鬼臼毒素(Podophyllotoxin)是一类主要从小檗科鬼臼属植物中分离得到的具有显著细胞毒性的天 然活性物质，又有很悠久的应用历史的药用植物，长期以来，鬼臼类木脂素一直作为药用成分广泛用于活 血散结，虫蛇咬伤，痛疖肿毒，跌打，风湿筋骨痛，催吐，疣瘤及支气管炎等症状.自二十世纪四十年代，King 和Shliivan首次报道鬼臼毒素具有类似秋水仙碱的作用(Stahelin H.F.，Eur.J.Cancer，1970，6，303)， 但因其毒副作用，曾在一段时间内限制了其在临床上的应用。之后，许多化学家和药物学家对其结构进行 了修饰，以期获得抗肿瘤活性好且毒副作用小的鬼臼脂素类药物。二十世纪六七十年代，山道士公司相继 发现4′-去甲表鬼臼脂素的β-D-葡萄糖衍生物VP-16(etopside)和VM-26(teniposide)等以下产物具 有强烈的抑制肿瘤细胞的活性，

1983年VP-16由美国FDA正式批准上市(New York：Academic Press Inc.，1984)。
VP-16主要合成路线可参见：1)北京制药工业研究所一室，北京医药工业，2：11，1984；2)日本公 开特许公报，61-134396；3)中国专利CN1057054A；WO 93/02094；4)中国专利CN 1337402A)。 Etopophos(Brit 1989：2207674)是VP-16的4′-磷酸酯二钠盐，已于1996年在美国上市。另还有NK-611 (日本公开特许88-10789；Drug Fut 1991，16(2)，113)、TOP-53(Drug Fut 1996，21，1136；Cancer Res1996，56，2809)、GL-331(Mol Pharmacol 1996，49，721)等几个药物已经进入临床II期或III 期实验，不久将要上市。试验表明，VP-16等鬼臼脂素类药物对小细胞肺癌，非何杰氏病，急性单核细胞 白血病，髓性单核细胞白血病，乳腺癌，膀胱癌，睾丸癌等众多肿瘤细胞有较好的治疗效果，但却存在着 耐药性强，水溶性差，严重的骨髓抑制以及口服效果差等缺点，寻找新的抗肿瘤活性好且毒副作用小的鬼 臼类药物，仍然是药学界的一大热点。

本发明的目的在于提供一类新型的鬼臼类药物抗肿瘤细胞化合物，这类新的化合物预期具有水溶性 好，有较低的毒性和较高的抗肿瘤作用。同时本发明提供这类新化合物的用途及其制备方法。
本发明的化合物分子式见下式：

式中R是氢、甲基、甲硫亚甲基、异丁基或苄基。
本发明的化合物制备方法是将鬼臼毒素与N-(1-氧基-2，2，6，6-四甲基哌啶-氧-羰基)-L-氨基酸溶于 干燥的二氯甲烷中，在氮气保护下搅拌均匀，然后加入二环己基碳二亚胺(DCC)，在氮气保护下搅拌反应， 待反应完成后再过滤除去白色沉淀，减压蒸除溶剂后，粗产物经柱层析纯化，用体积比为：15:1的二氯甲 烷-丙酮洗脱，得产物。
本发明的化合物最佳制备方法是将鬼臼毒素1mmol溶解在20ml二氯甲烷中，加入1mmol的N-(1-氧 基-2，2，6，6-四甲基哌啶-氧-羰基)-L-氨基酸化合物，在氮气保护下以N，N-二甲基吡啶作为催化剂，并加入 等量的二环己基碳二亚胺(DCC)为脱水剂，反应在室温条件进行。
本发明的化合物可用于制备抗肿瘤药物。
由本发明的化合物可见，它是将鬼臼脂素的C环4位以N-(1-氧基-2，2，6，6-四甲基哌啶-氧-羰基)-L-氨 基酸类化合物取代形成鬼臼酯。由于鬼臼类药物具有多种作用机制。鬼臼毒素能和纯化的微管蛋白结合， 抑制细胞微管的聚合，致使复制后的染色体不能分裂，细胞分裂停止；而Emanuel等人曾报道2，2，6，6-四 甲基-4-羟基哌啶氮氧自由基具有抗白血病的作用，将它引入到抗癌药物中很可能起到协同作用，许多学 者将不同的抗癌药物分子中引入氮氧自由基，能使母体化合物的毒性降低，而抗癌活性却保持甚至增强，在 我们先前的工作中将氮氧自由基引入鬼臼分子中也发现了这一点。同时，氮氧自由基能够作为药物基团的 载体，促使运载药物优先穿过癌变细胞膜，到达细胞DNA，而它本身并没有毒性和诱变因素。另一方面，L-氨 基酸在体内可以主动传送，可以作为药动团连接于药效团上，而且肿瘤在某个发育阶段合成蛋白质的速度 较快，要求氨基酸在癌细胞内快速浓集，有利于吸收和转运，因此，本发明将N-(1-氧基-2，2，6，6-四甲基 哌啶-氧-羰基)-L-氨基酸的化合物通过与C-4位形成羧酸酯的方式引入到鬼臼分子预期将能使母体化合物 的毒性降低，而抗癌活性却保持甚至提高；而且若使用得当，还可能减少或延缓耐药性的产生，同时该类 化合物也为借助电子自旋共振(ESR)技术研究鬼臼类药物抗癌机制提供了一种新手段，加之鬼臼类衍生物 和氮氧自由基各自的优点，前者具有显著的细胞毒活性及其亲脂性，后者能够作为药物载体调节药物分子 毒性及其良好的水溶性等特点；再加上L-氨基酸在人体中具有特殊的生理活性，因此将鬼臼衍生物与氮氧 自由基通过L-氨基酸联结成一个新的药物分子，可以得到高效低毒、脂水分配系数适当，特别是能定点释 放的药物。这样药物分子在体内运输过程中相对稳定，逐渐分解，最后在肿瘤细胞靶点定位释放，达到更 佳的治疗效果。而且本发明还可能克服鬼臼类化合物的首过代谢显著，亲脂性低，口服吸收不完全，直肠 吸收更差，生物利用度低的不足，并在一定程度上克服服药恶心、呕吐、腹泻和脱发等缺点。本发明的相 关试验证明此类化合物对P-388小鼠白血病，A-549人肺癌肿瘤细胞生长有显著的抑制作用，且抗肿瘤作用 属于强效。与现有抗肿瘤化合物相比，本发明的化合物含有水溶性的氨基酸和氮氧自由基部分，却不含有 葡萄糖的复杂结构。除此以外，本发明的化合物合成方法简单，原料廉价易得。
根据有关的研究表明，生物体内DNA的损伤可能导致突变和癌变，物理的和化学的因素常能诱发产生 非常活泼的自由基，致癌物也能经细胞活化而生成自由基C，这些自由基能使细胞中敏感的靶分子DNA转变 成DNA，随后与C形成DNA-C加合物，这些加合物可能是癌变诱发阶段的关键因子.如果非致癌物N与致癌 物竞争而生成DNA-N加合物，就可能阻止癌变。已有报道DNA可与氮氧自由基形成加合物。而本发明的化 合物中由于存在氮氧自由基，使得DNA-N加合物生成成为可能，从而可能阻止癌变；再者，一些研究发现 氮氧自由基能够作为药物基团的载体，促使药物优先穿过癌变细胞膜，到达细胞DNA，而它本身并没有毒性 和诱变因素同时它还有良好的水溶性，再加上L-氨基酸在人体中具有特殊的生理活性等优点，这些均预示 着本发明的化合物将有较高的抗癌活性，而这一点也被后叙的相关试验证明。
经体外抗肿瘤活性筛选研究结果表明，式I的化合物对P-388小鼠白血病，A-549人肺癌肿瘤细胞生 长有显著的抑制作用，且抗肿瘤作用属于强效，因此本发明的化合物可用于制备抗肿瘤的药物。

以下提供本发明的化合物的制备方法以及相应产物的活性实验结果
本发明的制备方法是：将鬼臼毒素与N-(1-氧基-2，2，6，6-四甲基哌啶-氧-羰基)-L-氨基酸溶于干燥 的二氯甲烷中，加入催化量的N，N-二甲基吡啶，在氮气保护下搅拌5分钟，然后加入二环己基碳二亚胺 (DCC)，在氮气保护下搅拌反应2小时，过滤除去白色沉淀，减压蒸除溶剂后，粗产物经柱层析纯化，用体 积比为：15:1的二氯甲烷-丙酮洗脱，得式I化合物。
相关的反应参见反应式1。

反应式1
式1中的R是氢、甲基、甲硫亚甲基、异丁基或苄基。
本发明所用的N-(1-氧基-2，2，6，6-四甲基哌啶-氧-羰基)-L-氨基酸通过下述方法得到：
将2，2，6，6-四甲基-4-羟基哌啶溶于20ml水和20ml甲醇，然后加入0.30克钨酸钠和0.20克乙二胺四 乙酸二钠盐放在磁力搅拌器上，开始搅动，待溶解后分批加入30％过氧化氢，继续搅拌8-10小时后，得橘 红色固体2，2，6，6-四甲基-4-羟基哌啶氮氧自由基.将溶于干燥乙醚的2，2，6，6-四甲基-4-羟基哌啶氮氧自 由基逐滴加入搅拌的溶于干燥四氢呋喃的的N，N-羰基二咪唑，在室温搅拌3小时，形成N-(1-氧基 -2，2，6，6-四甲基哌啶-氧-羰基)-咪唑，把所生成的N-(1-氧基-2，2，6，6-四甲基哌啶-氧-羰基)-咪唑加 入到溶有一水甲苯磺酸的干燥的丙酮溶液中，形成了活性的磺酸盐，将该磺酸盐立即加入到搅拌的溶有叠 氮化钠的水溶液中，在室温下搅拌15分钟，形成1-氧基-2，2，6，6-四甲基哌啶-氧-羰基叠氮，将该化合物溶 于二噁烷中，将其加入到溶有氨基酸和氧化镁的水溶液中，温度控制在40℃下，搅拌24小时，然后用乙酸 乙酯萃取干燥，蒸除溶剂纯化得到N-(1-氧基-2，2，6，6-四甲基哌啶-氧-羰基)-L-氨基酸.所用方法参见文 献方法(H.A.Staab et al，Chem.Ber.1962，95，1284及H.O.HANKOVSZKY et al， Synthesis.1979，530-531)；其反应参见下式

反应式2
其反应式中的R是氢、甲基、甲硫亚甲基、异丁基或苄基。
本发明所用的鬼臼毒素是从中药桃儿七(Podophyllium emodi Wallvar.Chinesis Spraque)中分离 出来并用作起始原料。所用方法参见(Peter H.Hofert；Rudolf Matusch.Helvetica Chimica Acta.1994， 77，771-777.)
本发明的最佳制备方法是将鬼臼毒素1mmol溶解在20ml二氯甲烷中，加入1mmol的N-(1-氧基 -2，2，6，6-四甲基哌啶-氧-羰基)-L-氨基酸化合物，在氮气保护下以N，N-二甲基吡啶作为催化剂，并加入等 量的二环己基碳二亚胺(DCC)为脱水剂，反应在室温条件进行。
以下提供本发明实施例
实施例1
4α-4-L-甘氨酸-N-(-甲酰-2′，2′，6′，6′-四甲基哌啶-4′-氮氧自由基酯基)鬼臼酯(Ia)的合 成
在250ml的锥形瓶中加入20ml水和20ml甲醇，0.30克钨酸钠和0.20克乙二胺四乙酸二钠盐，振荡 溶解，然后加入10克2，2，6，6-四甲基-4-羟基哌啶，放在磁力搅拌器上，开始搅动，待溶解后分批加入30％ 过氧化氢，继续搅拌，溶液由无色变为黄色，随后逐渐加深，最后成橘红色，反应约8-10小时后，减压蒸除 甲醇和大部分水，残留液冷却后加入少量碳酸钠振荡，并加入氯化钠盐析，用乙醚萃取3-4次，合并萃取液 用无水氯化钙干燥，减压除去乙醚，冷却固体得橘红色固体2，2，6，6-四甲基-4-羟基哌啶氮氧自由基10.5 克。本反应步骤系张自义等人发明于兰州大学学报(自然科学版)，1980，2，112.
将溶于20ml干燥乙醚的1.72克2，2，6，6-四甲基-4-羟基哌啶氮氧自由基逐滴加入搅拌的溶于30ml 干燥四氢呋喃的1.62克N，N-羰基二咪唑，在室温搅拌3小时，然后分别用水和氯化钠饱和溶液萃取，萃取液 被无水硫酸钠干燥，减压蒸干，在乙醚/正己烷中重结晶得到N-(1-氧基-2，2，6，6-四甲基哌啶-氧-羰基)- 咪唑1.6克.本反应步骤与H.A.Staab et al，Chem.Ber.1962，95，1284所公开的方法相同.
把所生成的N-(1-氧基-2，2，6，6-四甲基哌啶-氧-羰基)-咪唑1.4克溶于干燥的丙酮中加入到溶有一 水甲苯磺酸1.85克的干燥的丙酮溶液中，搅拌10分钟，然后加入乙醚出现沉淀，抽滤后得到了活性的 N-(1-氧基-2，2，6，6-四甲基哌啶-氧-羰基)-咪唑磺酸盐1.2克。
将该磺酸盐4.38克立即加入到搅拌的溶有1.3克叠氮化钠的10ml水溶液中，在室温下搅拌15分钟， 然后用正己烷萃取，萃取液用无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂，将残留液冷却到-20℃，得红色晶体1-氧基 -2，2，6，6-四甲基-氧-羰基叠氮2.17克。
将2.41克1-氧基-2，2，6，6-四甲基哌啶-氧-羰基叠氮溶于20ml二噁烷中，将其加入到溶有0.01mol 氨基酸和0.8克氧化镁的10ml水溶液中，温度控制在40℃下，搅拌24小时，然后用乙酸乙酯萃取并用无 水硫酸钠干燥，蒸除溶剂纯化得到N-(1-氧基-2，2，6，6-四甲基哌啶-氧-羰基)-L-氨基酸。本反应步骤是参 照H.O.HANKOVSZKY et al，Synthesis.1979，530-531所报道的方法。
鬼臼毒素是从中药桃儿七(Podophyllium emodi Wallvar.Chinesis Spraque)中分离出来并用作起 始原料。所用方法参见(Peter H.Hofert；Rudolf Matusch.Helvetica Chimica Acta.1994，77，771-777.)
将1mmol鬼臼毒素与1mmol的N-(1-氧基-2，2，6，6-四甲基哌啶-氧-羰基)-L-甘氨基酸溶于20ml干燥 的二氯甲烷中，加入催化量的0.1克N，N-二甲基吡啶，在氮气保护下搅拌5分钟，然后加入0.21克二环己 基碳二亚胺(DCC)，在氮气保护下搅拌反应2小时，过滤除去白色沉淀，减压蒸除溶剂后，粗产物经柱层析纯 化，用体积比为15:1的二氯甲烷-丙酮洗脱，得4α-4-L-甘氨酸-N-(-甲酰-2′，2′，6′，6′-四甲基哌 啶-4′-氮氧自由基酯基)鬼臼酯。
产物的检测数据如下：
产率：92％；m.p.135-137；(c＝0.5，CH2Cl2)IR(KBr)υcm-1：3373，1780，1723， 1485，1507，1589，930，1125，1179，1240，1371；MS(FAB)m/z：669(M-，38)，397(100)； HRMS(ESI)C34H41N2O12：理论值(M+2H)，671.2811，实测值，671.2802.ESR：g0＝2.0058，(3)Δ HPP＝35.309Gs，AN＝15.81Gs(三峰在1×10-4M，CH2Cl2)
实施例2
4α-4-L-丙氨酸-N-(-甲酰-2′，2′，6′，6′-四甲基哌啶-4′-氮氧自由基酯基)鬼臼酯(Ib)的合成
实验步骤与实施例1同，仅以丙氨酸代替甘氨酸。反应所得产物检测数据如下：
产率：90％；m.p.138-140℃；(c＝0.5，CH2Cl2)IR(KBr)υcm-1：3344，1781， 1716，1485，1507，1589，930，1126，1175，1239，1365；MS(FAB)m/z：683(M-，30)，397(100)； HRMS(ESI)C35H43N2O12：理论值(M+2H)，685.2967，实测值，685.2962.ESR：g0＝2.0058，(3)Δ HPP＝44.268Gs，AN＝15.81Gs(三峰在1×10-4M，CH2Cl2)
实施例3
4α-4-L-甲硫氨酸-N-(-甲酰-2′，2′，6′，6′-四甲基哌啶-4′-氮氧自由基酯基)鬼臼酯(Ic)的合成
实验步骤与实施例1同，仅以甲硫氨酸代替实施例1的甘氨酸。反应所得产物检测数据如下：
产率：91％；m.p.115-117；(c＝0.5，CH2Cl2)IR(KBr)υcm-1：3337，1781，1719， 1485，1507，1589，930，1126，1175，1239，1365；MS(FAB)m/z：743M-，68)，397(100)；HRMS(ESI) C37H47N2O12S：理论值(M+2H)，745.3001，实测值，745.3001.ESR：g0＝2.0058，(3)ΔHPP＝34.255Gs，AN ＝15.81Gs(三峰在1×10-4M，CH2Cl2)
实施例4
4α-4-L-异亮氨酸-N-(-甲酰-2′，2′，6′，6′-四甲基哌啶-4′-氮氧自由基酯基)鬼臼酯(Id)的合成
实验步骤与实施例1同，仅以异亮氨酸代替实施例1的甘氨酸。反应所得产物检测数据如下：
产率：83％；m.p.117-118℃；(c＝0.5，CH2Cl2)IR(KBr)υcm-1：3349，1782， 1718，1485，1507，1589，930，1126，1178，1240，1366.MS(FAB)m/z：725(M-，48)，397(100)； HRMS(ESI)C38H49N2O12：理论值(M+2H)，727.3437，实测值，727.3437.ESR：g0＝2.0058，(3)ΔHPP＝32.674Gs， AN＝15.81Gs(三峰在1×10-4M，CH2Cl2)
实施例5
4α-4-L-苯丙氨酸-N-(-甲酰-2′，2′，6′，6′-四甲基哌啶-4′-氮氧自由基酯基)鬼臼酯(Ie)的合成
实验步骤与实施例1同，仅以苯丙氨酸代替实施例1的甘氨酸。反应所得产物检测数据如下：
产率：88％；m.p.120-121℃；(c＝0.5，CH2Cl2)IR(KBr)υcm-1：3334，1780，1719， 1485，1506，1589，929，1125，1177，1239，1365.MS(FAB)m/z：759(M+，27)，397(100)；HRMS(ESI) C41H47N2O12：理论值(M+2H)，761.3280，实测值，761.3284.ESR：g0＝2.0058，(3)△HPP＝27.404Gs，AN＝15.81 Gs(三峰在1×10-4M，CH2Cl2)
相关的药理实验方法及结果
本发明的药理实验采用四氮唑盐还原法(MTT分析法)以代谢还原3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl) -2，5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT)为基础。在实验中活细胞的线粒体中存在与NADP相关的脱 氢酶，可将黄色的MTT还原为不溶性的蓝紫色的(Formazan)，死细胞此酶消失，不被还原。用DMSO溶解 Formazan后可用酶标仪在550nm波长处检测吸光度。
磺酰罗丹明B(sulforhodamineB，SRB)蛋白染色法SRB是一种蛋白结合染料，可与生物大分子中的 碱性氨基酸结合，其在515nm的OD读数与细胞数呈良好的线性关系，故可用作细胞数的定量。
实验方法为：(1)取培养4-5天，处于指数生长期的细胞培养液一瓶，加入适量Trypsin-EDTA液，使 贴壁细胞脱落，用10ml含5％胎牛血清的RPMI1640培养液配成悬液。(2)用台盼蓝染色后在血球记数板上作 细胞记数。(3)用细胞培养基稀释细胞悬液，配成每100ml含10000或20000个细胞。(4)取96孔平板，每 孔加细胞悬液100ul。并将平板置37℃CO2(5％)温箱24小时。(5)受试化合物作5个稀释度，依次为10-4， 10-5，10-6，10-7，10-8mol/L。(6)将平板在37℃，含5％CO2空气及100％湿度的温箱中孵育2-3天。(7)MTT用 无血清RPMI1640培养液配成1mg/ml溶液，每孔加50ul，37℃温育4小时，使MTT还原为甲。(8)吸 取上清液，加入150ulDMSO使甲溶解，用平板摇床摇匀。(9)用自动化分光光度平板读数计在550nm 处测定每个小孔的吸光度。
体外药理实验结果见下表对P-388小鼠白血病和A-549人肺癌肿瘤细胞生长的抑制率％。
表一 对P-388小鼠白血病肿瘤细胞生长的抑制率％
  浓度 样品编号 10-4 10-5 10-6 10-7 10-3 评价 Ia 96.3 91.0 89.1 87.8 77.5 强效 Ib 99.9 89.2 88.3 81.1 70.8 强效 Ic 94.9 88.8 86.3 73.8 43.0 强效 Id 95.8 94.3 73.9 14.0 0 弱效 Ie 93.5 92.6 80.7 68.6 52.3 强效 VP-16 99.2 70.6 25.5 6.0 1.8 —
注：(1)筛选方法：四氮唑盐还原法；(2)作用时间：72小时；(3)样品编号Ia至Ie分别为前述 实施例1至实施例5所得产物。
表二 对A-549人肺癌肿瘤细胞生长的抑制率％
  浓度 样品编号 104 10-5 10-6 10-7 10-8 评价 Ia 87.9 87.3 82.8 80.1 75.5 强效 Ib 94.7 86.1 83.5 81.6 50.6 强效 Ic 89.5 83.5 83.3 73.2 45.9 强效 Id 87.0 83.6 72.8 39.0 10.7 弱效 Ie 87.9 87.0 81.9 79.9 60.0 强效 VP-16 97.5 50.7 45.0 0 0 —
注：(1)筛选方法：磺酰罗丹明B蛋白染色法；(2)作用时间：72小时；(3)样品编号Ia至Ie分 别为前述实施例1至实施例5所得产物。
体外实验证明，其中本发明的化合物中四个对白血病细胞株(P-388)，人肺癌(A-549)有强效，其抑 制率比VP-16强得多，只有一个化合物表现为弱效，其药理活性显著，与VP-16对比，本发明的化合物对 白血病细胞株(P-388)和肺癌细胞株(A-549)有更为显著的效果。从该类化合物可以推断出该类化合物 的活性很可能与L-氨基酸的类型有关，所以有必要在这方面做进一步的探索。另外从前述实施例中可见， 该类化合物合成方法简单，原料廉价易得。