[0001] 本发明涉及化学领域，尤其涉及医药，特别是一种叶酸类似物及用于医疗的叶酸类似物的盐。背景技术：

[0002] 还原型叶酸(FH4)是嘌呤类生物合成和脱氧尿苷酸(dUMP)转化成胸苷酸(dTMP)过程中必需的一碳单位转运体。在这些生化反应中，还原型叶酸被氧化，经二氢叶酸还原酶(DHFR)再生为活性的还原型叶酸。

[0003] 甲氨蝶呤(MTX)和类似化合物是公知的强烈地结合DHFR的药物，这些药物能抑制二氢叶酸还原成四氢叶酸，导致dTMP和/或嘌呤类缺陷，DNA合成中断，进而产生细胞毒作用，导致细胞死亡。这些药物已被研制成抗癌药物，而且目前作为临床药物占据了很重要的位置。Pemetrexed(MTA)是新近研究开发的多靶点的抗叶酸药物，通过抑制至少3种与叶酸代谢、嘌呤和嘧啶合成有关的酶包括DHFR胸苷酸合酶(TS)，甘氨酰胺核苷酸甲酰转移酶(GARFT)，对多种实体瘤有抗癌作用。

[0004] 由美国普林斯顿大学E.C.Taylor教授研究小组与礼莱(Eli Lily)公司合作开发了多个抗癌药物，Lometrexol(DDATHF)它具有蝶啶环的基本骨架。但其作用机理与这类结构的药物不同，对二氢叶酸还原酶(DHFR)没有抑制活性，而主要是通过在嘌呤生物合成途径的初始步骤中抑制甘氨酰胺核苷酸甲酰转移酶(GARFT)的机理完成(医药化学杂志28，9149(1985))。

[0005] MTX主要通过叶酸拮抗作用抗癌，有较强的毒性，对实体瘤作用不大，还存在着肿瘤细胞对这种药的抗药性，因此不能获得满意的治疗效果。因此特别期望开发出新的作用机理对癌细胞显示出选择性毒性的抗癌药物。发明内容：

[0006] 本发明的目的在于提供一种叶酸类似物及用于医疗的叶酸类似物的盐，所述的这种叶酸类似物及用于医疗的叶酸类似物的盐要解决现有技术中抗癌药物有较强毒性、对实体瘤作用有限、肿瘤细胞对抗癌药物产生抗药性的技术问题。

[0007] 本发明的这种叶酸类似物及用于医疗的叶酸类似物的盐是下列通式

[0008] (I)表示的化合物，

[0009]

[0010] 通式(I)

[0011] 其中R＝OH、或NH2、或OCH3。

[0012] 当R＝OH时，即：N-{4-[2-(2-氨基-4-甲氧基-5，6，7，8-四氢-9H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮卓-6-基)]-乙基-苯甲酰基}-L-谷氨酸。

[0013] 当R＝NH2时，即：N-{4-[2(2-氨基-4-羟基-5，6，7，8-四氢-9H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮卓-6-基)]-乙基-苯甲酰基}-L-谷氨酸。

[0014] 当R＝OCH3时，即：N-{4-[2-(2，4-二氨基-5，6，7，8-四氢-9H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮卓-6-基)]-乙基-苯甲酰基}-L-谷氨酸。

[0015] 进一步，R还可以是或Cl或OCH2CH3

[0016] 进一步的，所述的盐为钠盐、或者钾盐、或者其他适用的金属离子盐、或者铵盐、或者二乙胺盐、或者乙二胺盐、或者其他适用的有机胺盐。

[0017] 本发明还提供了上述的叶酸类似物及用于医疗的叶酸类似物的盐在制备治疗癌症的药物中的应用。

[0018] 本发明还提供了一种制备上述的叶酸类似物及用于医疗的叶酸类似物的盐的中间体，所述的中间体是具下列通式(II)表示的化合物，

[0019]

[0020] 通式(II)

[0021] 其中R＝OH、或Cl、或NH2、或OCH3、或OCH2CH3；R’为低级烷氧基、或苄氧基、或谷氨酸酯。

[0022] 进一步的，低级烷氧基选自甲氧基、或者乙氧基。

[0023] 进一步的，谷氨酸酯选自二甲酯、或者二乙酯。

[0024] 本发明还提供了一种制备上述的叶酸类似物及用于医疗的叶酸类似物的盐的中间体，所述的中间体是通式(III)表示的化合物，

[0025]

[0026] 通式(Ⅲ)

[0027] 其中R＝OH、或Cl、或NH2、或OCH3、或OCH2CH3；R’为低级烷氧基、或苄氧基、或谷氨酸酯。

[0028] 进一步的，低级烷氧基选自甲氧基、或者乙氧基。

[0029] 进一步的，谷氨酸酯选自二甲酯、或者二乙酯。

[0030] 本发明在合成过程可以先制得中间体III(R’＝OCH3，OC2H5，等)再与谷氨酸酯反应(路线A)，也可以先引入谷氨酸酯，再引入偶氮结构，然后还原关环(路线B)。

[0031] 以R＝OCH3为例，但不仅限于该官能团。

[0032] 合成路线A：以丁二烯和硝基甲烷反应得5-乙烯基-4，5-二氢-恶唑，再进行还原得3-羟基-4-烯-戊胺，所得的胺与2-氨基-4，6-二氯-嘧啶反应得2-氨基-6-(3-羟基-4-烯-1-基)-氨基-4-氯-嘧啶，和甲醇钠作用后氯被甲氧基取代，所得产物与对碘苯甲酸甲酯进行Heck反应得4-[5-(2-氨基-4-甲氧基-嘧啶-6-氨基)-3-氧代-戊基]-苯甲酸甲酯，然后和对氯苯重氮盐反应生成棕红色固体4-{5-[2-氨基-4-甲氧基-5-(4-氯苯偶氮基)-6-嘧啶]-氨基-3-氧代-戊基}-苯甲酸甲酯，该化合物在醋酸中还原关环得关键中间体4-[2-(2-氨基-4-甲氧基-5，6，7，8-四氢-9H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮卓-6-基)-乙基]-苯甲酸甲酯。该中间体经水解，然后和谷氨酸酯反应得N-{4-[2-(2-氨基-4-甲氧基-5，6，7，8-四氢-9H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮卓-6-基)]-乙基-苯甲酰基}-L-谷氨酸二乙酯(7)，化合物(7)再进行水解得N-{4-[2-(2-氨基-4-甲氧基-5，6，7，8-四氢-9H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮卓-6-基)]-乙基-苯甲酰基}-L-谷氨酸(8)，化合物(8)用氨水处理得N-{4-[2-(2，4-二氨基-5，6，7，8-四氢-9H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮卓-6-基)]-乙基-苯甲酰基}-L-谷氨酸，化合物(7)用三甲基碘化硅处理得N-{4-[2-(2-氨基-4-羟基-5，6，7，8-四氢-9H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮卓-6-基)]-乙基-苯甲酰基}-L-谷氨酸(9)。

[0033] 合成路线B：用N-(4-碘代苯甲酰)-谷氨酸二乙酯与2-氨基-4-甲氧基-6-(3-羟基-4-烯-1-戊氨基)-嘧啶(2)进行Heck反应得N-{4-[5-(2-氨基-4-甲氧基-嘧啶-6-基)-氨基-3-氧代-戊基]-苯甲酰基}-L-谷氨酸(10)，化合物(10)与对氯苯重氮盐反应得N-{4-[5-(2-氨基-4-甲氧基-5-(4-氯苯偶氮基)-嘧啶-6-基)-氨基-3-氧代-戊基]-苯甲酰基}-L-谷氨酸二乙酯(11)，然后还原关环得化合物(7)，与合成路线A所得化合物一致。

[0034] 虽然大量的不对称碳原子存在于本发明的化合物及其中间体中，但除了谷氨酸的侧链中不对称碳原子具有S(L)的绝对构型之外，其它不对称中心的绝对构型可以是S或R的混和物。在这种情况下，存在非对映异构体，而且需要时可通过常规分离和纯化手段对其进行分离。

[0035]

[0036]

[0037] 本发明和已有技术相比，其技术进步是显而易见的。本发明的叶酸类似物或其盐可以对多个肿瘤细胞具有强大的抑制生长活性。具体实施方式：

[0038] 方法A：

[0039] 实施例1

[0040] 4-氯-2-氨基-6-(3-羟基-4-烯基-1-戊氨基)-嘧啶(1)的合成

[0041] 50mmol 4，6-二氯-2-氨基-嘧啶和5mmol～60mmol 3-羟基-4-烯-1-戊胺溶于200ml乙醇中加入51mmol三乙胺，N2保护下回流4h。除去溶剂，残留固体加CH2Cl2溶剂溶解，过滤除去不溶物，滤液浓缩，残留物用硅胶柱层析。洗脱剂MeOH/CH2Cl2＝2/98。得产物8.31g，收率73％。

[0042] 1H NMR(CDCl3)δ：1.65～1.85(2H，dm)，3.30-3.63(m，2H)，4.2(1H，dm)，4.97(2H，sb)，5.03(1H，d)，5.27(1H，d)，5.80(1H，s)，5.91(1H，m)。

[0043] 实施例2

[0044] 2-氨基-4-甲氧基-6-(3-羟基-4-烯基-1-戊氨基)-嘧啶(2)的合成

[0045] 在100ml甲 醇 中 加 入6.48g(120mmol) 甲 醇 钠 和5g(22mmol)4-氯-2- 氨基-6-(3-羟基-4-烯基-1-戊氨基)-嘧啶，N2保护下回流48h，减压除去大部分溶剂，加入100ml饱和NH4Cl水溶液，用CH2Cl2萃取(100mlx3)，有机层用无水Na2SO4干燥。浓缩得淡黄色固体3.13g，产率63.6％。

[0046] 1H NMR(CDCl3)δ：1.61-1.80(2H，dm)，3.21-3.62(2H，dm)，3.80(3H，S)，4.19(1H，d)，4.73(2H，S，NH2)，4.88(1H，S，NH)，5.09(1H，d)，5.25(1H，d)，5.14(1H，s)，5.88(1H，m)。

[0047] 实施例3

[0048] 4-[5-(2-氨基-4-甲氧基-嘧啶-6-氨基)-3-氧代-戊基]-苯甲酸甲酯(3)

[0049] 560mg(2.5mmol)2-氨基-4-甲氧基-6-(3-羟基-4-烯基-1-戊氨基)-嘧啶，720.5mg(2.75mmol)4-碘苯甲酸甲酯，577.5mg(6.87mmol)NaHCO3，28mg(0.125mmol)Pd(AcO)2，885.5mg(2.75mmol)Bu4NBr和0.5g粉碎的4A分子筛，溶于20ml无水DMF中，N2保护下室温搅拌72h，过滤，滤液减压除去溶剂，得棕红色固体，硅胶柱层析梯度洗脱
1.CH2Cl2，2.CH2Cl2/MeOH(98：2)得略带淡棕色固体0.77g，收率86％，mp110-113℃，Rf＝
0.489(CH2Cl2/MeOH＝20：1)。

[0050] 1H NMR(CDCl3)δ：2.66(2H，t)，2.74(2H，t)，2.93(2H，t)，3.46(2H，m)，3.77(3H，s)，3.88(3H，s)，4.67(2H，s，NH2)，4.95(1H，s，NH)，5.09(1H，s)，7.21(2H，d)，7.92(2H，d)。

[0051] 实施例4

[0052] 4-{5-[2-氨基-4-甲氧基-5-(4-氯苯偶氮基)-6-嘧啶]-氨基-3-氧代-戊基}-苯甲酸甲酯(4)

[0053] 1.4g 4-氯苯胺溶于22.5ml 3N盐酸中，冷却至0℃，加入0.75g NaNO2的水溶液(15ml)，制得重氮盐。10mmol(3.58g)4-[5-(2-氨基-4-甲氧基-嘧啶-6-氨基)-3-氧代-戊基]-苯甲酸甲酯(化合物3)溶于45ml冰醋酸和45ml H2O的混和物中，加入18g CH3CO2Na·3H2O，冷却到0℃，然后滴加先前制得的重氮盐溶液，加完后反应混和物室温搅拌过夜，有黄色固体析出。抽滤固体，用大量水洗，干燥得淡黄色固体3.39g，收率68％，mp63～65℃。

[0054] 1H NMR(CDCl3)δ：2.71 ～ 2.78(4H，m)，2.95(2H，t)，3.84(2H，q)，3.89(3H，s)，4.02(3H，s)，5.10(2H，b)，7.19(2H，d)，7.39(2H，d)，7.67(2H，d)，7.89(2H，d)，10.79(1H，b)。

[0055] 实施例5

[0056] 4-[2-(2-氨基-4-甲氧基-5，6，7，8-四氢-9H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮卓-6-基)-乙基]-苯甲酸甲酯(5)

[0057] 1.31g(2.7mmol)4-{5-[2-氨基-4-甲氧基-5-(4-氯苯偶氮基)-6-嘧啶]-氨基-3-氧代-戊基}-苯甲酸甲酯(化合物4)溶于200ml AcOH中，加入81mmol(5.26g)zn粉，N2保护下回流2h，冷却，过滤，滤液减压除去溶剂，硅胶柱层析，洗脱剂CH2Cl2/MeOH，得淡黄色固体产物0.573g，收率59.4％，Rf＝0.52(CH2Cl2/MeOH＝15：1)。

[0058] 1H NMR(CDCl3)δ：1.6～2.1(4H，m)，2.6～3.2(4H，m)，3.50(1H，m)，3.58(1H，b)，3.9(6H，s)，4.66(2H，b)，5.28(1H，b)，7.25(2H，d)，7.96(2H，d)。

[0059] 实施例6

[0060] 4-[2-(2-氨基-4-甲氧基-5，6，7，8-四氢-9H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮卓-6-基)-乙基]-苯甲酸(6)

[0061] 1.6mmol(0.57g)化合物(5)加入30ml MeOH，10ml0.5N NaOH，N2保护下回流4h，减压除去大部分溶剂，剩余约5ml，滴加AcOH至pH＝5～6.有淡黄色固体析出，抽滤，水洗，真空干燥得产物0.438g，收率80％。

[0062] 1H NMR(DMSO-d6)δ：1.4～1.9(4H，m)，2.49～2.99(4H，m)，3.29(1H，m)，3.75(3H，s)，5.75(2H，b)，5.88(1H，b)，7.29(2H，d)，7.82(2H，d)。

[0063] 实施例7

[0064] N-{4-[2-(2-氨基-4-甲氧基-5，6，7，8-四氢-9H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮卓-6-基)-乙基]-苯甲酰基}-L-谷氨酸二乙酯(7)

[0065] 1mmol(0.343g) 化 合 物 (6)，5.4mmol(0.6ml，0.548g)N- 甲 基 吗 啉，1.7mmol(0.3g)2-氯-4，6-二甲氧基-l，3，5-三嗪溶于30ml DMF，N2保护下室温搅拌3h，再加入2.7mmol(0.3ml，0.274g)N-甲基吗啉和1.75mmol(420mg)L-谷氨酸二乙酯盐酸盐，反应混和物搅拌过夜。减压除去溶剂，硅胶柱层析(CH2Cl2/MeOH＝50：1)洗脱，得产物0.26g，收率49％，Rf＝0.44(CH2Cl2/MeOH＝15：1)。

[0066] 1H NMR(CDCl3)δ：1.22(3H，t)，1.3(3H，t)，1.67 ～ 2.43(6H，m)，2.48(2H，m)，2.75 ～ 3.2(4H，m)，3.50(1H，m)，4.0(3H，s)，4.10(2H，q)，4.23(2H，q)，4.82(1H，m)，
5.18(2H，b)，5.26(1H，b)，6.05(1H，b)，7.04(1H，t)，7.25(2H，d)，7.74(2H，d)。

[0067] HRMS：m/z(MH+)calcd for C26H37N6O6529.2775，found 529.2792。13C NMR：14.03，27.20，30.43，32.25，35.56，37.79，41.97，52.27，54.14，56.45，60.69，61.61，104.43，
127.33，128.43，131.49，145.68，153.84，154.80，162.14，166.14，166.94，171.99，173.12。

[0068] 实施例8

[0069] N-{4-[2-(2-氨基-4-甲氧基-5，6，7，8-四氢-9H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮卓-6-基)-乙基]-苯甲酰基}-L-谷氨酸(8)

[0070] 0.6mmol(315mg)N-{4-[2-(2-氨基-4-甲氧基-5，6，7，8-四氢-9H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮卓-6-基)-乙基]-苯甲酰基}-L-谷氨酸二乙酯(7)溶于10ml甲醇中，加入3.6ml1N NaOH水溶液，N2保护下室温搅拌2h，减压除去大部分溶剂，滴加AcOH调pH＝
5～6析出固体，抽滤水洗，干燥得产物。

[0071] 1H NMR(DMSO-d6)δ：1.05 ～ 2.11(6H，m)，2.35(2H，t)，2.71(2H，t)，3.21 ～3.51(3H，m)，3.92(3H，s)，4.41(1H，m)，7.71(1H，s)，7.29(1H，d)，7.33(2H，d)，7.44(1H，b)，
7.82(2H，d)，8.52(2H，d)。

[0072] HRMS：m/z(MH+)calcd for C22H29N6O6473.2149，found 473.2112。

[0073] 13CNMR：26.391，30.930，31.641，32.673，35.496，52.461，55.511，57.823，114.522，128.27，128.923，132.102，145.877，153.250，154.623，165.102，167.492，
173.964，174.652。

[0074] 实施例9

[0075] N-{4-[2-(2-氨基-4-羟基-5，6，7，8-四氢-9H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮卓-6-基)-乙基]-苯甲酰基}-L-谷氨酸(9)

[0076] 0.37mmol(196mg)N-{4-[2-(2-氨基-4-甲氧基-5，6，7，8-四氢-9H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮卓-6-基)-乙基]-苯甲酰基}-L-谷氨酸二乙酯(7)溶于20ml无水CHCl3，加入2.97mmol(CH3)3SiI(594mg，0.424ml)，N2保护下40～50℃加热反应20h，减压除去溶剂，用乙醚洗涤得淡黄色固体，所得固体加少量水(2ml)，加入NaOH(1N，2～3ml)，室温搅拌，滤去不溶物，滤液滴加AcOH调pH到5～6，有固体析出，抽滤，水洗，真空干燥。

[0077] 1H NMR δ：1.6～2.11(6H，m)，2.33(2H，t)，2.43(1H，m)，2.67(2H，t)，3.24(1H，m)，3.39(1H，m)，4.40(1H，m)，7.0(1H，b)，7.21(2H，d)，7.79(2H，d)，8.51(2H，d)，8.65(1H，13
b)，8.96(1H，s)，9.24(1H，s)，10.65(1H，s)。 C NMR δ：：26.28，28.19，30.76，32.22，
35.01，36.41，48.39，52.27，65.76，128.07，128.67，132.13，145.36，156.64，167.12，
169.23，172.77，173.73，174.32，175.65。

[0078] 方法B：

[0079] 实施例10

[0080] N-{4-[5-(2-氨基-4-甲氧基-嘧啶-6-基)-氨基-3-氧代-戊基]-苯甲酰基}-L-谷氨酸二乙酯(10)

[0081] 10mmol(4.31g) N-(4-碘代苯甲酰)-谷氨酸二乙酯，2.75mmol(2.32g)NaHCO3，0.5mmol(112m幼醋酸钯，11mmol(3.54g)四丁基溴化铵，2g4A分子筛和9mmol(2.02g)2-氨基-4-甲氧基-6-(3-羟基-4-烯基-1-戊氨基)-嘧啶(2)溶于80ml DMF中，N2保护下搅拌72h，过滤，滤液减压除去溶剂，残留物硅胶柱层析(CH2Cl2/MeOH＝15：1)得微红色胶状物3.211g，产率67％。

[0082] 1H NMR(CDCl3)δ：1.23(3H，t，J＝7Hz)，1.32(3H，t，J＝7Hz)，2.15～2.55(4H，m)，2.73(2H，t，J＝7HZ)，2.81(2H，t，J＝7HZ)，2.96(2H，t，J＝7HZ)，3.54(2H，m)，3.90(3H，s)，4.12(2H，m)，4.24(2H，m)，4.78(1H，m)，4.85(2H，s)，5.07(1H，s)，5.15(1H，t)，7.23(2H，d，J＝8HZ)，7.24(1H，d)， 7.72(2H，d，J＝8Hz)。

[0083] 元素分析(C26H35N5O7)计算值C：58.97％，H：6.16％，N：13.22％；实测值C：58.71％，H：6.53％，N：13.17％。

[0084] 实施例11

[0085] N-{4-[5-(2-氨基-4-甲氧基-5-(4-氯苯偶氮基)-嘧啶-6-基)-氨基-3-氧代-戊基]-苯甲酰基}-L-谷氨酸二乙酯(11)

[0086] 4mmol(510mg)对氯苯胺溶于8ml3N盐酸中，冷却到0℃加入4mmol(276mg)NaNO2，得重氮盐，将所得的重氮盐在0℃滴加到3.75mmol(1.98g)N-{4-[5-(2-氨基-4-甲氧基-嘧啶-6-基)-氨基-3-氧代-戊基]-苯甲酰基}-L-谷氨酸二乙酯(10)的冰醋酸加水(20ml+18ml)及7.2gCH3CO2Na·3H2O的混和溶剂中，然后将反应混合物室温搅拌过夜，抽
1
滤，所得固体产物，用水洗涤，然后真空干燥。得(11)2.21g，收率88％。H NMR(CDCl3)δ：
1.24(3H，t，J＝7HZ)，1.32(3H，t，J＝7HZ)，2.15～2.45(4H，m)，2.79(4H，m)，2.96(2H，t，J＝7.2HZ)，3.95(2H，m)，4.10(3H，m)，4.12(2H，m)，4.24(2H，m)，4.77(1H，m)，5.11(2H，s)，
6.96(1H，d)，7.18(2H，d，J＝7.4HZ)，7.44(2H，d，J＝8HZ)，7.64(2H，d，J＝8HZ)，7.79(2H，d，J＝7.4HZ)。元素分析(C32H38N7O7Cl·0.25H2O)计算值C：57.14％，H：5.77％，N：14.58％；
实测值C：56.94％，H：5.74％，N：14.33％。

[0087] 实施例12

[0088] N-{4-[2-(2-氨基-4-甲氧基-5，6，7，8-四氢-9H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮卓-6-基)-乙基]-苯甲酰基}-L-谷氨酸二乙酯(7)的制备方法二

[0089] 1.5mmol(1.0g)化合物(11)，30mmol(1.96g)Zn粉加入到乙酸(5ml)，水(20ml)和甲醇(20ml)的混和溶剂中，N2保护下回流6h。抽滤，滤液减压除去溶剂，残留物用硅胶柱层析得(7)0.43g，54％。

[0090] 1H NMR显示与前一种方法所得产物一致。

[0091] 实施例13

[0092] N-{4-[2-(2，4-二 氨 基-5，6，7，8- 四 氢-9H- 嘧 啶 并 [4，5-b][1，4]二 氮卓-6-基)-乙基]-苯甲酰基}-L-谷氨酸(12)

[0093] 4mmol N-{4-[2-(2-氨基-4-甲氧基-5，6，7，8-四氢-9H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮卓-6-基)-乙基]-苯甲酰基}-L-谷氨酸，加入5ml浓氨水，室温搅拌30h，减压除去大部分氨，HPLC分离。

[0094] 实施例14

[0095] N-{4-[2-(2-氨基-4-羟基-5，6，7，8-四氢-9H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮卓-6-基)-乙基]-苯甲酰基}-L-谷氨酸二钠盐(13)

[0096] 化合物9(23.0mg，50.2μmol)加入到一烧瓶中，再加入蒸馏水(1.5ml)，1N NaOH溶液(0.1ml)，室温下搅拌反应0.5小时，减压下蒸去溶剂，用水-乙醇重结晶，得到固体(14.2mg，56％)。

[0097] ESI-MS：m/z228.1(Neg)

[0098] 实施例15

[0099] N-{4-[2-(2-氨基-4-甲氧基-5，6，7，8-四氢-9H-嘧啶并[4，5-b][1，4]二氮卓-6-基)-乙基]-苯甲酰基}-L-谷氨酸二二乙胺盐(14)

[0100] 化合物8(33.0mg，70μmol)加入到一烧瓶中，再加入蒸馏水(2ml)，二乙胺盐(11mg，140μl)，室温下搅拌反应0.5小时，减压下蒸去溶剂，用水-甲醇重结晶，得到固体(23.8mg，55％)。

[0101] ESI-MS：m/z 235.2(Neg)。

[0102] 实施例16

[0103] 化合物8，9的抗肿瘤生物活性测试选用了四氮唑盐(microculturetetrozolium，