具有抗菌和抗肿瘤活性的新大环内酯化合物专利检索-杂环化合物有1个氮原子和1个氧原子作为仅有的杂环原子的环与C07D 261/00至C07D 267/00中1个以上的组相应的专利检索查询-专利查询网

具有抗菌和抗肿瘤活性的新大环内酯化合物
申请号	CN200680046689.5	申请日	2006-11-28	公开(公告)号	CN101326170A	公开(公告)日	2008-12-17
申请人	云南省玉溪市维和制药有限公司;			发明人	陈庚辉; 李滨; 约翰·韦伯斯特; 胡凯基; 李建雄;
摘要	本发明涉及具有抗菌和抗肿瘤活性的式I所示新大环内酯化合物，其可用作治疗微生物感染(特别是涉及抗药性葡萄状球菌的传染病)和治疗人或动物癌症的药物和/或农药。
权利要求	1.式I的化合物或其盐：其中，R1，R2，R3和R4独立地选自如下组成的组：H；烷基，环烷基，烯基，炔基，芳基或芳烷基，其中上述基团为取代的或未取代的；卤素，硝基，CN，羟基，氨基，COR8，NR9R10，S(O)2NR9R10；S(O)nR9， n＝0-2；OR11和杂环基； R5和R6独立地选自如下组成的组：H；烷基，环烷基，烯基，炔基，芳基或芳烷基，其中上述基团为取代的或未取代的；卤素，硝基，CN，羟基，氨基，COR8，NR9R10； R7选自如下组成的组：H；烷基，环烷基，烯基，炔基，芳基或芳烷基和杂环基，其中上述基团为取代的或未取代的； R8选自H；烷基，环烷基，芳基或芳烷基，其中上述基团为取代的或未取代的； R9和R10选自H；烷基，环烷基，芳基或芳烷基，其中上述基团为取代的或未取代的； R11选自H；烷基，环烷基，芳基，芳烷基或酰基，其中上述基团为取代的或未取代的； -(X-Z)-的结构如下： R12，R13，R14和R15独立地选自如下组成的组：H；烷基，环烷基，烯基，炔基，芳基或芳烷基，其中上述基团为取代的或未取代的；卤素，硝基，CN，羟基，氨基，COR8，NR9R10，S(O)2NR9R10；S(O)nR9，n＝0-2； OR11和杂环基。 2.根据权利要求1所述的化合物，其中R1为羟基，R2，R3和R4为 H。 3.根据权利要求2所述的化合物，其中R6为羟基，R7为异丁基。 4.根据权利要求3所述的化合物，其中R12和R13为羟基，R14和R15 为H。 5.根据权利要求1所述的化合物，其中，-(X-Z)-是-(CHR16-CHR17)-， R16和R17独立地选自如下组成的组：H；烷基，环烷基，烯基，炔基，芳基或芳烷基，其中上述基团为取代的或未取代的。 6.根据权利要求1所述的化合物，其中-(X-Z)-为如下结构： 7.根据权利要求1所述的化合物，其中-(X-Z)-为如下结构： 8.根据权利要求1所述的化合物，其中-(X-Z)-为如下结构： R14，R15，R16和R17独立地选自如下组成的组：H；烷基，环烷基，烯基，炔基，芳基或芳烷基，其中上述基团为取代的或未取的；卤素，硝基，CN，羟基，氨基，COR8，NR9R10，S(O)2NR9R10；S(O)nR9，n＝0-2； OR11和杂环基。 9.一种药物组合物，其包括式I所示的化合物或其盐，其中，R1，R2，R3和R4独立地选自如下组成的组：H；烷基，环烷基，烯基，炔基，芳基或芳烷基，其中上述基团为取代的或未取代的；卤素，硝基，CN，羟基，氨基，COR8，NR9R10，S(O)2NR9R10；S(O)nR9， n＝0-2；OR11和杂环基； R5和R6独立地选自如下组成的组：H；烷基，环烷基，烯基，炔基，芳基或芳烷基，其中上述基团为取代的或未取代的；卤素，硝基，CN，羟基，氨基，COR8，NR9R10； R7选自如下组成的组：H；烷基，环烷基，烯基，炔基，芳基或芳烷基和杂环基，其中上述基团为取代的或未取代的； R8选自H；烷基，环烷基，芳基或芳烷基，其中上述基团为取代的或未取代的； R9和R10选自H；烷基，环烷基，芳基或芳烷基，其中上述基团为取代的或未取代的； R11选自H；烷基，环烷基，芳基，芳烷基或酰基，其中上述基团为取代的或未取代的； -(X-Z)-的结构如下： R12，R13，R14和R15独立地选自如下组成的组：H；烷基，环烷基，烯基，炔基，芳基或芳烷基，其中上述基团为取代的或未取代的；卤素，硝基，CN，羟基，氨基，COR8，NR9R10，S(O)2NR9R10；S(O)nR9，n＝0-2； OR11和杂环基。 10.根据权利要求9所述的组合物，其中-(X-Z)-是-(CHR16-CHR17)-， R16和R17独立地选自如下组成的组：H；烷基，环烷基，烯基，炔基，芳基或芳烷基，其中上述基团为取代的或未取代的。 11.根据权利要求9所述的组合物，其中-(X-Z)-为如下结构： 12.根据权利要求9所述的组合物，其中-(X-Z)-为如下结构： 13.根据权利要求9所述的组合物，其中-(X-Z)-为如下结构： R14，R15，R16和R17独立地选自如下组成的组：H；烷基，环烷基，烯基，炔基，芳基或芳烷基，其中上述基团为取代的或未取代的；卤素，硝基，CN，羟基，氨基，COR8，NR9R10，S(O)2NR9R10；S(O)nR9，n＝0-2； OR11和杂环基。 14.式I所示的化合物或其盐在制备治疗微生物感染和肿瘤疾病的药物中的应用；其中，R1，R2，R3和R4独立地选自如下组成的组：H；烷基，环烷基，烯基，炔基，芳基或芳烷基，其中上述基团为取代的或未取代的；卤素，硝基，CN，羟基，氨基，COR8，NR9R10，S(O)2NR9R10；S(O)nR9， n＝0-2；OR11和杂环基； R5和R6独立地选自如下组成的组：H；烷基，环烷基，烯基，炔基，芳基或芳烷基，其中上述基团为取代的或未取代的；卤素，硝基，CN，羟基，氨基，COR8，NR9R10； R7选自如下组成的组：H；烷基，环烷基，烯基，炔基，芳基或芳烷基和杂环基，其中上述基团为取代的或未取代的； R8选自H；烷基，环烷基，芳基或芳烷基，其中上述基团为取代的或未取代的； R9和R10选自H；烷基，环烷基，芳基或芳烷基，其中上述基团为取代的或未取代的； R11选自H；烷基，环烷基，芳基，芳烷基或酰基，其中上述基团为取代的或未取代的； -(X-Z)-的结构如下： R12，R13，R14和R15独立地选自如下组成的组：H；烷基，环烷基，烯基，炔基，芳基或芳烷基，其中上述基团为取代的或未取代的；卤素，硝基，CN，羟基，氨基，COR8，NR9R10，S(O)2NR9R10；S(O)nR9，n＝0-2； OR11和杂环基。 15.根据权利要求14的应用，其中-(X-Z)-是-(CHR16-CHR17)-，R16 和R17独立地选自如下组成的组：H；烷基，环烷基，烯基，炔基，芳基或芳烷基，其中上述基团为取代的或未取代的。 16.根据权利要求14的应用，其中-(X-Z)-为如下结构： 17.根据权利要求14的应用，其中-(X-Z)-为如下结构： 18.根据权利要求14的应用，其中-(X-Z)-为如下结构： R14，R15，R16和R17独立地选自如下组成的组：H；烷基，环烷基，烯基，炔基，芳基或芳烷基，其中上述基团为取代的或未取代的；卤素，硝基，CN，羟基，氨基，COR8，NR9R10，S(O)2NR9R10；S(O)nR9，n＝0-2； OR11和杂环基。
说明书全文	技术领域本发明提供具有抗菌和抗肿瘤活性的新化合物WBI-3001系列。本发明还提供WBI-3001系列的制备方法，包括培养致病杆菌属的种 (Xenorhabdus species)的微生物的步骤。本发明更进一步提供包含 WBI-3001、其盐的抗菌和抗肿瘤组合物和本发明的化合物作为抗菌和抗肿瘤药物的使用方法。下图表示了WBI-3001系列的结构式，其为一组新的化合物，式I 其中，R1，R2，R3，R4，R5，R5′，R6，R6′，R7，R7′，R8，R8′，R9 和R9′独立地选自如下组成的组：H；烷基，环烷基，烯基，炔基，芳基或芳烷基，其中上述基团为取代的或未取代的；卤素，硝基，CN，羟基，氨基，COR10，NR11R12，S(O)2NR11R12；S(O)nR11，n＝0-2；OR13和杂环基。R5和R5′；R6和R6′；R7和R7′；R8和R8′；R9和R9′不能同时是氮， CN，羟基，氨基，COR10，NR11R12，S(O)2NR11R12。 R10选自H；烷基，环烷基，芳基，或芳烷基，其中上述基团为取代的或未取代的；或NR11R12，或OR11； R11和R12选自H；烷基，环烷基，芳基或芳烷基，其中上述基团为取代的或未取代的； R13选自H；烷基，环烷基，芳基，芳烷基或酰基，其中上述基团为取代的或未取代的。背景技术因为社会的、法律的、生物学的改变，曾经一度通过合成杀虫剂和化学药物而得到控制的一些有害物质和人、家养动物和农作物疾病又重新出现在世界的许多地方，并且最近几年越来越明显。在医学和农林学方面，许多微生物对杀虫剂和化学药物的抗性的发展正对人类产生越来越多的挑战。此外，人类和动物肿瘤疾病的治疗仍旧是一个艰巨的任务。因此，对用以有效控制疾病的新农药(agrochemicals)和新药物有迫切的需要。从栖息于土壤中的微生物获得的微生物产品的多样性成为新药物和农药研发的传统资源库。最近的一个成果是线虫-细菌组合作为对抗虫害的生物控制药物的商业应用。该生物控制药物的一个重要特征是与线虫共生的细菌(致病杆菌属的种(Xenorhabdus spp.)或发光杆菌属的种(Photorhabdus spp.))产生大量具备生物活性的代谢物，包括抑制细菌、真菌和酵母生长的抗菌物质(Webster等，2002)。虽然关于致病杆菌属的种(Xenorhabdus spp.)和发光杆菌属的种 (Photorhabdus spp.)的生物学方面的出版物很有限，但已经认识到那些生物活性物质是由这些细菌产生的。这些特殊的化合物中的一些已经被分离和鉴定，并且它们的结构也已经被阐明(Forst和Nealson，1996)。最近，发现致病杆菌属的种(Xenorhabdus species)和发光杆菌(Photorhabdus luminescens)的无细胞培养肉汤对多种农业和医学上重要的真菌是有对抗作用的(Chen等人，1994)。从这些细菌培养物中发现了两种类型的新抗菌物质：nematophin(Webster等，US 专利5569668)和xenorxides(Webster 等，US专利6316476)。并且，xenorxides已经被证实具有非常强的抗肿瘤活性(Webster等，US专利6020360)。作为这些细菌正在进行的研究中的一部分，WBI-3001系列(一组新的化学物质)发现有非常强的抗菌和抗肿瘤活性，并且成为本发明的主题。现有技术资料没有记载WBI-3001的存在及其应用或者作为抗菌和/抗肿瘤药物的任何可以使用的方面。发明内容微生物本研究中使用的伯氏致病杆菌(Xenorhabdus bovienii)及其线虫共生体斯氏线虫(Steinernema feltiae)采集于加拿大英属哥伦比亚大学的土壤，并且培养于Dr.J.M.Webster在Simon Fraser University，Burnaby，B.C.， Canada V5A 1S6的生物学系的实验室。简要的说，以25个侵染性幼虫 (infective juvenile，IJ)/幼虫的比例，用带有伯氏致病杆菌(X.bovienii)A21 株的侵染性幼虫线虫侵染大蜡螟(Greater Wax Moth，Galleria mellonella) 的终龄幼虫。24到48小时后，通过将死去的昆虫幼虫蘸满95％的酒精并将其点燃的方式对其进行表面消毒。解剖尸体，将血淋巴放置于琼脂培养基上，在室温下进行黑暗培养。根据布达佩斯条约，用于分离本发明化合物的菌株保藏于Rochville，Md.的美国典型培养物保藏中心，保藏号为ATCC 55743。Webster等人在其#6583171号美国专利中，对该菌株的分离步骤和该菌株的特征进行了充分的描述。 WBI-3001的制备微生物伯氏致病杆菌的培养产生了新物质WBI-3001。为了制备 WBI-3001，将伯氏致病杆菌培养(发酵)，例如在大约25℃，沉没在包含碳源(碳水化合物)和氮源的水性培养基中进行有氧培养，直到培养基具备了WBI-3001所形成的抗菌活性。发酵过程可以持续约48-96小时，发酵结束时，生成抗菌的WBI-3001，且其可以从发酵培养基中分离和纯化。在发酵完成后，发酵肉汤可以进行过滤或离心分离，用盐酸将滤液的pH值调节到大约7.0或者不对pH值进行调节。然后，滤液可以用与水不混溶的有机溶剂，例如，用乙酸乙酯或氯仿进行萃取。混合的有机层(例如合并的乙酸乙酯或氯仿萃取液)可以被真空浓缩(例如在大约 30℃)成油性渣体(“糖浆”)。这些油可以与小量的有机溶剂混合，并在硅胶柱上进行色谱分析。在上样后，可利用氯仿或其他有机溶剂洗脱生物活性部分。这些生物活性部分可以用高效液相色谱(HPLC)在有机溶液和/或水溶液中进一步纯化。本发明的化合物包括WB1-3001及其盐。本文所用的术语“盐”是指其与无机和/或有机的酸和碱形成的酸性盐和/或碱性盐。合适的酸例如包括盐酸、硫酸、硝酸、苯磺酸、醋酸、马来酸、酒石酸和可药用的类似酸。优选的是可药用的盐，特别是当使用本发明的化合物作为药物的时候。其它盐例如在这些化合物的加工过程中，或在非药物型用途的需求下应用。 WBI-3001及其应用 WBI-3001由于对动物和植物的致病微生物具有抗菌活性，其可用于预防和治疗由这些微生物引发的感染，特别是，由对抗生素有抗性的细菌(例如葡萄球菌属的细菌)引发的感染。可治疗的宿主包括植物和动物，特别是如狗、猫和其他家养动物等哺乳动物，尤其是人。 WBI-3001还对一些人癌细胞系具有很强的抗肿瘤活性。最重要的， WBI-3001抑制人肺癌的生长以及人宫颈癌和乳腺癌的生长。剂型、给药方式以及剂量，可以由熟练的技术人员进行选择。对成年人的示例性剂量为每日大约2.5mg到大约2,000mg。对哺乳动物的给药方式例如可以是口服、肠胃外或者局部给药(topical)。对植物宿主的给药方式例如可以通过施予种子、树叶或其他植物部分，或者施予土壤中来实现。当WBI-3001或其盐被用于治疗的时候，它们可以被单独使用或者以药学上合适的制剂形式使用，所述制剂含有活性成分以外的一种或多种常规的载体。根据疾病的性质和/或给药途径，本发明的组合物可以用已知的方法来制备。药物组合物的例子包括适于口服、局部或肠胃外给药的任何固体组合物(片剂、丸剂、胶囊、颗粒、粉末等)或液体组合物(溶液、悬浮液或乳剂)，它们可以仅包括纯化合物或其盐，也可以由该化合物或其盐与任何的载体或其他药学活性化合物组合在一起。这些组合物在肠胃外使用前需要进行灭菌。给药剂量取决于疾病的种类、宿主的类型(包括其年龄，健康状况和体重)、同时进行的其他类型的治疗(如果有其他类型的治疗)、以及治疗的频率和治疗比。示例性地，使用的活性成分的剂量水平，在静脉给药时是0.1到约200mg/kg宿主体重；肌肉给药时是1到约500mg/kg 宿主体重；口服给药时是5到约1000mg/kg宿主体重；滴鼻给药时是5 到约1000mg/kg宿主体重；喷雾给药时是5到约1000mg/kg宿主体重。以浓度表示，用于皮肤、鼻腔、咽喉、支气管、阴道、直肠或者眼睛局部给药的本发明组合物含有浓度为组合物的约0.01到约50％w/w，优选约1到约20％w/w的活性成分。同样地，对于肠胃外给药，使用的组合物可含有约0.05到约50％w/v，优选约5到约20％w/v的本发明活性成分。在动物和人的疾病的治疗中，用作抗菌药物和/或抗肿瘤药物的活性成分的WBI-3001或其盐，可以利用现有技术中的药用物质和确定的工艺容易地制成单位剂型。可以选择合适的固体或液体赋形剂(vehicles)或者稀释剂，通过本领域技术人员已知的方法制备该组合物。作为农业应用，该抗菌组合物可以用这些活性成分之一置于惰性载体内制成。如果制成固体，活性成分可以与例如漂白土(Fuller′s earth)、高岭土、硅土或其他可润湿的无机稀释剂等常用载体混合。也可以使用流动性粉尘制剂，其通过将干燥的活性成分与诸如滑石粉、硅藻土 (kieselguhr)、叶蜡石、粘土和硅藻土(diatomaceous earth)等的细微固体混合而制得。根据其在液体载体中的溶解性，粉末可以以悬浮液或溶液形式施用。可以使用压力喷雾剂，特别是活性成分弥散于低沸点的分散剂溶剂载体中的气雾剂。重量百分比可以根据该组合物被应用的方式和所使用的制剂进行调整，通常，该抗菌组合物中包括0.005wt％到95wt％的活性成分。该抗菌组合物可以与其他成分一起使用，所述其他成分包括生长调节因子、杀虫剂和肥料等。有助于应用、易于操作、维持化学稳定性和增强效力的活性成分制剂可能需要添加多种不同的物质。根据活性成分的溶解性、火灾隐患(fire hazard)和闪点、乳化度、比重和经济因素选择溶剂。可加入佐剂以增强活性成分，还可以包括阴离子、阳离子或非离子的表面活性剂。稳定剂和防冻剂可以延长保藏时间。另外，可以加入增效剂、粘结剂、铺展剂(spreader)和除臭剂化合物以改善商业制剂的处理特性。可选的，该活性成分可与诸如碳酸钙等惰性载体组合制成丸，或制成其他可消耗的给药器(consumable delivery device)，包括用于定量传输活性成分的控释给药器。本发明的化合物还可用作抗菌药物，用于抑制现存微生物的生长或者根除活宿主表面上或活宿主外媒介(medium)内的微生物。本发明的化合物和/或它们的盐例如可用作消毒剂，对多种易于微生物生长的固体或液体媒介进行消毒。本发明化合物的合适用量可根据本领域技术人员已知的方法来确定。下面的例子用于进一步说明本发明，但其并不用于以任何形式限定本权利要求书的范围。具体实施方式实施例1.从伯氏致病杆菌培养肉汤中制备和分离WBI-3001 伯氏致病杆菌的初级培养物维持14天后进行次级培养。通过将一接种环的培养物加入到100ml锥形烧瓶中的50ml胰酶大豆肉汤(TSB)中，制备接种体(Inocula)的初级培养物。在25℃下，培养物在Eberbach转动振荡器(Eberbach gyrorotary shaker)上以120rpm震动24小时。在 2000ml的烧瓶中，通过将100ml该细菌培养物加入到900ml的TSB中开始细菌发酵。烧瓶在25℃下于Eberbach转动振荡器上进行黑暗培养。96 小时后，培养物立即进行离心分离(12,000xg，20分钟，4℃)以分离出细菌细胞。伯氏致病杆菌接种到二十升培养基。接种的培养基在37℃ 下培养3天。然后，培养基被研碎并用20L的乙酸乙酯萃取三次。合并萃取物并进行真空蒸发。蒸发后得到大约20克油性物质。向该油性物质加入100ml己烷，搅拌所得混合物半小时。通过此操作，出现了固体沉淀物。通过过滤得到大约10克固体。将这些固体重新溶解在20ml氯仿中，并装入硅胶柱通过色谱分析进行分离。氯仿和甲醇(9∶1)混合物为洗脱剂。通过TLC监测这些化学物质的分离。对色谱分析纯化所得的物质进行抗菌活性实验。得到一个具有显著抗菌活性的化学物质，用 NMR和MS对其进行鉴别。该化学物质的结构如下所示：例2.WBI-3001的鉴定用C5D5N5在Bruker WM600光谱仪上得到NMR光谱。通过70eV 下操作的惠普5985B gc/ms体系使用直接进样探针(direct probe)得到低分辨率MS。通过上述相同的设备使用异丁烷得到CIMS图谱。用Kratos MS80设备得到高分辨率MS。用配备沃特斯(Waters)996 PDA检测器的沃特斯2695进行HPLC和UV分析。 1H NMR(C5D5N)(600Hz)δ0.87(dd，6H，J＝7.2Hz)，1.42(mult.，1H)， 1.83(mult.，2H)，1.92(mult.，2H)，2.21(mult.，1H)，2.35(mult.，1H)，2.94(dd， 1H，J＝16Hz，J＝3Hz)，3.21(dd，1H，J＝16Hz，J＝13Hz)，3.41(mult.，1H)， 4.40(mult.，1H)，4.66(mult.，1H)，4.72(dd.，1H，J＝16Hz，J＝3Hz)，4.88(d，1H， J＝6Hz)，5.02(dd，1H，J＝6Hz，J＝3Hz)，6.62(d，1H，J＝7Hz)，6.97(d，1H， J＝8Hz)，7.35(t，1H，J＝8Hz)，8.78(d，1H，J＝9Hz). 13C NMR(C5D5N)(600Hz)δ21.76(C-1)，23.41(C-1’)，24.70(C-8)， 24.94(C-2)，25.91(C-7)，30.10(C-6)，39.93(C-3)，45.53(C-12)，49.39(C-4)， 62.46(C-9)，71.78(C-11)，74.16(C-10)，81.77(C-5)，109.07(C-18)， 115.95(C-20)，118.67(C-19)，136.50(C-17)，140.78(C-15)，162.40(C-16)， 170.01(C-13)，173.99(C-14). MS：408(CI)(M+1) UV(CH3CN∶H2O＝2∶8)：Dmax(logε)314.8nm(3.7). 例3.WBI-3001作为抗菌药物进行了以下实验，其显示了WBI-3001的抗菌特性。为了确定 WBI-3001的最小抑制浓度(MIC)，采用了标准稀释方法。测试在35℃下进行，并在培养24小时后测定MICs。表1显示了这些化合物对每种微生物的抑制所测定的MICs。得到的结论是，从致病杆菌(Xenorhabdus)分离出的WBI-3001具有有效的抗菌特性，特别是对一些有抗生素抗性的葡萄球菌菌株的抗菌特性。表1：24hr和48hr时间点下，胰蛋白酶大豆肉汤中，WBI-3001和红霉素的MICs(注：MIC值的单位是μg/ml). 细菌样品 WBI-3001 红霉素大肠杆菌(Escherichia coli) 4 1 表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis) 8 0.25 金黄色葡萄球菌MSRA(S.aureus MSRA) 4 ＞32 粪肠球菌(Enterococcus faecalis) 32 ＞32 化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes) 4 0.03 绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa) ＞32 ＞32 耐甲氧西林株的临床分离物(clinical isolates) 例4.WBI-3001作为抗肿瘤药物 WBI-3001体外的抗肿瘤活性已经在人肺癌H460、乳腺癌MCF-7和宫颈癌Hela的细胞培养物中得到确认。测试用Skehan等人(1990)所描述的方法进行。WBI-3001对这些癌细胞都表现出很强的抗肿瘤活性。表2.WBI-3001对三种肿瘤细胞系的抗肿瘤活性 IC50(μg/ml) 化合物 H460 MCF-7 Hela WBI-3001 0.1 0.81 0.24 尽管上述说明含有许多具体特征，然而它们不应当被认为是对本发明的限定，只是优选的实施方式的例子。因此，本发明的范围不应当由所提供的实施例来限定，而应当通过权利要求和其法律等同物来限定。

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