镰刀菌及其发酵化合物在防治坏死样凋亡相关疾病中的应用专利检索-杂环化合物含大于六元的环有1个氧原子作为仅有的杂环原子专利检索查询-专利查询网

镰刀菌及其发酵化合物在防治坏死样凋亡相关疾病中的应用
申请号	CN202210721964.X	申请日	2022-06-24	公开(公告)号	CN115074255A	公开(公告)日	2022-09-20
申请人	自然资源部第三海洋研究所;			发明人	杨献文; 马华彬; 汪朝凤; 邹正彪; 徐琳; 谢明敏; 郝优佳;
摘要	本发明公开了镰刀菌(Fusarium sp.)ZEN‑48、利用其制备发酵化合物及其发酵化合物在制备防治坏死样凋亡(necroptosis)相关疾病中的应用。镰刀菌(Fusarium sp.)ZEN‑48于2022年4月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2022503；本发明镰刀菌Fusarium sp.ZEN‑48的发酵产物为大环内酯类化合物或其盐，具有靶向性抑制TNFα诱导的坏死样凋亡的作用，可用于制备抗坏死样凋亡相关疾病的治疗药物。本发明对我国海洋药物开发具有重要意义，对坏死样凋亡相关的疾病治疗和新药开发具有重要意义。
权利要求	1.镰刀菌(Fusarium sp.)ZEN‑48菌株，保藏编号为CCTCC M 2022503，2022年4月27日保藏于中国典型培养物保藏中心。 2.镰刀菌(Fusarium sp.)ZEN‑48在制备发酵化合物中的应用，其特征在于，所述发酵化合物为大环内酯类化合物或其盐，其结构如式(I)所示： 3.如权利要求2所述发酵化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： S1、将保藏编号为CCTCC M 2022503的镰刀菌(Fusarium sp.)ZEN‑48进行发酵培养，得到发酵物； S2、将步骤S1得到的发酵物用乙酸乙酯进行萃取，取有机萃取物进行层析，分别使用石油醚、二氯甲烷和甲醇进行洗脱，浓缩二氯甲烷层，得到粗提物； S3、将步骤S2得到的粗提物用正相硅胶柱色谱进行分离，用二氯甲烷‑甲醇体系进行梯度洗脱，依次得到3个粗馏分：Fr.1～Fr.3； S4、将粗馏分Fr.1先使用ODS柱色谱进行分离，再使用水‑甲醇体系进行梯度洗脱依次得到两段粗馏分：Fr.1‑1、Fr.1‑2； S5、将粗馏分Fr.1‑1用葡聚糖凝胶柱分离后重结晶得到所述发酵化合物。 4.镰刀菌(Fusarium sp.)ZEN‑48的发酵化合物在制备防治坏死样凋亡相关疾病的药物中的应用，其特征在于，所述镰刀菌ZEN‑48的发酵化合物如权利要求2中所定义或如权利要求3所述制备方法获得。 5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述坏死样凋亡为TNFα诱导的坏死样凋亡或TNFα+ZVAD诱导的坏死样凋亡。 6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物是通过靶向RIPK3破坏坏死小体的形成和RIPK3/MLKL的磷酸化，进而抑制坏死样凋亡。 7.如权利要求4‑6任一项所述的应用，其特征在于，所述坏死样凋亡疾病包括神经退行性疾病、炎症性肠病、动脉粥样硬化、急性胰腺炎、急性/药物诱导的肝损伤、急性肾损伤、病毒性感染及肿瘤中的一种或多种。 8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述神经退行性疾病包括阿尔茨海默症和肌萎缩侧索硬化；和/或，所述肿瘤包括脑胶质瘤、乳腺癌、肺癌、肝癌、食管癌、结直肠癌和前列腺癌中的一种或多种。 9.如权利要求4‑6、8中任一项或权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物包含药学有效量的发酵化合物及药物辅料，所述酵化合物如权利要求2中所定义；和/或，所述药物的剂型为丸剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、管饲制剂、混悬剂、喷雾剂或膏剂。 10.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求2所述的发酵化合物，所述发酵化合物通过权利要求3所述的制备方法获得。
说明书全文	镰刀菌及其发酵化合物在防治坏死样凋亡相关疾病中的应用技术领域 [0001] 本发明涉及微生物、药物化合物技术领域，具体涉及镰刀菌ZEN‑48、利用其制备发酵化合物及其发酵化合物在防治坏死样凋亡相关疾病中的应用。背景技术 [0002] 坏死样凋亡(Necroptosis)是一种非Caspase依赖的程序性细胞死亡，被认为与多种人类疾病有关，如神经退行性疾病和炎症性疾病及病毒感染引发的相关疾病。坏死样凋亡可由死亡受体、Toll样受体、干扰素受体等激活诱导。在坏死样凋亡中，有一个核心信号轴，RIPK1(受体相互作用蛋白激酶1)‑RIPK3(受体相互作用蛋白激酶3)‑MLKL(混合谱系激酶结构域样假激酶)，并形成由RIPK1‑RIPK3‑MLKL组成的坏死小体，最终诱导MLKL的磷酸化和寡聚化，进而转移到质膜并触发膜溶解，导致细胞内容物完全释放并促进炎症。 [0003] 大量的研究证实RIPK1是细胞凋亡和坏死以及炎症通路中的一个关键调节因子。RIPK1逐渐成为神经退行性疾病、自身免疫性疾病和炎症等多种疾病治疗的有效靶点之一。目前，用于自身免疫性疾病的GSK′772、用于肌萎缩侧索硬化症(ALS)的DNL747等，正在临床试验中进行研究。但是，总的来说，对程序性坏死的研究以及相关靶点，包括RIPK1、RIPK3和MLKL的研究还处于初期。因此，具有选择性、有效性和安全性的坏死样凋亡小分子抑制剂有待于进一步的被发现和开发。 [0004] 大环内酯类是一类以大环内酯环为特征并以可变侧链/基团为特征的疏水化合物。大环内酯类药物已被证明具有治疗特性。事实上，一些广为人知的抗生素化合物，包括红霉素，是大环内酯类。除了抗生素特性外，大环内酯类还显示出其他广泛的药理作用，如抗病毒、抗寄生虫、抗真菌和免疫抑制作用等。因此，开发大环内酯类药物在防治坏死样凋亡疾病中应用是有必要的。发明内容 [0005] 本发明的目的在于提供一种镰刀菌(Fusarium sp.)ZEN‑48及其发酵化合物在制备坏死样凋亡药物中的应用。本发明提供的大环内酯类化合物为brefeldin A或其盐，分离自镰刀菌(Fusarium sp.)ZEN‑48的发酵产物，其对TNFα诱导的坏死样凋亡具有显著的靶向抑制作用，对坏死样凋亡相关的疾病治疗和新药开发具有重要意义。 [0006] 本发明的第一方面，提供保藏编号为CCTCC M 2022503的镰刀菌(Fusarium sp.)ZEN‑48，保藏于中国典型培养物保藏中心。 [0007] 本发明的第二方面，提供镰刀菌(Fusarium sp.)ZEN‑48在制备发酵化合物中的应用，所述发酵化合物为大环内酯类化合物或其盐，其结构如式(I)所示： [0008] [0009] 本发明的第三方面，提供镰刀菌(Fusarium sp.)ZEN‑48的发酵化合物的制备方法，包括以下步骤： [0010] S1、将保藏编号为CCTCC M 2022503的镰刀菌(Fusarium sp.)ZEN‑48进行发酵培养，得到发酵物； [0011] S2、将步骤S1得到的发酵物用乙酸乙酯进行萃取，取有机萃取物进行层析，分别使用石油醚、二氯甲烷和甲醇进行洗脱，浓缩二氯甲烷层，得到粗提物； [0012] S3、将步骤S2得到的粗提物用正相硅胶柱色谱进行分离，用二氯甲烷‑甲醇体系进行梯度洗脱，依次得到3个粗馏分：Fr.1～Fr.3； [0013] S4、将粗馏分Fr.1先使用ODS柱色谱进行分离，再使用水‑甲醇体系进行梯度洗脱依次得到两段粗馏分：Fr.1‑1、Fr.1‑2； [0014] S5、将粗馏分Fr.1‑1用葡聚糖凝胶柱分离后重结晶得到所述发酵化合物。 [0015] 本发明的第四方面，提供镰刀菌(Fusarium sp.)ZEN‑48的发酵化合物在制备防治坏死样凋亡相关疾病的药物中的应用，所述镰刀菌ZEN‑48的发酵化合物如本发明第二方面中所定义或通过本发明第三方面的制备方法获得。 [0016] 在其中一些实施例中，所述坏死样凋亡为TNFα诱导的坏死样凋亡或TNFα+ZVAD诱导的坏死样凋亡。 [0017] 在其中一些实施例中，所述药物通过靶向RIPK3破坏坏死体形成及RIPK3的磷酸化，进而抑制坏死样凋亡。 [0018] 在其中一些实施例中，所述坏死样凋亡疾病包括神经退行性疾病、炎症性肠病、动脉粥样硬化，急性胰腺炎，急性/药物诱导的肝损伤、急性肾损伤、病毒性感染及肿瘤中的一种或多种。 [0019] 在其中一些实施例中，所述神经退行性疾病包括阿尔茨海默症和肌萎缩侧索硬化。 [0020] 在其中一些实施例中，所述肿瘤包括脑胶质瘤、乳腺癌、肺癌、肝癌、食管癌、结直肠癌和前列腺癌； [0021] 优选地，所述肿瘤为结直肠癌、肝癌。 [0022] 在其中一些实施例中，所述坏死样凋亡疾病包括阿尔茨海默症、肌萎缩侧索硬化、炎症性肠病、动脉粥样硬化、急性胰腺炎、急性/药物诱导的肝损伤、急性肾损伤、病毒性感染(如HSV)引发的相关症状。 [0023] 在其中一些实施例中，所述药物包含化合物brefeldinA或其盐及药物辅料。 [0024] 在其中一些实施例中，所述药物的剂型为丸剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、管饲制剂、混悬剂、喷雾剂或膏剂。 [0025] 本发明的第五方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物包含本发明第二方面中所述的发酵化合物，所述发酵化合物通过本发明第四方面的制备方法获得。 [0026] 与现有技术相比，本发明具有以下优点： [0027] 本发明提供了新的大环内酯类化合物，其分离自深海镰刀菌(Fusarium sp.)ZEN‑48的发酵提取物。本发明经实验验证了所述大环内酯类化合物对抗坏死样凋亡的作用，并且进一步通过细胞周期分析、主要标志物分析，证明了所述化合物通过抑制细胞增殖来达到治疗效果。本发明提供的大环内酯类化合物在制备抗坏死样凋亡相关疾病方面具有良好的应用前景。附图说明 [0028] 通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。在附图中： [0029] 图1化合物1对L929的细胞活性抑制作用； [0030] 图2化合物1对TNFα及TNFα+ZVAD诱导L929坏死样凋亡的作用(检测ATP法)； [0031] 图3化合物1对TNFα+ZVAD诱导坏死小体形成的作用； [0032] 图4化合物1对TNFα+ZVAD诱导RIPK3/MLKL的磷酸化的作用； [0033] 图5化合物1与RIPK3的分子对接3D图； [0034] 图6化合物1与RIPK3的分子对接二维投影图； [0035] 该菌株的保藏信息为： [0036] 镰刀菌(Fusarium sp.)ZEN‑48，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉大学，保藏编号为CCTCC M 2022503，保藏日期为2022年4月27日。具体实施方式 [0037] 下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。 [0038] 实施例1镰刀菌(Fusarium sp.)ZEN‑48的培养、发酵液及发酵化合物的制备[0039] 1、制备镰刀菌(Fusarium sp.)ZEN‑48发酵液 [0040] (1)将镰刀菌(Fusarium sp.)ZEN‑48(保藏编号CCTCC M 2022503)在PDA平板上于25℃培养2天； [0041] (2)将新鲜的菌丝体接到含有1100mL PDB的培养液中；24h后，将20mL 种子液接种到1L的三角烧瓶中(50瓶)进行发酵，所述三角烧瓶中包括4g 葡萄糖、8g甘露醇、2g蛋白胨、2g味精、1.2g 酵母提取物和1.2g麦芽糖，上述物质溶解于400mL去离子水中并用NaOH调节PH至7.5，得到发酵液。 [0042] 2、制备镰刀菌(Fusarium sp.)ZEN‑48的发酵化合物 [0043] (1)将上述得到的发酵液用乙酸乙酯萃取三次，减压蒸发掉有机溶剂，得到有机萃取物； [0044] (2)将这些萃取物过正相柱层析柱，分别使用石油醚，二氯甲烷和甲醇进行洗脱，浓缩二氯甲烷层，得到粗提物； [0045] (3)将步骤(2)得到的粗提物使用正相硅胶柱色谱进行分离，用二氯甲烷‑甲醇体系进行梯度洗脱，得到3个馏分(Fr.1～Fr.3)； [0046] (4)将步骤(3)中的馏分Fr.1先使用ODS柱色谱进行分离，使用甲醇‑水体系进行梯度洗脱，继而使用Sephadex葡聚糖凝胶色谱柱(纯甲醇)分离，经重结晶得到化合物1。 [0047] 将上述步骤中得到的化合物1进行核磁检测，核磁数据结果见表1： [0048] 表1.化合物1在CD3OD溶剂中的1H和13C‑NMR核磁数据 [0049] [0050] 结合X‑射线单晶衍射结果，其X‑射线单晶衍射图见式II。最终确定了化合物1是大环内酯类化合物，其结构如式I所示： [0051] [0052] [0053] 实施例2化合物1对L929细胞的活性抑制作用 [0054] (1)L929细胞经常规消化后，于培养基中重悬并吹打成单细胞悬液，然后以每孔4000个细胞接种到96孔板，每孔体积100μL； [0055] (2)37℃，5％CO2的培养箱中培养12h，然后分别加入如下浓度(0.1μM，1μM，10μM，25μM)的式I化合物处理细胞，以DMSO作为对照； [0056] (3)继续培养24h后，每孔加10μL的CCK‑8(HY‑K0301,MCE)，37℃避光反应0.5h； [0057] (4)酶标仪测定450nm吸收值，计算细胞活率。 [0058] 实验结果如图1所示，当化合物1的处理浓度达到25μM的时候，对L929细胞的抑活率为50％，表现出一定的抑制细胞生长的活性。 [0059] 实施例3、化合物1对TNFα和TNFα+ZVAD诱导的L929坏死样凋亡的作用 [0060] (1)L929细胞经常规消化后，于培养基中重悬并吹打成单细胞悬液，然后以每孔10000个细胞接种到96孔板，每孔体积100μL； [0061] (2)37℃，5％CO2的培养箱中培养12h，然后分别加入如下浓度(0.1μM，0.25μM，0.5μM，0.75μM，1μM，2μM，5μM)的化合物1处理细胞，预处理半个小时，DMSO作为溶剂对照(0)； [0062] (3)然后分别加入TNFα(10ng/mL)刺激处理细胞12h，或者TNFα(10ng/mL)+ZVAD(10μM)刺激处理细胞4h； [0063] (4)在对应的时间，检测细胞的ATP含量(G7570，Promega)。 [0064] 结果如图2所示，化合物1对TNFα或者TNFα+ZVAD诱导的L929细胞坏死样凋亡具有显著的抑制活性，EC50分别为0.75μM和0.5μM。 [0065] 实施例4、化合物1对TNFα+ZVAD诱导坏死小体形成的作用 [0066] (1)Flag‑Ripk1‑Knock in‑L929细胞经常规消化后，于培养基中重悬并吹打成单7 细胞悬液，然后以1x10个细胞接种到10cm盘，体积10mL； [0067] (2)37℃，5％CO2的培养箱中培养12h，然后加入化合物1(1μM)预处理半个小时，DMSO作为对照； [0068] (3)然后，分别加入TNFα(10ng/mL)+ZVAD(10μM)刺激处理细胞3h，DMSO作为对照(‑)； [0069] (4)收取细胞，在冰上裂解，利用M2 beads(Anti‑Flag)对坏死细胞进行免疫共沉淀，然后通过western blot分析。 [0070] 结果如图3所示，TNFα(10ng/mL)+ZVAD(10μM)刺激下诱导坏死小体(RIPK1‑RIPK3‑MLKL)形成，化合物1(1μM)预处理后，坏死小体不能形成。 [0071] 实施例5、化合物1对TNFα+ZVAD诱导RIPK3/MLKL的磷酸化的作用 [0072] (1)L929细胞经常规消化后，于培养基中重悬并吹打成单细胞悬液，然后以每孔15 ×10个细胞接种到12孔板，每孔体积1mL； [0073] (2)37℃，5％CO2的培养箱中培养12h，然后加入化合物1(1μM)预处理半个小时,DMSO作为对照； [0074] (3)然后，加入TNFα(10ng/mL)+ZVAD(10μM)刺激处理细胞1h,2h； [0075] (4)收取细胞，裂解，western blot分析。 [0076] 结果如图4所示，TNFα(10ng/mL)+ZVAD(10μM)刺激下诱导RIPK3/MLKL发生磷酸化，化合物1(1μM)预处理后，磷酸化不能发生。 [0077] 实施例6、化合物1与RIPK3的分子对接 [0078] 受体源于RCSB蛋白质数据库下载的人类RIPK3 晶体结构(PDB ID：6OKO)。基于Discovery Studio 2019 软件的CDOCKER程序用于探索化合物化合物1与RIPK3的结合模式。通过自动“准备蛋白质”程序准备对接，包括去除水分子、添加氢原子和质子化氨基酸驻留在指定的pH值为7.4。从ZINC数据库下载化合物1的3D结构，并通过“制备配体”程序在指定的pH＝7.4下构建和制备。6OKO结合位点的坐标为x：‑26.906093；y：11.526759；z：‑ 9.429040，半径为 [0079] 化合物1与RIPK3的分子对接的3D结果如图5所示，其二维投影结果如图6所示，化合物1与受体蛋白形成了多个范德华力(van der vaals)，配体分子结构中两个羟基相连的碳原子分别与蛋白氨基酸残基LYS51以及ASP161各生成1个hydrogen作用。此外，化合物1的大环内酯骨架与残基ALA64和LEU139可形成2个烷基(alkyl)相互作用。 [0080] 以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

意见反馈