钙离子通道阻滞剂化合物及其制备方法和应用 |
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| 申请号 | CN201610992800.5 | 申请日 | 2016-11-11 | 公开(公告)号 | CN106892875A | 公开(公告)日 | 2017-06-27 |
| 申请人 | 杭州唯铂莱生物科技有限公司; | 发明人 | 占纪勋; 于大禹; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及化合物 生物 合成和纯化技术领域，尤其涉及 钙 离子通道阻滞剂化合物及其制备方法和应用。该化合物结构如下：其中，R1为H或羟基，R2为H或甲基，R3为异丙基或异丁基，R4为H或甲基。本发明还提供钙离子通道阻滞剂化合物的制备方法，并涉及钙离子通道阻滞剂化合物在制备 治疗 高血压 、心绞痛、心肌梗塞以及心律不齐药物中的应用。本发明发现并鉴定出全新的留辛亚辛类似物，并将来生物合成多种新型环缩酚酞提供了一种高效的途径。 | ||||||
| 权利要求 | 1.钙离子通道阻滞剂化合物，其特征在于：该化合物结构如下： |
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| 说明书全文 | 钙离子通道阻滞剂化合物及其制备方法和应用技术领域背景技术[0002] 钙离子通道阻滞剂（calcium channel blocker，CCB）是阻断钙离子经过细胞膜上的钙离子通道进入细胞的药物。钙离子通道阻滞剂广泛应用于治疗高血压，对老年患者尤其有效。还用于调节心率，预防脑血管痉挛，减轻心绞痛引起的疼痛。钙通道阻滞剂是一类非常重要的治疗高血压药物，我国有一半以上服药治疗的高血压患者应用钙通道阻滞剂。国际上的重要临床研究显示，亚洲患者对钙通道阻滞剂更敏感，也更容易坚持治疗。 [0003] 环缩酚酞是一类由氨基酸和羟基酸通过酰胺与酯链连接形成的天然产物，具有免疫抑制、抗菌、抗发炎和抗肿瘤等生物活性。它同时也是一种钙离子通道阻滞剂，能够阻止钙离子进入细胞，因此也被用来治疗高血压、心绞痛、心肌梗塞以及心律不齐等症状。 [0004] 留亚拉辛（leualacin）是真菌Hapsidospora irregularis的一种代谢产物。留亚拉辛最主要功效是作为钙通道阻滞剂，其在科学研究及医疗应用上具有重要意义。当前，被人类认知和发掘的钙离子通道阻滞剂天然产物种类稀少，限制了钙离子通道阻滞剂在医学上的应用。因此，发掘并将更多钙离子通道阻滞剂应用于医学领域、工业生产，对促进人类健康事业的发展具有重要作用。 发明内容[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一类新型钙离子通道阻滞剂-留亚拉辛类似物，以解决目前钙离子通道阻滞剂天然产物种类稀少的问题。 [0006] 本发明另一目的是提供钙离子通道阻滞剂-留亚拉辛及其衍生物的制备方法。 [0007] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：本发明提供一类钙离子通道阻滞剂化合物，该化合物结构如下： 式中，R1为H或羟基，R2为H或甲基，R3为异丙基或异丁基，R4为H或者甲基。 [0008] 本发明的钙离子通道阻滞剂化合物中，R1为H，R2为甲基，R3为异丁基，R4为甲基，该化合物记为化合物2（leualacin B（2））。 [0009] 本发明的钙离子通道阻滞剂化合物中，R1为H，R2为H，R3为异丁基，R4为甲基，该化合物记为化合物3（leualacin C（3））。 [0010] 本发明的钙离子通道阻滞剂化合物中，R1为H，R2为H，R3为异丙基，R4为甲基，该化合物记为化合物4（leualacin D（4））。 [0011] 本发明的钙离子通道阻滞剂化合物中，R1为羟基，R2为H，R3为异丁基，R4为甲基，该化合物记为化合物5（leualacin E（5））。 [0012] 本发明的钙离子通道阻滞剂化合物中，R1为羟基，R2为H，R3为异丁基，R4为H，该化合物记为化合物6（leualacin F（6））。 [0013] 本发明的钙离子通道阻滞剂化合物中，R1为羟基，R2为H，R3为异丙基，R4为H，该化合物记为化合物7（leualacin G（7））。 [0014] 本发明中，留辛拉辛（leualacin）记为化合物1，留辛拉辛结构式如下：本发明还提供钙离子通道阻滞剂化合物的制备方法：将菌株Hapsidospora irregularis接种于K2固体平板培养基，在30℃条件下，培养8天，获得单克隆；将单克隆转移至在K2肉汤培养液，在28-31℃条件下，培养6-8天，所得培养物经分离纯化，获得所述钙离子通道阻滞剂化合物。 [0015] 进一步地，所得培养物分离纯化方法为：所得培养物经第一次离心后，用甲醇对沉淀细胞体进行提取，超声震碎处理后进行第二次离心，第二次离心后所得上清液加到洗脱柱中，得洗脱液；洗脱柱再依次用74-76%甲醇水溶液以及甲醇进行洗脱，洗脱物分别进行液相分析，并收集洗脱液；用含有0.1%甲酸的80-90%甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集目标流出液，获得所述钙离子通道阻滞剂化合物。 [0016] 本发明还涉及钙离子通道阻滞剂化合物在制备治疗高血压、心绞痛、心肌梗塞以及心律不齐药物中的应用。 [0017] Hapsidospora irregularis是 Pseudeurotiaceae家族的一类真菌，本发明从中鉴定出6种全新的环缩酚酞，这意味着本发明扩增这种真菌的天然产物图谱。 [0018] 本发明的有益效果在于：（1）本发明从Hapsidospora irregularis及其代谢产物进行了更全面地研究，发现并鉴定出7种环缩酚酞类产物，其中的留辛亚辛为已知物，其余6种为全新的留辛亚辛类似物，解决了钙离子通道阻滞剂天然产物种类稀少，特别是环缩酚酞类钙离子通道阻滞剂天然产物种类稀少的问题。（2）本发明的制备方法工艺简单，操作过程易控制，生产成本低，为将来生物合成多种新型环缩酚酞提供了一种高效的途径。附图说明 [0019] 利用附图对发明作进一步说明，但附图中的实施例不构成对本发明的任何限制，对于本领域的普通技术人员，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据以下附图获得其它的附图。 [0020] 图1为Hapsidospora irregularis FERM BP-2511真菌菌株代谢产物液相分析图谱，液相分析在210 nm下进行；编号1-7分别代表1-7号化合物；A为头孢菌素 P1；B为异头孢菌素P2；C为特氨酸Sch210971和Sch210972的混合物；高效液相分析条件：Agilent 1220 HPLC仪器， Agilent ZORBAX SB-C18 洗脱柱 (5 µm，21.2 mm×150 mm)。 具体实施方式[0021] 下面结合附图对本发明作进一步的说明，见附图1。 [0022] 实施例1Hapsidospora irregularis FERM BP-2511菌株的培养 Hapsidospora irregularis FERM BP-2511菌株在K2固体平板培养基上划线培养获得单克隆，培养条件：30℃，8天；单克隆先在5 mL K2肉汤培养液中预培养，预培养条件：37℃， 250 rpm，1天，然后转移到50 mL K2肉汤培养液中，K2肉汤培养液培养条件：250 rpm，30℃， 7天。本实施例所用的K2肉汤培养液添加有酪氨酸。所述K2固体平板培养基由以下质量-体积浓度的组分组成：3.9 g/L PDA，2 g/L蔗糖，1 g/L酪蛋白，0.5 g/L磷酸二氢钾，0.125 g/L硫酸镁，余量为水；所述K2肉汤培养液由以下质量-体积浓度的组分组成：PDB 2.4 g/L，蔗糖2 g/L，酪蛋白1 g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L，硫酸镁0.125 g/L，余量为水；所述酪氨酸的添加量为5 g/L，即1 L K2肉汤培养液中添加有5 g酪氨酸。 [0023] 上述Hapsidospora irregularis FERM BP-2511菌株购自日本IPOD；上述的配制培养基所用的化学试剂购自杭州华东医药集团有限公司。 [0024] 实施例2化合物的合成和提取 根据实施例1中的方式，获取3 L K2肉汤培养液，将该培养液于3500 rpm下离心5分钟，收集上清液合并后加到HP-20洗脱柱（10 cm×50 cm）上，用4 L纯水进行洗脱。用500 mL甲醇对沉淀细胞体进行提取，超声震碎处理40分钟，重复提取3次。再次离心，3500 rpm，5分钟，上清液用3倍体积水进行稀释，加到HP-20洗脱柱（10 cm×50 cm）上，即得25%的洗脱液。 洗脱柱再依次用4 L的75%甲醇水溶液以及100%甲醇进行洗脱，洗脱物分别进行液相分析，并收集洗脱液。 [0025] 实施例3化合物1的提取纯化 取实施例2中所得洗脱液，用Agilent ZORBAX SB-C18 洗脱柱 (5 µm, 21.2 mm×150 mm)在Agilent 1220 HPLC上进行液相分析，用含有0.1%甲酸的90%甲醇水溶液以3 mL每分钟的流速进行梯度洗脱，收集28-31分钟的流出物。将该流出物重新用Agilent ZORBAX SB-C18 洗脱柱 (5 µm, 21.2 mm×150 mm)在Agilent 1220 HPLC上进行液相分析，用70%的甲醇水溶液以1 mL每分钟的流速进行洗脱，获得450毫克纯净的化合物。对所得化合物进行核磁共振分析，确定该化合物为化合物1（leualacin）。 [0026] 实施例4化合物2的提取纯化 取实施例2中所得洗脱液，用Agilent ZORBAX SB-C18 洗脱柱 (5 µm, 21.2 mm×150 mm)在Agilent 1220 HPLC上进行液相分析，用含有0.1%甲酸的90%甲醇水溶液以3 mL每分钟的流速进行梯度洗脱，收集31-33分钟的流出物。将该流出物重新用Agilent ZORBAX SB-C18 洗脱柱 (5 µm, 21.2 mm×150 mm)在Agilent 1220 HPLC上进行液相分析，用85%的甲醇水溶液以1 mL每分钟的流速进行洗脱，获得39毫克纯净的化合物。对所得化合物进行核磁共振分析，确定该化合物为化合物2（leualacin B（2））。 [0027] 实施例5化合物3的提取纯化 取实施例2中所得洗脱液，用Agilent ZORBAX SB-C18 洗脱柱 (5 µm, 21.2 mm×150 mm)在Agilent 1220 HPLC上进行液相分析，用含有0.1%甲酸的80%甲醇水溶液以3 mL每分钟的流速进行梯度洗脱，收集25-27分钟的流出物。将该流出物重新用Agilent ZORBAX SB-C18 洗脱柱 (5 µm, 21.2 mm×150 mm)在Agilent 1220 HPLC上进行液相分析，用60%的乙腈水溶液以1 mL每分钟的流速进行洗脱，获得35毫克纯净的化合物。对所得化合物进行核磁共振分析，确定该化合物为化合物3（leualacin C（3））。 [0028] 实施例6化合物4的提取纯化 取实施例2中所得洗脱液，用Agilent ZORBAX SB-C18 洗脱柱 (5 µm, 21.2 mm×150 mm)在Agilent 1220 HPLC上进行液相分析，用含有0.1%甲酸的80-90%甲醇水溶液以3 mL每分钟的流速进行梯度洗脱，收集27-29分钟的流出物。将该流出物重新用Agilent ZORBAX SB-C18 洗脱柱 (5 µm, 21.2 mm×150 mm)在Agilent 1220 HPLC上进行液相分析，用60%的乙腈水溶液以1 mL每分钟的流速进行洗脱，获得35毫克纯净的化合物。对所得化合物进行核磁共振分析，确定该化合物为化合物4（leualacin D（4））。 [0029] 实施例7化合物5的提取纯化 取实施例2中所得洗脱液，用Agilent ZORBAX SB-C18 洗脱柱 (5 µm, 21.2 mm×150 mm)在Agilent 1220 HPLC上进行液相分析，用含有0.1%甲酸的70-80%甲醇水溶液以3 mL每分钟的流速进行梯度洗脱，收集20-22分钟的流出物。将该流出物重新用Agilent ZORBAX SB-C18 洗脱柱 (5 µm, 21.2 mm×150 mm)在Agilent 1220 HPLC上进行液相分析，用55%的乙腈水溶液以1 mL每分钟的流速进行洗脱，获得33毫克纯净的化合物。对所得化合物进行核磁共振分析，确定该化合物为化合物5（leualacin E（5））。 [0030] 实施例8化合物6号的提取纯化 取实施例2中所得洗脱液，用Agilent ZORBAX SB-C18 洗脱柱 (5 µm, 21.2 mm×150 mm)在Agilent 1220 HPLC上进行液相分析，用含有0.1%甲酸的70-80%甲醇水溶液以3 mL每分钟的流速进行梯度洗脱，收集18-21分钟的流出物。将该流出物重新用Agilent ZORBAX SB-C18 洗脱柱 (5 µm, 21.2 mm×150 mm)在Agilent 1220 HPLC上进行液相分析，用55%的乙腈水溶液以1 mL每分钟的流速进行洗脱，获得59毫克纯净的化合物。对所得化合物进行核磁共振分析，确定该化合物为化合物6（leualacin F（6））。 [0031] 实施例9化合物7的提取纯化 取实施例2中所得洗脱液，用Agilent ZORBAX SB-C18 洗脱柱 (5 µm, 21.2 mm×150 mm)在Agilent 1220 HPLC上进行液相分析，用含有0.1%甲酸的70%甲醇水溶液以3 mL每分钟的流速进行梯度洗脱，收集16-18分钟的流出物。将该流出物重新用Agilent ZORBAX SB-C18 洗脱柱 (5 µm, 21.2 mm×150 mm)在Agilent 1220 HPLC上进行液相分析，用40%的乙腈水溶液以1 mL每分钟的流速进行洗脱，获得18毫克纯净的化合物7，对所得化合物进行核磁共振分析，确定该化合物为化合物7（leualacinG（7））。 [0032] 实施例10本实施例与实施例1的不同之处在于： Hapsidospora irregularis FERM BP-2511菌株在K2固体平板培养基上划线培养获得单克隆，培养条件：30℃，8天；单克隆先在5 mL K2肉汤培养液中预培养，预培养条件：37℃， 250 rpm，1天，然后转移到50 mL K2肉汤培养液中，所述K2肉汤培养液添加有酪氨酸，培养条件：250 rpm，28℃，8天。所述K2固体平板培养基的由以下质量-体积浓度的组分组成：3.9 g/L PDA，2 g/L蔗糖，1 g/L酪蛋白，0.5 g/L磷酸二氢钾，0.125 g/L硫酸镁，余量为水；其中，所述K2肉汤培养液由以下质量体积比的组分组成：2.4 g/L PDB，2 g/L蔗糖，1 g/L酪蛋白，0.5 g/L磷酸二氢钾，0.125 g/L硫酸镁，余量为水，所述酪氨酸的添加量为4 g/L。本实施例所得培养物的后续处理步骤同实施例2-9，制得化合物1-7。 [0033] 实施例11本实施例与实施例1的不同之处在于： Hapsidospora irregularis FERM BP-2511菌株在K2固体平板培养基上划线培养获得单克隆，培养条件：30℃，8天；单克隆先在5 mL K2肉汤培养液中预培养，预培养条件：37℃， 250 rpm，1天，然后转移到50 mL K2肉汤培养液中，所述K2肉汤培养液添加有酪氨酸，培养条件：250 rpm，31℃，6天。所述K2固体平板培养基由以下质量-体积浓度的组分组成：3.9 g/L PDA，2 g/L蔗糖，1 g/L酪蛋白，0.5 g/L磷酸二氢钾，0.125 g/L硫酸镁，余量为水；所述K2肉汤培养液由以下质量-体积浓度的组分组成：2.4 g/L PDB，2 g/L蔗糖，1 g/L酪蛋白， 0.5 g/L磷酸二氢钾，0.125 g/L硫酸镁，0.5 g/L酪氨酸，余量为水；所述酪氨酸的添加量为 6 g/L。本实施例所得培养物的后续处理步骤同实施例2-9，得到化合物1-7。 [0034] 实施例12本实施例与实施例1的不同之处在于： Hapsidospora irregularis FERM BP-2511菌株在K2固体平板培养基上划线培养获得单克隆，培养条件：30℃，8天；单克隆先在5 mL K2肉汤培养液中预培养，预培养条件：37℃， 250 rpm，1天，然后转移到50 mL K2肉汤培养液中，所述K2肉汤培养液添加有酪氨酸，培养条件：260 rpm，30℃，8天。所述K2固体平板培养基由以下质量-体积浓度的组分组成：3.9 g/L PDA，2 g/L蔗糖，1 g/L酪蛋白，0.5 g/L磷酸二氢钾，0.125 g/L硫酸镁，余量为水；所述K2肉汤培养液由以下质量-体积浓度的组分组成：2.4 g/L PDB，2 g/L蔗糖，1 g/L酪蛋白， 0.5 g/L磷酸二氢钾，0.125 g/L硫酸镁，0.5 g/L酪氨酸，余量为水；所述酪氨酸的添加量为 5 g/L。本实施例所得培养物的后续处理步骤同实施例2-9，得到化合物1-7。 [0035] 实施例13本实施例与实施例1的不同之处在于： Hapsidospora irregularis FERM BP-2511菌株在K2固体平板培养基上划线培养获得单克隆，培养条件：30℃，8天；单克隆先在5 mL K2肉汤培养液中预培养，预培养条件：37℃， 250 rpm，1天，然后转移到50 mL K2肉汤培养液中，所述K2肉汤培养液添加有酪氨酸，培养条件：240 rpm，29℃，8天。所述K2固体平板培养基由以下质量-体积浓度的组分组成：3.9 g/L PDA，2 g/L蔗糖，1 g/L酪蛋白，0.5 g/L磷酸二氢钾，0.125 g/L硫酸镁，余量为水；所述K2肉汤培养液由以下质量-体积浓度的组分组成：2.4 g/L PDB，2 g/L蔗糖，1 g/L酪蛋白， 0.5 g/L磷酸二氢钾，0.125 g/L硫酸镁，0.5 g/L酪氨酸，余量为水；所述酪氨酸的添加量为 5 g/L。本实施例所得培养物的后续处理步骤同实施例2-9，得到化合物1-7。 [0036] 本发明的化合物1-7及其结构式如下所示：确定实施例2-9所制得的钙离子留亚拉辛（化合物1）其及留亚拉辛类似物（化合物2 - 7）的结构。使用同位素试剂CDCl3或CD3OD，在JEOL ECX-300仪器上测定一维核磁共振（1D NMR）；在JEOL ECX-300或Bruker AvanceIII HD Ascend-500仪器上测定二维核磁共振（2D NMR）；化学位移值以ppm计；耦合常数以Hz计；LR-ESI-MS和HR-ESI-MS数据分别用Agilent 6130 LC-MS和Agilent G6224ATOF质谱仪测得。 [0037] 表 1 化合物1-7的氢同位素核磁共振数据（其中化合物1-6使用CDCl3试剂，化合物7使用CD3OD试剂，化学位移值δ以ppm计；耦合常数J以Hz计）表2 化合物1-7的碳同位素核磁共振数据（其中化合物1-6使用CDCl3试剂，化合物7使用CD3OD试剂，化学位移值δ以ppm计） 表3化合物1-7氨基酸与羟基酸基团绝对构型的测定 （Rudolph Autopol IV旋光计仪器，10 cm样品管，19℃） 采用瞬时受体通道电位试验证实留亚拉辛（leualacin）类似物具有钙通道阻滞剂效果： 1. 荧光细胞钙离子通量化验 使用BMG Labtech NOVOStar荧光板读取器，结合平板试剂输送系统，进行荧光细胞钙离子通量化验。 [0038] 2.实验用细胞株培养人胚胎肾细胞株293（HEK293）能够稳定表达TRPA1、M8、TRPV3或V4。细胞株培养在2%（w/v）明胶的96孔盘上：培养基是添加5%胎牛血清、1倍的青霉素/链霉素浓缩液以及300 µg/mL 遗传霉素的F12介质。 [0039] 过表达TRPV1的细胞株与正常表达的BEAS-2B 细胞株亦用于实验。 [0040] 肺支气管表皮细胞（LOBAR）培养在BronchiaLife B/T 介质中，培养至体系约占培养盘总体积的80-90%。 [0041] 上述肺支气管表皮细胞购自Lifeline Cell Technology，供体编号1344；其余细胞株购买自广州吉妮欧生物科技有限公司；所用的化学试剂购自杭州华东医药集团有限公司。 [0042] 3.细胞预处理及通量化验操作试验进行前，将上述细胞转移至LHC-9和Fluo 4-Drirect的1:1混合体系中，其中含有专用淬火染料。随后HEK293与LOBAR细胞株置于37℃细胞培养箱中，培养1小时；BEAS-2B细胞株则在室温下培养1小时。培养后的细胞用LHC-9溶液进行清洗。清洗完成后所有细胞均在37℃下再培养30分钟，使Fluo 4-AM更好地剪切和激活，同时使测试化合物1-7号与Fluo 4达到平衡状态。 [0043] 处理溶液采用3倍浓缩的LHC9（用于TRPV1、M8和V4）或钙分析缓冲液（用于TRPA1、V3和LOBAR）。取96孔盘中的培养液50 µL，添加25 µL上述浓缩液。在37℃下检测1分钟内细胞荧光变化。荧光强度最大变化率(max ΔF/s)作为量化数据；空白培养介质处理作为阴性对照；用特定TRP通道阻滞剂处理实验组的数据作为抑制效果对照。 [0044] 特定通道阻滞剂分别如下：TRPA1使用250 µM 2,4-ditert butylphenol； M8使用25 µM icilin； V1使用10 µM的capsaicin；V3使用300 µM carvacrol；V4使用30 nM GSK1016790A。重复上述处理操作三次及以上。钙离子流通量数据如表4所示： 表4钙离子流通量数据表 其中，表中LOBAR为人类肺支气管表皮初级细胞株；HEK-293为人胚胎肾细胞株；HEK- 293 TRPA1、HEK-293 TRPM8、HEK-293 TRPV3和HEK-293 TRPV4分别为不同的通道蛋白过表达细胞株；BEAS-2B为人类肺支气管表皮永生细胞株；BEAS-2B TRPV1为过表达TRPV1的人类肺支气管表皮永生细胞株；1-7分别代表留亚拉辛（化合物1）及其类似物（化合物2-7）。 [0045] 所述LHC-9、Fluo 4-Drirect溶液购自Invitrogen；所述化学试剂购自杭州华东医药集团有限公司。 [0046] 本发明还提供该化合物药学上可接受的盐或其溶剂合物。本发明涉及钙离子通道阻滞剂化合物在制备治疗高血压、心绞痛、心肌梗塞以及心律不齐药物中的应用。新型钙离子通道阻滞剂化合物可以单独或以药物组合物的形式给药，可根据给药途径配成各种适宜的剂型。使用一种或多种生理学上可接受的载体，包含赋形剂和助剂，它们有利于将钙离子通道阻滞剂化合物加工成可以在药学上使用的制剂。适当的制剂形式取决于所选择的给药途径，可以按照本领域熟知的常识进行制造。 [0047] 最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。 |
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