[0001] 相关申请的交叉引用

[0002] 本申请要求2014年3月26日提交的美国临时申请号61/970,737的权益，其以引用的方式整体并入本文并且用于所有目的。

[0003] 以ASCII文件形式提交的“序列表”、表格或计算机程序列表附录的引用

[0004] 写入文件48440-541001WO_ST25.TXT(2015年3月24日创建，1,055字节，机器格式IBM-PC，MS-Windows操作系统)中的序列表据此以引用的方式并入本文。

[0005] 关于联邦资助的研究和开发下作出的发明的权利的声明

[0006] 本发明根据由国立癌症研究院(National Institute of Cancer，NCI)授予的拨款号CA 127541和由国立卫生研究院(National Institutes of Health，NIH)授予的拨款号P30CA033572在政府资助下作出。政府享有本发明中的某些权利。

[0007] 发明背景

[0008] 抗代谢药物羟基脲(HU)已用于治疗多种人癌症，包括慢性骨髓源性白血病、头颈部癌症和其它癌症(1)。它的主要抗癌靶标是使核糖核苷酸还原成它们的相应脱氧形式以供给dNTP来达成DNA复制和修复的核糖核苷酸还原酶(RR)(3,4)。人RR由hRRM1和hRRM2亚单位组成(3,4)。在基因毒性刺激之后，替代性RR酶被诱导以供给dNTP来达成DNA修复，该酶由hRRM1和p53R2(hRRM2的由肿瘤抑制蛋白p53反式活化的同源物)组成(5)。在细胞内，已知HU通过淬灭自由基介导的催化(3)的氧化转化(6)产生自由基来抑制两种类型的RR(4)。然而，在药理学上，HU疗法因体内半衰期短暂和成问题的副作用而受损，该副作用最特别是骨髓抑制以及胃肠和皮肤病学影响(7)。

[0009] 聚(ADP-核糖)聚合酶-1(PARP1)和PARP2均是在肿瘤发展中具有作用的ADP核糖基转移酶(ART)。具有PARP活性的ART成员(诸如PARP1)含有具有高度保守的活性位点序列的保守催化结构域(12-14)。在单链DNA断裂之后，PARP1从β-NAD+底物合成ADP-核糖聚合物，并且将这些聚合物转移至接受体蛋白质(其自身或其它蛋白质)的谷氨酸、赖氨酸或天冬氨酸残基中，该聚合物随后由聚(ADP-核糖)糖基水解酶(PARG)降解。在单链DNA断裂修复(SSBR)或碱基切除修复(BER)期间，PARP1和PARP2与X射线修复互补蛋白-1(XRCC1)相互作用以将SSBR/BER因子DNA聚合酶β或DNA连接酶III募集至DNA损害位点(12-14)。在无PARP1下，在DNA复制期间持续存在单链断裂将导致复制叉停滞，其解决需要BRCA1或BRCA2介导的同源性修复(HR)(15,16)。BRCA1连同BRCA2一起是与家族性乳腺癌的发作相关联的肿瘤抑制基因(11)。在不存在BRCA1下，双链断裂因此积累，从而通过凋亡来导致细胞死亡。BRCA1/2缺陷性肿瘤可对PARP1抑制剂敏感，但可遭受对PARP1抑制剂的获得性抗性。因此，本领域中对避免与当前疗法相关的副作用和/或获得性抗性的BRCA1/2缺陷性肿瘤治疗存在需要。
因此，本文提供对本领域中这些和其它问题的解决方案。

[0010] 发明简述

[0011] 本文尤其公开通过施用有效量的COH29(包括其药学上可接受的盐)来治疗BRCA1缺陷性受试者、PARP1抑制剂抗性受试者或DNA损害性抗癌剂抗性受试者的癌症的方法。也公开通过以组合协同量施用COH29(包括其药学上可接受的盐)和DNA损害性抗癌剂来治疗受试者的癌症的方法。

[0012] 附图简述

[0013] 图1A-1B.BRCA1状态影响COH29细胞毒性和抗肿瘤活性：图1A：与COH29一起孵育72小时并被溶解的表达wt(野生型)BRCA1(OV90)或突变BRCA1(UWB1.289)的卵巢癌细胞的剂量响应曲线(细胞活力通过MTT测定来评估)，并且描绘的各点代表用误差棒指示的三个独立实验的平均值；用HCC1937(图1B)和HCC1937+BRCA1(图1C)细胞在雌性NSG小鼠的乳腺脂肪垫中产生的肿瘤外植体的生长(如所指示用COH29或媒介物治疗小鼠-结果是来自4只小鼠/组的肿瘤测量结果的平均值±标准误差)。

[0014] 图2A-2B.患者群组中RRM2表达与PARP1的关联。(图2A)乳腺癌和(图2B)卵巢癌中的从公共临床结果数据库提取的RRM2和PARP1表达的回归图。

[0015] 图3A-3B.COH29抑制BRCA1缺陷性人乳腺癌细胞中的PARP1：图3A)：使用Materials&Methods中所述的程序，一式两份评估COH29对表达突变或wt BRCA1(在各情况下，wt＝+BRCA1)的各对等基因乳腺(HCC1937)和卵巢(UWB1.289)癌细胞系中的PARP1活性的影响；图3B：通过使用抗人PARP1抗体作为初级抗体进行蛋白质印迹分析来评估COH29对等基因HCC1937/HCC1937+BRCA1细胞系中的PARP1蛋白表达的影响。装载对照是β-肌动蛋白。

[0016] 图4A-4B:.BRCA1对在用COH29和顺铂双重处理之后的细胞可存活性的影响：图4A：用固定浓度的COH29(12.5μΜ)加顺铂(12.5、25、50和100μΜ)处理24小时的HCC1937和HCC1937+BRCA1细胞的通过MTT测定所评估的活力(描绘的各点代表用误差棒指示的三个独立实验的平均值)；图4B：在单独5μΜCOH29、单独4μΜ顺铂或两种药物在相同浓度下的组合存在下，所指示细胞中的24小时活力的直方图(显示的是三个独立实验的平均值)。

[0017] 图5A-5D.COH29相较于HU在斑马鱼基因毒性测定中的作用：图5A：暴露于如所指示的HU的在4dpf(受精后天数)时的野生型斑马鱼胚胎(眼和心脏发育方面的形态学变化由箭头指示)。图5B：一系列不同浓度的HU对斑马鱼的影响的柱状图(0、5、10、20、50mM，n＝50，一式三份进行)。图5C：暴露于如所指示的COH29的在4dpf时的野生型斑马鱼胚胎。图5D：一系列不同浓度的COH29对斑马鱼的影响的柱状图(0、10、20、50、100μΜ，n＝46，一式三份进行)。

[0018] 图6.COH29处理使DNA损害检查点活化。COH29处理对表达wt p53(MCF-7)或p53缺陷性(MCF-7p53-/-)的人乳腺癌细胞中以及三重阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-468)中的DNA损害检查点蛋白质的影响，通过蛋白质印迹所评估。

[0019] 图7A-7D.在BRCA1野生型人肺癌细胞中，COH29活化DDR，并且抑制RAD51表达。图7A：通过蛋白质印迹分析来评估COH29对细胞质和核中的DDR相关蛋白质的影响，其中用COH29在指示的剂量下处理细胞48小时，并且使用指示的抗体，使细胞溶解产物经受免疫印迹(FOXO3活性由它的下游靶标p27Kip1的水平指示，并且β-微管蛋白和核纤层蛋白A/C代表细胞质和核提取物的分级分离和装载对照)；图7B-7D：通过间接免疫荧光测定来评估COH29对DDR相关蛋白质磷酸ATM(图7B)、γ-Η2ΑΧ(图7C)和磷酸p53(图7D)与foxo3在核中共定位的影响。对于各蛋白质，分析平均300个染色细胞，并且直方图显示具有阳性核(≥5个灶)的细胞的百分比(％)，其中生物学重复实验的数目是3，误差棒代表标准偏差(SD)，并且P值(配对t检验)如所指示。

[0020] 图8A-8B.COH29对NHEJ DNA修复的影响。在所示剂量下的单独或与顺铂组合的COH29的活性，通过在使细胞暴露于药物24小时之后对EJ2(图8A)(替代性NHEJ路径)或EJ5(图8B)(NHEJ路径)细胞进行FACS分析所评估。

[0021] 图9A-9B.COH29抑制人肺癌细胞中的RAD51：图9A：使用抗人RAD51抗体作为初级抗体，通过间接免疫荧光测定来评估COH29对RAD51蛋白的作用。图9B：使用抗人RAD51抗体作为用于分析的初级抗体(装载对照是β-肌动蛋白)，通过蛋白质印迹分析来评估COH29对RAD51蛋白的作用；用COH29在指示的剂量下处理A549肺癌细胞24小时，并且在COH-29处理之后的γ-Η2ΑΧ表达样式也类似地分析于图9A和9B中。

[0022] 发明详述

[0023] 定义

[0024] “患者”、“受试者”、“有需要的患者”和“有需要的受试者”在本文中可互换使用，并且是指罹患或易患可通过施用COH29或COH29与如本文讨论的其它抗癌剂组合来治疗的疾病或病状的活生物体。在实施方案中，疾病或病状是癌症。受试者的非限制性实例包括人、其它哺乳动物、牛、大鼠、小鼠、狗、猴、山羊、绵羊、母牛、鹿和其它非哺乳动物动物。在实施方案中，患者是人。

[0025] 如本文所用的“癌症受试者”是指患有如本文所述的癌症的受试者。癌症受试者可患有至少一种本文所述的癌症。因此，举例来说，癌症受试者可指“乳腺癌受试者”(例如患有乳腺癌的受试者)或“卵巢癌受试者”(例如患有卵巢癌的受试者)。癌症受试者可患有展现特定基因型或表型特征(例如缺陷性基因产物或对特定抗癌剂的抗性)的癌症。因此，癌症受试者可为“BRCA1缺陷性受试者”，其中BRCA1缺陷性受试者是患有包括BRCA1缺陷性基因或BRCA1缺陷性蛋白(例如“BRCA1缺陷”)的癌的受试者。在实施方案中，“BRCA1缺陷性受试者”是指至少部分地直接或间接导致受试者的癌症的BRCA1基因非表达(例如相对于对照或健康受试者，表达降低)，在受试者中不存在功能性BRCA1(例如相对于对照或健康受试者，数量降低)，或BRCA1表达降低。在实施方案中，BRCA1缺陷性受试者显示BRCA1基因非表达，在受试者中不存在功能性BRCA1。癌症受试者可为“PARP1抑制剂抗性受试者”，其中PARP1抑制剂抗性受试者是患有对至少一种如本领域中已知的PARP1抑制剂具有抗性的癌症的受试者。癌症受试者可为“DNA损害性抗癌剂抗性受试者”，其中此受试者患有对至少一种如本领域中已知的DNA损害性抗癌剂具有抗性的癌症。癌症受试者可患有展现超过一种基因型或表型特征的癌症(例如乳腺癌受试者可患有具有BRCA1缺陷和对至少一种PARP1抑制剂的抗性的癌症)。

[0026] “COH29”是指具有式(N-(4-(3,4-二羟基苯基)-5-苯基噻唑-2-基)-3,4-二羟基苯甲酰胺)的化合物：

[0027]

[0028] COH29和它的合成描述于整体并入本文的美国专利号：7,956,076；8,372,983以及国际申请号：PCT/US 13/24490中。

[0029] 可向本文所述的癌症受试者，包括例如乳腺癌受试者、卵巢癌受试者、BRCA1缺陷性受试者、PARP1抑制剂抗性受试者或DNA损害性抗癌剂抗性受试者施用COH29。施用可在如本文阐述的治疗有效量下。

[0030] “BRCA1”是根据它的常见普通含义使用，并且是指具有相同或类似名称的蛋白质及其功能性片段和同源物。该术语包括重组或天然存在形式的BRCA1(例如乳腺癌1，早期发作；GI编号：1698399)或其维持BRCA1活性的变体(例如相较于BRCA1，在至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％活性内)。

[0031] “γ-Η2ΑΧ”是根据它的常见普通含义使用，并且是指具有相同或类似名称的蛋白质及其功能性片段和同源物。该术语包括任何重组或天然存在形式的γ-Η2ΑΧ(例如γ组蛋白H2AX；GI编号：4504253)或其维持γ-Η2ΑΧ活性的变体(例如相较于γ-Η2ΑΧ，在至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％活性内)。

[0032] “Rad51”是根据它的常见普通含义使用，并且是指具有相同或类似名称的蛋白质及其功能性片段和同源物。该术语包括任何重组或天然存在形式的Rad51(例如GI编号：49168602)或其维持Rad51活性的变体(例如相较于Rad51，在至少30％、40％、50％、60％、
70％、80％、90％、95％或100％活性内)。

[0033] “PARP1”是根据它的常见普通含义使用，并且是指具有相同或类似名称的蛋白质及其功能性片段和同源物。该术语包括任何重组或天然存在形式的PARP1(例如聚[ADP-核糖]聚合酶1；GI编号：156523968)或其维持PARP1活性的变体(例如相较于PARP1，在至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％活性内)。“PARP1抑制剂”是抑制PARP1(NAD+ADP-核糖基转移酶1)的活性的组合物(例如化合物、肽、蛋白质、核酸或抗体)。

[0034] “PARP1抑制剂”是通过抑制PARP1的活性或表达来有效治疗癌症的组合物(例如化合物、多肽、氨基酸、多核苷酸、核酸或抗体)。PARP1抑制剂的非限制性实例包括奥拉帕尼(olaparib)、维利帕尼(veliparib)、依尼帕尼(iniparib)和尼拉帕尼(niraparib)。

[0035] “DNA损害性抗癌剂”是通过损害DNA来有效治疗癌症的组合物(例如化合物、多肽、氨基酸、多核苷酸、核酸或抗体)。DNA损害性抗癌剂可为化学治疗剂。在实施方案中，DNA损害剂包括辐照(例如γ辐照)。DNA损害性抗癌剂的相互作用可直接的(例如与DNA自身结合或相互作用)或间接的(例如与和DNA相互作用的其它分子结合或相互作用)。在本文中，DNA损害性抗癌剂包括例如烷基化剂(例如氮丙啶、甲基蜜胺、亚硝基脲、氮芥、白消安、环磷酰胺和甲基苄肼)、抗代谢剂、蒽环霉素、基于铂的药剂、紫杉烷、激酶抑制剂、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂(HDAC)、拓扑异构酶抑制剂和核苷酸类似物。在实施方案中，DNA损害性抗癌剂包括插入在DNA碱基对之间或结合在DNA的小沟或大沟中的组合物。在实施方案中，DNA损害性抗癌剂是拓扑异构酶I药剂、喜树碱、伊立替康、拓扑替康、拓扑异构酶II药剂、顺铂、卡铂、奥沙利铂、亚德里亚霉素(adriamycin)(例如阿霉素(doxorubicin))、依托泊苷、单链断裂剂(例如BCNU(卡莫司汀)、CCNU(洛莫司汀))、DTIC(达卡巴嗪)、癌得星(Cytoxan)(环磷酰胺)、异环磷酰胺、博莱霉素和丝裂霉素C。

[0036] “化学治疗”或“化学治疗剂”是根据它的平常普通含义使用，并且是指具有抗赘生性质或抑制细胞生长或增殖的能力的化学组合物或化合物。

[0037] 抗癌药物顺铂已用于治疗各种人癌症，包括例如卵巢癌、睾丸癌、生殖细胞肿瘤、小细胞肺癌、淋巴瘤、头颈部癌和膀胱癌。在本文中，“基于铂的化合物”或“含有铂的药剂”是指含有由有机和/或无机官能基围绕的中心铂原子的化合物，其包括重金属络合物。包括在基于铂的化合物内的是基于铂的药物。基于铂的化合物的非限制性实例包括顺铂、卡铂、奈达铂(nedaplatin)、奥沙利铂、赛特铂(satraplatin)、三铂(triplatin)、四硝酸盐、其药学上可接受的盐、其立体异构体、其衍生物、其类似物及其组合。术语“顺铂”包括衍生物和类似物，诸如以引用的方式整体并入本文的美国专利号4,177,263、4,584,316、5,648,362和5,399,694中所述的那些。

[0038] 顺铂抗癌活性主要源于靶标细胞中的DNA交联，此需要涉及顺铂氯离子与亲核试剂基团的交换反应。顺铂通过与d(GpG)或d(ApG)序列形成链内加合物来在DNA中导致二齿损伤。顺铂也能够产生可干扰DNA复制的链间交联。损伤使DNA损害检查点活化，从而导致细胞周期进展阻滞。患者中形成继发性肿瘤代表与顺铂疗法相关的一个主要问题。顺铂的其它副作用可包括肾毒性、神经毒性、恶心、耳毒性、骨髓毒性和电解质不平衡。顺铂抗性也见于癌症患者中。

[0039] 术语“治疗(treating/treatment)”是指在治疗或改善损伤、疾病、病变或病状方面的任何成功迹象，包括任何客观或主观参数，诸如减轻；缓解；减弱症状或使得损伤、病变或病状更可为患者耐受；减缓退化或衰退速率；使得退化终点的致虚弱性较小；改进患者的身体或精神健康状态。对症状的治疗或改善可基于客观或主观参数；包括身体检查、神经精神病学测验和/或精神病学评估的结果。术语“治疗”及其变化形式包括预防损伤、病变、病状或疾病。

[0040] 如本文所用，术语“癌症”是指见于哺乳动物中的所有类型的癌症、赘瘤、恶性或良性肿瘤，包括白血病、癌瘤和肉瘤。示例性癌症包括乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、肾癌和胰腺癌。额外实例包括白血病(例如急性骨髓性白血病(“AML”)或慢性骨髓源性白血病(“CML”))、脑癌、肺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、肉瘤和前列腺癌、子宫颈癌、胃癌、头颈部癌、子宫癌、间皮瘤、转移性骨癌、神经管母细胞瘤、霍奇金氏病(Hodgkin's Disease)、非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多、原发性巨球蛋白血病、原发性脑肿瘤、恶性胰腺胰岛瘤、恶性类癌瘤、膀胱癌、恶变前皮肤病变、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、神经母细胞瘤、食道癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、内分泌和外分泌胰腺赘瘤。

[0041] 术语“白血病”广泛指代形成血液的器官的进行性恶性疾病，并且通常特征在于血液和骨髓中的白细胞和它们的前体的增殖和发育不正常。白血病通常基于以下加以临床分类：(1)疾病的持续时间和特性-急性或慢性；(2)涉及的细胞的类型-骨髓性(骨髓源性)、淋巴性(淋巴源性)或单核细胞性；以及(3)血液中的异常细胞的数目增加或不增加-白血病性或非白血性(亚白血病性)。鼠类白血病模型被广泛接受为可预测体内抗白血病活性。据信无论所治疗的白血病的类型如何，在P388细胞测定中测试为阳性的化合物都将通常展现一定抗白血病活性水平。因此，本发明包括一种治疗白血病的方法，包括治疗急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病、急性早幼粒细胞性白血病、成人T细胞白血病、非白血性白血病、白血性白血病、嗜碱粒细胞性白血病、母细胞白血病、牛白血病、慢性粒细胞性白血病、皮肤白血病、胚性白血病、嗜酸性粒细胞性白血病、格罗斯白血病(Gross'leukemia)、毛细胞白血病、血母细胞性白血病、造血母细胞性白血病、组织细胞性白血病、干细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、白细胞减少性白血病、淋巴细胞性白血病、淋巴母细胞性白血病、淋巴细胞性白血病、淋巴源性白血病、淋巴细胞性白血病、淋巴肉瘤细胞性白血病、肥大细胞白血病、巨核细胞白血病、小髓母细胞性白血病、单核细胞性白血病、髓母细胞白血病、骨髓性白血症、骨髓性粒细胞性白血病、髓单核细胞性白血病、内格利白血病、浆细胞白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞性白血病、早幼粒细胞性白血病、里德尔细胞白血病、席林氏白血病(Schilling's leukemia)、干细胞性白血病、亚白血病性白血病和未分化细胞性血病。

[0042] 术语“肉瘤”通常是指由如同胚性结缔组织的物质构成的肿瘤，并且通常由包埋在原纤维或均质物质中的紧密堆积的细胞组成。可用抗赘生硫醇结合线粒体氧化剂和抗癌剂的组合治疗的肉瘤包括软骨肉瘤、纤维肉瘤、淋巴肉瘤、黑肉瘤、粘液肉瘤、骨肉瘤、艾伯内西氏肉瘤(Abemethy's sarcoma)、脂肪肉瘤、脂肉瘤、腺泡状软组织肉瘤、釉母细胞性肉瘤、葡萄样肉瘤、绿色瘤肉瘤、绒毛膜癌、胚性肉瘤、韦尔姆斯氏肿瘤肉瘤(Wilms'tumor sarcoma)、子宫内膜肉瘤、基质肉瘤、尤因氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、筋膜肉瘤、纤维母细胞性肉瘤、巨细胞肉瘤、粒细胞性肉瘤、霍奇金氏肉瘤、特发性多发性色素沉着出血性肉瘤、B细胞的免疫母细胞性肉瘤、淋巴瘤、T细胞的免疫母细胞性肉瘤、詹森氏肉瘤(Jensen's sarcoma)、卡波西氏肉瘤、库普弗细胞肉瘤、血管肉瘤、白血病性肉瘤、恶性间质瘤肉瘤、骨膜外肉瘤、网织红细胞性肉瘤、劳斯肉瘤、浆液囊性肉瘤、滑膜肉瘤和毛细管扩张性肉瘤。

[0043] 术语“黑素瘤”用于意指由皮肤和其它器官的黑素细胞系统产生的肿瘤。可用抗赘生硫醇结合线粒体氧化剂和抗癌剂的组合治疗的黑素瘤包括例如肢端雀斑黑素瘤、无黑色素性黑素瘤、良性青少年黑素瘤、克劳德曼氏黑素瘤(Cloudman's melanoma)、S91黑素瘤、哈丁-帕西黑素瘤(Harding-Passey melanoma)、青少年黑素瘤、恶性小痣黑素瘤、恶性黑素瘤、结节性黑素瘤、甲下黑素瘤和浅表扩散性黑素瘤。

[0044] 术语“癌瘤”是指由倾向于浸润周围组织并导致转移的上皮细胞构成的恶性新生物。可用抗赘生硫醇结合线粒体氧化剂和抗癌剂的组合治疗的示例性癌瘤包括例如腺泡癌、腺泡状癌、腺囊性癌、腺样囊性癌、腺癌、肾上腺皮质癌、肺泡癌、肺泡细胞癌、基底细胞癌、基底细胞癌、基底细胞样癌、基底鳞状细胞癌、细支气管肺泡癌、细支气管癌、支气管源性癌、髓样癌(cerebriform carcinoma)、肝小胆管癌、绒膜癌、胶样癌、粉刺癌、子宫体癌、筛状癌、铠甲状癌、皮肤癌、柱状癌、柱状细胞癌、导管癌、硬癌(carcinoma durum)、胚性癌、脑样癌、表皮样癌、腺样上皮癌(carcinoma epitheliale adenoides)、外生性癌、溃疡性癌、纤维癌、凝胶样癌(gelatinifomi carcinoma)、凝胶状癌、巨细胞癌(giant cell carcinoma)、巨细胞癌(carcinoma gigantocellulare)、腺性癌、粒层细胞癌、毛发基质癌(hair-matrix carcinoma)、血样癌、肝细胞癌、许特莱细胞癌(Hurthle cell carcinoma)、透明癌、肾上腺样癌、婴儿胚性癌、原位癌、表皮内癌、上皮内癌、克龙派切尔氏癌(Krompecher's carcinoma)、库尔契茨基细胞癌(Kulchitzky-cell carcinoma)、大细胞癌、豆状癌(lenticular carcinoma)、豆状癌(carcinoma lenticulare)、脂瘤性癌、淋巴上皮癌、髓样癌(carcinoma medullare)、髓样癌(medullary carcinoma)、黑色素癌、软癌(carcinoma molle)、粘液癌(mucinous carcinoma)、粘液癌(carcinoma muciparum)、粘液细胞癌、粘液表皮样癌、粘液癌(carcinoma mucosum)、粘液癌(mucous carcinoma)、粘液瘤样癌(carcinoma myxomatodes)、鼻咽癌、燕麦细胞癌、骨化性癌、骨样癌、乳头状癌、门静脉周围癌、侵袭前癌、棘细胞癌、髓样癌(pultaceous carcinoma)、肾脏肾细胞癌、贮备细胞癌(reserve cell carcinoma)、肉瘤样癌、施奈德癌(schneiderian carcinoma)、硬癌(scirrhous carcinoma)、阴囊癌、印戒细胞癌、单纯癌、小细胞癌、马铃薯状癌、球状细胞癌、梭形细胞癌、海绵样癌、鳞状癌、鳞状细胞癌、绳捆癌(string carcinoma)、血管扩张性癌(carcinoma telangiectaticum)、血管扩张性癌(carcinoma telangiectodes)、移行细胞癌、结节性癌(carcinoma tuberosum)、结节性癌(tuberous carcinoma)、疣状癌(verrucous carcinoma)和绒毛状癌。

[0045] “癌症模型生物体”是展现指示癌症的表型或在生物体内展现致癌要素的活性的生物体(例如癌细胞系)。癌症模型生物体可展现如本文所述的癌症的表型。因此，癌症模型生物体可为例如对PARP1抑制剂具有抗性，或对DNA损害性抗癌剂具有抗性的缺乏BRCA1的癌细胞系。广泛多种生物体可充当癌症模型生物体，并且包括例如癌细胞和哺乳动物生物体，诸如啮齿动物(例如小鼠或大鼠)和灵长类动物(诸如人)。癌细胞系被本领域技术人员广泛理解为与体内癌展现类似表型或基因型的细胞。如本文所用的癌细胞系包括来自动物(例如小鼠)以及来自人的细胞系。

[0046] “抗癌剂”是根据它的平常普通含义使用，并且是指具有抗赘生性质或抑制细胞生长或增殖的能力的组合物(例如化合物、多肽、氨基酸、多核苷酸、核酸或抗体)。在一些实施方案中，抗癌剂是化学治疗剂。在一些实施方案中，抗癌剂是本文鉴定的在治疗癌症的方法中具有效用的药剂。在一些实施方案中，a抗癌剂是由FDA或除美国以外的国家的类似管理机构核准用于治疗癌症的药剂。抗癌剂可对某些癌症或某些组织具有选择性。

[0047] 如本文所用，术语“施用”意指口服施用，以栓剂形式施用，经表面接触，静脉内、胃肠外、腹膜内、肌肉内、病变内、鞘内、鼻内或皮下施用，或向受试者中植入缓慢释放装置，例如小型渗透泵。施用是通过任何途径来达成，包括胃肠外和经粘膜(例如经颊、舌下、经腭、经齿龈、经鼻、经阴道、经直肠或经皮)。胃肠外施用包括例如静脉内、肌肉内、小动脉内、皮内、皮下、腹膜内、室内和颅内。其它递送模式包括但不限于使用脂质体制剂、静脉内输注、经皮贴片等。

[0048] 就“共同施用”来说，其意指在施用一种或多种额外疗法的同时，就在此举之前或就在此举之后施用本文所述的组合物。举例来说，可向患者单独施用COH29，或可向患者共同施用COH29。共同施用意图包括个别地或以组合形式(超过一种化合物或药剂)同时或依序施用化合物。因此，当需要时，也可使制剂与其它活性物质组合(例如以降低代谢降解)。

[0049] 本文公开的组合物可配制成涂敷棒、溶液剂、混悬剂、乳液、凝胶剂、乳膏剂、软膏剂、糊剂、胶状物、涂剂、粉剂和气雾剂，通过经表面途径来经皮递送。口服制剂包括适于由患者摄取的片剂、丸剂、粉剂、糖衣片、胶囊、液体、糖锭、扁囊剂、凝胶剂、糖浆、浆液、混悬液等。固体形式制剂包括粉剂、片剂、丸剂、胶囊、扁囊剂、栓剂和可分散颗粒剂。液体形式制剂包括溶液、混悬液和乳液，例如水溶液或水/丙二醇溶液。本发明的组合物可另外包括用以提供持续释放和/或舒适性的组分。所述组分包括高分子量阴离子拟粘液聚合物、胶凝性多糖和精细分散的药物载体基质。这些组分更加详细讨论于美国专利号4,911,920；5,403,841；5,212,162；和4,861,760中。这些专利的整个内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。本文公开的组合物也可以微球体形式递送以达成在体内缓慢释放。举例来说，微球体可通过皮内注射在皮下缓慢释放的含有药物的微球体(参见Rao,J.Biomater 
Sci.Polym.Ed.7:623-645,1995)；以可生物降解和可注射的凝胶制剂形式(参见例如Gao Pharm.Res.12:857-863,1995)；或以用于口服施用的微球体形式(参见例如Eyles,J.Pharm.Pharmacol.49:669-674,1997)来施用。在另一实施方案中，本发明的组合物的制剂可通过使用与细胞膜融合或被胞吞的脂质体来递送，即通过采用连接于脂质体的结合细胞的表面膜蛋白受体，从而导致胞吞作用的受体配体。通过使用脂质体，特别是当脂质体表面携带对靶标细胞具有特异性，或另外优先针对特定器官的受体配体时，可使本发明的组合物的递送在体内集中至靶标细胞中。(参见例如Al-Muhammed,J.Microencapsul.13:293-
306,1996；Chonn,Curr.Opin.Biotechnol.6:698-708,1995；Ostro,Am.J.Hosp.Pharm.46:
1576-1587,1989)。组合物也可以纳米粒子形式递送。

[0050] “有效量”是相对于在不存在化合物下，所述化合物的足以实现陈述的目的的量(例如实现它被施用所用于达成的效应，治疗疾病，降低酶活性，增加酶活性，减弱信号传导路径，或减轻疾病或病状的一种或多种症状)。“治疗有效量”的一实例是足以促进对疾病的一种或多种症状的治疗、预防或减轻的量，其也可被称为“治疗有效量”。“减轻”一种或多种症状(以及这个短语的语法等效形式)意指降低所述症状的严重性或发生次数，或消除所述症状。精确量将取决于治疗目的，并且将可由本领域技术人员使用已知技术确定(参见例如Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(第1-3卷,1992)；Lloyd,The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)；Pickar,Dosage Calculations(1999)；以及Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第20版,2003,Gennaro编,Lippincott,Williams&Wilkins)。

[0051] 向哺乳动物施用的剂量和频率(单次或多次剂量)可视多种因素而变化，例如所述哺乳动物是否罹患另一疾病以及它的施用途径；接受者的身材、年龄、性别、健康状况、体重、身体质量指数和膳食；所治疗的疾病的症状的性质和程度、并行治疗的种类、由所治疗的疾病所致的并发症或其它健康相关问题。其它治疗方案或药剂可与申请人的本发明的方法和化合物联合使用。调整和操作确立的剂量(例如频率和持续时间)完全属于本领域技术人员的能力。

[0052] 本文所述的治疗有效量可最初由细胞培养测定加以确定。靶标浓度将为活性化合物的能够实现本文所述的方法的那些浓度，如使用本文所述或本领域中已知的方法所测量。

[0053] 如本领域中所熟知，用于人中的治疗有效量也可由动物模型确定。举例来说，可配制用于人的剂量以实现已被发现在动物中有效的浓度。如上所述，可通过监测化合物有效性以及向上或向下调整剂量来调整人中的剂量。基于上述方法和其它方法调整剂量以在人中实现最大功效完全属于普通熟练技术人员的能力。

[0054] 剂量可视患者的需求和所采用的化合物而变化。在本发明的情形下，向患者施用的剂量应足以随时间在患者中实现有益治疗响应。剂量的大小也将由任何不利副作用的存在性、性质和程度决定。确定适于特定情况的剂量属于从业者的技能。通常，治疗以小于化合物的最优剂量的较小剂量启始。此后，以小增量增加剂量直至达到在各情况下的最优效应。剂量和间隔可个别地加以调整以提供施用化合物的对所治疗的特定临床适应症有效的水平。这将提供与个体的疾病状态的严重性相称的治疗方案。

[0055] 如本文所定义，关于蛋白质-抑制剂相互作用的术语“抑制(inhibition/inhibit/inhibiting)”等意指相对于在不存在抑制剂下蛋白质的活性或功能，负性影响(例如降低)蛋白质的活性或功能。当关于抑制某一基因使用时，“抑制”意指相对于在不存在抑制剂下所述基因的活性或表达，负性影响(例如降低)所述基因的活性或表达。在一些实施方案中，抑制是指减轻疾病或疾病的症状。在一些实施方案中，抑制是指降低特定蛋白质或核酸靶标的活性。因此，抑制至少部分地包括部分或完全阻断刺激，降低、阻止或延迟活化，或使信号转导或酶活性或蛋白质的量失活、脱敏或下调。

[0056] 术语“协同”、“协同作用”、“协同的”、“组合协同量”和“协同治疗作用”在本文中可互换使用，并且是指组合施用的化合物的测量作用，其中所述测量作用大于单独施用的各化合物的个别作用的总和。

[0057] 方法

[0058] 在第一方面的是一种治疗有需要的受试者的癌症的方法。所述方法包括向受试者施用有效量的COH29。受试者是如本文阐述的BRCA1缺陷性受试者、PARP1抑制剂抗性受试者或DNA损害性抗癌剂抗性受试者。因此，在实施方案中，受试者是BRCA1缺陷性受试者。受试者可为PARP1抑制剂抗性受试者。受试者可为DNA损害性抗癌剂抗性受试者。在实施方案中，受试者是BRCA1缺陷性受试者、PARP1抑制剂抗性受试者或DNA损害性抗癌剂抗性受试者中的至少一个。因此，受试者可为BRCA1缺陷性受试者以及PARP1抑制剂抗性受试者或DNA损害性抗癌剂抗性受试者中的至少一个(即癌症具有BRCA1缺陷和对PARP1抑制剂或DNA损害性抗癌剂中的至少一个的抗性)。

[0059] 在实施方案中，受试者是乳腺癌受试者、卵巢癌受试者、结肠癌受试者、肝癌受试者、肾癌受试者、肺癌受试者、非小细胞肺癌受试者、脑癌受试者、前列腺癌受试者、胰腺癌受试者、黑素瘤受试者、白血病受试者或肉瘤受试者。

[0060] 受试者可为乳腺癌受试者或卵巢癌受试者。受试者可为乳腺癌受试者。受试者可为卵巢癌受试者。受试者可为结肠癌受试者。受试者可为肝癌受试者。受试者可为肾癌受试者。受试者可为肺癌受试者或非小细胞肺癌受试者。受试者可为脑癌受试者。受试者可为前列腺癌受试者。受试者可为胰腺癌受试者。受试者可为黑素瘤受试者。受试者可为白血病受试者。受试者可为肉瘤受试者。

[0061] 癌症受试者(例如乳腺、卵巢、肺、前列腺或胰腺癌受试者)也可为BRCA1缺陷性受试者、PARP1抑制剂抗性受试者或DNA损害性抗癌剂抗性受试者中的至少一个。因此，在实施方案中，癌症受试者是BRCA1缺陷性受试者。在实施方案中，癌症受试者是PARP1抑制剂抗性受试者。在实施方案中，癌症受试者是DNA损害性抗癌剂抗性受试者。在实施方案中，癌症受试者是BRCA1缺陷性受试者和PARP1抑制剂抗性受试者。在实施方案中，癌症受试者是PARP1抑制剂抗性受试者和DNA损害性抗癌剂抗性受试者。在实施方案中，癌症受试者是BRCA1缺陷性受试者、PARP1抑制剂抗性受试者和DNA损害性抗癌剂抗性受试者。

[0062] 因此，在实施方案中，受试者是患有乳腺癌或卵巢癌的BRCA1缺陷性受试者。BRCA1缺陷性受试者可患有乳腺癌。BRCA1缺陷性受试者可患有卵巢癌。

[0063] 在实施方案中，受试者是患有乳腺癌或卵巢癌的PARP1抑制剂抗性受试者。PARP1抑制剂抗性受试者可患有乳腺癌。PARP1抑制剂抗性受试者可患有卵巢癌。

[0064] 在实施方案中，受试者是患有特征在于对至少一种包括但不限于顺铂、卡铂、奥沙利铂、亚德里亚霉素、米托蒽醌(mitoxantrone)、VP16、CPT11或喜树碱的DNA损害性抗癌剂具有抗性的癌症的DNA损害性抗癌剂抗性受试者。在实施方案中，受试者是患有乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌、脑癌、前列腺癌、胰腺癌、黑素瘤、白血病或肉瘤的DNA损害性抗癌剂抗性受试者。受试者可为患有乳腺癌的DNA损害性抗癌剂抗性受试者。受试者可为患有卵巢癌的DNA损害性抗癌剂抗性受试者。

[0065] 在实施方案中，受试者是BRCA1缺陷性受试者和PARP1抑制剂抗性受试者。受试者可为患有乳腺癌或卵巢癌的BRCA1缺陷性受试者和PARP1抑制剂抗性受试者。受试者可为患有乳腺癌的BRCA1缺陷性受试者和PARP1抑制剂抗性受试者。受试者可为患有卵巢癌的BRCA1缺陷性受试者和PARP1抑制剂抗性受试者。

[0066] 在实施方案中，受试者是BRCA1缺陷性受试者和DNA损害性抗癌剂抗性受试者。受试者可为患有乳腺癌或卵巢癌的BRCA1缺陷性受试者和DNA损害性抗癌剂抗性受试者。受试者可为患有乳腺癌的BRCA1缺陷性受试者和DNA损害性抗癌剂抗性受试者。受试者可为患有卵巢癌的BRCA1缺陷性受试者和DNA损害性抗癌剂抗性受试者。

[0067] 在实施方案中，受试者是PARP1抑制剂抗性受试者和DNA损害性抗癌剂抗性受试者。受试者可为患有乳腺癌或卵巢癌的PARP1抑制剂抗性受试者和DNA损害性抗癌剂抗性受试者。受试者可为患有乳腺癌的PARP1抑制剂抗性受试者和DNA损害性抗癌剂抗性受试者。受试者可为患有卵巢癌的PARP1抑制剂抗性受试者和DNA损害性抗癌剂抗性受试者。

[0068] 在实施方案中，受试者是BRCA1缺陷性受试者、PARP1抑制剂抗性受试者和DNA损害性抗癌剂抗性受试者。受试者可为患有乳腺癌或卵巢癌的BRCA1缺陷性受试者、PARP1抑制剂抗性受试者和DNA损害性抗癌剂抗性受试者。受试者可为患有乳腺癌的BRCA1缺陷性受试者、PARP1抑制剂抗性受试者和DNA损害性抗癌剂抗性受试者。受试者可为患有卵巢癌的BRCA1缺陷性受试者、PARP1抑制剂抗性受试者和DNA损害性抗癌剂抗性受试者。

[0069] 在实施方案中，癌症受试者是乳腺癌受试者和BRCA1缺陷性受试者、PARP1抑制剂抗性受试者或DNA损害性抗癌剂抗性受试者中的至少一个。因此，在实施方案中，乳腺癌受试者也是BRCA1缺陷性受试者。在实施方案中，乳腺癌受试者也是PARP1抑制剂抗性受试者。在实施方案中，乳腺癌受试者也是DNA损害性抗癌剂抗性受试者。乳腺癌受试者可为BRCA1缺陷性受试者和PARP1抑制剂抗性受试者(例如乳腺癌受试者患有具有BRCA1缺陷，并且对PARP1抑制剂具有抗性的癌症)。乳腺癌受试者可为BRCA1缺陷性受试者和DNA损害性抗癌剂抗性受试者(例如乳腺癌受试者患有具有BRCA1缺陷，并且对DNA损害性抗癌剂具有抗性的癌症)。乳腺癌受试者可为PARP1抑制剂抗性受试者和DNA损害性抗癌剂抗性受试者(例如乳腺癌受试者患有对PARP1抑制剂和DNA损害性抗癌剂具有抗性的癌症)。乳腺癌受试者可为BRCA1缺陷性受试者、PARP1抑制剂抗性受试者和DNA损害性抗癌剂抗性受试者(例如乳腺癌受试者患有具有BRCA1缺陷，并且对PARP1抑制剂和DNA损害性抗癌剂具有抗性的癌症)。

[0070] 在实施方案中，癌症受试者是卵巢癌受试者和BRCA1缺陷性受试者、PARP1抑制剂抗性受试者或DNA损害性抗癌剂抗性受试者中的至少一个。因此，在实施方案中，卵巢癌受试者也是BRCA1缺陷性受试者。在实施方案中，卵巢癌受试者也是PARP1抑制剂抗性受试者。在实施方案中，卵巢癌受试者也是DNA损害性抗癌剂抗性受试者。卵巢癌受试者可为BRCA1缺陷性受试者和PARP1抑制剂抗性受试者(例如卵巢癌受试者患有具有BRCA1缺陷，并且对PARP1抑制剂具有抗性的癌症)。卵巢癌受试者可为BRCA1缺陷性受试者和DNA损害性抗癌剂抗性受试者(例如卵巢癌受试者患有具有BRCA1缺陷，并且对DNA损害性抗癌剂具有抗性的癌症)。卵巢癌受试者可为PARP1抑制剂抗性受试者和DNA损害性抗癌剂抗性受试者(例如卵巢癌受试者患有对PARP1抑制剂和DNA损害性抗癌剂具有抗性的癌症)。卵巢癌受试者可为BRCA1缺陷性受试者、PARP1抑制剂抗性受试者和DNA损害性抗癌剂抗性受试者(例如卵巢癌受试者患有具有BRCA1缺陷，并且对PARP1抑制剂和DNA损害性抗癌剂具有抗性的癌症)。

[0071] 在实施方案中，癌症受试者是乳腺癌受试者、卵巢癌受试者、结肠癌受试者、肝癌受试者、肾癌受试者、肺癌受试者、非小细胞肺癌受试者、脑癌受试者、前列腺癌受试者、胰腺癌受试者、黑素瘤受试者、白血病受试者或肉瘤受试者。在实施方案中，癌症受试者是乳腺癌受试者或卵巢癌受试者。在实施方案中，癌症受试者是乳腺癌受试者。在实施方案中，癌症受试者是卵巢癌受试者。

[0072] 受试者可患有如本文所述的癌症，其中所述癌症展现BRCA1缺陷、对PARP1抑制剂的抗性或对DNA损害性抗癌剂的抗性中的至少一个。癌症可为乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌、脑癌、前列腺癌、胰腺癌、黑素瘤、白血病或肉瘤。癌症可为一种上文提及的具有BRCA1缺陷的癌症。癌症可为一种上文提及的对PARP1抑制剂具有抗性的癌症。癌症可为一种上文提及的对DNA损害性抗癌剂具有抗性的癌症。

[0073] 在实施方案中，癌症具有BRCA1缺陷以及对PARP1抑制剂的抗性或对DNA损害性抗癌剂的抗性中的至少一个。在实施方案中，癌症对PARP1抑制剂具有抗性，并且具有BRCA1缺陷或对DNA损害性抗癌剂的抗性中的至少一个。在实施方案中，癌症对DNA损害性抗癌剂具有抗性，并且具有BRCA1缺陷或对PARP1抑制剂的抗性中的至少一个。

[0074] 癌症可为乳腺癌或卵巢癌。癌症可为乳腺癌。癌症可为卵巢癌。癌症可为结肠癌。癌症可为肝癌。癌症可为肾癌。癌症可为肺癌或非小细胞肺癌。癌症可为脑癌。癌症可为前列腺癌。癌症可为胰腺癌。癌症可为黑素瘤。癌症可为白血病。癌症可为肉瘤。

[0075] 在实施方案中，施用COH29使癌症受试者(例如BRCA1缺陷性受试者、PARP1抑制剂抗性受试者或DNA损害性抗癌剂抗性受试者)中特定蛋白质的活性或表达降低。抑制可由COH-29结合靶标蛋白质所致，此可通过蛋白酶体募集来诱导蛋白质的降解。蛋白质水平变化转而可调节相应基因的表达样式。在实施方案中，COH29抑制受试者中PARP1、Rad51或BRCA1的活性或表达。可进行分析(例如微阵列分析)以鉴定由于COH29治疗而差异性表达的基因。因此，施用COH29可降低受试者中BRCA1蛋白活性或表达。施用COH29可降低受试者中PARP1蛋白活性或表达。施用COH29可降低受试者中Rad51蛋白活性或表达。受试者可为如本文所述的癌症受试者，包括其实施方案。在实施方案中，癌症受试者是乳腺癌受试者、卵巢癌受试者、结肠癌受试者、肝癌受试者、肾癌受试者、肺癌受试者、非小细胞肺癌受试者、脑癌受试者、前列腺癌受试者或胰腺癌受试者。癌症受试者可为乳腺癌受试者或卵巢癌受试者。

[0076] 在实施方案中，可将COH29治疗的BRCA1缺陷性受试者的RNA表达谱与COH29治疗的BRCA1+(例如完整BRCA1)癌症受试者的RNA表达谱进行比较。因此，在实施方案中，COH29在BRCA1缺陷性受试者中比在BRCA1+癌症受试者中在更大程度上抑制蛋白质的活性或表达。因此，在实施方案中，COH29在BRCA1缺陷性受试者中比在BRCA1+癌症受试者中在更大程度上抑制PARP1。COH29可在BRCA1缺陷性受试者中比在BRCA1+癌症受试者中在更大程度上抑制Rad51。在实施方案中，COH29通过合成致死性(synthetic lethality)来治疗BRCA1缺陷性受试者。BRCA1缺陷性受试者如本文所述，包括其实施方案。在实施方案中，BRCA1缺陷性受试者也是乳腺癌受试者或卵巢癌受试者。

[0077] 在实施方案中，施用COH29使癌(例如是BRCA1缺陷性或对PARP1抑制剂或DNA损害性抗癌剂中的任一者或两者具有抗性的癌)中特定蛋白质的活性或表达降低。抑制可由COH-29结合靶标蛋白质所致，此可通过蛋白酶体募集来诱导蛋白质的降解。蛋白质水平变化转而可调节相应基因的表达样式。在实施方案中，COH29抑制癌中PARP1、Rad51或BRCA1的活性或表达。可进行分析(例如微阵列分析)以鉴定由于COH29治疗而差异性表达的基因。因此，施用COH29可降低癌中BRCA1蛋白活性或表达。施用COH29可降低癌中PARP1蛋白活性或表达。施用COH29可降低癌中Rad51蛋白活性或表达。癌症可为如本文所述的癌症，包括其实施方案。在实施方案中，癌症是乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌、脑癌、前列腺癌或胰腺癌。癌症可为乳腺癌或卵巢癌。

[0078] 在实施方案中，可将用COH29治疗的BRCA1缺陷性癌的RNA表达谱与用COH29治疗的BRCA1+癌的RNA表达谱进行比较。因此，在实施方案中，COH29在BRCA1缺陷性癌症中比在BRCA1+癌症中在更大程度上抑制蛋白质的活性或表达。COH29可在BRCA1缺陷性癌症中比在BRCA1+癌症中在更大程度上抑制PARP1。COH29可在BRCA1缺陷性癌症中比在BRCA1+癌症中在更大程度上抑制Rad51。在实施方案中，COH29通过合成致死性来治疗BRCA1缺陷性癌症。癌症可为如本文所述的癌症，包括其实施方案。癌症可为乳腺癌或卵巢癌。

[0079] COH29可通过合成致死性来展现对BRCA1缺陷性人癌症的特异性。因此，在实施方案中，COH29治疗BRCA1缺陷性受试者，包括其实施方案。在实施方案中，合成致死性由抑制BRCA1缺陷性癌中的第二蛋白质引起。第二蛋白质可为PARP1。可将具有BRCA1缺陷的癌的表达谱与BRCA1+癌细胞进行比较。在实施方案中，COH29使BRCA1缺陷性癌中的PARP1活性降低约10％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。因此，在实施方案中，相比于BRCA1+癌细胞中，COH29以更大功效抑制BRCA1缺陷性癌细胞中的PARP1活性。在实施方案中，COH29使BRCA1缺陷性癌中的PARP1表达降低约5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、
90％、95％或100％。因此，在实施方案中，相比于BRCA1+癌细胞中，COH29以更大功效抑制BRCA1缺陷性癌细胞中的PARP1表达。

[0080] 施用COH29可抑制受试者中的DNA修复。施用COH29可抑制碱基切除修复(BER)(例如通过例如使用特定糖苷酶移除受损害的碱基以修正由于氧化、烷基化、脱氨和脱嘌呤/脱嘧啶损害而产生的碱基损伤来修复受损害的DNA)。施用COH29可抑制核苷酸切除修复(NER)(例如通过移除短单链DNA区段来修正产生庞大DNA加合物的DNA损害，诸如由UV暴露所致的损害)。施用COH29可抑制受试者中的双链DNA断裂修复(例如使用非同源性末端接合(NHEJ路径)、微同源介导的末端接合(MMEJ)路径，或通过同源性重组(HR))。施用COH29可抑制受试者中的碱基切除修复、核苷酸切除修复或双链DNA断裂修复。

[0081] 在实施方案中，可通过检测例如像ATM、foxo3、γ-Η2ΑΧ、p53或Rad51的蛋白质的经调节活性或表达来评估COH29的基因毒性概况以及因此它活化DNA损害检查点和诱导DNA损害的能力。

[0082] 调节可为蛋白质的活性或表达增加或蛋白质的活性或表达降低。因此，在实施方案中，施用COH29使受试者中的γ-Η2ΑΧ活性或表达增加。在实施方案中，施用COH29使受试者中的γ-H2AX活性或表达增加。施用COH29可使受试者中的γ-H2AX活性或表达增加至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍或20倍。γ-Η2ΑΧ活性或表达增加可指示对DNA损害检查点的活化和对DNA损害的诱导。在实施方案中，施用COH29使如本文所述的癌(包括其实施方案)中的γ-Η2ΑΧ活性或表达增加。在实施方案中，施用COH29使如本文所述的癌(包括其实施方案)中的γ-Η2ΑΧ活性或表达增加。在实施方案中，施用COH29使三重阴性乳腺癌中的γ-Η2ΑΧ活性或表达增加。因此，在实施方案中，施用有效量的COH29治疗三重阴性乳腺癌。

[0083] COH29可抑制DNA双链断裂(DSB)修复。DSB可通过例如同源性重组(HR)或非同源性末端接合(NHEJ)路径来修复。在实施方案中，COH29抑制HR。在实施方案中，COH29抑制NHEJ路径。可通过抑制HR修复中涉及的蛋白质(例如像BRCA1和Rad51)的蛋白质水平来延长DNA损害响应。在实施方案中，施用COH29使受试者中或癌中的Rad51活性或表达降低。在实施方案中，施用COH29使受试者中或癌中的BRCA1活性或表达降低。在实施方案中，受试者中或癌中的BRCA1或Rad51的表达得以降低。在实施方案中，受试者中或癌中的BRCA1和Rad51的表达得以降低。

[0084] 在另一方面的是一种治疗有需要的受试者的癌症的方法。所述方法包括以组合协同量施用COH29和DNA损害性抗癌剂。在实施方案中，受试者如本文所述，包括其实施方案。因此，在某些实施方案中，受试者是BRCA1缺陷性受试者或PARP1抑制剂抗性受试者。受试者可为BRCA1缺陷性受试者。受试者可为PARP1抑制剂抗性受试者。

[0085] 癌症可为乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌、脑癌、前列腺癌、胰腺癌、黑素瘤、白血病或肉瘤。癌症可为乳腺癌或卵巢癌。因此，在实施方案中，受试者是乳腺癌受试者或卵巢癌受试者。受试者可为乳腺癌受试者。受试者可为卵巢癌受试者。受试者也可展现一种或多种如本文所述的表型或基因型，包括其实施方案(例如乳腺癌受试者也可为BRCA1缺陷性受试者或DNA损害性抗癌剂抗性受试者)。在实施方案中，受试者是BRCA1缺陷性受试者和DNA损害性抗癌剂抗性受试者。受试者可患有对DNA损害性抗癌剂具有抗性的癌症。本文方法可通过共同施用有效量的COH29来提供对癌症的治疗，所述癌症对至少一种DNA损害性抗癌剂具有抗性。

[0086] 在实施方案中，DNA损害性抗癌剂是化学治疗性DNA损害剂。DNA损害性抗癌剂可为烷基化剂。DNA损害性抗癌剂可为如本文所述的抗代谢剂，包括其实施方案。DNA损害性抗癌剂可为蒽环霉素。DNA损害性抗癌剂可为基于铂的药剂。DNA损害性抗癌剂可为紫杉烷。DNA损害性抗癌剂可为激酶抑制剂。DNA损害性抗癌剂可为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂。DNA损害性抗癌剂可为拓扑异构酶抑制剂。DNA损害性抗癌剂可为核苷酸类似物。在实施方案中，在DNA损害性癌症药剂和COH29存在下，对癌症的抑制得以协同增加。

[0087] 在实施方案中，治疗方法包括以合成致死性抑制至少两种蛋白质。至少一种蛋白质可为BRCA1。至少一种蛋白质可为Rad51。至少一种蛋白质可为PARP1。在实施方案中，对PARP1的抑制可在BRCA1缺陷性受试者中。在实施方案中，在DNA损害性抗癌剂和COH29存在下，对PARP1的抑制得以协同增加。DNA损害性抗癌剂可为吉西他滨、γ辐照或顺铂，包括它的如本文阐述的衍生物。

[0088] DNA损害性抗癌剂可为顺铂，包括它的如本文所述的衍生物。在实施方案中，施用COH29使顺铂的细胞毒性增加至大于顺铂在单独施用时的细胞毒性的水平(例如以组合协同量一起施用COH29和顺铂)。顺铂是一种广泛使用的化学治疗剂，其抗癌活性主要归因于靶标细胞中的DNA交联。因此，在实施方案中，共同施用COH29和顺铂导致的癌细胞可存活性降低大于在单独施用COH29或顺铂时的癌细胞可存活性降低(例如以组合协同量一起施用COH29和顺铂)。

[0089] DNA损害性抗癌剂可为吉西他滨。在实施方案中，共同施用COH29和吉西他滨导致的癌细胞可存活性降低大于在单独施用COH29或吉西他滨时的癌细胞可存活性降低(例如以组合协同量一起施用COH29和吉西他滨)。DNA损害性抗癌剂可为γ辐照。在实施方案中，施用COH29以及用γ辐照治疗导致的癌细胞可存活性降低大于在单独施用COH29或γ辐照时的癌细胞可存活性降低。COH29可在用γ辐照治疗之前、期间或之后施用。实施例

[0090] DNA损害性药物的功效受细胞DNA修复能力高度影响和调节(9)。实际上，小分子DNA修复抑制剂已在临床前研究中与常规化学疗法药物组合(18)，从而指示DNA修复机构是新型癌症治疗的有前途靶标。此外，PARP抑制剂已在临床试验中与铂化学疗法组合(19,20)。与这些报道一致，尤其发现COH29增强细胞对顺铂的敏感性，尤其在BRCA1缺乏性细胞中。这表明COH29合成致死性依赖于HR缺乏性细胞中的NER或BER。因此，在不受任何特定理论束缚下，我们提出COH29干扰若干DNA修复路径(NER、BER和HR)会促进在存在或不存在顺铂下在BRCA1缺乏性细胞中观察的细胞毒性。因此，COH29可作为有效力的DNA修复抑制剂加以利用。

[0091] 所有细胞系都从美国典型培养物保藏中心(American  Type  Culture Collection，Manassas,VA,USA)获得。将细胞在37℃下于5％CO2中维持在具有10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺以及每毫升培养基100U青霉素和100μg链霉素(Sigma)的RPMI 1640培养基(Mediatech)中。为分离HCC1937+BRCA1细胞，用表达全长BRCA1cDNA的pcDNA3.1质粒转染亲本HCC1937细胞。选择稳定转染子克隆，并且用于药物敏感性测定。对于稳定转染，根据制造商说明书，使用 6转染试剂(Roche Molecular Biochemical,Monza,Italy)使
在30-40％汇合下的细胞与2mg质粒DNA一起孵育过夜。接着在嘌呤霉素(1μg/ml)
(Invitrogen Life Technologies,La Jolla,CA,USA)中选择细胞。在20至30天之后，扩增并筛选由HCC1937转染获得的有活力的嘌呤霉素抗性菌落。通过蛋白质印迹分析来测定稳定表达嘌呤霉素，并且保留生长潜力的克隆的BRCA1表达。通过蛋白质印迹分析，我们评估BRCA1表达在嘌呤霉素抗性cDNA/转染子细胞中的恢复。这些经转染细胞显示BRCA1蛋白表达增加，从而表明蛋白质表达的有效恢复。

[0092] 在City of Hope合成和纯化COH29。γ-Η2AX购自cell signaling(Danvers,MA,USA)。Rad51购自Novus(Littleton,CO,USA)。β-肌动蛋白来自Millipore(Billerica,MA,USA)。对FOXO3(H-144和N-16，1:1000)、磷酸H2AX丝氨酸-139(γ-Η2ΑΧ，1:1,000)、磷酸p53丝氨酸-15(p53-pS15，1:1,000)、Rad51(1:1000)、β-微管蛋白(1:1000)、核纤层蛋白A/C(1:2000稀释度)、PARP具有特异性的抗体以及抗小鼠和抗兔IgG从Santa  Cruz Biotechnology(Santa Cruz,CA,USA)获得。针对FOXO3(1:1,000)和磷酸ATM丝氨酸-1981(ATM-pS1981，1:1,000稀释度)的Ab分别从Epitomics(Burlingame,CA)和Millipore(Billerica,MA)获得。针对p53-pS15的Ab购自Cell Signaling Technology(Danvers,MA)。
抗p27Kip1Ab购自BD PharMingen(San Diego,CA)。Alexa 488(绿色)和Alexa 594(红色)缀合的二级Ab从Molecular Probes(Eugene,OR)获得。抗兔IgG(完整分子)-FITC抗体购自Sigma(St.Louis,MO,USA)。RHODAMINE RED-XTM山羊抗小鼠IgG购自Invitrogen(Carlsbad,CA,USA)。

[0093] 如先前所述进行免疫荧光实验(21,22)。具体来说，使A549细胞在玻璃盖片上生长。在用COH29(1或10μΜ)处理24或48小时之后，用4％多聚甲醛固定细胞10分钟，并且用TRITONTM X-100(0.5％)进行可渗透化处理。盖片用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤，并且用含有2％牛血清白蛋白(BSA)的PBS阻断，与对FOXO3或ATM-pS1981或γ-Η2ΑΧ或p53-pS15具有特异性的Ab(1:50-1:200稀释度)一起孵育，随后与Alexa 488缀合的抗兔或抗小鼠(1:
200)、Alexa 594缀合的抗山羊(1:100)二级Ab(Molecular Probes)一起孵育。使细胞与4',
6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI；Sigma)一起孵育以使核染色。观察特异性染色，并且用Leica SP2AOBS共焦激光扫描显微镜捕集图像。为测量灶阳性细胞，我们使用约300个通过共焦显微术随机捕集的细胞。由含有至少5个灶的细胞计算视为灶阳性细胞的百分比。呈现的各误差棒是标准偏差的平均值。

[0094] 对于亚细胞分级分离，用胰蛋白酶处理细胞，并且用冷PBS溶液洗涤两次。在1,200g下离心5分钟之后，在冰上于补充有蛋白酶抑制剂(各自5μg/ml的抑肽素(pepstatin)、亮肽素(leupeptin)和抑蛋白酶肽(aprotinin))和磷酸酶抑制剂，含有0.2％NONIDETTM P-
40(NP-40)的缓冲液(50mM HEPES(pH 7.5)、150mM NaCl、1mM EDTA)中孵育细胞5分钟。在1,
000g下离心5分钟之后，收集上清液(即细胞质部分)，并且用相同缓冲液洗涤集结块两次。
在冰上用含有0.5％NP-40的分级分离缓冲液提取洗涤样品达40分钟以获得核部分。所有样品都加以超声处理，并且通过在16,000g下离心15分钟来澄清化。所有部分的蛋白质浓度都用Bio-Rad蛋白质测定(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)加以测定。如先前所述进行免疫印迹(21,22)。简要来说，使等量的煮沸蛋白质样品经受SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，并且转移于硝化纤维素膜(Bio-Rad Laboratories)上。将膜在含3％BSA的含有
0.05％吐温20(Tween 20)的Tris缓冲盐水(TBST)中阻断1小时，并且与在含有1％BSA的TBST中稀释的初级抗体(1:500或1:1000)一起孵育1小时。在用TBST洗涤2次之后，使膜与辣根过氧化物酶缀合的二级Ab(1:3000稀释度)一起在室温下孵育1小时。用West-Q化学发光试剂盒(GenDEPOT,Barker,TX)观察胶片上的免疫印迹。

[0095] 通过与MTT一起孵育以及用微板读取器在560nm的波长下监测由活细胞形成的MTT甲臜来进行MTT细胞毒性测定；使用下式确定存活率：

[0096] (A测试–A空白)/(A对照–A空白)x 100％。使用半自动基于荧光的数字成像显微术系统(DIMSCAN)在96孔板中测定细胞毒性。DIMSCAN使用数字成像显微术来定量选择性积累FDA(二乙酸荧光素；Alfa Aesar,Ward Hill,MA)的活细胞。DIMSCAN能够在通过数字定限和曙红Y(eosin Y)(Mallinckrodt Baker,Center Valley,PA)淬灭来消除本底荧光之后，通过定量每孔总荧光(其与活细胞的数目成比例)来历经4对数动态范围测量细胞毒性。视细胞系生长速率而定，将细胞于100μL完全培养基中在每孔2,000至5,000个细胞下接种至96孔板中。在过夜孵育之后，将测试化合物于50μL培养基中在各种浓度下添加至各孔中。在37℃下与药物一起孵育96小时之后，添加FDA(最终浓度：10mg/mL)和曙红Y[最终浓度：0.1％(w/v)]至各孔中，并且在37℃下再孵育细胞20分钟。接着使用DIMSCAN测量每孔总荧光，并且将结果表示为处理孔中的荧光与未处理孔中的荧光的比率(存活分数)。

[0097] 原位肿瘤模型。根据由City of Hope的IACUC核准的方案进行小鼠实验。因为HCC1937和HCC1937+BRCA1细胞形成缓慢生长肿瘤，所以使用MATRIGELTM(Becton-Dickinson 6 TM
Biosciences)将它们进行植入。为产生肿瘤，将4x 10个细胞于200μL含有50％MATRIGEL的无血清培养基中注射至一对8周龄雌性NSG小鼠的腹股沟区域周围的乳腺脂肪垫中。一旦初始肿瘤达到直径13mm，即将它们解剖出，切碎成3mm块段，并且植入实验小鼠的乳腺脂肪垫的腹股沟区域中。历经28天时期测量肿瘤，并且对于各时间点，史都登t检验(student t-test)用于确定用含400mg/kg COH29的30％聚乙二醇硬脂酸酯(solutol)每日管饲与相应媒介物对照之间的统计显著性。小于0.05的p值(双侧)被视为指示统计显著性。

[0098] 产生EJ2细胞以通过监测GFP的荧光强度来评估Alt-NHEJ，并且EJ5细胞用于如先前所述测定NJEJ。(23)将细胞接种至6孔板中，并且用COH29或顺铂在不同浓度下处理24小时。接着用胰蛋白酶处理细胞，洗涤，并且通过流式细胞计量术来分析。

[0099] 如先前所述进行抗人BRCA1siRNA表达性质粒的构建(24)。因此，利用先前公布的抗人BRCA1siRNA序列(5’-UCACAGUGUCCU  UUAUGUA-3’[SEQ  ID NO:1]和5’-UACAUAAAGGACACUGUGA-3’[SEQ ID NO:2])。在各情况下，将编码siRNA的退火寡核苷酸双链体亚克隆至表达载体psiRNA-hHlzeo(InvivoGen,San Diego,CA,USA)中以在RNA聚合酶III依赖性H1RNA启动子的控制下进行表达。通过电穿孔，用指示的质粒在等摩尔浓度下转染细胞。

[0100] 使用 微型试剂盒(Qiagen Inc.)分离总RNA。以DNA酶I处理来移除基因组DNA污染。通过1％琼脂糖凝胶(SeaKem,FMC,Rockland,ME,USA)电泳或用Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)来考查分离的RNA的完整性。通过紫外分光光度测定法来确定RNA浓度(A260/A280比率)。使用MMLV逆转录酶和作为引物的随机六聚体(Invitrogen)，从总RNA制备cDNA。通过实时PCR，使用cDNA样品来定量基因表达。
针对BRCA1的引物购自APPLIED Foster City,CA,USA。根据APPLIED
指导方针(PRIMER 软件；APPLIED )设
计针对18S和β-肌动蛋白的额外引物和探针以符合实时PCR要求。引物的序列是

[0101] AGGAATTGCGGGAGGAAAATGGGT(SEQ ID NO:3)和

[0102] GCCCCCTGAAGATCTTTCTGTCCT(SEQ ID NO:4)。

[0103] 根据制造商方案，使用PARP1化学发光测定试剂盒(BPS Bioscience,San Diego)测定PARP1活性。简要来说，使用测试抑制剂、阳性对照、底物对照和空白反应，在25℃下用活化的DNA在PARP测定缓冲液中进行核糖基化反应1小时。通过抗生蛋白链菌素-HRP来检测，其中在光度计中读取化学发光底物A和B。

[0104] 斑马鱼(Zebrafish/Danio rerio)从台北医学大学的斑马鱼核心研究室(zebrafish Core facility of Taipei Medical University)获得，并且按照14小时光照/10小时黑暗循环维持在28℃下。在28℃下孵育胚胎，并且如所述确定不同发育阶段(25)。在20hpf时用不同浓度的HU(0、5、10、20、50mM)或COH29(0、10、20、50、100μΜ)处理野生型胚胎以评估诱变效应。每个孔条件处理15个胚胎。在2、3、4、5和6dpf时观察处理的胚胎。在6dpf时，测定展现发育异常的鱼的百分比和存活率。使用Olympus LX70-FLA倒置荧光显微镜观察胚胎。使用SPOT数字照相机系统(Diagnostic Instruments,Sterling Heights,Michigan,USA)获取图像，并且用ImageJ软件集合(26)。

[0105] 使用 GENOMICS SUITETM(6.6版；Partek,Inc.)对微阵列样品进行RMA标准化(27)，并且如果基因显示至少1.2倍变化和<0.05的假发现率(FDR)，那么它们被确定为差异性表达。使用Benjamini和Hochberg(28)的方法，由关于线性对比p值的ANOVA分布计TM
算FDR值。在 GENOMICS SUITE 内进行基因本体论(GO)(29)富集分析，并且以费
雪精确检验(Fisher Exact test)p值<0.05将GO种类确定为显著。

[0106] 基于Ivshina等人研究，使用 U133A&B(GSE4922)，由对289个石蜡包埋的乳腺癌肿瘤样品的基因表达剖析来确定RRM2-PARP1关联分析。(30)使用
Bioconductor R程序包(64位，v 3.0.2)进行统计分析(31)。使用斯皮尔曼氏秩关联(Spearman's rank correlation)进行关联分析。P<0.05和r>0.5的水平被视为统计显著。

[0107] 如先前所公布(26)，在修改下进行含有SV40复制起点的pSVO+质粒的体外复制。最终25μL反应体积含有30mM HEPES(pH＝7.2)、7mM MgCl2、0.5mM DTT、5μCi[α-32P]-dCTP、1μΜdCTP、各自100μΜdTTP、dCTP和dGTP、各自200μΜCTP、UTP和GTP、4mM ATP、40mM磷酸肌酸、50μg肌酸磷酸激酶、50ng pSVO+、0.1-1.0μg T Ag(通过滴定测定确定的最优浓度)和最优量的HeLa提取物(通过滴定测定所确定)(Chimerx；Milwaukee,WI)。为定量DNA复制抑制，在开始反应之前使HeLa提取物与递增浓度的COH29一起孵育30分钟。添加HeLa-化合物混合物至其余SV40DNA复制组分中，在37℃下孵育1小时，在 DE81滤纸上点样，用
100mM焦磷酸钠(pH 7.4)和300mM甲酸铵(pH 7.4)洗涤，接着干燥。接着通过液体闪烁计数来测定并入新合成的子代DNA链中的放射性标记的物质的量。

[0108] 在不受任何特定理论束缚下，COH29抗癌活性可至少部分地源于抑制人核糖核苷酸还原酶(hRR)，其是一种用于生物合成脱氧核糖核苷酸来达成DNA复制的酶。此外，作为碱基切除修复复合物的组分，核糖核苷酸还原酶也涉及于DNA修复中。因此，在实施方案中，在本文中发现COH29靶向修复复合物的若干额外组分。此外，在实施方案中，BRCA1缺陷性人乳腺癌或卵巢癌细胞比野生型BRCA1对应物对COH29更敏感。在实施方案中，在BRCA1突变细胞中，COH29展现与诸如顺铂的DNA交联药物协同。在实施方案中，在本文中发现COH29抑制RAD51，在不受任何特定理论束缚下，RAD51涉及于通过同源性重组(HR)路径对双链断裂(DSB)的修复中。在实施方案中，COH29靶向多个DNA修复路径，并且潜在调节由遗传背景(突变)所致的备用DNA修复。在实施方案中，COH29可克服对PARP抑制剂(例如PARP1抑制剂)的获得性抗性。在药理学上，以及在不受任何特定理论束缚下，在本文中发现COH29抑制吉西他滨抗性人癌细胞增殖，并且与顺铂或γ辐照协同。

[0109] COH29是一种芳族取代的噻唑化合物，在不受任何特定理论束缚下，其占据hRRM2亚单位上位于hRRM1/hRRM2界面处的在结构上保守的配体结合袋。在实施方案中，与这个袋的结合抑制hRRM1/hRRM2装配，从而有效抑制RR活性。在体外，在多个人癌细胞系中，COH29是活性的，并且显示其是高度有效力的，其中在大多数情况下IC50小于10μΜ。已显示COH29在NCI-60细胞系组中具有广泛活性，并且多个人乳腺癌细胞系(包括例如人卵巢癌细胞系)对COH29敏感(6)。乳腺癌和卵巢癌在突变BRCA1基因携带者中比在一般群体中以更大频率发生(32)。因此，在本文中，探究的是BRCA1缺陷性人癌细胞是否对COH29显示更大敏感性。实际上，如图1A中所示，由于纯合性2594delC突变而表达截短BRCA1蛋白的UWB1.289卵巢癌细胞系(33)比表达野生型BRCA1的OV90人卵巢癌细胞系(IC50：31.57±3.35μΜ)对COH29更敏感(IC50：12.30±1.15μΜ)。

[0110] 评估COH29在具有相同遗传背景，仅在BRCA1表达方面不同的乳腺癌细胞中的作用以确定突变BRCA1使细胞毒性增加的程度。首先，考查使BRCA1表达沉默的影响。HCC1937是导致内源性表达截短BRCA1蛋白的插入突变纯合性人乳腺癌细胞(34)，并且HCC1937+BRCA1是表达人野生型BRCA1蛋白的稳定转染子克隆。在这些细胞中，通过RNA干涉来抑制BRCA1表达。在用10μΜ COH29处理72小时之后，72％的用对照siRNA转染的HCC1937+BRCA1细胞存活。相比之下，仅53％的用BRCA1siRNA转染的细胞存活。通过比较HCC1937细胞和HCC1937+BRCA1细胞来探究恢复野生型BRCA1表达对COH29细胞毒性的影响。当用不同剂量的COH29处理72小时时，表达野生型BRCA1的细胞比BRCA1突变HCC1937细胞(IC50：7.25±0.64μΜ)对COH29的敏感性小得多(IC50：35.01±3.63μΜ)。实时逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)显示HCC1937+BRCA1细胞表达BRCA1的水平比HCC1937高约2.5倍。

[0111] 在原位肿瘤外植体模型中进一步确认BRCA1缺乏性细胞对COH29的敏感性。相较于媒介物，通过用400mg/kg COH29每日口服给药，植入小鼠乳腺脂肪垫中的HCC1937肿瘤的生长得以显著(p＝0.0007)抑制(图1B)。相比之下，COH29治疗小鼠中的用等基因HCC1937+BRCA1细胞产生的肿瘤不显著小于媒介物对照中(p＝0.1577；图1C)。

[0112] 也考查卵巢癌细胞中BRCA1突变对COH29处理响应的影响。UWB1.289+BRCA1是表达人野生型BRCA1基因的卵巢癌细胞的稳定转染子克隆，并且UWB1.289是用表达新霉素抗性基因的对照质粒转染的亲本细胞。用不同剂量的COH29处理这些细胞72小时。表达wt BRCA1的细胞对COH29的敏感性较小(IC50：对于UWB1.289+BRCA1和UWB1.289分别是23.52±2.38μΜ和12.30±1.15μΜ)。RT-PCR测定显示UWB1.289+BRCA1细胞表达的BRCA1的水平比UWB1.289高约3.08倍。这些结果表明在BRCA1缺陷性人癌细胞中，COH29可诱导更大致死性。COH29的额外药理学数据如表1和2所提供。特别重要的是发现COH29抑制对吉西他滨或顺铂具有抗性的各种人癌细胞的生长(表1)。

[0113] 专利

[0114] 代理人案号48440-541001WO

[0115]

[0116] 专利

[0117] 代理人案号48440-541001WO

[0118] 为鉴定COH29通过其来优先溶解BRCA1突变人癌细胞的机理，我们使用微阵列平台进行全基因组微阵列分析以鉴定受COH29
处理影响的基因表达谱和路径。将COH29处理的缺乏BRCA1的HCC1937乳腺癌细胞的RNA表达谱与COH29处理的HCC1937+BRCA1细胞的RNA表达谱进行比较。HCC1937-COH29细胞与HCC1937+BRCA1-COH29细胞两者均显示DNA修复基因的基因本体论(GO)富集(表1a；p值在
0.0046-0.0069的范围内)，从而表明COH29干扰DNA修复路径。举例来说，在HCC1937细胞中，DNA修复中涉及的DNA连接得以更强烈富集，此可与表型效应相关。在BRCA1野生型细胞中，COH29诱导DNA损害信号传导，并且抑制BRCA1和Rad51表达，从而表明COH29可抑制同源性重组(HR)路径以维持由COH29活化的DDR(DNA损害响应)诱导的双链断裂(DSB)。

[0119] 表1a.由于COH29处理而下调的基因的基因本体论富集

[0120]

[0121] 我们另外考查了公开可用的在乳腺癌和卵巢癌患者群组中进行的基因表达研究以验证RRM2与PARP1之间的基因表达关联。我们发现在Ivshina等人(30)的乳腺癌群组研究中(n＝289，P＝0，r＝0.56；图2A)，以及在来自Anglesio等人(35)的卵巢癌群组研究中的RRM2和PARP1基因表达关联分析中(n＝90，p＝0，r＝0.62；图2B)，在RRM2与PARP1之间存在强烈关联。未来在所选患者群组中的基因型-表型关联可有助于确定用COH29与传统乳腺和卵巢化学疗法组合进行靶向治疗的风险概况。

[0122] 为探究COH29通过其来优先溶解BRCA1突变人癌细胞的机理，我们设法鉴定靶标蛋白质。在不受任何特定理论束缚下，我们推理靶标蛋白质的表达谱可通过与COH29相互作用而受影响。举例来说，COH-29与靶标蛋白质结合可通过蛋白酶体募集来诱导它的降解。蛋白质水平变化转而可改变相应基因的表达样式。进行微阵列分析以鉴定由于COH29处理而差异性表达的基因。将COH29处理的缺乏BRCA1的HCC1937乳腺癌细胞的RNA表达谱与COH29处理的HCC1937+BRCA1细胞的RNA表达谱进行比较。差异性表达的基因的群集显示于图2A-2B中。

[0123] 为确定COH29是否抑制hPARP1，考查用或不用COH29处理4小时、8小时或24小时的细胞的溶解产物中的PARP1活性。在缺乏BRCA1的人乳腺癌HCC1937细胞中，24小时COH29孵育使PARP1活性降低41.08％(726177cps(针对未处理)对427851cps(针对COH29处理))，而在类似处理的含有BRCA1的HCC1937+BRCA1细胞中，它降低了12.66％(2336878cps(针对未处理)对2041097cps(针对COH-29处理))(图3A)。

[0124] 在UWB1.289人卵巢癌株系中，PARP1受COH29抑制更显著(图3A)。在8小时COH29处理之后，在缺乏BRCA1的UWB1.289细胞中，PARP1活性降低了31.79％(113559cps(针对未处理)对774611(针对COH29处理))，而在类似处理的表达wt BRCA1的UWB1.289+BRCA1细胞中，它升高了46.31％(145769cps(针对未处理)对2129944cps(针对COH29处理))。总之，这指示在BRCA1缺陷性人癌细胞中，COH29以更大功效抑制PARP1。

[0125] 也考查COH29对PARP1蛋白水平的影响。用COH29处理24小时使HCC1937BRCA1缺陷性乳腺癌细胞中的PARP1蛋白减弱，以及在较小程度上使HCC1937BRCA1wt细胞中的PARP1蛋白减弱(图3B)。对于4小时COH29处理，观察到少许降低。相比之下，ABT-888处理4小时导致HCC1937细胞中的PARP1显著降低，而与它们的BRCA1状态无关(图3B)。

[0126] 在BRCA1突变细胞背景下通过抑制PARP1实现的合成致死性可加强DNA损害性药物的细胞毒性。(18)在此处，我们探究在BRCA1缺陷性人癌细胞中，由COH29抑制PARP1是否增强顺铂的细胞毒性。顺铂是一种广泛使用的化学治疗剂，其抗癌活性主要归因于靶标细胞中的DNA交联。表达wt BRCA1的人乳腺癌株系HCC1937的稳定转染子(HCC1937+)或对照转染子(HCC1937)细胞用COH29和顺铂同时处理24小时。在用两种药物处理之后，当相较于HCC1937+BRCA1细胞时，在HCC1937细胞中存在可存活性显著降低(图4A)。并行进行的对照实验显示用单独COH29或单独顺铂进行单次处理对两种细胞系产生较小但类似的水平的影响(图4B；也参见表3)。在COH29与吉西他滨或γ辐照之间观察到额外协同(表2)。

[0127] 表2：COH29与各种抗赘生治疗剂的协同

[0128]

[0129] ND；未进行

[0130] 已知RR抑制性药物羟基脲具有基因毒性(36,37)。预期COH29具有类似结果，因为它也抑制RR。在人细胞中，所述损害使DNA损害检查点活化以停止细胞周期进展来允许有时间进行修复。在不受任何特定理论束缚下，由DNA损害引发的信号传导最初由‘共济失调-毛细血管扩张突变物’(ATM)和‘ATM和Rad 3相关物’(ATR)介导。Chk1和Chk2代表信号传导事件的下游激酶，其使Cdc25磷酸酶磷酸化。抑制Cdc25转而会抑制Cdk/周期素复合物，从而导致细胞周期阻滞(39)。为评估COH29处理对DNA损害检查点的作用，我们采用两种在p53状态方面不同的细胞系。COH29处理含有野生型p53的MCF7细胞使DNA损害检查点活化(图6左侧图版)，如由ATM的磷酸化所证实。下游激酶CHK1和CHK2也被磷酸化。在缺乏p53的MCF7细胞(MCF-7p53-/-)中，在COH29处理之后，这些蛋白质也被类似地修饰(图6中心图版)。在DNA损害之后，ATM或ATR使γ-Η2ΑΧ磷酸化以将修复蛋白质募集至受损害的DNA的位点(39)。在两种细胞系中，在COH29处理之后，均存在γ-Η2ΑΧ水平增加。因此，COH29处理以p53非依赖性方式使DNA损害检查点活化。最后，考查COH29在表达降低水平的孕酮受体、雌激素受体和Her2受体的‘三重阴性’人乳腺癌细胞中的影响(33)。当用COH29处理MDA-MB-468细胞时，观察到以上激酶的类似活化概况(图6，右侧图版)。

[0131] 进一步评估COH29在BRCA1野生型细胞中的作用。如图7A中所示，COH29也诱导γ-Η2ΑΧ、磷酸p53和磷酸ATM在核中积累。此外，观察到在COH29处理的细胞中，在核中对foxo3和它的靶标蛋白质p27的诱导(图7A)。此外，我们通过共焦免疫荧光显微术发现γ-Η2ΑΧ、磷酸p53和磷酸ATM与foxo3共定位在核中(图7B、7C和7D)。这些结果指示在BRCA1野生型NSCLC A549细胞中，COH29也诱导DNA损害。DNA双链断裂(DSB)可通过同源性重组(HR)或非同源性末端接合(NHEJ)路径来修复。为进一步阐明COH29在DSB DNA修复中的作用，我们通过基于GFP的染色体报道体EJ5-GFP确定在细胞中，COH29对NHEJ修复效率具有少许影响(图8A-8B)。然而，根据蛋白质印迹分析，在BRCA1野生型NSCLC A549细胞的核中，COH29对负责HR修复的关键蛋白质Rad51的表达的作用被下调(图7A)。此外，COH29抑制BRCA1和Rad51灶形成的蛋白质水平，伴有DSB标志物γ-Η2ΑΧ在细胞中积累(图9A和9B)，从而表明COH29可能够通过下调BRCA1野生型A549细胞中的HR路径来延长DNA损害响应(DDR)诱导的DSB。

[0132] 为评估COH29的基因毒性，用一定剂量范围的COH29(0-100μΜ)从1至7dpf(受精后天数)处理野生型斑马鱼胚胎，并且与用已知会导致发育缺陷的HU(0-50mM)类似处理的胚胎进行比较。如所预期，截至4dpf，HU导致眼和心脏中的缺陷(图5A)，并且导致突变胚胎的数目剂量依赖性增加(图5B)。相比之下，在COH29存在下未观察到发育缺陷(图5C)或活力降低(图5D)。

[0133] 在本文中，在体外研究与体内研究两者中均观察到COH29在BRCA1缺乏性细胞系中比在BRCA1野生型细胞系中更具活性。BRCA1是细胞对DNA损害的应答的一种介体。因此，在本文中进行的对COH29处理的BRCA1缺乏性细胞和BRCA1野生型细胞的差异性基因表达分析将PARP1鉴定为另一受抑制蛋白质。此外，我们尤其发现COH29加强DNA损害剂顺铂的活性。此外，我们尤其发现COH29以p53非依赖性方式使DNA损害检查点活化，并且核Rad51被下调。

[0134] 在试图整合以上观察结果时，我们提出下方案。在不受任何特定理论束缚下，我们提出在人细胞中，对DNA的损害(诸如由顺铂形成的交联)通常通过BER路径来修复。因为RR提供为修复所必需的dNTP，所以所述酶密切涉及于在S期期间发生的BER中。在G1期中，p53诱导性亚单位p53R2提供dNTP来达成BER。我们先前报道由COH29抑制RR会导致体内dNTP消减(6)。

[0135] COH29可影响双链DNA断裂修复，如由我们的显示HR复合蛋白Rad51受抑制的数据所表明。这由COH29导致细胞内Rad51蛋白水平减弱的观察结果指示(图7A)。响应于DNA损害，RAD51从胞质液易位至核以在ssDNA上形成核丝，此是为促进HR路径所必需的步骤(45,46)。在未处理细胞中，大多数Rad51在胞质液中表达(图7B，上部图版)。响应于暴露于COH29，与Rad51显著降低并行的核中γ-H2AX表达显著增加表明Rad51可在COH29诱导的DSB中起作用。COH29对Rad51的这个作用类似于文献对已知会使复制叉停滞的HU记载的作用(47)，其中重要差别在于COH29比HU更有效力20倍(6)，并且不具有可观基因毒性(图5A-
5D)。

[0136] 此外，COH29也抑制BRCA1，其是另一重要HR组分。已报道抑制PARP会下调由E2F4和p130介导的BRCA1和RAD51表达(48)。开发用以打断HR DNA修复机构的抑制剂(51)已变得具有吸引力，因为Rad51表达升高已在众多类型的癌症中被观察到，并且与不良预后和药物抗性相关联(52,53)。已报道通过上调Rad51表达水平来增加HR能力可导致癌细胞对PARP抑制剂的抗性(54)。甚至在BRCA1缺陷性细胞中，使53BP1损失也可允许达成部分HR修复，并且介导对PARP抑制剂的获得性抗性(55)。由COH29诱导的通过下调Rad51的表达水平来使它的功能失活可充当针对癌症的潜在疗法。我们的数据显示COH29可干扰细胞中的BER、NER和HR修复路径，从而表明COH29可靶向由遗传背景或对PARP抑制剂的抗性所致的备用DNA修复。

[0137] 通过合成致死性或其它手段来增加DNA损害性药物的效价携有由于抑制体内DNA修复能力而使这些药物的诱变潜力增加的风险。在dsB修复路径的情况下，显示POLD1的失活(参见上文)导致结肠直肠腺瘤和癌瘤(49)。RAD51的多态性与某些人癌症类型的发作相关联(50)。然而，本文数据已显示不同于HU，COH29处理似乎不在斑马鱼的胚胎发育期间致使可见形态学异常。此处所述的进步可导致进一步改进当前用于治疗人癌症的策略。COH-29对各种人乳腺癌细胞的作用显示于表3中。

[0138] 表3.COH29、顺铂和太平洋紫杉醇对乳腺癌细胞系的作用。

[0139]

[0140] 参考文献

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[0143] 实施方案

[0144] 本文公开的主题的实施方案包括以下。

[0145] 实施方案1.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括施用有效量的COH29(N-(4-(3，4-二羟基苯基)-5-苯基噻唑-2-基)-3，4-二羟基苯甲酰胺)，其中所述受试者是BRCA1缺陷性受试者、PARP1抑制剂抗性受试者或DNA损害性抗癌剂抗性受试者。

[0146] 实施方案2.如实施方案1所述的方法，其中所述受试者是乳腺癌受试者或卵巢癌受试者。

[0147] 实施方案3.如实施方案1所述的方法，其中所述施用抑制所述受试者中的DNA修复。

[0148] 实施方案4.如实施方案1所述的方法，其中所述施用抑制所述受试者中的碱基切除修复(BER)、核苷酸切除修复(NER)或双链DNA断裂修复。

[0149] 实施方案5.如实施方案1所述的方法，其中所述施用增加所述受试者中的γ-H2AX蛋白活性或表达。

[0150] 实施方案6.如实施方案1所述的方法，其中所述施用降低所述受试者中的Rad51蛋白活性或表达。

[0151] 实施方案7.如实施方案1所述的方法，其中所述施用降低所述受试者中的BRCA1蛋白活性或表达。

[0152] 实施方案8.如实施方案1所述的方法，其中所述施用降低所述受试者中的PARP1蛋白活性或表达。

[0153] 实施方案9.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括以组合协同量施用COH29(N-(4-(3,4-二羟基苯基)-5-苯基噻唑-2-基)-3,4-二羟基苯甲酰胺)和DNA损害性抗癌剂。

[0154] 实施方案10.如实施方案9所述的方法，其中所述受试者是BRCA1缺陷性受试者或PARP1抑制剂抗性受试者。

[0155] 实施方案11.如实施方案10所述的方法，其中所述受试者是乳腺癌受试者或卵巢癌受试者。

[0156] 实施方案12.如实施方案9所述的方法，其中所述DNA损害性抗癌剂是化学治疗性DNA损害剂。

[0157] 实施方案13.如实施方案12所述的方法，其中所述化学治疗性DNA损害剂是烷基化剂。

[0158] 实施方案14.如实施方案13所述的方法，其中所述烷基化剂是氮丙啶、甲基蜜胺、亚硝基脲、氮芥、白消安、环磷酰胺或甲基苄肼。

[0159] 实施方案15.如实施方案9所述的方法，其中所述化学治疗性DNA损害剂是拓扑异构酶I药剂、拓扑异构酶II药剂、喜树碱、伊立替康、拓扑替康、顺铂、卡铂、奥沙利铂、亚德里亚霉素、阿霉素、依托泊苷、单链断裂剂、BCNU卡莫司汀、CCNU、DTIC、癌得星、异环磷酰胺、博莱霉素或丝裂霉素C。

[0160] 实施方案16.如实施方案9所述的方法，其中所述DNA损害性抗癌剂是顺铂、吉西他滨或γ辐照。