ＤＹＲＫを阻害する化合物を含有する医薬組成物 |
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| 申请号 | JP2010521663 | 申请日 | 2009-06-30 | 公开(公告)号 | JPWO2010010797A1 | 公开(公告)日 | 2012-01-05 |
| 申请人 | 株式会社キノファーマ; | 发明人 | 萩原正敏; 浩司 澁谷; 浩司 澁谷; 英理子 大西; 英理子 大西; 靖 小川; 靖 小川; 孝充 細谷; 孝充 細谷; 俊行 平松; 俊行 平松; 吉田 実代; 実代 吉田; | ||||
| 摘要 | DYRK1A、DYRK1B、及び、DYRK2の少なくとも1つの活性亢進を伴う 疾病 の治療又は予防のための医薬組成物の提供。DYRK1A、DYRK1B、及び、DYRK2の少なくとも1つの蛋白質リン 酸化 活性を阻害する化合物を有効成分とする、DYRK1A、DYRK1B、及び、DYRK2の少なくとも1つの活性亢進を伴う疾病の治療又は予防のための医薬組成物。 | ||||||
| 权利要求 | ＤＹＲＫ１Ａ、ＤＹＲＫ１Ｂ、及び、ＤＹＲＫ２の少なくとも１つの蛋白質リン酸化活性を阻害する化合物を有効成分とする、ＤＹＲＫ１Ａ、ＤＹＲＫ１Ｂ、及び、ＤＹＲＫ２の少なくとも１つの活性亢進を伴う疾病の治療又は予防のための医薬組成物。 前記疾病が、ＤＹＲＫ１Ａ、ＤＹＲＫ１Ｂ、及び、ＤＹＲＫ２の少なくとも１つの活性阻害が治療又は予防に有効な疾病である、請求項１記載の医薬組成物。 前記疾病が、精神神経疾患及び悪性腫瘍を含む、請求項１又は２に記載の医薬組成物。 前記精神神経疾患が、ダウン症候群及びアルツハイマー病を含む、請求項３記載の医薬組成物。 前記悪性腫瘍が、膵管がん及び横紋筋肉腫を含む、請求項３記載の医薬組成物。 前記化合物が、ベンゾチアゾール誘導体である、請求項１から５のいずれかに記載の医薬組成物。 ＤＹＲＫ１Ａ、ＤＹＲＫ１Ｂ、及び、ＤＹＲＫ２の少なくとも１つの活性亢進を伴う疾病の治療又は予防のための医薬組成物であって、 有効成分として下記式（Ｉ）の化合物、又は、その製薬上許容される塩若しくは溶媒和物を含む、医薬組成物。 ［上記式（Ｉ）において、 Ａは、Ｓ（硫黄原子）又はＳｅ（セレニウム原子）であり、 Ｘは、ハロゲン置換されてもよいＣ １ −Ｃ １０アルキル基であり、 Ｙは、Ｈ（水素原子）、ハロゲン置換されてもよいＣ １ −Ｃ １０アルキル基、Ｃ ２ −Ｃ ６アルケニル基、−Ｒ １ ＯＨ、−ＣＯＯＲ ２ 、及び、−Ｒ １ ＯＣＯＲ ３から選択され、 Ｚは、ハロゲン置換されてもよいＣ １ −Ｃ １０アルキル基、ハロゲン、−ＮＨＣＯＲ ２ 、−ＯＲ ２ 、及び、−ＯＣＯＲ ３から選択され、 Ｒ １は、Ｃ １ −Ｃ １０アルキレン基であり、 Ｒ ２は、Ｈ、又は、Ｃ １ −Ｃ １０アルキル基であり、 Ｒ ３は、Ｃ １ −Ｃ １０アルキル基、Ｃ １ −Ｃ ３アルコキシ基若しくはＣ １ −Ｃ ６アルキル基で置換されてもよいアリール基、及び、Ｃ １ −Ｃ ６アルキル基で置換されてもよいへテロアリール基から選択される。 ］ 前記疾病が、ＤＹＲＫ１Ａ、ＤＹＲＫ１Ｂ、及び、ＤＹＲＫ２の少なくとも１つの活性阻害が治療又は予防に有効な疾病である、請求項７記載の医薬組成物。 前記疾病が、精神神経疾患及び悪性腫瘍を含む、請求項７又は８に記載の医薬組成物。 前記精神神経疾患が、ダウン症候群及びアルツハイマー病を含む、請求項９記載の医薬組成物。 前記悪性腫瘍が、膵管がん及び横紋筋肉腫を含む、請求項９記載の医薬組成物。 ＤＹＲＫ１Ａ、ＤＹＲＫ１Ｂ、及び、ＤＹＲＫ２の少なくとも１つの活性亢進を伴う疾病の治療又は予防の方法であって、ＤＹＲＫ１Ａ、ＤＹＲＫ１Ｂ、及び、ＤＹＲＫ２の少なくとも１つの蛋白質リン酸化活性を阻害する化合物を有効成分とする医薬組成物を対象に有効量投与することを含む、治療又は予防方法。 前記対象又はその一部においてＤＹＲＫ１Ａ、ＤＹＲＫ１Ｂ、及び、ＤＹＲＫ２の少なくとも１つが活性亢進していることを確認することを含む、請求項１２記載の治療又は予防方法。 前記疾病が、ＤＹＲＫ１Ａ、ＤＹＲＫ１Ｂ、及び、ＤＹＲＫ２の少なくとも１つの活性阻害が治療又は予防に有効な疾病である、請求項１２又は１３記載の治療又は予防方法。 前記疾病が、精神神経疾患及び悪性腫瘍を含む、請求項１２から１４のいずれかに記載の治療又は予防方法。 前記精神神経疾患が、ダウン症候群及びアルツハイマー病を含む、請求項１５記載の治療又は予防方法。 前記悪性腫瘍が、膵管がん及び横紋筋肉腫を含む、請求項１５記載の治療又は予防方法。 前記化合物が、ベンゾチアゾール誘導体である、請求項１２から１７のいずれかに記載の治療又は予防方法。 ＤＹＲＫ１Ａ、ＤＹＲＫ１Ｂ、及び、ＤＹＲＫ２の少なくとも１つの活性亢進を伴う疾病の治療又は予防の方法であって、請求項７から１１のいずれかに記載の医薬組成物を対象に有効量投与することを含む、治療又は予防方法。 前記対象又はその一部においてＤＹＲＫ１Ａ、ＤＹＲＫ１Ｂ、及び、ＤＹＲＫ２の少なくとも１つが活性亢進していることを確認することを含む、請求項１９記載の治療又は予防方法。 前記疾病が、ＤＹＲＫ１Ａ、ＤＹＲＫ１Ｂ、及び、ＤＹＲＫ２の少なくとも１つの活性阻害が治療又は予防に有効な疾病である、請求項１９又は２０記載の治療又は予防方法。 前記疾病が、精神神経疾患及び悪性腫瘍を含む、請求項１９から２１のいずれかに記載の治療又は予防方法。 前記精神神経疾患が、ダウン症候群及びアルツハイマー病を含む、請求項２２記載の治療又は予防方法。 前記悪性腫瘍が、膵管がん及び横紋筋肉腫を含む、請求項２２記載の治療又は予防方法。 下記式（Ｉ）化合物、又は、その製薬上許容される塩若しくは溶媒和物。 ［上記式（Ｉ）において、 Ａは、Ｓ（硫黄原子）又はＳｅ（セレニウム原子）であり、 Ｘは、ハロゲン置換されてもよいＣ １ −Ｃ １０アルキル基であり、 Ｙは、Ｈ（水素原子）、ハロゲン置換されてもよいＣ １ −Ｃ １０アルキル基、Ｃ ２ −Ｃ ６アルケニル基、−Ｒ １ ＯＨ、−ＣＯＯＲ ２ 、及び、−Ｒ １ ＯＣＯＲ ３から選択され、 Ｚは、ハロゲン置換されてもよいＣ １ −Ｃ １０アルキル基、ハロゲン、−ＮＨＣＯＲ ２ 、−ＯＲ ２ 、及び、−ＯＣＯＲ ３から選択され、 Ｒ １は、Ｃ １ −Ｃ １０アルキレン基であり、 Ｒ ２は、Ｈ、又は、Ｃ １ −Ｃ １０アルキル基であり、 Ｒ ３は、Ｃ １ −Ｃ １０アルキル基、Ｃ １ −Ｃ ３アルコキシ基若しくはＣ １ −Ｃ ６アルキル基で置換されてもよいアリール基、及び、Ｃ １ −Ｃ ６アルキル基で置換されてもよいへテロアリール基から選択され、 但し、 ＡがＳかつＸ及びＹがメチル基の場合、Ｚは、フッ素原子（Ｆ）、ヒドロキシ基、メトキシ基、エトキシ基、及び、アセトキシ基を除く上記範囲から選択され、 ＡがＳかつＸがエチル基かつＹがメチル基の場合、Ｚは、メトキシ基を除く上記範囲から選択される。 ］ モデル動物の初期胚にＤＹＲＫ１Ａ、ＤＹＲＫ１Ｂ、及び、ＤＹＲＫ２の少なくとも１つのｍＲＮＡを誘導して発生異常を起こしうる状態とすること、 前記初期胚を候補化合物と接触させること、及び、 候補化合物を接触させなかった場合と比較して候補化合物による発生異常の抑制効果を評価することを含む、ＤＹＲＫ１Ａ、ＤＹＲＫ１Ｂ、及び、ＤＹＲＫ２の少なくとも１つの活性亢進を伴う疾病の治療又は予防のための医薬組成物の有効成分のスクリーニング方法。 |
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| 说明书全文 | 本発明は、ＤＹＲＫ１Ａ、ＤＹＲＫ１Ｂ、及び、ＤＹＲＫ２の少なくとも１つを阻害するベンゾチアゾール誘導体、それを含有する医薬組成物、及び、それを用いた疾病の治療・予防方法に関する。 蛋白質リン酸化酵素（キナーゼ）は、細胞内情報伝達に必須であり、それらの発現異常あるいは活性異常は、様々な疾患を惹起することが知られている。 そのため、様々なリン酸化酵素が創薬標的因子として着目され、標的のリン酸化酵素に特異的なインヒビターの探索が世界中で行われている。 リン酸化酵素ファミリーの１つに、ＤＹＲＫファミリーがある。 ＤＹＲＫの名称の由来は、“dual-specificity tyrosine phosphorylation regulated kinase”である。 すなわち、ＤＹＲＫファミリーは、チロシン（Ｔｙｒ）及びセリン／トレオニン（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）の両方を基質とするリン酸化酵素のファミリーであって、自己リン酸化の場合にのみＴｙｒリン酸化酵素として機能し、細胞内では“ｐｒｏｌｉｎｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ”なＳｅｒ／Ｔｈｒリン酸化酵素として機能する。 ＤＹＲＫファミリーのメンバーとして、ＤＹＲＫ１Ａ、ＤＹＲＫ１Ｂ、ＤＹＲＫ２、ＤＹＲＫ３、ＤＹＲＫ４の５つが知られている。 ＤＹＲＫ１Ａは、精神神経疾患との関連性が深い。 ＤＹＲＫ１Ａ遺伝子は、ダウン症候群の原因である２１番染色体トリソミーのダウン症クリティカル領域（ＤＳＣＲ）に位置する。 そして、これまでに、マウスではＤＹＲＫ１Ａの単独の過剰発現によりダウン症様の精神神経症状をきたすことが報告され（非特許文献１、２）、ダウン症患者及びダウン症モデルマウスの脳内ではＤＹＲＫ１Ａ発現が上昇することが報告されている（非特許文献３）。 これらのことは、ＤＹＲＫ１Ａが、ダウン症候群の発症において重要な役割を担っていることを示している。 また、アルツハイマー病の原因として、Ａβの蓄積とタウ蛋白質（Ｔａｕ）の異常リン酸化が知られている。 アルツハイマー病の患者では、Ａβの発現亢進とＤＹＲＫ１Ａの発現とが有意に一致することから、Ａβの発現亢進からＴａｕの異常リン酸化への橋渡しをＤＹＲＫ１Ａが担うという作業仮説も提案されている（非特許文献４）。 ＤＹＲＫ１Ｂは、悪性腫瘍との関連性が深い。 例えば、膵癌組織においてＤＹＲＫ１Ｂの発現が上昇すること（非特許文献５）、横紋筋肉腫においてＤＹＲＫ１Ｂが多く発現していること（非特許文献６）が開示されている。 そして、ＤＹＲＫ１Ｂは、ストレス応答経路により活性化され、チェックポイントキナーゼとして機能し、損傷した腫瘍細胞を休止状態に停止させて腫瘍細胞の修復をさせる、という作業仮説も提案されている（非特許文献７）。 ＤＹＲＫ２については、ＤＮＡ損傷に応答してｐ５３を制御し、アポトーシスを誘導することが示唆されている（非特許文献８）。 一方、ベンゾチアゾール誘導体とリン酸化酵素との関係においては、リン酸化酵素であるＣｌｋ１及びＣｌｋ４のリン酸化活性を阻害できるベンゾチアゾール誘導体が開示されている（特許文献１、非特許文献９）。 Branchi I et al. J Neuropathol Exp Neurol. 2004 May;63(5):429-40. Altafaj X et al. Hum Mol Genet. 2001 Sep 1;10(18):1915-23. Dowjat WK et al. Neurosci Lett. 2007 Feb 8;413(1):77-81. Epub 2006 Dec 4. Kimura R et al. Hum Mol Genet. 2007 Jan 1;16(1):15-23. Epub 2006 Nov 29. Deng X et al. Cancer Res. 2006 Apr 15;66(8):4149-58. Mercer SE et al. Cancer Res. 2006 May 15;66(10):5143-50. Friedman E. J Cell Biochem. 2007 Oct 1;102(2):274-9. Taira N et al. Mol Cell. 2007 Mar 23;25(6):794-6. Muraki M et al.J Biol Chem. 2004 Jun 4;279(23):24246-54. Epub 2004 Mar 8. ＤＹＲＫは疾患と密接な関係を持つリン酸化酵素であり、ＤＹＲＫのリン酸化活性を阻害できれば疾患の治療や予防に有用であると考えられる。 しかしながら、ＤＹＲＫのリン酸化活性を効果的に阻害できる医薬組成物は未だ報告されていない。 そこで、本発明は、ＤＹＲＫ１Ａ、ＤＹＲＫ１Ｂ、及び、ＤＹＲＫ２の少なくとも１つの活性亢進を伴う疾病の治療又は予防のための医薬組成物、及びそれを用いた治療方法を提供する。 本発明の医薬組成物は、一つの態様として、ＤＹＲＫ１Ａ、ＤＹＲＫ１Ｂ、及び、ＤＹＲＫ２の少なくとも１つの蛋白質リン酸化活性を阻害する化合物を有効成分とする医薬組成物であって、ＤＹＲＫ１Ａ、ＤＹＲＫ１Ｂ、及び、ＤＹＲＫ２の少なくとも１つの活性亢進を伴う疾病の治療又は予防のための医薬組成物である。 また、本発明の医薬組成物は、その他の態様として、ＤＹＲＫ１Ａ、ＤＹＲＫ１Ｂ、及び、ＤＹＲＫ２の少なくとも１つの活性亢進を伴う疾病の治療又は予防のための医薬組成物であって、有効成分として下記式（Ｉ）の化合物、又は、その製薬上許容される塩若しくは溶媒和物を含有する医薬組成物である。
１ −Ｃ １０アルキル基であり、
１ −Ｃ １０アルキル基、Ｃ ２ −Ｃ ６アルケニル基、−Ｒ １ ＯＨ、−ＣＯＯＲ ２ 、及び、−Ｒ １ ＯＣＯＲ ３から選択され、
１ −Ｃ １０アルキル基、ハロゲン、−ＮＨＣＯＲ ２ 、−ＯＲ ２ 、及び、−ＯＣＯＲ ３から選択され、
１は、Ｃ １ −Ｃ １０アルキレン基であり、
２は、Ｈ、又は、Ｃ １ −Ｃ １０アルキル基であり、
３は、Ｃ １ −Ｃ １０アルキル基、Ｃ １ −Ｃ ３アルコキシ基若しくはＣ １ −Ｃ ６アルキル基で置換されてもよいアリール基、及び、Ｃ １ −Ｃ ６アルキル基で置換されてもよいへテロアリール基から選択される。 ］ 本発明の治療又は予防方法は、一つの態様において、ＤＹＲＫ１Ａ、ＤＹＲＫ１Ｂ、及び、ＤＹＲＫ２の少なくとも１つの活性亢進を伴う疾病の治療又は予防の方法であって、ＤＹＲＫ１Ａ、ＤＹＲＫ１Ｂ、及び、ＤＹＲＫ２の少なくとも１つの蛋白質リン酸化活性を阻害する化合物を有効成分とする医薬組成物を対象に有効量投与することを含む治療又は予防方法である。 また、本発明の治療又は予防方法は、その他の態様として、ＤＹＲＫ１Ａ、ＤＹＲＫ１Ｂ、及び、ＤＹＲＫ２の少なくとも１つの活性亢進を伴う疾病の治療又は予防の方法であって、本発明の医薬組成物を対象に有効量投与することを含む治療又は予防方法である。 本発明の医薬組成物及び治療又は予防方法によれば、ＤＹＲＫ１Ａ、ＤＹＲＫ１Ｂ、及び、ＤＹＲＫ２の少なくとも１つのリン酸化活性を阻害できることから、好ましくは、これらのリン酸化酵素の活性亢進を伴う疾病の治療又は予防ができる。 本発明は、ＤＹＲＫ１Ａ、ＤＹＲＫ１Ｂ、及び、ＤＹＲＫ２の少なくとも１つの活性亢進を伴い発現される個体の異常が、ＤＹＲＫ１Ａ、ＤＹＲＫ１Ｂ、及び、ＤＹＲＫ２の少なくとも１つの蛋白質リン酸化活性を阻害する化合物により抑制可能であるという知見に基づく。 本発明は、また、下記式（Ｉ）のベンゾチアゾール誘導体が蛋白質リン酸化酵素であるＤＹＲＫ１Ａ、ＤＹＲＫ１Ｂ、及び、ＤＹＲＫ２のリン酸化活性に対して阻害能を有するという知見に基づく。 なお、下記式（Ｉ）のベンゾチアゾール誘導体は、上記特許文献１及び非特許文献９に開示されたベンゾチアゾール誘導体と一部重複する。 しかしながら、これらの文献は、上記式（Ｉ）に含まれる一部のベンゾチアゾール誘導体がＣｌｋファミリー（Ｃｌｋ１及び４）のリン酸化酵素の阻害剤となりうることのみを開示し、ＤＹＲＫファミリーのリン酸化酵素については言及がない。 すなわち、本発明は下記を含む；
１ −Ｃ １０アルキル基であり、Ｙは、Ｈ（水素原子）、ハロゲン置換されてもよいＣ １ −Ｃ １０アルキル基、Ｃ ２ −Ｃ ６アルケニル基、−Ｒ １ ＯＨ、−ＣＯＯＲ ２ 、及び、−Ｒ １ ＯＣＯＲ ３から選択され、Ｚは、ハロゲン置換されてもよいＣ １ −Ｃ １０アルキル基、ハロゲン、−ＮＨＣＯＲ ２ 、−ＯＲ ２ 、及び、−ＯＣＯＲ ３から選択され、
１は、Ｃ １ −Ｃ １０アルキレン基であり、Ｒ ２は、Ｈ、又は、Ｃ １ −Ｃ １０アルキル基であり、Ｒ ３は、Ｃ １ −Ｃ １０アルキル基、Ｃ １ −Ｃ ３アルコキシ基若しくはＣ １ −Ｃ ６アルキル基で置換されてもよいアリール基、及び、Ｃ １ −Ｃ ６アルキル基で置換されてもよいへテロアリール基から選択される。 ］
１ −Ｃ １０アルキル基であり、Ｙは、Ｈ（水素原子）、ハロゲン置換されてもよいＣ １ −Ｃ １０アルキル基、Ｃ ２ −Ｃ ６アルケニル基、−Ｒ １ ＯＨ、−ＣＯＯＲ ２ 、及び、−Ｒ １ ＯＣＯＲ ３から選択され、Ｚは、ハロゲン置換されてもよいＣ １ −Ｃ １０アルキル基、ハロゲン、−ＮＨＣＯＲ ２ 、−ＯＲ ２ 、及び、−ＯＣＯＲ ３から選択され、
１は、Ｃ １ −Ｃ １０アルキレン基であり、Ｒ ２は、Ｈ、又は、Ｃ １ −Ｃ １０アルキル基であり、Ｒ ３は、Ｃ １ −Ｃ １０アルキル基、Ｃ １ −Ｃ ３アルコキシ基若しくはＣ １ −Ｃ ６アルキル基で置換されてもよいアリール基、及び、Ｃ １ −Ｃ ６アルキル基で置換されてもよいへテロアリール基から選択され、但し、ＡがＳかつＸ及びＹがメチル基の場合、Ｚは、フッ素原子（Ｆ）、ヒドロキシ基、メトキシ基、エトキシ基、及び、アセトキシ基を除く上記範囲から選択され、ＡがＳかつＸがエチル基かつＹがメチル基の場合、Ｚは、メトキシ基を除く上記範囲から選択される。 ］
［ＤＹＲＫ１Ａ，ＤＹＲＫ１Ｂ，ＤＹＲＫ２］ ［用途］ 本発明の医薬組成物は、ＤＹＲＫ１Ａ、ＤＹＲＫ１Ｂ、及び、ＤＹＲＫ２の少なくとも１つの活性阻害が治療又は予防に有効な疾病に対する治療又は予防に用いることが好ましい。 本発明の医薬組成物が用いられる疾病としては、精神神経疾患や、悪性腫瘍が挙げられる。 前記精神神経疾患は、ＤＹＲＫ１Ａ、ＤＹＲＫ１Ｂ、及び、ＤＹＲＫ２の少なくとも１つの活性亢進を伴うもの、好ましくは、ＤＹＲＫ１Ａの活性亢進を伴うものであり、より好ましくは、ＤＹＲＫ１Ａの過剰発現を伴う精神神経疾患及びＴａｕリン酸化亢進を伴う精神神経疾患であり、代表的には、ダウン症候群、及びアルツハイマー病を含む。 なお、前記精神神経疾患は、ダウン症候群以外、又は、アルツハイマー病以外の精神神経疾患であってもよい。 前記悪性腫瘍は、ＤＹＲＫ１Ａ、ＤＹＲＫ１Ｂ、及び、ＤＹＲＫ２の少なくとも１つの活性亢進を伴う悪性新生物、好ましくはＤＹＲＫ１Ａ及びＤＹＲＫ１Ｂの活性亢進を伴う悪性新生物であり、より好ましくはＤＹＲＫ１Ｂの活性亢進を伴う悪性新生物である。 代表的には、膵管がん及び横紋筋肉腫並びにＨＰＶによるがんを含むがこれらには限定されない。 ＤＹＲＫ１Ａの活性亢進を伴う疾病、及びＤＹＲＫ１Ａの活性阻害が治療又は予防に有効な疾病としては、精神神経疾患が挙げられる。 前記精神神経疾患の第一の例が、ダウン症候群である。 上述したとおり、ＤＹＲＫ１Ａの遺伝子は、ダウン症候群の原因である２１番染色体トリソミーのダウン症クリティカル領域（ＤＳＣＲ）に位置し、マウスではＤＹＲＫ１Ａの単独の過剰発現によりダウン症様の精神神経症状をきたすことが報告され、ダウン症患者及びダウン症モデルマウスの脳内ではＤＹＲＫ１Ａ発現が上昇することが報告されている。 さらに、後述の実施例に記載するとおり、神経系に発生異常を呈するＤＹＲＫ１Ａ過剰発現アフリカツメガエルモデルに、本発明の医薬組成物の有効成分である上記式（Ｉ）の化合物を投与すると正常な発生を導くことができる。 したがって、本発明の医薬組成物であれば、ダウン症候群を含む精神神経症状を治療又は予防できるといえる。 ＤＹＲＫ１Ａの活性亢進を伴う疾病、及びＤＹＲＫ１Ａの活性阻害が治療又は予防に有効な疾病である精神神経疾患の第二の例が、アルツハイマー病である。 アルツハイマー病の発症機構として、まずアミロイド前駆体蛋白質（ＡＰＰ）から産生されたベータアミロイド（Ａβ）が蓄積し、次いでＴａｕの過剰リン酸化が起こり、その結果、神経原線維変化・神経細胞死が誘導されるという機序が最も有力であると考えられている。 Ｔａｕの異常リン酸化はＤＹＲＫ１Ａと密接な関係にあり、後述の実施例に記載するとおり、細胞内にＤＹＲＫ１Ａ及びＴａｕを過剰発現させた系において、Ｔａｕの異常リン酸化は、本発明の医薬組成物の有効成分である上記式（Ｉ）の化合物の投与により抑制される。 さらに、ＤＹＲＫ１Ａは、Ａβの蓄積を促進するＡＰＰのリン酸化に関与することも示唆されている（Ryoo SR et al. J Neurochem. 2008 Mar;104(5):1333-44. Epub 2007 Nov 14）。 したがって、本発明の医薬組成物であれば、アルツハイマー病を含む精神神経症状を治療又は予防できるといえる。 また、ダウン症候群の原因である２１番染色体トリソミーのダウン症クリティカル領域（ＤＳＣＲ）には、ＤＹＲＫ１Ａ遺伝子のみならず、ＡＰＰ遺伝子も位置し、ダウン症患者が健常人に比べて早期にかつ高効率にアルツハイマー病を発症することから、本発明の医薬組成物であれば、ダウン症患者におけるアルツハイマー病を治療又は予防できるといえる。 ＤＹＲＫ１Ａの活性亢進を伴う疾病、及びＤＹＲＫ１Ａの活性阻害が治療又は予防に有効な疾病である悪性腫瘍の例は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）によるがんである。 ＤＹＲＫ１Ａは、ＨＰＶ１６の蛋白質をリン酸化することにより該ウイルス蛋白質の安定化に働き、それらが子宮頸部がんの細胞癌化に関与することが報告されている（Chang HS et al. Int J Cancer. 2007 Jun 1;120(11):2377-85.; Liang YJ et al. Int J Biochem Cell Biol. 2008 40(11):2431-41.）。 したがって、本発明の医薬組成物であれば、ＨＰＶによるがん、好ましくはＨＰＶ１６によるがん、さらに好ましくはＨＰＶによる子宮頸部がん、さらにより好ましくはＨＰＶ１６による子宮頸部がんを治療又は予防できるといえる。 ＤＹＲＫ１Ｂの活性亢進を伴う疾病、及びＤＹＲＫ１Ｂの活性阻害が治療又は予防に有効な疾病としては、悪性腫瘍が挙げられる。 上述したとおり、ＤＹＲＫ１Ｂは、膵管がん組織や横紋筋肉腫において発現が増加する。 さらに、後述の実施例に記載するとおり、悪性腫瘍由来の細胞系の細胞に本発明の医薬組成物の有効成分である上記式（Ｉ）の化合物を投与すると増殖抑制効果及び／又は抗がん剤作用増強効果を発揮する。 よって、本発明の医薬組成物は、悪性腫瘍の治療に有用である。 また、本発明は、その他の態様として、ＤＹＲＫ１Ｂの活性亢進を伴う悪性腫瘍において抗がん剤の作用を増強するための医薬組成物であって、ＤＹＲＫ１Ａ、ＤＹＲＫ１Ｂ、及び、ＤＹＲＫ２の少なくとも１つの蛋白質リン酸化活性を阻害する化合物を有効成分とする医薬組成物を提供しうる。 さらにその他の態様として、本発明は、ＤＹＲＫ１Ｂの活性亢進を伴う悪性腫瘍において抗がん剤の作用を増強するための医薬組成物であって、上記式（Ｉ）のベンゾチアゾール誘導体、又は、その製薬上許容される塩若しくは溶媒和物を、好ましくは有効成分として含む医薬組成物を提供しうる。 ［有効成分］ ［ベンゾチアゾール誘導体］
１ −Ｃ １０アルキル基であり、
１ −Ｃ １０アルキル基、Ｃ ２ −Ｃ ６アルケニル基、−Ｒ １ ＯＨ、−ＣＯＯＲ ２ 、及び、−Ｒ １ ＯＣＯＲ ３から選択され、
１ −Ｃ １０アルキル基、ハロゲン、−ＮＨＣＯＲ ２ 、−ＯＲ ２ 、及び、−ＯＣＯＲ ３から選択され、
１は、Ｃ １ −Ｃ １０アルキレン基であり、
２は、Ｈ、又は、Ｃ １ −Ｃ １０アルキル基であり、
３は、Ｃ １ −Ｃ １０アルキル基、Ｃ １ −Ｃ ３アルコキシ基若しくはＣ １ −Ｃ ６アルキル基で置換されてもよいアリール基、及び、Ｃ １ −Ｃ ６アルキル基で置換されてもよいへテロアリール基から選択される。 ］ なお、本発明において、「Ｃ １ −Ｃ ｎアルキル基」とは、１〜ｎ個の炭素原子を有する直鎖状又は分枝状のアルキル基をいい、「Ｃ １ −Ｃ ｎアルキレン基」とは、前記定義のＣ １ −Ｃ ｎアルキル基の二価の置換基をいう。 また、「Ｃ １ −Ｃ ｍアルコキシ基若しくはＣ １ −Ｃ ｎアルキル基で置換されてもよいアリール基」とは、側鎖のないアリール基（例えば、フェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基等）及び１以上のＣ １ −Ｃ ｍアルコキシ基（炭素数１〜ｍ個のアルコキシ基）側鎖若しくは１以上のＣ １ −Ｃ ｎアルキル基（炭素原子数１〜ｎ個のアルキル基）側鎖を有するアリール基（例えば、ｏ，ｍ，ｐ−メトキシフェニル基、ジメトキシフェニル基、トリメトキシフェニル基、ｏ，ｍ，ｐ−トリル基、ジメチルフェニル基、メシチル基等）をいう。 「へテロアリール基」とはアリール基の環内に１個以上のヘテロ原子を含むものをいい、ヘテロ原子としては、窒素、硫黄、酸素が挙げられる。 「ハロゲン置換されてもよい」とは、１以上の水素原子がハロゲン原子により置換される場合を含むことをいい、ハロゲン原子は、フッ素原子（Ｆ）、塩素原子（Ｃｌ）、及び臭素原子（Ｂｒ）を含む。 また、「Ｃ ２ −Ｃ ｎアルケニル基」とは、２〜ｎ個の炭素原子を有する直鎖状又は分枝状のアルケニル基をいい、ビニル基、アリル基、プロペニル基、ブテニル基等を含む。 また、ベンゾチアゾール化合物としては、上記式（Ｉ）のＡは硫黄（Ｓ）であるが、本発明におけるベンゾチアゾール誘導体は、上記式（Ｉ）のＡがセレニウム（Ｓｅ）に置換された化合物を含みうる。 上記式（Ｉ）において、前記Ｃ １ −Ｃ １０アルキル基は、リン酸化活性に対する阻害能の点から、Ｃ １ −Ｃ ６アルキル基であることが好ましく、Ｃ １ −Ｃ ４アルキル基であることがより好ましい。 また、前記Ｃ １ −Ｃ １０アルキレン基は、リン酸化活性に対する阻害能の点から、Ｃ １ −Ｃ ６アルキレン基であることが好ましく、Ｃ １ −Ｃ ４アルキレン基であることがより好ましい。 また、前記Ｃ ２ −Ｃ ６アルケニル基は、リン酸化活性に対する阻害能の点から、Ｃ ２ −Ｃ ４アルケニル基が好ましく、Ｃ ２ −Ｃ ３アルケニル基がより好ましい。 また、上記式（Ｉ）における前記Ｃ １ −Ｃ ６アルキル基は、リン酸化活性に対する阻害能の点から、Ｃ １ −Ｃ ４アルキル基であることが好ましく、Ｃ １ −Ｃ ３アルキル基であることがより好ましい。 上記式（Ｉ）において、Ｘは、ハロゲン置換されてもよいＣ １ −Ｃ １０アルキル基であって、ＤＹＲＫ１Ａ、ＤＹＲＫ１Ｂ、及び、ＤＹＲＫ２のリン酸化活性に対する阻害能の点から、ハロゲン置換されてもよいＣ １ −Ｃ ４アルキル基が好ましく、ハロゲン置換されてもよいＣ １ −Ｃ ３アルキル基がより好ましく、メチル基、エチル基、又はパーフルオロメチル基がさらに好ましい。 上記式（Ｉ）において、Ｙは、Ｈ、ハロゲン置換されてもよいＣ １ −Ｃ １０アルキル基、Ｃ ２ −Ｃ ６アルケニル基、−Ｒ １ ＯＨ、−ＣＯＯＲ ２ 、及び、−Ｒ １ ＯＣＯＲ ３から選択される。 ここで、−Ｒ １ ＯＨとしては、ヒドロキシＣ １ −Ｃ ６アルキル基が挙げられる。 −Ｒ １ ＣＯＯＲ ２としては、Ｃ １ −Ｃ ４アルコキシカルボニルＣ １ −Ｃ ４アルキル基が挙げられ、−ＣＯＯＲ ２としては、カルボキシル基、及びＣ １ −Ｃ ４アルコキシカルボニル基が挙げられ−Ｒ １ ＯＣＯＲ ３としては、Ｃ １ −Ｃ ４アルキルアシルオキシＣ １ −Ｃ ４アルキル基、（ヘテロ）アリールアシルオキシＣ １ −Ｃ ４アルキル基、及びＣ １ −Ｃ ４アルキル（ヘテロ）アリールアシルオキシＣ １ −Ｃ ４アルキル基が挙げられる。 Ｙは、ＤＹＲＫ１Ａ、ＤＹＲＫ１Ｂ、及び、ＤＹＲＫ２のリン酸化活性に対する阻害能の点から、Ｈ、Ｃ １ −Ｃ ６アルキル基、Ｃ ２ −Ｃ ４アルケニル基、ヒドロキシＣ １ −Ｃ ６アルキル基、Ｃ １ −Ｃ ４アルキルアシルオキシＣ １ −Ｃ ４アルキル基、及びＣ １ −Ｃ ４アルコキシカルボニル基が好ましく、Ｈ、メチル基、エチル基、ペンチル基、ビニル基、ヒドロキシメチル基、アセトキシメチル基、メトキシカルボニルブチル基、及びエトキシカルボニル基がより好ましい。 上記式（Ｉ）において、Ｚは、ハロゲン置換されてもよいＣ １ −Ｃ １０アルキル基、ハロゲン、−ＮＨＣＯＲ ２ 、−ＯＲ ２ 、及び、−ＯＣＯＲ ３から選択される。 ここで、−ＯＲ ２としては、ヒドロキシ基、及びＣ １ −Ｃ ６アルコキシ基が挙げられる。 なお、−ＯＣＯＲ ３は、ヒドロキシ基のプロドラッグ形態と考えることができる。 この場合、生体内で代謝されヒドロキシ基となるものであれば、−ＯＣＯＲ ３におけるＲ ３は特に制限されないが、−ＯＣＯＲ ３としては、Ｃ １ −Ｃ ４アルキルアシルオキシ基、（ヘテロ）アリールアシルオキシ基、Ｃ １ −Ｃ ３アルコキシアリールアシルオキシ基、及びＣ １ −Ｃ ４アルキル（へテロ）アリールアシルオキシ基が挙げられる。 Ｚは、ＤＹＲＫ１Ａ、ＤＹＲＫ１Ｂ、及び、ＤＹＲＫ２のリン酸化活性に対する阻害能の点から、ヒドロキシ基、Ｃ １ −Ｃ ６アルコキシ基、ハロゲン、及びＣ １ −Ｃ ４アルキルアシルオキシ基が好ましく、ヒドロキシ基、メトキシ基、エトキシ基、フッ素、塩素、臭素、アセトキシ基がより好ましい。 また、ＤＹＲＫ２のリン酸化活性に対する阻害能の点からは、Ｚは、−ＮＨＣＯＲ ２であることも好ましく、アセチルアミノ基であることがより好ましい。 Ｚは、ヒドロキシ基のプロドラッグ形態としては、生体内で代謝されてヒドロキシ基へのなり易さ及びＤＹＲＫ１Ａ、ＤＹＲＫ１Ｂ、及び、ＤＹＲＫ２のリン酸化活性に対する阻害能の点から、Ｃ １ −Ｃ ４アルキルアシルオキシ基、アリールアシルオキシ基、Ｃ １ −Ｃ ３アルコキシアリールアシルオキシ基、及びヘテロアリールアシルオキシ基が好ましく、アセトキシ基、ピバロイルオキシ基、ベンゾイルオキシ基、（モノ-、ジ-、トリ-）メトキシベンゾイルオキシ基、ニコチノイルオキシ基、及びイソニコチノイルオキシ基がより好ましい。 上記式（Ｉ）のベンゾチアゾール誘導体は、製薬上許容される塩又は溶媒和物の形態であってもよい。 塩の形態としては、例えば、無機酸塩、有機酸塩、無機塩基塩、有機塩基塩、酸性または塩基性アミノ酸塩などが挙げられる。 無機酸塩の好ましい例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩などが挙げられ、有機酸塩の好ましい例としては、酢酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、ステアリン酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩などが挙げられる。 また、無機塩基塩の好ましい例としては、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、アンモニウム塩などが挙げられ、有機塩基塩の好ましい例としては、ジエチルアミン塩、ジエタノールアミン塩、メグルミン塩、Ｎ，Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミン塩などが挙げられる。 酸性アミノ酸塩の好ましい例としては、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩などが挙げられ、塩基性アミノ酸塩の好ましい例としては、アルギニン塩、リジン塩、オルニチン塩などが挙げられる。 また、上記式（Ｉ）のベンゾチアゾール誘導体は、溶媒和物の形態としては、大気中の水分を吸収しあるいは吸着水が付いた水和物や、他のある種の溶媒を吸収した溶媒和物が挙げられる。 本発明の医薬組成物の有効成分として好ましい形態の一例は、以下のものが挙げられる。 但し、本発明はこれらに限定されない。 製造例００９のベンゾチアゾール誘導体は、製造例００１の５位のメトキシ基の脱保護（脱メチル化）あるいは、製造例０１９の５位のアセチル基の脱保護（アセチル基のアルカリ加水分解）により得ることができる。 また、製造例０１９のベンゾチアゾール誘導体は、製造例００９の５位のヒドロキシ基がアセチル化されたものであって、製造例００９のプロドラッグ形態として機能しうるベンゾチアゾール誘導体である。 したがって、本発明は、その他の態様において、生体内（好ましくはヒトの体内）において製造例００９となりうるベンゾチアゾール誘導体、すなわち、製造例００９のプロドラッグ形態として機能しうるベンゾチアゾール誘導体を有効成分とする医薬組成物である。 製造例００９のプロドラッグとしては、以下の形態も挙げることができる。 ［ベンゾチアゾール誘導体の製造方法］ ［医薬組成物の製造方法］ 経口投与に適した剤形としては、錠剤、粒子、液体又は粉末含有カプセル、トローチ、咀嚼剤、多粒子及びナノ粒子、ゲル、フィルムなどの固形製剤；懸濁液、溶液、シロップ及びエリキシルなどの液体製剤が挙げられる。 前記賦形剤としては、セルロース、炭酸カルシウム、第二リン酸カルシウム、マンニトール及びクエン酸ナトリウムなどの担体；ポリビニルピロリジン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース及びゼラチンなどの造粒結合剤；澱粉グリコール酸ナトリウム及びケイ酸塩などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム及びステアリン酸などの滑沢剤；ラウリル硫酸ナトリウムなどの湿潤剤；保存剤、抗酸化剤、矯味矯臭剤及び着色剤が挙げられる。 本発明の医薬組成物の非経口投与としては、上記式（Ｉ）のベンゾチアゾール誘導体、又は、その製薬上許容される塩若しくは溶媒和物を、血流中、筋肉中又は内部器官中に直接投与することが挙げられる。 非経口投与は、静脈内、動脈内、腹腔内、鞘内、心室内、尿道内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内及び皮下の投与を含む。 非経口投与は、例えば、針注射器、針なし注射器及びその他の注入技術で行える。 また、非経口投与に適した剤形としては、例えば、賦形剤及び／又は緩衝剤を含む水溶液が挙げられる。 ［治療・予防方法］ 本発明の治療又は予防方法は、本発明の医薬組成物を対象に有効量投与することを含むことが好ましい。 対象がヒトである場合、例えば、上記式（Ｉ）のベンゾチアゾール誘導体の１日あたりの総量は、一般的には、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲とすることができる。 また、一日当たりの総量は、単回又は分割投与で投与することができる。 投与方法は、上述した経口／非経口投与を適宜選択できる。 なお、使用する医薬組成物に含まれる上記式（Ｉ）のベンゾチアゾール誘導体の好ましい形態は、上述した本発明の医薬組成物の場合と同様である。 本発明の治療又は予防方法は、さらに、対象においてＤＹＲＫ１Ａ、ＤＹＲＫ１Ｂ、及び、ＤＹＲＫ２の少なくとも１つが活性亢進していることを確認する工程を含むことが好ましい。 この確認工程は、本発明の医薬組成物を投与する前に行うことが好ましい。 この確認工程は、対象から血液、細胞、組織等を採取し、ＤＹＲＫ１Ａ、ＤＹＲＫ１Ｂ、及び、ＤＹＲＫ２の少なくとも１つのｍＲＮＡの転写量、蛋白質の量、及び、リン酸化活性の少なくとも１つについて測定し、正常細胞又は正常個体と比較することを含んでもよい。 具体的な測定方法は、当業者であれば適宜選択できる。 あるいは、確認工程は、ＤＹＲＫ１Ａ、ＤＹＲＫ１Ｂ、又は、ＤＹＲＫ２に特異的な抗体を含むプローブを使用したイメージング方法を使用して蛋白質の量を測定することを含んでもよい。 また、本発明の治療又は予防方法が悪性腫瘍の治療又は予防方法である場合、さらに、従来の抗がん剤を投与する工程を含んでもよい。 本発明の医薬組成物と従来の抗がん剤とを併用することで、例えば、従来の抗がん剤の抗がん作用を増強できる。 したがって、本発明は、その他の態様として、ＤＹＲＫ１Ａ、ＤＹＲＫ１Ｂ、及び、ＤＹＲＫ２の少なくとも１つの活性亢進、好ましくはＤＹＲＫ１Ｂの活性亢進を伴う悪性腫瘍において抗がん剤の作用を増強する方法であって、本発明の医薬組成物を対象（ヒト、動物、細胞を含む）に有効量投与することを含む方法を提供しうる。 この方法においても、対象においてＤＹＲＫ１Ａ、ＤＹＲＫ１Ｂ、及び、ＤＹＲＫ２の少なくとも１つが活性亢進していることを確認する工程を含むことが好ましい。 ［阻害試薬キット］ ［阻害方法］ ［スクリーニング方法］ ［新規なベンゾチアゾール誘導体］ すなわち、上記条件ａは、上記式（Ｉ）においてＡ＝Ｓ，Ｘ＝Ｙ＝−ＣＨ ３の場合には、Ｚは、ハロゲン置換されてもよいＣ １ −Ｃ ６アルキル基、Ｃｌ、Ｂｒ、−ＮＨＣＯＲ ２ 、Ｃ ３ −Ｃ ６アルコキシ基、Ｃ ２ −Ｃ ４アルキルアシルオキシ基、（ヘテロ）アリールアシルオキシ基、Ｃ １ −Ｃ ３アルコキシアリールアシルオキシ基、及びＣ １ −Ｃ ４アルキル（へテロ）アリールアシルオキシ基から選択されることを規定することが好ましい。 また、上記条件ｂは、上記式（Ｉ）においてＡ＝Ｓ，Ｘ＝−Ｃ ２ Ｈ ５ ，Ｙ＝−ＣＨ ３の場合には、Ｚは、ハロゲン置換されてもよいＣ １ −Ｃ ６アルキル基、ハロゲン、−ＮＨＣＯＲ ２ 、ヒドロキシ基、Ｃ １ −Ｃ ６アルコキシ基、Ｃ ２ −Ｃ ４アルキルアシルオキシ基、（ヘテロ）アルキルアリールアシルオキシ基、Ｃ １ −Ｃ ３アルコキシアリールアシルオキシ基、及びＣ １ −Ｃ ４アルキル（へテロ）アリールアシルオキシ基から選択されることを規定することが好ましい。 本発明のベンゾチアゾール誘導体の好ましい形態は、上記特許文献１及び非特許文献９と重複するものを除き、上述した本発明の医薬組成物の場合と同様である。 次に、実施例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれらに限定されない。 ［ベンゾチアゾール誘導体の製造例］ ［製造例００１］
２ ＳＯ ４上で乾燥し、ろ過し、減圧濃縮した。 その残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１８ｇ、ＣＨ ２ Ｃｌ ２ ／エチルアセテート、４：１）を用いて精製し、１−（３−エチル−５−メトキシ−２，３−ジヒドロベンゾチアゾール−２−イリデン）プロパン−２−オン（製造例００１の化合物）を淡黄色固体として得た（２０１ｍｇ、８０６μｍｏｌ、収率５４．１％）。 ＮＭＲとＭＳの結果を下記に示す。 1 H NMR (CDCl 3 , 400 MHz) δ 1.37 (t, 3H, J = 7.3 Hz, CH 3 ), 2.24 (s, 3H, CH 3 ), 3.88 (s, 3H, OCH 3 ), 4.02 (q, 2H, J = 7.3 Hz, CH 2 ), 5.87 (s, 1H, olefinic), 6.65 (d,1H, J = 2.3 Hz, aromatic), 6.75 (dd, 1H, J = 2.3, 8.5 Hz, aromatic), 7.45 (d, 1H, J = 8.5 Hz, aromatic).
+ ) m/z 250.901 ((M+H) + , C 13 H 16 NO 2 S requires 250.0902). ［製造例００２］
1 H NMR (CDCl 3 , 400 MHz) δ 1.20 (t, 3H, J = 7.3 Hz, CH 3 ), 1.37 (t, 3H, J = 7.2 Hz, CH 3 ), 2.50 (q, 2H, J = 7.3 Hz, CH 2 ), 3.86 (s, 3H, OCH 3 ), 4.02 (q, 2H, J = 7.2 Hz, CH 2 ), 5.87 (s, 1H, olefin), 6.64 (d, 1H, J = 2.3 Hz, aromatic), 6.74 (dd, 1H, J = 2.3, 8.5 Hz, aromatic), 7.44 (d, 1H, J = 8.5 Hz, aromatic).
+ ) m/z 264.1051 ((M+H) + , C 14 H 18 NO 2 S requires 264.1058). ［製造例００３］
1 H NMR (CDCl 3 , 400 MHz) δ 1.38 (t, 3H, J = 7.3 Hz, CH 3 ), 2.53 (s, 3H, CH 3 ), 4.01 (q, 2H, J = 7.3 Hz, CH 2 ), 5.90 (s, 1H, olefinic), 6.81 (dd, 1H, J = 2.4, 3 J HF = 9.2 Hz, aromatic), 6.89 (ddd, 1H, J = 2.4, 8.4, 3 J HF = 9.2 Hz, aromatic), 7.48 (dd, 1H, J = 8.4, 4 J HF = 5.4 Hz, aromatic).
+ ) m/z 238.0697 ((M+H) + , C 12 H 13 FNOS requires 238.0702). ［製造例００４］
２ ＳＯ ４上で乾燥し、ろ過し、減圧濃縮した。 その残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（２０ｇ、ｎ−ヘキサン／エチルアセテート、２：１）を用いて精製し、褐色油状物の５−エトキシ−２−メチルベンゾチアゾールを得た（２１６ｍｇ、１．１１ｍｍｏｌ、収率９２．３％）。 ５−メトキシ−２−メチルベンゾチアゾールにかえて５−エトキシ−２−メチルベンゾチアゾールを使用したほかは、［製造例００１］と同様に製造し、淡黄色固体の１−（５−エトキシ−３−エチル−２，３−ジヒドロベンゾチアゾール−２−イリデン）プロパン−２−オン（製造例００４の化合物）を得た。 1 H NMR (CDCl 3 , 400 MHz) δ 1.37 (t, 3H, J = 7.4 Hz, CH 3 ), 1.44 (t, 3H, J = 7.0 Hz, CH 3 ), 2.23 (s, 3H, CH 3 ), 4.01 (q, 2H, J = 7.4 Hz, CH 2 ), 4.08 (q, 2H, J = 7.0 Hz, CH 2 ), 5.86 (s, 1H, olefinic), 6.65 (d, 1H, J = 2.3 Hz, aromatic), 6.74 (dd, 1H, J = 2.3, 8.5 Hz, aromatic), 7.43 (d, 1H, J = 8.5 Hz, aromatic)
+ ) m/z 264.1051 ((M+H) + , C 14 H 18 NO 3 S requires 264.1058). ［製造例００５］
1 H NMR (CDCl 3 , 400 MHz) δ 0.91 (t, 3H, J = 7.2 Hz, CH 3 ), 1.21 (t, 3H, J = 7.5 Hz, CH 3 ), 1.29-1.48 (m, 6H, CH 2 x 3), 1.78 (m, 2H, J = 7.6 Hz, CH 2 ), 2.50 (q, 2H,J = 7.5 Hz, CH 2 ), 3.86 (s, 3H, OCH 3 ), 3.94 (t, 2H, J = 7.6 Hz, CH 2 ), 5.86 (s, 1H, olefinic), 6.64 (d, 1H, J = 2.3 Hz, aromatic), 6.75 (dd, 1H, J = 2.3, 8.6 Hz,aromatic), 8.55 (d, 1H, J = 8.6 Hz, aromatic).
+ ) m/z 320.1683 ((M+H) + , C 18 H 25 NO 3 S requires 320.1684). ［製造例００６］
1 H NMR (CDCl 3 , 400 MHz) δ 1.46 (t, 3H, J = 7.3 Hz, CH 3 ), 3.91 (s, 3H, OCH 3 ), 4.20 (q, 2H, J = 7.3 Hz, CH 2 ), 6.17 (s, 1H, olefinic), 6.82 (d, 1H, J = 2.1 Hz, aromatic), 6.93 (dd, 1H, J = 2.1, 8.5 Hz, aromatic), 7.60 (d, 1H, J = 8.5 Hz, aromatic).
+ ) m/z 304.0618 ((M+H) + , C 13 H 13 F 3 NO 2 S requires 304.0619). ［製造例００７］
1 H NMR (CDCl 3 , 400 MHz) δ 2.24 (s, 3H, CH 3 ), 3.52 (s, 3H, CH 3 ), 3.87 (s, 3H, OCH 3 ), 5.86 (s, 1H, olefinic), 6.66 (d, 1H, J = 2.1 Hz, aromatic), 6.75 (dd, 1H, J= 2.1, 8.5 Hz, aromatic), 7.44 (d, 1H, J = 8.5 Hz, aromatic).
+ ) m/z 236.0746 ((M+H) + , C 12 H 14 NO 2 S requires 236.0745). ［製造例００８］
1 H NMR (CDCl 3 , 400 MHz) δ 2.23 (s, 3H, CH 3 ), 3.52 (s, 3H, CH 3 ), 5.89 (s, 1H, olefinic), 6.84 (dd, 1H, J = 2.3, 3 J HF = 9.6 Hz, aromatic), 6.89 (ddd, 1H, J = 2.3, 8.6, 3 J HF = 8.9 Hz, aromatic), 7.48 (dd, 1H, J = 8.6, 4 J HF = 5.2 Hz, aromatic).
+ ) m/z 224.0547 ((M+H) + , C 11 H 11 FNOS requires 224.0545). ［製造例００９］
２ Ｃｌ ２中に１−（３−エチル−５−メトキシ−２，３−ジヒドロベンゾチアゾール−２−イリデン）プロパン−２−オン（製造例００１の化合物）（５．４８ｇ、２２．０ｍｍｏｌ）を含むサスペンションに、三臭化ホウ素 １．０Ｍ ＣＨ ２ Ｃｌ ２溶液（４４．０ｍｌ、４４．０ｍｍｏｌ）を０℃にて添加して、室温にて２３時間撹拌した。 その後、混合物へ飽和炭酸水素ナトリウム溶液（１００ｍｌ）を添加し、減圧濃縮によりＣＨ ２ Ｃｌ ２を除去した。 漏斗を用いて沈殿物を濾しとり、エチルアセテートで洗浄後、減圧乾燥した後、エタノール（５５０ｍｌ）を用いて再結晶により精製し、乳白色固体の１−（３−エチル−５−ヒドロキシ−２，３−ジヒドロベンゾチアゾール−２−イリデン）プロパン−２−オン（製造例００９の化合物）を得た（３．２１ｇ、１３．６ｍｍｏｌ、収率６２．１％）。 1 H NMR (CDCl 3 , 400 MHz) δ 1.37 (t, 3H, J = 6.9 Hz, CH 3 ), 2.07 (s, 3H, CH 3 ), 4.06 (q, 2H, J = 6.9 Hz, CH 2 ), 6.05 (s, 1H, olefinic), 6.63 (d, 1H, J = 8.4 Hz, aromatic), 6.77 (br s, 1H, aromatic), 7.46 (d, 1H, J = 8.4 Hz, aromatic), 9.72 (s, 1H, OH).
+ ) m/z 236.0744 ((M+H) + , C 12 H 14 NO 2 S requires 236.0745). ［製造例０１０］
1 H NMR (CDCl 3 , 400 MHz) δ 1.39 (t, 3H, J = 7.3 Hz, CH 3 ), 2.26 (s, 3H, CH 3 ), 4.02 (q, 2H, J = 7.3 Hz, CH 2 ), 5.90 (s, 1H, olefinic), 7.22 (d, 1H, J = 1.7 Hz, aromatic), 7.27 (dd, 1H, J = 1.7, 8.2 Hz, aromatic), 7.43 (d, 1H, J = 8.2 Hz, aromatic).
+ ) m/z 297.9899 ((M+H) + , C 12 H 13 NOSBr requires 297.9901). ［製造例０１１］
1 H NMR (CDCl 3 , 400 MHz) δ 1.39 (t, 3H, J = 7.3 Hz, CH 3 ), 2.26 (s, 3H, CH 3 ), 4.03 (q, 2H, J = 7.3 Hz, CH 2 ), 5.90 (s, 1H, olefinic), 7.08 (d, 1H, J = 1.8 Hz, aromatic), 7.13 (dd, 1H, J = 1.8, 8.2 Hz, aromatic), 7.48 (d, 1H, J = 8.2 Hz, aromatic).
+ ) m/z 254.0411 ((M+H) + , C 12 H 13 NOSCl requires 254.0406). ［製造例０１２］
1 H NMR (CDCl 3 , 400 MHz) δ 1.37 (t, 3H, J = 7.3 Hz, CH 3 ), 2.23 (s, 3H, CH 3 ), 2.25 (s, 3H, CH 3 ), 4.06 (q, 2H, J = 7.3 Hz, CH 2 ), 5.89 (s, 1H, olefinic), 6.90 (d, 1H, J = 8.3 Hz, aromatic), 7.45 (d, 1H, J = 8.3 Hz, aromatic), 7.66 (s, 1H, NH), 7.96 (s, 1H, aromatic).
+ ) m/z 277.1013 ((M+H) + , C 14 H 17 N 2 O 2 S requires 277.1011). ［製造例０１３］
1 H NMR (CDCl 3 , 400 MHz) δ 1.05 (t, 3H, J = 7.5 Hz, CH 3 ), 1.83 (m, 2H, J = 7.5 Hz, CH 2 ), 2.24 (s, 3H, CH 3 ), 3.86 (s, 3H, OCH 3 ), 3.91 (q, 2H, J = 7.5 Hz, CH 2 ), 5.86 (s, 1H, olefinic), 6.65 (d, 1H, J = 2.3 Hz, aromatic), 6.75 (dd, 1H, J = 2.3, 8.5 Hz, aromatic), 7.45 (d, 1H, J = 8.5 Hz, aromatic).
+ ) m/z 264.1065 ((M+H) + , C 14 H 18 NO 2 S requires 264.1058). ［製造例０１４］
1 H NMR (CDCl 3 , 400 MHz) δ 2.22 (s, 3H, CH 3 ), 3.85 (s, 3H, OCH 3 ), 4.57 (ddd, 2H,J = 1.8, 2.1, 4.6 Hz, CH 2 ), 5.13 (dd, 1H, J = 2.1, 17.2 Hz, olefinic), 5.29 (dd, 1H, J = 1.8, 10.4 Hz, olefinic), 5.89 (ddt, 1H, J = 4.6, 10.4, 17.2 Hz, olefinic), 6.60 (d, 1H, J = 2.1 Hz, aromatic), 6.76 (dd, 1H, J = 2.1, 8.6 Hz, aromatic), 7.45 (d, 1H, J = 8.6 Hz, aromatic).
+ ) m/z 262.0902 ((M+H) + , C 14 H 16 NO 2 S requires 262.0902). ［製造例０１５］
1 H NMR (CDCl 3 , 400 MHz) δ 1.39 (t, 3H, J = 7.2 Hz, CH 3 ), 2.27 (s, 3H, CH 3 ), 3.87 (s, 3H), 4.08 (q, 2H, J = 7.2 Hz, CH 2 ), 6.19 (s, 1H, olefinic), 6.70 (d, 1H, J= 2.3 Hz, aromatic), 6.76 (dd, 1H, J = 2.3, 8.4 Hz, aromatic), 7.54 (d, 1H, J =8.4 Hz, aromatic).
+ ) m/z 298.0347 ((M+H) + , C 13 H 16 NO 2 Se requires 298.0346). ［製造例０１６］
1 H NMR (DMSO-d 6 , 400 MHz) δ 1.87 (s, 3H, CH 3 ), 2.09 (s, 3H, CH 3 ), 3.81 (s, 3H, OCH 3 ), 4.35 (d, 2H, J = 4.3 Hz, CH 2 ), 4.39 (d, 2H, J = 4.3 Hz, CH 2 ), 6.14 (s, 1H, olefinic), 6.78 (dd, 1H, J = 2.0, 8.6 Hz, aromatic), 7.04 (d, 1H, J = 2.0 Hz, aromatic), 7.58 (d, 1H, J = 8.6 Hz, aromatic).
+ ) m/z 308.0964 ((M+H) + , C 15 H 18 NO 4 S requires 308.0957). ［製造例０１７］
1 H NMR (DMSO-d 6 , 400 MHz) δ 2.06 (s, 3H, CH 3 ), 3.70 (q, 2H, J = 5.7 Hz, CH 2 ), 4.07 (t, 2H, J = 5.7 Hz, CH 2 ), 4.97 (t, 1H, J = 5.7 Hz, OH), 6.05 (s, 1H, olefinic), 6.62 (dd, 1H, J = 2.0, 8.4 Hz, aromatic), 6.81 (d, 1H, J = 2.0 Hz, aromatic), 7.44 (d, 1H, J = 8.4 Hz, aromatic), 9.67 (s, 1H, OH).
+ ) m/z 252.0693 ((M+H) + , C 12 H 14 NO 3 S requires 252.0694). ［製造例０１８］
1 H NMR (CDCl 3 , 400 MHz) δ 1.29 (t, 3H, J = 7.2 Hz), 2.23 (s, 3H, CH 3 ), 3.84 (s,3H, OCH 3 ), 4.27 (q, 2H, J = 7.2 Hz, CH 2 ), 4.64 (s, 2H, CH 2 ), 5.78 (s, 1H, olefinic), 6.55 (d, 1H, J = 2.2 Hz, aromatic), 6.77 (dd, 1H, J = 2.2, 8.5 Hz, aromatic), 7.45 (d, 1H, J = 8.5 Hz, aromatic).
+ ) m/z 308.0960 ((M+H) + , C 15 H 18 NO 4 S requires 308.0957). ［製造例０１９−Ａ］
２ ＳＯ ４上で乾燥し、ろ過し、減圧濃縮した。 その残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（３０ｇ、ＣＨ ２ Ｃｌ ２ ／エチルアセテート、４：１）を用いて精製し、無色固体の１−（５−アセトキシ−３−エチル−２，３−ジヒドロベンゾチアゾール−２−イリデン）プロパン−２−オン（製造例０１９の化合物）を得た（２７４ｍｇ、９８８μｍｏｌ、収率９８．９％）。 1 H NMR (CDCl 3 , 400 MHz) δ 1.37 (t, 3H, J = 7.4 Hz, CH 3 ), 2.24 (s, 3H, CH 3 ), 2.33 (s, 3H, CH 3 ), 4.01 (q, 2H, J = 7.4 Hz, CH 2 ), 5.88 (s, 1H, olefinic), 6.87-6.90 (m, 2H, aromatic), 7.53 (d, 1H, J = 8.4 Hz, aromatic)
+ ) m/z 278.0846 ((M+H) + , C 14 H 16 NO 3 S requires 278.0851). ［製造例０１９−Ｂ］ ［製造例０２０］
２ ＳＯ ４上で乾燥し、ろ過し、減圧濃縮した。 その残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０ｇ、ＣＨ ２ Ｃｌ ２ ／エチルアセテート、４：１）を用いて精製し、淡黄色固体の２−［５−アセトキシ−２−（２−オキソプロピリデン）−２，３−ジヒドロベンゾチアゾール−３−イル］エチルアセテート（製造例０２０の化合物）を得た（１０４ｍｇ、３１０μｍｏｌ、収率９１．４％）。 1 H NMR (CDCl 3 , 400 MHz) δ 2.02 (s, 3H, CH 3 ), 2.26 (s, 3H, CH 3 ), 2.34 (s, 3H, CH 3 ), 4.24 (t, 2H, J = 6.0 Hz, CH 2 ), 4.42 (t, 2H, J = 6.0 Hz, CH 3 ), 5.93 (s, 1H, olefinic), 6.90 (dd, 1H, J = 2.0, 8.2 Hz, aromatic), 6.95 (d, 1H, J = 2.0 Hz, aromatic), 7.53 (d, 1H,), 7.96 (s, 1H, J = 8.2 Hz, aromatic).
+ ) m/z 336.0905 ((M+H) + , C 16 H 18 NO 5 S requires 336.0906). ［製造例０２１］
２ Ｃｌ ２で３回抽出した。 １つにまとめた有機抽出液を水にて１回洗浄し、Ｎａ ２ ＳＯ ４上で乾燥し、ろ過し、減圧濃縮した。 その残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（３０ｇ、ＣＨ ２ Ｃｌ ２ ／エチルアセテート、４：１）を用いて精製し、無色固体の３−エチル−２−（２−オキソプロピリデン）−２，３−ジヒドロベンゾチアゾール−５−イルベンゾエート（製造例０２１の化合物）を得た（２１４ｍｇ、６３１μｍｏｌ、収率９９．１％）。 1 H NMR (DMSO-d 6 , 400 MHz) δ 1.21 (t, 3H, J = 7.0 Hz, CH 3 ), 2.11 (s, 3H, CH 3 ), 4.14 (q, 2H, J = 7.0 Hz, CH 2 ), 6.15 (s, 1H, olefinic), 7.11 (dd, 1H, J = 2.0, 8.4Hz, aromatic), 7.50 (d, 1H, J = 2.0 Hz, aromatic), 7.60-7.64 (m, 1H, aromatic),7.74-7.75 (m, 1H, aromatic), 7.79 (d, 1H, J = 8.4 Hz, aromatic), 8.14-8.17 (m, 1H, aromatic).
+ ) m/z 340.1008 ((M+H) + , C 19 H 18 NO 3 S requires 339.0929). ［製造例０２２］
1 H NMR (DMSO-d 6 , 400 MHz) δ 1.20 (t, 3H, J = 7.0 Hz, CH 3 ), 1.32 (s, 9H, CH 3 x 3), 2.11 (s, 3H, CH 3 ), 4.13 (q, 2H, J = 7.0 Hz, CH 2 ), 6.12 (s, 1H, olefinic), 6.89 (dd, 1H, J = 1.8, 8.4 Hz, aromatic), 7,26 (d, 1H, J = 1.8Hz, aromatic), 7.72 (d, 1H, J = 8.4 Hz, aromatic).
+ ) m/z 320.1321 ((M+H) + , C 17 H 22 NO 3 S requires 320.1320). ［製造例０２３］
1 H NMR (DMSO-d 6 , 400 MHz) δ 1.22 (t, 3H, J = 7.0 Hz, CH 3 ), 2.12 (s, 3H, CH 3 ), 4.13 (q, 2H, J = 7.0 Hz, CH 2 ), 6.15 (s, 1H, olefinic), 7.15 (dd, 1H, J = 2.0, 8.2Hz, aromatic), 7.54 (d, 1H, J = 2.0 Hz, aromatic), 7.81 (d, 1H, J = 8.2 Hz, aromatic), 8.03 (dd, 2H, J = 1.7, 4.4 Hz, aromatic), 8.90 (dd, 2H, J = 1.7, 4.4 Hz,aromatic).
+ ) m/z 341.0961 ((M+H) + , C 18 H 17 N 2 O 3 S requires 341.0960). ［製造例０２４］
1 H NMR (DMSO-d 6 , 400 MHz) δ 1.22 (t, 3H, J = 7.2 Hz, CH 3 ), 2.12 (s, 3H, CH 3 ), 4.13 (q, 2H, J = 7.2 Hz, CH 2 ), 6.15 (s, 1H, olefinic), 7.15 (dd, 1H, J = 2.0, 8.4Hz, aromatic), 7.53 (d, 1H, J = 2.0 Hz, aromatic), 7.67 (ddd, 1H, J = 0.8, 4.9,8.1 Hz, aromatic), 7.81 (d, 1H, J = 8.4 Hz, aromatic), 8.49 (ddd, 1H, J = 1.8, 2.1, 8.1 Hz, aromatic), 8.91 (dd, 1H, J = 1.8, 4.9 Hz, aromatic), 9.28 (dd, 1H, J = 0.8, 2.1 Hz, aromatic).
+ ) m/z 341.0961 ((M+H) + , C 18 H 17 N 2 O 3 S requires 341.0960). ［製造例０２５］
２ Ｃｌ ２に溶解させた後、トリエチルアミン（７．４０ｍＬ、５３．１ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノピリジン（１４４ｍｇ、１．１８ｍｍｏｌ）および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（４．９８ｇ、２６．０ｍｍｏｌ）を常温で連続的に添加して、４９時間室温にて攪拌した。 その後、混合溶液を水（３００ｍＬ）へ注ぎ込み、混合物を１５０ｍＬのＣＨ ２ Ｃｌ ２で３回抽出した。 １つにまとめた有機抽出液を水（１００ｍＬ）、ブライン（１００ｍＬ）で順次洗浄し、Ｎａ ２ ＳＯ ４上で乾燥し、ろ過し、減圧濃縮した。 その残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（１２０ｇ、ｎ−ヘキサン／エチルアセテート／ＣＨ ２ Ｃｌ ２ 、２：１：１）を用いて精製し、無色固体の２−メチルベンゾチアゾール−５−イル ２，４，６−トリメトキシベンゾエートを得た（２．１８ｇ、６．０７ｍｍｏｌ、収率５１．４％）。
1 H NMR (CDCl 3 , 300 MHz) δ 1.39 (t, 3H, J = 7.2 Hz, CH 3 ), 2.25 (s, 3H, CH 3 ), 3.86 (s, 3H, OCH 3 ), 3.88 (s, 6H, OCH 3 x 2), 4.05 (q, 2H, J = 7.2 Hz, CH 2 ), 5.90 (s, 1H, oleffin), 6.16 (s, 2H, aromaric x 2), 7.01-7.08 (m, 2H, aromatic x 2), 7.56 (d, 1H, J = 9.0 Hz, aromatic). ［製造したベンゾチアゾール誘導体のリン酸化酵素の活性阻害］ 大腸菌で発現させて精製した０．２７μｇの組み換えＤＹＲＫ１Ａ蛋白質と８．２５μｇのＭＢＰ（Ｕｐｓｔａｔｅ社製）とを、反応バッファー（１０ｍＭ ＭｇＣｌ、１０μＭ ＡＴＰ、１μＣｉ［γ− ３２ Ｐ］ＡＴＰ、製造例００１〜０２４の化合物終濃度１０μＭ）中で３０℃、１０分間インキュベートした。 製造例００１〜０２４の化合物は、ＤＭＳＯに溶解し、必要に応じてＤＭＳＯにて段階希釈を行った。 このリン酸化酵素の活性測定におけるＤＹＲＫ１ＡとＭＢＰの量、及び反応時間の条件は、予め反応の直線性を検討し、直線性が成立する条件を選択した。 ＤＹＲＫ１ＡとＭＢＰの反応を１０分行った後、反応液をＰ８１フォスフォセルロースメンブレン（Ｐ８１；Ｗｈａｔｍａｎ）に滴下し、乾燥後、５％リン酸溶液で洗浄した。 洗浄後、Ｐ８１メンブレンの３２ Ｐ放射活性を液体シンチレーションカウンター（ＡＬＯＫＡ ＬＩＱＵＩＤ ＳＣＩＮＴＩＬＬＡＴＩＯＮ ＣＯＵＮＴＥＲ ＬＳＣ−５１００）により測定した。 製造例００１〜０２４の化合物非添加のコントロールとして、化合物の溶解・希釈に用いたＤＭＳＯを反応バッファーに加えることにより、全てのサンプルでＤＭＳＯの最終濃度を統一化した。 製造例の化合物、及び、コントロールにつき３個のサンプルで測定を行い、測定結果をコントロールの数値に対する割合（％）及び標準偏差として表した。 また、同様の手法により、ＤＹＲＫ１Ｂ及びＤＹＲＫ２についても化合物１０μＭにおけるリン酸化活性の阻害効果を測定した。 これらの結果を下記表１に示す。 上記表１に示すとおり、製造例００１〜０１８のベンゾチアゾール誘導体は、ＤＹＲＫ１Ａ、ＤＹＲＫ１Ｂ、及び、ＤＹＲＫ２の少なくとも１つのリン酸化活性を少なくとも５０％以上阻害できた。 また、製造例００１〜０１８のベンゾチアゾール誘導体は、チロシンキナーゼであるＭｅｔやセリン・トレオニンキナーゼであるＡＳＫ１などのリン酸化活性に対して、ＤＹＲＫ１Ａ、ＤＹＲＫ１Ｂ、及び、ＤＹＲＫ２と比べて大きな阻害能を示さなかった（データ示さず）。 したがって、製造例００１〜０１８のベンゾチアゾール誘導体は、ＤＹＲＫ１Ａ、ＤＹＲＫ１Ｂ、及び、ＤＹＲＫ２に対して選択的にリン酸化活性を阻害する傾向が示された。 なお、上記表１における製造例０１９〜０２４の化合物の中には、リン酸化活性阻害能を発揮しないものもあったが、これらは製造例００９の化合物又は製造例０１７の化合物のプロドラッグ形態であるため、インビトロでのリン酸化活性阻害能を示さない場合がある。 なお、後述する実施例で、プロドラッグ形態の製造例０１９〜０２４のベンゾチアゾール誘導体が生体内又は細胞内でリン酸化活性を阻害できることが示されている。 ［培養細胞内におけるタウ蛋白質（Ｔａｕ）のリン酸化阻害］ ＣＯＳ−７細胞（ＣＲＬ−１６５１）をＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、ペニシリンストレプトマイシン添加）培地にて培養し、ｐＥＧＦＰ−ＤＹＲＫ１ＡとｐＥＧＦＰ−ＭＡＰＴをＧｅｎｅＪｕｉｃｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて強制発現させた。 ３時間後にベンゾチアゾール誘導体（製造例００１、００９、０１９〜０２５の化合物）をそれぞれ終濃度１０μＭにて添加し、２１時間、３７℃、５％ＣＯ ２培養条件下で培養した。 なお、製造例０２５の化合物は、ラット血清中でインキュベーション（３７℃６０分）を行って５位のエステル結合を加水分解（エステラーゼ反応）させ、その代謝産物をＨＰＬＣにより回収して濃縮後、濃度測定、フィルター滅菌を行ったものを添加した。 また、ベンゾチアゾール非添加群として前記ベンゾチアゾール誘導体の溶媒であるＤＭＳＯを培地に添加した。 その後、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）とホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｎａｃａｌａｉ）を加えたＲＩＰＡバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＧＴＡ、１％ ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０、０．５％ ＤＯＣ、０．１％ ＳＤＳ）で細胞を溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーで希釈して蛋白質サンプルとした。 このサンプルを２０μｇ／レーンにてＳＤＳアクリルアミドゲルに電気泳動し、ＰＶＤＦメンブレンにトランスファー後、抗ＧＦＰ抗体（ＭＢＬ）、抗Ｔａｕ［ｐＴ２１２］抗体（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ）にて抗体反応を行い、Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ（Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）によるケミルミ発光にてリン酸化Ｔａｕのバンド、並びに、総Ｔａｕを示すＧＦＰのバンドを検出した。 それら検出されたバンドをデンシトメトリー（ＡＴＴＯ ＣＳ Ａｎａｌｙｚｅｒ ｖｅｒ ３．０）により数値化し、化合物非添加群のリン酸化Ｔａｕのバンドの発光を１００％とし、各群におけるバンドの発光を数値化した。 なお、それぞれのリン酸化Ｔａｕのバンドは、総Ｔａｕにより補正を行った。 その結果を下記表２及び図１に示す。 上記表２及び図１に示すとおり、ベンゾチアゾール誘導体非添加群（コントロール）において観察されたタウ蛋白質のリン酸化は、ベンゾチアゾール誘導体の添加により抑制されることが示された。 製造例０１９〜０２４は、上述のインビトロのリン酸化活性阻害能の測定（上記表１）では阻害活性が低かったが、細胞内においては良好なＤＹＲＫ１Ａの活性阻害を示した（上記表２及び図１）。 製造例０２５の化合物は、血清中でのインキュベーションを行わない場合にはタウ蛋白質のリン酸化阻害活性は低かった（data not shown）。 しかし、製造例０２５の化合物は、血清中でのインキュベーションを行うことで細胞内において良好なＤＹＲＫ１Ａの活性阻害を示した（上記表２及び図１）。 なお、図２は、ベンゾチアゾール誘導体（製造例００１、０１９、００９）の添加量とタウ蛋白質のリン酸化阻害との関係を示す図である。 同図に示すように、培養細胞内におけるタウ蛋白質のリン酸化阻害は、ベンゾチアゾール誘導体の添加量に依存した。 ［ＤＹＲＫ１Ａ過剰発現モデルにおける神経発生異常の抑制］ ［ＤＹＲＫ１Ａ過剰発現によるアフリカツメガエルの発生異常モデル］ ［ベンゾチアゾール誘導体によるアフリカツメガエルの発生異常に対する抑制効果］ 図３は、上記ＤＹＲＫ１Ａ過剰発現モデルの発生異常に対する抑制効果実験の結果を示す観察写真である。 ａ）、ｄ）及びｇ）はＤＹＲＫ１ＡのｍＲＮＡ非投与群であり、ｂ）、ｅ）及びｈ）は２５０ｐｇのＤＹＲＫ１Ａ ｍＲＮＡ投与群であり、ｃ）、ｆ）及びｉ）は５００ｐｇのＤＹＲＫ１Ａ ｍＲＮＡ投与群である。 また、ａ）、ｂ）及びｃ）はベンゾチアゾール誘導体非投与群であり、ｄ）、ｅ）及びｆ）は製造例００１のベンゾチアゾール誘導体投与群であり、ｇ）、ｈ）及びｉ）は製造例０１９のベンゾチアゾール誘導体投与群である。 図４は、上記ＤＹＲＫ１Ａ過剰発現モデルにおける抑制効果を調べた個体の発生異常（眼形成異常）について、正常、軽度及び重度の３つに分類し、各実験群におけるそれぞれの割合を百分率で示したグラフである。 また、図５は、上記ＤＹＲＫ１Ａ過剰発現モデルにおける抑制効果を調べた個体の発生異常（頭部縮小）について、各実験群における割合を百分率で示したグラフである。 図４ａはｍＲＮＡ非投与・ベンゾチアゾール非投与群のグラフであり、図４ｂは２５０ｐｇ ｍＲＮＡ投与群のグラフであり、図４ｃは５００ｐｇ ｍＲＮＡ投与群のグラフであり、図５ａはｍＲＮＡ非投与・ベンゾチアゾール非投与群及び２５０ｐｇ ｍＲＮＡ投与群のグラフであり、図５ｂはｍＲＮＡ非投与・ベンゾチアゾール非投与群及び５００ｐｇ ｍＲＮＡ投与群のグラフである。 なお、図４及び５の各群におけるサンプル数は以下のとおりである。 ｍＲＮＡ非投与・ベンゾチアゾール非投与群（ｎ＝２９）、２５０ｐｇ ｍＲＮＡ投与・ベンゾチアゾール非投与群（ｎ＝３６）、２５０ｐｇ ｍＲＮＡ投与・製造例００１投与群（ｎ＝２９）、２５０ｐｇ ｍＲＮＡ投与・製造例０１９投与群（ｎ＝２３）、５００ｐｇ ｍＲＮＡ投与・ベンゾチアゾール非投与群（ｎ＝５５）、５００ｐｇ ｍＲＮＡ投与・製造例００１投与群（ｎ＝３７）、５００ｐｇ ｍＲＮＡ投与・製造例０１９投与群（ｎ＝３５）。 図３〜５に示すとおり、対照群（ｍＲＮＡ非投与・溶媒のみ、図３ａ、図４ａ、図５ａ及びｂ）では正常な形態形成が認められたのに対し、ベンゾチアゾール誘導体を投与しないＤＹＲＫ１Ａ過剰発現胚では、眼形成異常及び頭部縮小を特徴とする発生異常が認められた（図３ｂ及びｃ、図４ｂ及びｃ、図５）。 しかし、ベンゾチアゾール誘導体（製造例００１及び０１９）を投与すると、ＤＹＲＫ１Ａ過剰発現による発生異常は顕著に抑制された（図３ｅ、ｆ、ｈ、ｉ、図４ｂ及びｃ、図５）。 すなわち、ベンゾチアゾール誘導体の投与によって、ＤＹＲＫ１Ａ過剰発現に起因する異常を個体レベルで抑制できることが示された。 なお、製造例０１９は、上述のインビトロのリン酸化活性阻害能の測定（上記表１）では阻害活性が低かったが、生体内においては良好なＤＹＲＫ１の活性阻害を示した。 ＤＹＲＫ１Ａ過剰発現及びベンゾチアゾール誘導体投与時での発生段階における分子レベルの変化を確認するため、ＤＹＲＫ１Ａ ｍＲＮＡを５００ｐｇ投与した時の各種頭部神経マーカーの発現変化とベンゾチアゾール誘導体投与時の効果を検討した。 その結果を図６に示す。 図６は、アフリカツメガエル初期胚でのＤＹＲＫ１Ａ過剰発現モデル（ｍＲＮＡ（＋）レーン）における神経発生マーカーの発現異常とベンゾチアゾール誘導体投与によるその発現異常回復効果を示す図である。 ｍＲＮＡ（−）レーンは、正常個体における神経発生マーカーの発現レベルを示す。 まず、アフリカツメガエルの８細胞期胚動物極背側２割球に０又は５００ｐｇのアフリカツメガエルＤＹＲＫ１Ａ合成ｍＲＮＡを注入し、同時に製造例００１（１０μＭ）、製造例０１９（２．５μＭ）、又はコントロールとして溶媒（ＤＭＳＯ）のみを飼育水に添加し、ベンゾチアゾール誘導体による回復効果を検討した。 ＤＹＲＫ１Ａ合成ｍＲＮＡ注入後、胚を暗下にて２３℃で１日間培養し、ｓｔａｇｅ１７の時点で頭部を収穫し、ＲＮＡを回収してＲＴ−ＰＣＲによる発現解析を行った。 神経全般、後脳、中脳、及び前脳の頭部神経マーカーであるＮＣＡＭ、Ｋｒｏｘ２０、Ｅｎ２、Ｏｔｘ２、並びに、眼形成マーカーであるＬｈｘ２及びＲｘ１について、ｍＲＮＡの発現量の解析を行った。 なお、内部標準として、ｘＯｄｃを利用した。 同図において、−、＋で示したレーンはそれぞれＤＹＲＫ１Ａ ｍＲＮＡを添加しない個体のコントロール、及びＤＹＲＫ１Ａ ｍＲＮＡを注入した個体のサンプルの結果を示す。 図６に示すとおり、ＤＹＲＫ１Ａの過剰発現により、神経全般（ＮＣＡＭ）、後脳（Ｋｒｏｘ２０）、中脳（Ｅｎ２）、及び前脳（Ｏｔｘ２）マーカー、並びに、眼形成マーカー（Ｌｈｘ２及びＲｘ１）の発現低下が認められた（図６、ＤＭＳＯのｍＲＮＡ（＋）レーン）。 そして、これらの神経マーカーの発現低下は、製造例００１及び０１９のベンゾチアゾール誘導体を投与することによって改善された（図６、製造例００１及び０１９のｍＲＮＡ（＋）レーン）。 したがって、ベンゾチアゾール誘導体投与によりＤＹＲＫ１Ａ過剰発現に起因する発生異常を個体レベルで抑制できることが、分子レベルで示された。 ［ＤＹＲＫ１Ｂ発現悪性腫瘍に対する増殖抑制効果／抗がん剤作用増強効果］ まず、横紋筋肉腫細胞株ＲＭＳ−ＹＭ（理研バイオリソースセンター ＲＣＢ１６９５）をＲＰＭＩ１６４０（１０％ＦＢＳ、１００μＭ ｎｏｎｅ ｅｓｓｅｎｓｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ペニシリンストレプトマイシン添加）培地にて培養し、ベンゾチアゾール誘導体（製造例０１９、００９）及び上記式（Ｉ）に属さない下記化学式で表される化合物（以下、「陰性対照化合物」ともいう）を終濃度２０、５０、１００μＭで添加し、横紋筋肉腫細胞株ＲＭＳ−ＹＭに対するベンゾチアゾール誘導体の細胞増殖抑制効果を検討した。 また、ベンゾチアゾール誘導体非添加群をコントロールとして、ベンゾチアゾール誘導体の溶媒であるＤＭＳＯを同じ最終濃度となるよう添加した。 ベンゾチアゾール誘導体及び／又はＤＭＳＯ添加後、細胞を２日間培養した。 培養後、ＷＳＴ−８（２−（ｍｅｔｈｏｘｙ−４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−（２．４−ｄｉｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ， ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ）（Ｎａｃａｌａｉ）法により細胞生存率を測定し、ベンゾチアゾール誘導体非添加群を１００％としたときの細胞生存率を算出した。 その結果を図７ａに示す。 図７ａは、横紋筋肉腫細胞株ＲＭＳ−ＹＭに対するベンゾチアゾール誘導体の細胞増殖抑制効果を調べた結果のグラフである。 図７ａに示すとおり、ベンゾチアゾール誘導体のみを使用した場合において濃度依存的な悪性腫瘍の細胞増殖抑制効果が確認できた。 つぎに、横紋筋肉腫細胞株ＲＭＳ−ＹＭを培養し、抗がん剤非添加・ベンゾチアゾール添加群、抗がん剤非添加・ベンゾチアゾール非添加群、抗がん剤添加・ベンゾチアゾール非添加群、抗がん剤添加・ベンゾチアゾール添加群にて横紋筋肉腫細胞株ＲＭＳ−ＹＭに対するベンゾチアゾール誘導体の細胞増殖抑制効果を検討した。 抗がん剤非添加・ベンゾチアゾール添加群には、終濃度２０μＭのベンゾチアゾール誘導体（製造例０１９、００９）又は陰性対照化合物を添加した。 抗がん剤非添加・ベンゾチアゾール非添加群には、ベンゾチアゾールの溶媒であるＤＭＳＯを添加した。 抗がん剤を添加した群（抗がん剤添加・ベンゾチアゾール非添加群及び抗がん剤添加・ベンゾチアゾール添加群）には、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）を終濃度０．５、３ｎＭ、又はアクチノマイシンＤ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ）を終濃度５ｎＭで添加した。 抗がん剤添加・ベンゾチアゾール添加群には、抗がん剤に加えて、終濃度２０μＭのベンゾチアゾール誘導体（製造例０１９、００９）又は陰性対照化合物を添加した。 抗がん剤及び／又はベンゾチアゾール誘導体及び／又は陰性対照化合物及び／又はＤＭＳＯ添加後、細胞を２日間培養した。 培養後、ＷＳＴ−８法により細胞生存率を測定し、抗がん剤非添加・ベンゾチアゾール非添加群を１００％としたときの各群における細胞生存率を算出した。 その結果を図７ｂ及びｃに示す。 図７ｂ及びｃは、横紋筋肉腫細胞株ＲＭＳ−ＹＭに対するベンゾチアゾール誘導体と抗がん剤（ビンクリスチン：図７ｂ、アクチノマイシンＤ：図７ｃ）との併用の効果を調べた結果のグラフである。 図７ｂに示すとおり、ビンクリスチン３ｎＭと各種ベンゾチアゾール誘導体の併用効果を検討すると、ビンクリスチン単独使用時（６５．６％）に比べて細胞生存率が低下し、製造例０１９及び００９ではそれぞれ３５．１％、２６．７％まで低下した。 また、図７ｃに示すとおり、同様の効果がアクチノマイシンＤと各種ベンゾチアゾール誘導体の併用時においても認められた。 アクチノマイシンＤ ５ｎＭで併用効果を検討すると、単独使用時（６６．４％）に比べて細胞生存率が低下し、製造例０１９及び００９ではそれぞれ３３．３％、３３．２％まで低下した。 したがって、ベンゾチアゾール誘導体による抗がん剤作用の増強効果が確認できた。 上記増殖抑制効果及び抗がん剤作用増強効果が、上記以外のＤＹＲＫ１Ｂが高発現する癌細胞に対しても発現するかどうかを確認するため、その他のＤＹＲＫ１Ｂ高発現癌細胞株（Ｐａｎｃ−１）を用いて上述と同じように実験を行った。 ＤＹＲＫ１Ｂを発現するヒト膵管癌細胞株であるＰａｎｃ−１（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ−１４６９）をＲＰＭＩ１６４０（１０％ＦＢＳ、ペニシリンストレプトマイシン添加）培地にて培養し、抗がん剤非添加群・ベンゾチアゾール非添加群には、ベンゾチアゾールの溶媒であるＤＭＳＯを添加した。 抗がん剤非添加・ベンゾチアゾール添加群には、終濃度２０μＭのベンゾチアゾール誘導体（製造例００１、０１９、００９）及び陰性対照化合物を添加した。 抗がん剤を添加した群には、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）をＰａｎｃ−１細胞株に対して終濃度５ｎＭで添加した。 抗がん剤添加群・ベンゾチアゾール添加群には、抗がん剤に加えて、終濃度２０μＭのベンゾチアゾール誘導体（製造例００１、０１９、００９）又は陰性対照化合物を添加した。 抗がん剤及び／又はベンゾチアゾール誘導体及び／又は陰性対照化合物及び／又はＤＭＳＯ添加後、細胞を３日間培養した。 培養後、ＷＳＴ−８法により細胞生存率を測定し、抗がん剤非添加群・ベンゾチアゾール非添加群を１００％としたときの各群における細胞生存率を算出した。 その結果を図８に示す。 図８に示すとおり、Ｐａｎｃ−１細胞株のゲムシタビン５ｎＭ単独投与の場合、細胞生存率は５８．４％であった。 一方、ベンゾチアゾール誘導体をゲムシタビンと併用すると、製造例００１、０１９及び００９の場合、それぞれ、４１．４％、３６．３％及び３７．６％まで低下した。 これらの実験結果から、ベンゾチアゾール誘導体がＤＹＲＫ１Ｂを発現する悪性細胞に対して選択的に他の抗がん剤の作用を増強し、増殖抑制効果を持つことが示唆された。 |
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