一种N-乙酰观蓝的纯化工艺及其应用
| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 公开; 实质审查; |
| 专利有效性 | 实质审查 | 当前状态 | 实质审查 |
| 申请号 | CN202410767712.X | 申请日 | 2024-06-14 |
| 公开(公告)号 | CN118772055A | 公开(公告)日 | 2024-10-15 |
| 申请人 | 南京合谷生命生物科技有限公司; | 申请人类型 | 企业 |
| 发明人 | 请求不公布姓名; 请求不公布姓名; 请求不公布姓名; 请求不公布姓名; 请求不公布姓名; 请求不公布姓名; | 第一发明人 | 请求不公布姓名 |
| 权利人 | 南京合谷生命生物科技有限公司 | 权利人类型 | 企业 |
| 当前权利人 | 南京合谷生命生物科技有限公司 | 当前权利人类型 | 企业 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：江苏省 | 城市 | 当前专利权人所在城市：江苏省南京市 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：江苏省南京市南京江北新区探秘路73号树屋十六栋C1-1栋15号楼 | 邮编 | 当前专利权人邮编：210000 |
| 主IPC国际分类 | C07D213/90 | 所有IPC国际分类 | C07D213/90 ; C09B57/00 |
| 专利引用数量 | 0 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 14 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 广州三环专利商标代理有限公司 | 专利代理人 | 宋静娜; |
| 摘要 | 本 发明 涉及 生物 色素的分离纯化技术领域，尤其涉及一种N‑乙酰观蓝的纯化工艺及其应用。本发明所述纯化工艺先将N‑乙酰观蓝 发酵 液调节至酸性，使得N‑乙酰观蓝慢慢集聚形成较大沉降颗粒，以便后续能够有效分离N‑乙酰观蓝与菌 体细胞 ；然后，采用卧螺离心机分离N‑乙酰观蓝和菌体，收集固体沉淀得到N‑乙酰观蓝与少量菌体的混合物；加入 水 重悬后，再加入溶菌酶，将固体沉淀中含有的少量菌体细胞降解成细胞碎片；最后经过二次固液分离去除含菌体细胞碎片的液体，收集N‑乙酰观蓝沉淀，不经水洗直接进行干燥，得到N‑乙酰观蓝纯品。该纯化工艺得到的N‑乙酰观蓝产品收率高，能耗低，工艺中无安全隐患，可以实现工业化生产。 | ||
| 权利要求 | 1.一种N‑乙酰观蓝的纯化工艺，其特征在于，包括如下步骤： |
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| 说明书全文 | 一种N‑乙酰观蓝的纯化工艺及其应用技术领域背景技术[0002] N‑乙酰观蓝是一种天然非水溶性蓝色素，分子量为290，主要用于染料行业。目前染料行业使用的蓝色素主要为靛蓝，靛蓝的生产以化学合成为主，化学合成的靛蓝以苯胺为原料，对人体伤害很大，生产过程对环境的污染很大，而微生物发酵的N‑乙酰观蓝生产过程中对环境的污染很小，成本低，染色工艺比靛蓝简单，上色牢度更好，已经成为合成靛蓝的替代方案。 [0003] 目前，靛蓝的纯化工艺主要为溶剂法(专利CN1081191A)和还原氧化法(专利CN1061069C)，这两种方法难以用于N‑乙酰观蓝的纯化，存在成本高，分离效率低，易污染环境等问题。生物观蓝产品和菌体细胞粒径差距较大，通过沉降法可以分离产品和菌体细胞，生物N‑乙酰观蓝产品颗粒和菌体细胞大小相近，产品和菌体的分离比观蓝难度更高，不能通过常规沉降法直接分离，其他生物行业使用的碟式离心设备、平板离心机、过滤设备难以分离产品和菌体细胞，很难拿出高纯度的N‑乙酰观蓝纯品。 发明内容[0004] 本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供一种N‑乙酰观蓝的纯化工艺，通过调酸沉淀、卧螺离心机连续式沉降离心，以及溶菌酶处理得到收率高的N‑乙酰观蓝。 [0005] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案为： [0006] 第一方面，本发明提供了一种N‑乙酰观蓝的纯化工艺，包括如下步骤： [0007] (1)在N‑乙酰观蓝发酵液中加入酸，调节pH至4.0‑6.0，静置； [0008] (2)以1000‑3000g的离心力离心，收集固体沉淀； [0009] (3)加入水重悬固体沉淀得到混合液，搅拌，调节pH，加入溶菌酶反应，搅拌； [0010] (4)以1000‑3500g的离心力离心，收集沉淀，干燥，得到所述N‑乙酰观蓝。 [0011] 本发明所述纯化工艺先将N‑乙酰观蓝发酵液调节至酸性，使得N‑乙酰观蓝慢慢集聚形成较大沉降颗粒，以便后续能够有效分离N‑乙酰观蓝与菌体细胞；然后，采用卧螺离心机分离N‑乙酰观蓝和菌体，收集固体沉淀得到N‑乙酰观蓝与少量菌体的混合物；加入水重悬后，再加入溶菌酶，将固体沉淀中含有的少量菌体细胞降解成细胞碎片；最后经过二次固液分离去除含菌体细胞碎片的液体，收集N‑乙酰观蓝沉淀，不经水洗直接进行干燥，得到N‑乙酰观蓝纯品。该纯化工艺得到的N‑乙酰观蓝产品收率高，能耗低，工艺中无安全隐患，可以实现工业化生产。 [0012] 优选地，所述步骤(1)中，调节pH至5.0。 [0013] 酸性条件下，N‑乙酰观蓝分子的表面电荷发生变化，在搅拌过程中集聚形成较大颗粒沉淀，N‑乙酰观蓝和菌体形成重量差异，能够与菌体细胞有效分离，在该特定pH下，可达到最佳分离效果。 [0014] 优选地，所述步骤(2)中，离心力为2000g。 [0015] 优选地，所述步骤(2)、(4)中，采用卧螺离心机进行离心。 [0016] 本发明用卧螺离心机代替传统离心机进行固液分离，其特殊的曲线沉降可以更好地分离发酵液中的N‑乙酰观蓝和菌体，处理量大，适合高固含量物料的分离，产品收率高。离心后，N‑乙酰观蓝沉淀连同少量混杂的菌体细胞通过浓相出口排出，清液和大部分菌体细胞通过清液出口排出，便于收集所需的产品沉淀。 [0017] 优选地，所述步骤(3)中，水的添加量为固体沉淀重量的1‑6倍。 [0018] 更优选地，所述步骤(3)中，水的添加量为固体沉淀重量的2倍。 [0019] 优选地，所述步骤(3)中，溶菌酶的添加量为混合液重量的0.05‑0.3％。 [0020] 更优选地，所述步骤(3)中，溶菌酶的添加量为混合液重量的0.05％。 [0021] 本发明的纯化工艺在加入溶菌酶前，先通过调酸沉淀、卧螺离心机连续式沉降离心，可以去除大部分的菌体，剩下的少量菌体细胞混杂在沉淀中，只需要加入少量的溶菌酶便可将菌体破解成细胞碎片，得到产品纯度高的N‑乙酰观蓝产品，大大降低了生产成本和工艺难度。 [0022] 更优选地，所述步骤(3)中，溶菌酶的添加量为混合液重量的0.05％。 [0023] 优选地，所述步骤(3)中，溶菌酶的反应条件满足以下(a)‑(d)中的至少一项： [0024] (a)pH为5.0‑8.5； [0025] (b)反应温度为20‑55℃； [0026] (c)作用时间为0.5‑6h； [0027] (d)酶活力≥200万。 [0028] 更优选地，溶菌酶的反应条件为：pH为6.0，反应温度37℃，作用时间1.5h。 [0029] 优选地，所述步骤(4)中，离心力为3000g。 [0030] 优选地，所述步骤(4)中，干燥温度为50‑100℃。 [0031] 更优选地，所述步骤(4)中，干燥温度为80℃。 [0032] 第二方面，本发明提供了上述的N‑乙酰观蓝的纯化工艺在制备N‑乙酰观蓝纯品中的应用。 [0033] 本发明的有益效果为： [0034] 1、通过将N‑乙酰观蓝发酵液调节至酸性，改变了发酵液中N‑乙酰观蓝分子的表面电荷，使其聚集形成比菌体细胞更大的沉淀颗粒，以便后续能够有效分离N‑乙酰观蓝与菌体细胞。 [0035] 2、相比于目前使用较多的碟式离心机和传统离心机，本发明采用卧螺离心机设备进行连续式沉降离心，其特殊的曲线沉降分离更容易分离N‑乙酰观蓝和菌体细胞，降低了混合液的分离难度；且卧螺离心机的占地面积小，降低了车间使用面积。在实际生产中，通过提高卧螺离心机转鼓直径可以成倍地提高生产处理量，可以实现工业化生产。 [0036] 3、相比于直接加入溶菌酶对发酵液进行处理，本发明的纯化工艺在加入溶菌酶前，先通过调酸沉淀、卧螺离心机连续式沉降离心，可以去除大部分的菌体，剩下的少量菌体细胞混杂在沉淀中，只需要加入少量的溶菌酶便可将菌体破解成细胞碎片，得到产品纯度高的N‑乙酰观蓝产品，大大降低了生产成本和工艺难度。附图说明 [0037] 图1为实施例1中纯化得到的观蓝纯品的高效液相色谱示意图。 [0038] 图2为实施例1中纯化得到的观蓝纯品的质谱示意图。 [0039] 图3为实施例1中纯化得到的观蓝纯品的红外谱图。 [0040] 图4为实施例1‑16、对比例1‑2得到的产品干粉。 [0041] 图5为实施例1‑16、对比例1‑2工艺优化过程中产品纯度和收率情况。 具体实施方式[0042] 为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。 [0043] 本发明所用的溶菌酶购自宁夏夏盛实业集团有限公司，酶活力≥200万。 [0044] 实施例1： [0045] 本发明所述N‑乙酰观蓝的纯化工艺的一种实施例；所述N‑乙酰观蓝的纯化工艺包括如下步骤： [0048] (3)在100L发酵罐中加入35.7kg(添加量2倍)水，投入固体沉淀，重悬，开启搅拌，用30％碱液调节pH至6.0，加入26.8g(添加量0.05％)溶菌酶，升温至37℃，保温搅拌1.5h； [0049] (4)启动卧螺离心机，调节离心力至3000g，通过隔膜泵将混合液打入卧螺离心机，收集沉淀，在80℃下干燥至粉体，得到所述N‑乙酰观蓝。 [0050] 实施例2： [0051] 本发明所述N‑乙酰观蓝的纯化工艺的一种实施例；所述N‑乙酰观蓝的纯化工艺包括如下步骤： [0052] (1)将1210L的N‑乙酰观蓝发酵液(N‑乙酰观蓝的浓度为25.3g/L)置于2m3的发酵罐中，加入稀硫酸，调节pH至5.0，停止搅拌静置1h； [0053] (2)开启卧螺离心机，调节离心力至2000g，开启2m3发酵罐搅拌，通过隔膜泵将N‑乙酰观蓝发酵液打入卧螺离心机，进行固液分离，收集固体沉淀(共74.3kg)； [0054] (3)在500L发酵罐中加入148.6kg水(添加量2倍)，投入固体沉淀，重悬，开启搅拌，用30％碱液调节pH至6.0，加入111.4g(添加量0.05％)溶菌酶，升温至37℃，保温搅拌1.5h； [0055] (4)启动卧螺离心机，调节离心力至3000g，通过隔膜泵将混合液打入卧螺离心机，收集沉淀，在80℃下干燥至粉体，得到所述N‑乙酰观蓝。 [0056] 实施例3： [0057] 本发明所述N‑乙酰观蓝的纯化工艺的一种实施例；所述N‑乙酰观蓝的纯化工艺与实施例1的区别为：所述步骤(1)中，将pH调节至4.0，其余步骤与实施例1相同。 [0058] 实施例4： [0059] 本发明所述N‑乙酰观蓝的纯化工艺的一种实施例；所述N‑乙酰观蓝的纯化工艺与实施例1的区别为：所述步骤(1)中，将pH调节至6.0，其余步骤与实施例1相同。 [0060] 实施例5： [0061] 本发明所述N‑乙酰观蓝的纯化工艺的一种实施例；所述N‑乙酰观蓝的纯化工艺与实施例1的区别为：所述步骤(2)中，离心力为1000g，其余步骤与实施例1相同。 [0062] 实施例6： [0063] 本发明所述N‑乙酰观蓝的纯化工艺的一种实施例；所述N‑乙酰观蓝的纯化工艺与实施例1的区别为：所述步骤(2)中，离心力为3000g，其余步骤与实施例1相同。 [0064] 实施例7： [0065] 本发明所述N‑乙酰观蓝的纯化工艺的一种实施例；所述N‑乙酰观蓝的纯化工艺与实施例1的区别为：所述步骤(3)中，水的添加量为固体沉淀重量的1倍，其余步骤与实施例1相同。 [0066] 实施例8： [0067] 本发明所述N‑乙酰观蓝的纯化工艺的一种实施例；所述N‑乙酰观蓝的纯化工艺与实施例1的区别为：所述步骤(3)中，水的添加量为固体沉淀重量的2.8倍，其余步骤与实施例1相同。 [0068] 实施例9： [0069] 本发明所述N‑乙酰观蓝的纯化工艺的一种实施例；所述N‑乙酰观蓝的纯化工艺与实施例1的区别为：所述步骤(3)中，温度调节至20℃，其余步骤与实施例1相同。 [0070] 实施例10： [0071] 本发明所述N‑乙酰观蓝的纯化工艺的一种实施例；所述N‑乙酰观蓝的纯化工艺与实施例1的区别为：所述步骤(3)中，温度调节至50℃，其余步骤与实施例1相同。 [0072] 实施例11： [0073] 本发明所述N‑乙酰观蓝的纯化工艺的一种实施例；所述N‑乙酰观蓝的纯化工艺与实施例1的区别为：所述步骤(3)中，pH调节至5.0，其余步骤与实施例1相同。 [0074] 实施例12： [0075] 本发明所述N‑乙酰观蓝的纯化工艺的一种实施例；所述N‑乙酰观蓝的纯化工艺与实施例1的区别为：所述步骤(3)中，pH调节至7.5，其余步骤与实施例1相同。 [0076] 实施例13： [0077] 本发明所述N‑乙酰观蓝的纯化工艺的一种实施例；所述N‑乙酰观蓝的纯化工艺与实施例1的区别为：所述步骤(3)中，保温搅拌时间为1h，其余步骤与实施例1相同。 [0078] 实施例14： [0079] 本发明所述N‑乙酰观蓝的纯化工艺的一种实施例；所述N‑乙酰观蓝的纯化工艺与实施例1的区别为：所述步骤(4)中，离心力为2500g，其余步骤与实施例1相同。 [0080] 实施例15： [0081] 本发明所述N‑乙酰观蓝的纯化工艺的一种实施例；所述N‑乙酰观蓝的纯化工艺包括如下步骤： [0082] (1)将300L的N‑乙酰观蓝发酵液(N‑乙酰观蓝的浓度为24.6g/L)置于500L的发酵罐中，加入稀硫酸，调节pH至5.0，停止搅拌静置1h； [0083] (2)开启卧螺离心机，调节离心力至2500g，开启500L发酵罐搅拌，通过隔膜泵将N‑乙酰观蓝发酵液打入卧螺离心机，进行固液分离，收集固体沉淀(共20.5kg)； [0084] (3)在300L发酵罐中加入123kg(添加量6倍)水，投入固体沉淀，重悬，开启搅拌，用30％碱液调节pH至8.5，加入430.5g(添加量0.3％)溶菌酶，升温至55℃，保温搅拌0.5h； [0085] (4)启动卧螺离心机，调节离心力至1000g，通过隔膜泵将混合液打入卧螺离心机，收集沉淀，在80℃下干燥至粉体，得到所述N‑乙酰观蓝。 [0086] 实施例16： [0087] 本发明所述N‑乙酰观蓝的纯化工艺的一种实施例；所述N‑乙酰观蓝的纯化工艺包括如下步骤： [0088] (1)将300L的N‑乙酰观蓝发酵液(N‑乙酰观蓝的浓度为24.6g/L)置于500L的发酵罐中，加入稀硫酸，调节pH至5.0，停止搅拌静置1h； [0089] (2)开启卧螺离心机，调节离心力至2000g，开启500L发酵罐搅拌，通过隔膜泵将N‑乙酰观蓝发酵液打入卧螺离心机，进行固液分离，收集固体沉淀(共17.86kg)； [0090] (3)在100L发酵罐中加入35.7kg(添加量2倍)水，投入固体沉淀，重悬，开启搅拌，用30％碱液调节pH至6.0，加入26.8g(添加量0.05％)溶菌酶，升温至37℃，保温搅拌6h； [0091] (4)启动卧螺离心机，调节离心力至3500g，通过隔膜泵将混合液打入卧螺离心机，收集沉淀，在80℃下干燥至粉体，得到所述N‑乙酰观蓝。 [0092] 对比例1： [0093] 本发明所述N‑乙酰观蓝的纯化工艺的一种对比例；所述N‑乙酰观蓝的纯化工艺包括如下步骤： [0094] (1)将300L的N‑乙酰观蓝发酵液(N‑乙酰观蓝的浓度为24.6g/L)置于500L的发酵罐中，不调节发酵液的pH，静置1h； [0095] (2)开启卧螺离心机，调节离心力至2000g，开启500L发酵罐搅拌，通过隔膜泵将N‑乙酰观蓝发酵液打入卧螺离心机，进行固液分离，收集固体沉淀(共12.7kg)； [0096] (3)在100L发酵罐中加入25.4kg(添加量2倍)水，投入固体沉淀，重悬，开启搅拌，用30％碱液调节pH至6.0，加入19g(添加量0.05％)溶菌酶，升温至37℃，保温搅拌1.5h； [0097] (4)启动卧螺离心机，调节离心力至3000g，通过隔膜泵将混合液打入卧螺离心机，收集沉淀，在80℃下干燥至粉体，得到所述N‑乙酰观蓝。 [0098] 对比例2： [0099] 本发明所述N‑乙酰观蓝的纯化工艺的一种对比例；所述N‑乙酰观蓝的纯化工艺与实施例1的区别为：所述步骤(2)中，离心力为3500g，其余步骤与实施例1相同。 [0100] 测试例1： [0101] 对实施例1得到的N‑乙酰观蓝产品采用高效液相色谱、质谱、红外谱分析鉴定。结果如图1‑3所示。 [0102] 测试例2： [0103] 材料：实施例1‑16、对比例1‑2得到的N‑乙酰观蓝产品(图4)。 [0104] 对产品干燥后的重量、纯度、收率进行计算，为便于比较，干燥重量为每100L发酵液纯化得到的产品(干粉)重量，单位：kg/100L；产品纯度通过高效液相色谱进行检测，产品收率通过下式进行计算： [0105] 产品收率＝干燥产品重量/(发酵液中含有的N‑乙酰观蓝浓度×发酵液体积)计算结果如表1、图5所示。 [0106] 表1 [0107] [0108] [0109] 通过实施例1‑16、对比例1‑2的不同纯化参数得到的N‑乙酰观蓝产品检测对比发现，实施例1‑16的纯化参数在本发明的范围内，可纯化出纯度和收率较高的产品。其中，实施例1的纯化工艺为最佳工艺，可以在纯度和收率同时达到最佳结果。实施例2是实施例1的工艺放大，同样具有较好的纯化效果。对比例1的纯化过程发酵液未经过pH的调节，无法有效分离N‑乙酰观蓝与菌体细胞，因此纯度较低。对比例2的的纯化过程中，第一次离心的离心力太高(超出了本发明的范围)，使得N‑乙酰观蓝和菌体杂质都被离心下来，菌体量太大，加入的溶菌酶几乎没有作用；重悬后产品浓度高，较难分离N‑乙酰观蓝与菌体细胞，导致纯化得到的产品杂质太高，纯度低。 [0110] 最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。 |
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