但低于60℃)后,即得到所要纯化的荧光分子琥珀酸酯。此琥珀酸酯即可用于寡核苷酸和蛋白标记,标记后的产物,通过透析,过柱和高压液相等方法除去反应副产物以及未反应的化合物,即得到所需荧光标记的寡核苷酸或蛋白。当这样的多个不同波长的荧光分子被标记在不同的核酸片段或蛋白分子上,就能达到多重实时定量检测分析,从而大大提高了检测的特异性,可靠性,均一性和灵敏度。此方法尤其适合于人类STR-PCR DNA复合扩增基因分型,基因和蛋白芯片产品中。
[0054] 上所述的实施例,只是本发明较优选的具体实施方式的一种,本领域的技术人员在本发明技术方案范围内进行的通常变化和替换都应包含在本发明的保护范围内。
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