一种环肽化合物clavatustideB及其制备方法和应用 |
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| 申请号 | CN201310574939.4 | 申请日 | 2013-11-15 | 公开(公告)号 | CN103641791A | 公开(公告)日 | 2014-03-19 |
| 申请人 | 浙江大学; | 发明人 | 吴斌; 叶瑛; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种环肽化合物clavatustide B及其制备方法和应用。clavatustide B的结构式如式（Ⅰ）所示，其备方法包括：将经活化的棒曲霉（Aspergillus clavatus）CCTCC No.M 2013421接种到 发酵 培养液中，进行发酵培养；发酵完成后，分离得到菌丝体和发酵液；对菌丝体提取物或发酵液提取物进行层析分离、纯化处理，制得所述环肽化合物；所述应用是所述环肽化合物在制备抗 肿瘤 药物或肿瘤 预防 保健食品中的应用。本发明的环肽化合物具有较好的体外抗肿瘤活性，其对HepG2细胞的IC50值为15μg/mL，具有良好的开发前景；并且制备方法操作简便，适合规模化生产。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种环肽化合物clavatustide B，其特征在于，结构式如式（Ⅰ）所示： |
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| 说明书全文 | 一种环肽化合物clavatustide B及其制备方法和应用技术领域背景技术[0002] 海洋微生物由于生活在压力环境下，其二次代谢产物往往具有陆地真菌二次代谢产物不具备的生物活性，近年来成为药物开发的热点。海洋微生物不仅生存竞争压力很大，其所处的海洋环境的pH范围、温度、压力、溶解氧、光线、营养和盐度等都与陆地环境不同，这是海洋微生物二次代谢产物多样性的基础（Debbab,A.;Aly,A.H.;Lin,W.H.;Proksch,P.Microb.Biotech.2010,3,544–563；Saleema,M.;Ali,M.S.;Hussain,S.;Jabbar,A.;Ashraf,M.;Lee,Y.S.Nat.Prod.Rep.2007,24,1142–1152；Wu,B.;Wu,X.;Sun,M.;Li,M.Mar.Drugs2013,11,2713-2721.）。 [0003] 海洋真菌作为海洋微生物的重要组成部分，在药物合成、石油降解、环境修复等方面具有重要作用。海洋真菌既具有真核生物典型的蛋白修饰性能，又具有微生物操作上简便、快速的优点，作为新的真核生物表达系统具有巨大的潜能和广阔的应用前景。近年来随着对海洋微生物研究的深入，从海洋真菌中发现了越来越多的抗肿瘤活性物质，海洋真菌成为了继海洋放线菌之后的又一研究热点。 [0004] 沼田敦等（徐赤，顾谦群，崔承彬.2001年.海洋微生物抗肿瘤代谢产物的研究进展[J].中国海洋药物.6:44-49.）对从浒苔属海藻Enteromorpha intestinalis体表分离到的一株青霉菌进行了一系列研究。将该菌株置于含2%葡萄糖、1%蛋白胨及0．5%酵母膏的海水培养基中，27℃培养3周，首先分离得到2个细胞毒代谢产物Communesins A和B，二者结构上仅酰基侧链存差异，但活性上却相差了近10倍。 [0005] 沼田敦等（徐赤，顾谦群，崔承彬.2001年.海洋微生物抗肿瘤代谢产物的研究进展[J].中国海洋药物.6:44-49.）还从分离于海鱼 Pseudolabrus japonicus胃肠道的曲霉Aspergillus fummigatus菌丝体中分离到一系列细胞毒化合物Fumiquinazolines A～G，对P385细胞有中等细胞毒性。Fenieal等人从加勒比海绿藻Penicillus capitatus体表分离的Aspergillus versicolor得到四个倍半萜硝基苯酯化合物，其中9a，14-二羟基-6对硝基苯甲酸肉桂酯对NCI的60个人类肿瘤细胞群的IC50的平均值为1．1mg/L，但对5种肾癌细胞（786-0，ACHN，CAK-1，TK-10，VO-31）有选择性毒性，平均IC50为0.51mg/L。 [0006] 海 洋热 液 口 是 地球 上 最 活 跃的 环 境（Thornburg,C.C.;Zabriskie,T.M.;McPhail,K.L.J.Nat.Prod.2010,73,489–499.）， 热 液 口 螃 蟹（Xenograpsus testudinatus）就生活在极端、毒性、布满硫化物的热液口附近。这种热液口螃蟹在台湾龟山岛被发现（eng,M.-S.;Ng,N.K.;Ng,P.K.L.Nature2004,432,969.），迄今为止，没有人研究这种热液口螃蟹的附生真菌的代谢产物。 发明内容[0007] 本发明提供了一种环肽化合物clavatustide B，该化合物从热液口螃蟹Xenograpsus testudinatus附生棒曲霉Aspergillus clavatus C2WU发酵培养物中提取获得，具有较强的抗肿瘤活性。 [0008] 一种环肽化合物clavatustide B，结构式如式（Ⅰ）所示： [0009] [0010] 本发明还提供了所述环肽化合物clavatustide B的制备方法，包括以下步骤： [0011] （1）将经活化的棒曲霉（Aspergillus clavatus）CCTCC No.M 2013421接种到发酵培养液中，于20-30℃发酵培养10-60天； [0012] 所述棒曲霉（Aspergillus clavatus）CCTCC No.M 2013421是从热液口螃蟹（Xenograpsus testudinatus）中分离得到的，是热液口螃蟹（Xenograpsus testudinatus）的附生真菌；该菌株已于2013年9月14日保藏于位于武汉市珞珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心（China Center for Type Culture Collection，CCTCC），保藏号为：CCTCC No.M 2013421。 [0013] 由于棒曲霉（Aspergillus clavatus）C2WU是真菌，采用常规的PDA液体培养基或麦芽汁培养基即可用于发酵。但为了更好地模拟棒曲霉C2WU的原生海洋环境，给微生物生长代谢提供足够的营养成分，作为优选，步骤（1）中，以1L计，所述发酵培养液的组成为：淀粉1-5g，麸皮10-20g，酵母膏3-15g，KH2PO4 0.1-0.8g，MgSO4·7H2O 0.1-0.8g，余量为海水。 [0015] 或者，以1L计，所述发酵培养液的组成为：蔗糖20-40g，酵母提取物8-12g，麦芽提取物18-22g，MgSO4·7H2O 0.3-0.5g，KH2PO4 0.3-0.5g，余量为海水。 [0016] 作为进一步优选，步骤（1）中，以1L计，所述发酵培养液的组成为：淀粉3g，麸皮14g，酵母膏6g，KH2PO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.4g，余量为海水。 [0017] 或者，以1L计，所述发酵培养液的组成为：马铃薯400g，蛋白胨6g，酵母膏2g，葡萄糖10g，余量为海水；培养液初始pH值为6.5。 [0018] 或者，以1L计，所述发酵培养液的组成为：蔗糖20.0g，酵母提取物10.0g，麦芽提取物20g，MgSO4·7H2O 0.4g，KH2PO4 0.4g，余量为海水。 [0019] 将所述棒曲霉C2WU制成浓度为107～109cfu/mL的孢子悬液，以 8～12%接种量接种到发酵培养液中，进行发酵培养。优选地，所述发酵培养的温度为20-30℃，时间为10-60天。更优选地，所述发酵培养的温度为22-26℃，时间为15-25天。最优选地，所述发酵培养的温度为24℃，时间为20天。在该发酵培养条件下，所述环肽化合物clavatustide B的产量最高。 [0020] 发酵培养采用静态培养方式进行即可，也可进行摇瓶培养，采用摇瓶培养时，发酵时间可视情况相应缩短。 [0021] （2）发酵完成后，分离得到菌丝体和发酵液； [0022] 本发明中，从发酵后获得的菌丝体和发酵液中均能提取、分离得到所述环肽化合物clavatustide A。其中，利用菌丝体获取clavatustide A时将菌丝体置于有机溶剂中浸提，得到浸提液，再用蒸馏水对浸提液混悬，得到水混悬液，然后用乙酸乙酯或氯仿对水混悬液进行萃取，得到萃取液A，萃取液A经浓缩后得到菌丝体提取物； [0023] 浸提时，菌丝体与有机溶剂的重量体积比优选为50～500g：1L，更优选为100g：1L。所述有机溶剂可选用甲醇、乙醇、乙酸乙酯和丙酮中的一种或两种，优选为甲醇或丙酮，甲醇或丙酮浸泡下，菌丝体能被充分破壁，使胞内物质有效溶出。 [0024] 利用发酵液获取clavatustide B时，用乙酸乙酯或氯仿对发酵液进行萃取，得到萃取液B，萃取液B经浓缩后得到发酵液提取物。 [0025] （3）对菌丝体提取物或发酵液提取物进行层析分离、纯化处理，制得所述环肽化合物clavatustide B； [0026] 作为优选，所述层析分离为正相硅胶柱层析分离，洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯混合液。层析分离时，依次以体积比为9:1、5:1、1:1、1:3、1:9的石油醚/乙酸乙酯混合液进行洗脱，收集体积比为5:1的石油醚/乙酸乙酯混合液洗脱出的馏分。 [0027] 经正相硅胶柱层析分离获得的目标馏分中，所述环肽化合物还含有少量杂质，若想获得纯度较高的目标化合物，还需对该目标馏分做进一步纯化处理。所述纯化处理的方法可选：重结晶、反相硅胶柱层析分离或高效液相色谱分离。 [0028] 其中，采用反相硅胶柱层析分离进行纯化时，优选的洗脱剂为甲醇/ 水混合液；更优选地，所述甲醇/水混合液按体积比9:1、5:1、1:1、1:3、1:9进行梯度洗脱，并收集体积比为1:1的甲醇/水混合液洗脱出的馏分。 [0029] 由此，本发明还提供了所述环肽化合物clavatustide B在制备抗肿瘤药物或肿瘤预防保健食品中的应用。该抗肿瘤药物以本发明的环肽化合物为主要活性成分，添加药剂学上可接受的辅料制成，可按照药剂学上记载的制剂制备方法制成制剂。所述的制剂可以为注射液、滴注液、粉针剂、颗粒剂、片剂、冲剂、散剂、口服液、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、口含剂、颗粒剂、丸剂、膏剂、丹剂、喷雾剂、滴丸剂、崩解剂、口崩片、微丸等。该肿瘤预防保健食品以本发明的环肽化合物为主要活性成分，添加可接受的保健食品辅料制成。 [0030] 作为优选，所述抗肿瘤药物为抗肝癌药物，所述肿瘤预防保健食品为肝癌预防保健食品。利用该环肽化合物进行体外抗肿瘤试验，表明该环肽化合物具有较好的体外抗肿瘤活性，其对HepG2细胞的IC50值为15μg/mL。 [0031] 与现有技术相比，本发明的有益效果为： [0032] 本发明利用环肽的极性差异从螃蟹附生真菌棒曲霉C2WU的发酵培养物中提取、分离获得了一种具有新颖结构的环肽化合物clavatustide B，该方法操作简便、提取得率高、产物纯度高，适合规模化生产；并且，该化合物具有较好的体外抗肿瘤活性，其对HepG2细胞的IC50值为15μg/mL，可用于制备抗肝癌药物或肝癌预防保健食品，具有良好的开发前景。附图说明 [0033] 图1为本发明环肽化合物clavatustide B的1H1H COSY、HMBC相关图谱； [0034] 图2为本发明环肽化合物clavatustide B的圆二色谱图；其中，上图为CD光谱图，CD光谱图的Y轴mdeg表示毫度，X轴为波长nm；下图为紫外光谱图，紫外光谱图的Y轴表示吸光度，X轴为波长nm； [0035] 图3为本发明环肽化合物clavatustide B的1H NMR核磁图谱； [0036] 图4为本发明环肽化合物clavatustide B的13C NMR核磁图谱； [0037] 图5为本发明环肽化合物clavatustide B的DEPT NMR核磁图谱； [0038] 图6为本发明环肽化合物clavatustide B的COSY NMR核磁图谱； [0039] 图7为本发明环肽化合物clavatustide B的HSQC NMR核磁图谱； [0040] 图8为本发明环肽化合物clavatustide B的HMBC NMR核磁图谱； [0041] 图9为本发明环肽化合物clavatustide B的红外光谱图。 具体实施方式[0042] 实施例1 [0043] （1）从热液口螃蟹中分离真菌 [0044] 热液口螃蟹Xenograpsus testudinatus获赠于浙江大学海洋学院叶瑛教授。首先用无菌海水冲洗热液口螃蟹3次，去掉非附着微生物；再将热液口螃蟹的外壳与组织分离，无菌条件下刮下外壳粉末；然后往外壳粉末中加入海水作系列梯度稀释（1:5，1:25，1:125，1:625），用旋涡振荡器振荡10min，获得悬浮液；于5000r/min下离心该悬浮液 20min，，倾去上清液；沉淀物用少量无菌海水重悬浮，取0.1mL重悬液涂布于GYP培养基（1.0g葡萄糖，0.1g酵母提取物，0.5g蛋白胨，15g琼脂，1L海水）平板；室温20℃下培养10d后，挑取单菌落经划线纯化后移于斜面4℃下保存备用。 [0045] （2）鉴别分离真菌 [0046] 分离真菌在PDA培养基上生长时，菌丝体白色、有隔，菌落边缘有宽2-6mm的薄层气生菌丝，气生菌丝呈毛毡状，紧贴基质生长；从基生菌丝长出的孢子头丰富，孢子头的顶囊呈棒状，表面呈灰绿蓝色，幼时为白色；顶囊和气生菌丝的顶端均有透明状分泌物，菌落反面呈黄褐色，有同心圆放射状纹理，纹理处颜色较深。 [0047] 同时提取菌株基因组DNA，扩增其ITS基因并进行序列测定，ITS基因的碱基序列如SEQ ID No.1所示。 [0048] 根据菌株的形态特征和ITS序列分析结果，鉴定该菌株为棒曲霉Aspergillus clavatus，命名为棒曲霉C2WU。 [0049] （3）发酵培养 [0050] 将经活化的棒曲霉C2WU制成浓度108cfu/mL孢子悬浮液，以10%接种 量接种到发酵培养液中，于24℃静态发酵培养20天。 [0051] 其中，培养液配方为：马铃薯400g，蛋白胨6g，酵母膏2g，葡萄糖10g，海水1000mL；发酵培养液的初始pH值为6.5。 [0052] （4）环肽化合物制备 [0053] 棒曲霉C2WU发酵培养后，取5L发酵培养液，离心取沉淀得到菌丝体；菌丝体用甲醇浸提1周，得到浸提液；浸提液经浓缩后用1L蒸馏水混悬，获得水混悬液；水混悬液用6L乙酸乙酯萃取，获得乙酸乙酯萃取液，乙酸乙酯萃取液经浓缩后得到浸膏10g；将浸膏用硅胶（100目，100g）拌样，进行正相硅胶柱层析分离（200-300目，100g；硅胶柱尺寸L50mm，12mm），依次以体积比9:1、5:1、1:1、1:3、1:9的石油醚/乙酸乙酯混合液进行梯度洗脱，每次300mL；TLC检测馏分，收集洗脱比例5:1的馏分合并、浓缩，再用甲醇重结晶，得到目标化合物。 [0054] 实施例2 [0055] （1）同实施例1第（1）部分。 [0056] （2）同实施例1第（2）部分。 [0057] （3）发酵培养 [0058] 将经活化的棒曲霉C2WU制成浓度109cfu/mL孢子悬浮液，以8%接种量接种到发酵培养液中，于22℃静态发酵培养25天。 [0059] 其中，发酵培养液的配方为：淀粉3g，麸皮14g，酵母膏6g，KH2PO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.4g，海水1000mL。 [0060] （4）环肽化合物制备 [0061] 棒曲霉C2WU发酵培养后，取5L发酵培养液，离心取上清得到发酵液；发酵液浓缩后用10g硅藻土拌样，1L乙酸乙酯回流，进行正相硅胶柱层析分离（200-300目，1kg；硅胶柱尺寸L50mm， 12mm），依次以体积比9:1、5:1、1:1、1:3、1:9的石油醚/乙酸乙酯混合液进行梯度洗脱，每次300mL；TLC检测馏分，收集洗脱比例5:1的馏分合并；目标馏分用反相硅胶柱层析或高效液相色谱纯化，以甲醇-水（60-40）洗脱，检测波长254nm，收集57min的馏分合并、浓缩，再用甲醇重结晶，得到目标化合物。 [0062] 实施例3 [0063] （1）同实施例1第（1）部分。 [0064] （2）同实施例1第（2）部分。 [0065] （3）发酵培养 [0066] 将经活化的棒曲霉C2WU制成浓度107cfu/mL孢子悬浮液，以12%接种量接种到发酵培养液中，于25℃静态发酵培养20天。 [0067] 其中，培养液配方为：蔗糖20.0g，酵母提取物10.0g，麦芽提取物20g，MgSO4·7H2O0.4g，KH2PO4 0.4g，海水1000mL。 [0068] （4）环肽化合物制备 [0069] 棒曲霉C2WU发酵培养后，将发酵培养液离心，分别获得菌丝体和发酵液。 [0070] 取菌丝体进行真空干燥，干重得253g，用甲醇提取（冷浸）3次（3×1L），得到甲醇提取液，浓缩得到浸膏13g；浸膏用500mL蒸馏水混悬，获得水混悬液；水混悬液用乙酸乙酯萃取3次（3×3L），得到萃取液A；发酵液（30L）用乙酸乙酯萃取3次（3×20L），得到萃取液B； [0071] 将萃取液A和萃取液B合并，用正相硅胶柱层析分离，依次以体积比9:1、5:1、1:1、1:3、1:9的石油醚/乙酸乙酯混合液进行梯度洗脱，每次300mL；TLC检测馏分，收集洗脱比例为1:3的馏分，用制备型HPLC进行纯化：流速8mL/min，检测波长254nm，以甲醇-水（15-85）洗脱；收集28min馏分，利用Sephadex LH-20column进行纯化，再经制备型HPLC纯化，流速8mL/min，检测波长254nm，以甲醇-水（15-85）洗脱，收集28min馏分，得到目标化合物。 [0072] 实施例4 目标化合物结构鉴定 [0073] 采用HPLC对制得的目标化合物进行纯度鉴定，纯度大于95%的样品运用质谱和核磁共振技术进行结构鉴定，核磁共振用Bruker AVANCE DRX-500NMR Sectrometer测定，TMS作内标；高分辨质谱用Agilent6210TOF LC/MS测定；电喷雾质谱ESI-MS用Bruker Esquire plus3000 Spectrometer测定，红外使用NicoletAvatar-360FT-IR红外光谱仪。 [0074] 目标化合物的一维NMR分析结果见表1，二维NMR分析结果见图1，圆二色谱分析结果见图2，核磁图谱见图3-8，红外图谱见图9。 [0075] 表1 环肽化合物的NMR数据（CDCl3） [0076]Position δC δH(J in Hz) D-phenyllactic acid 1 169.8,C 2 71.5,CH 5.51t(7.5) 3 37.2,CH2 3.39,dd(13.6,7.5);3.25,(13.6,7.5) 4 135.5,C 5/9 129.6,CH 7.31,overlap 6/8 128.7,CH 7.34,overlap 7 127.4,CH 7.31,overlap anthranilic acid I 10 167.5,Cd 11 127.4 12 129.6,CH 7.62,d(7.8) 13 126.5,CH 7.30,overlap 14 132.7,CH 7.44,t(7.8) 15 126.1,CH 7.19,d(7.8) 16 134.8,C NH 8.58,s anthranilic acid II 17 167.4,C 18 123.1,C 19 126.5,CH 7.56,d(7.8) 20 123.2,CH 7.03,t(7.8) 21 132.2,CH 7.40,t(7.8) 22 121.9,CH 8.48,d(7.8) 23 137.9,C NH 10.17,s glycine 24 167.5,C 25 54.1,CH2 5.25,d(14.8);3.10d(14.8) 26 35.9,CH3 3.01,s [0077] [0078] 经高分辨质谱和电喷雾质谱测定，目标化合物的分子量为458.1716，结合表1、图1-9的分析结果，可知该物质为环肽化合物，分子式为C26H24N3O5，结构式如下式所示，命名为clavatustide B，确定2位绝对构型为R型： [0079] [0080] 实施例5 环肽化合物的抗肿瘤活性分析 [0082] 取对数生长期HepG2细胞，以含0.25%胰蛋白酶的PBS液充分消化后，用RPMI16404 培养基稀释成5×10/mL的单细胞悬液，接种于96孔细胞培养板，每个浓度复种3孔，每孔180μL；置37℃培养箱温育12h 后加药，药物组每孔加含不同浓度（0.5μg/100μL、 1μg/100μL、2μg/100μL、3μg/100μL、3.5μg/100μL、4μg/100μL、5μg/100μL）clavatustide B的供试液，平行设空白对照组，共培养48h。 [0083] 按公式计算得到化合物clavatustide B对肿瘤细胞生长的抑制率以及半数抑制浓度（IC50）。由实验结果可知，该化合物对HepG2细胞的IC50=15μg/mL，表明该化合物具有较好的抗肿瘤作用。 [0084] 为了解clavatustide B抑制HepG2细胞的机制，将HepG2细胞用70%冷乙醇于4℃下固定，固定后的细胞与0.5mL DNA Prep LPR（Coulter DNA-Prep Reagents kit,Beckman Coulter,USA）于黑暗条件混合20分钟，然后用流式细胞仪进行分析，并用ModFit LT软件计算各期细胞群，计算结果见表2。 [0085] 表2 各时期细胞群组成 [0086]G1 phase S phase G2 phase Clavatustide B 67.57% 11.92% 20.52% Blank control 41.03% 19.49% 39.48% [0087] 由表2可见，Clavatustide B通过诱导HepG2细胞G1期阻滞，并抑制G1/S转换，从而实现对HepG2细胞的生长抑制。 [0088] 实施例6 含环肽化合物滴丸制剂的制备 |
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