本发明是关于有抗真菌活性的新化合物，制备方法及用途。更确切地说， 本发明公开了分子式（1)的化合物，含有它的药用组合物，利用微生物发酵制 备此化合物的方法，以及使用的新的微生物，和化合物及其药用组合物在制备 治疗和/或预防抗真菌药物中的用途。
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1950年以后，与抗生素相关的研究快速发展并广泛普及，开发出了对于各 种感染性疾病的许多治疗药物。另一方面，近年来出现了由念珠菌'曲霉，隐 球菌等真菌引发的深部真菌的增加和严重化的现象，这些现象和白血病，恶性 淋巴肿，HIV感染引起的免疫不全，抗癌药物引起的免疫能力低下以及抗生素大量使用引起的菌的变异现象关系密切。
现在，深部真菌的治疗中，常使用多烯大环内酯类，唑类，氟胞嘧啶类药 物，例如多烯类大环内酯类药物的一种两性霉素B，其抗真菌活性强，有很好的
治疗效果。但因为其肾毒性等副作用，被指出存在安全性的问题（Gallis等，Rev. Infect.Dis. Voll2,p309〜329， 1990 )，氟胞嘧啶类药物也存在安全性低和存在耐 药菌等方面的问题。
另一方面，唑类药物被认为安全范围广泛，副作用低，但有抗菌谱窄的问 题，因此对严重的病症的有效性低，而且被认为耐药性在增加。（Rex ，:, Antimicrob. Agents Chemother Vol 39, pl~8， 1995)
而且，近年来MicafUngin和Caspofungin等环肽类药物（Denning, Lancet Vol 362, 9330 pll42~1151,2003)被开发，用于深部真菌感染的治疗。
因为有上述的现状，应对病因的变化、安全性的确保、耐药菌的增加，希 望能开发新的抗真菌药物。 发明内容
本发明的主要目的是提供一种新化合物；
本发明的另一 目的是提供一种制备该抗真菌化合物的方法；
本发明更进一步的目的是提供一种具有抗真菌活性的新的药物组合物。
本发明的发明人，从微生物代谢产物的筛选新抗真菌药物的过程中，发现 属于牵连青霉（尸em'"7/ww /m/^ca似m)的真菌培养物中存在抗真菌活性的化合
物，接着为了确定培养物中活性物质，将培养物分离纯化并对化合物进行结构 解析，发现了分子式（O新化合物具有抗真菌活性，并在此基础上完成丫本发formula see original document page 5明。
本发明提供了具有抗真菌活性的分子式（1)的新化合物，而且木发明提供 丫对属于青霉属的菌种的培养，从它的代谢产物中得到式（1)表示的化合物的 提取过程，提供了式（1)表示化合物的制备方法。
本发明提供了：
1. 如分子式（1)表示的化合物及其可药用的盐；(1)
2. 制备上述化合物的方法，包括培养一种能够产式（1)化合物的青霉菌属微 生.物，和从培养物中提取纯化该化合物的方法；
3. 产生化合物（1)的青霉菌属微生物，牵连青霉（/^mW///ww /wp//ca/"w) NCC00646 CGMCC 1079。
4. 一种药物组合物，含有式（1)化合物作为活性成分及药用载体。
5. 上述药物组合物，可用于治疗和/或预防真菌感染。
本发明分子式（1)表示的化合物，具有很好的抗真菌活性作为真菌感染疾
病的治疗和/或预防药物，十分具有应用前景。
本发明的上述分子式（1)表示的新化合物（以下略称为化合物（l))有下
记的物理化学性状。 (1)颜色和外观：无色粉末(2) 分子式：C49H79N7016
(3) 质谱：（HRFAB-MS)
测量值：w/z 1022.5658 [M+H]+ 理论值：w/z 1022.5662 [C49H80N7O16]+
(4) 相对旋光度：[a]D=-36,2° (c0.8，MeOH，25。C)
(5) 紫外吸收波谱-
入讓，nm (El%lcm): 223 (sh, 108), 27^ (15), 283 (sh, 13) / MeOH
245 (92)， 291 (16) / 0.01N KOH+MeOH
(6) 红外吸收波谱：(KBr)
v醒，cm": 3360， 2928， 2855， 1628， 1520， 1456, 1232
(7) 核磁共振波谱(CDCl3， 400MHz)
S (ppm): 0.85 (3H， d), 0.87 (3H， t)， 1.04 (3H, d), 1.20 (6H， d), 1.25〜1.35 (19H， m)， 1.58 (2H， m), 1.90 (1H， m)， 2.05 (1H， m)， 2.08 (IH， m)， 2.21 (2H, t)， 2.41 (1H, m), 2.51 (1H, m)， 3.37 (1H, dd), 3.78 (1H， dd), 3.85 (1H, dd)， 3.91 (1H， m), 3.96 (1H， dd)， 4.14 (1H， m)， 4.17 (1H， dd), 4.21 (1H, dd)， 4.29 (1H， d)， 4.30 (IH， d)， 4.32 (IH， d)， 4.38 (1H, dd)， 4,50 (1H， dd)， 4.54 (IH， m)， 4.57 (1H， dd)， 4.83 (1H, d), 4.94 (IH， d), 5,22 (1H， d), 6.74 (2H， dd), 7.13 (2H， dd)
(8) '3C核磁共振波谱(CDCl3, 100MHz)
S (ppm): 11.2， 11.7, 19.6 (X2)， 20.0， 27.0， 28.2, 30.3, 30.5， 30.5， 30.5, 30.6， 30.7， 30.8， 35.0, 35.7， 36.8， 37.7， 38.5， 39,0， 51.6, 52.9， 56.3, 56.8， 57.】，58.5， 62.4， 68.3， 69.5， 69.7， 70.8, 71.2， 74.5, 75.5， 75.7， 76.9, 116.1 (X2)， 129.5 (X2), 133.0， 158.4， 169.9， 172.5 (X2)， 172.7， 173.5， 174.3, 176.2
(9) 溶解性：溶于甲醇，氯仿，乙酸乙酯和二甲基亚砜；不溶于正己烷和水。 和化合物(1)类似的化合物有棘白霉素B (echinocandin B) (sandoz等，
Tetrahedron letters Vol 46， p4147~4150， 1976)和Mulundocandin(Roy等，丄 Antibiotics Vol 40, P275-289, 1987)。但本发明的化合物（O和已知化合物物理 化学性状不同，能够明显区别。化合物（1)的可药用盐，可以举例为钠，钾，锂等碱金属或钙等碱土金属
±卜
rrft- o
上述化合物（1)能够使用产生该化合物的青霉属真菌培养，从培养物中提 取该化合物。作为产生化合物（1)的青霉属真菌，只要能产生化合物（1)并 不受限制。例如牵连青霉（尸^^'肌^^>^/^0^/«)真菌NCC00646.
化合物（1)的产生菌NCC00646从中国云南西双版纳（xishuangbanna) 的土壤中分离得到。
NCC00646的菌株在Czapek，s琼脂培养基，potato dextrose琼脂培养基中， 26°C。菌落为青绿色到深绿色，绒状，形成菌丝索，菌丝层致密。没有可溶色 素形成，背面为褐色。
分生孢子有基质形成，直径2〜2.5"m，长100"m。该青霉为单轮生或两 个梗基形成的复轮生，小梗8〜12个密集，9〜12X2〜2.5ym，分生孢子球形或近 球形，2.5〜3um，略粗糙。
从以上的菌学特征可以认为NCC00646属于真菌的牵连青霉（/^w/a7/Z"m z'wp//cfl?ww)。
菌株NCC00646于2003年12月18日被保藏在中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心(CGMCC)中，保藏号：CGMCCNo.1079。
本发明中化合物（1)的产生菌可以使用NCC00646由来的突变体（既可以
自然发生也可为诱变），质体融合或基因重组的突变株。NCC00646菌株和突变
株，可以由自然界生存的突变株，也可以为人工变异的突变株。
培养化合物（1)的产生菌，可以利用含有通常的微生物的营养源的培养基。 营养源，可以利用公知的真菌培养基。例如，用作碳源可以是葡萄糖、蔗
糖、糖蜜、糊精、淀粉、甘油，动物油和植物油。用作氮源常常是大豆粉、麦
芽汁、棉子，玉米浆、蛋白胨、牛肉膏、干酪素、酵母膏，尿素，以及硫酸铵
和硝酸铵等铵盐。加入一些无机盐也很有效，如钠、钾、钙、锰、钴、铜盐，以及氯化物、磷酸盐和硫酸盐。另外，加入一些有利于真菌生长的有机物和无 机物也有利于真菌的生长。
可以在需氧条件下，采用静止培养法或者振荡培养法培养化合物（1)的产 生菌，静置培养，振荡培养或罐培养均可，其中采用静置培养更有利。培养温 度和时间在化合物（1)产生菌生长的状况下不受限制，可以根据培养基不同设
定。适宜的培养温度为2(TC〜3(TC， 26。C附近最佳。培养周期一般在2〜21天 内的产量达到最大。培养结束后，化合物（1)达到最高量时停止培养，提取化 合物（1)。 '
从发酵液中提取的化合物(l)，根据其性状，可以利用通常的分离手段。分 离'手段可以举例为溶媒提取，吸附洗脱，各种树脂层析及沉淀法等。这些手段 的组合使用效果更好。
具体说，从NCC00646培养物中提取目标产物，可以先用67%的丙酮水溶 液从菌株目的物的发酵液中抽提，蒸发除去粗提液中的丙酮，然后用乙酸乙酯 抽提。乙酸乙酯的抽提物用硅胶柱层析和凝胶过滤层析提纯，最后用TLC或者 HPLC纯化得到化合物（1)。
化合物（1)和其可药用盐，具有抗真菌活性，其中任何一种含有有效成分 的药物组合物，对包含人在内的动物给药后，效果明显。具体来讲，对真菌感 染症的治疗和/或预防有效，可以作为抗真菌药物。
作为经口服给药的制剂，可以做成片剂、丸剂、胶囊剂、散剂，口服剂， 颗粒剂、粉剂、悬浊剂，糖浆，舌下剂等。作为非经口给药的制剂，可以做成 针剂、皮肤吸收剂、吸入剂、栓剂等。本发明的药物组合物的配方中可以加入 一些可以接受的药物添加剂，如表面活性剂、赋形剂、稳定剂、润湿剂、崩解 剂、增溶剂、等渗剂、缓冲剂、着色剂、芳香剂等。
药用载体可以使用制药行业中允许使用的载体，它的种类和组成可根据给 药途径和方法而定。例如，液体载体可以为水，醇，大豆油，芝麻油等，固体 载体可以为麦芽糖，蔗糖等糖类，赖氨酸等氨基酸，羟丙基纤维素等纤维素衍
9生物，环糊精等多糖，硬脂酸镁等有机酸盐。以注射剂形式的制剂，液体载体 一般为生理盐水，各种缓冲液，葡萄糖等糖类溶液等。
本发明中化合物（1)和它的盐作为药物组合物给药时，给药剂量因病人的 年龄和体重，疾病特性和严重性，以及给药途径而异，可以参考动物实验的结 果和具体情况，总给药量不能超过一定范围。具体讲，对成人的口服剂量是1〜
1,000mg/kg/天，静脉注射的剂量是0.1〜100mg/kg/天。 附图说明
附图h化合物NCC00646的紫外图谱
附图2:化合物NCC00646的红外图谱
附图3:化合物NCC00646的核磁图谱（谱）
附图4:化合物NCC00646的核磁图谱（。C谱）

以下为本发明的实施例，并不是对本发明的限定，也包括这里没有显示的
改变的方法和修饰手段。
实施例1化合物NCC00646的制备 (1)菌株NCC00646的培养
将牵连青霉菌（尸抓'a7/i'圃/wp/!'c^訓）的单孢子在新鲜的麦芽膏琼脂
(MEA)斜面培养24。C， 5天。培养好的斜面制成含0.01%吐温80的10毫升 的孢子悬液。0.5毫升孢子悬液在含有麦芽膏琼脂（MEA)的平皿'中涂匀，培养 5天后，用无菌环刮取平皿上的孢子，悬浮于无菌蒸馏水中，接种到含有15公 斤麦麸的生物反应器中培养7天。培养容器（不锈钢制）200X80X17cm
(2)化合物NCC00646的提取纯化
上述培养物的一部分（2kg)，先用2L67。/。的丙酮水溶液抽提，获得粗提 液。过滤并蒸出丙酮，然后用1.5L乙酸乙酯抽提。乙酸乙酯抽提物蒸发后得到 6.8g粗提物。粗提物用100ml甲醇溶解，加入20 g硅胶（WAKOGEL C-300， Wako Pure Chemical Industries)减压干燥，将吸附有粗提物的硅胶加到装有30g硅胶的层析柱上，然后用氯仿：甲醇=99: Kl00ml)，氯仿：甲醇二97:3(500m】）， 氯仿：甲醇=90: 10(300ml)等的溶剂顺序洗脱。在甲醇：氯仿=50: 50(500ml) 部分，活性成分被洗脱出，减压干燥后得到426mg的干燥固体。
干燥固体用甲醇溶解后，进行Sephadex LH-20凝胶过滤柱层析（Pharmacia, 5cmi.d,X90cm)，并用甲醇洗脱。洗脱量为600〜650ml部分的组份干燥后得到 79mg固体。接着，这些固体用甲醇溶解，使用HPLC色谱柱（Cosmosil AR-1I内径2cm X25cm Nacalai Tesque)进行制备，流动相为乙腈：蒸馏水=40: 30。流动相的流速为10ml/min， 13.5分钟洗脱出的成分，减压浓缩，得到化合 物（1) 6.2mg。
实施例2:化合物NCC00646的抗真菌活性测定
实施例2中得到的化合物（1)的抗真菌活性，采用液体浓度稀释法测定对 真菌菌株的最小抑菌浓度。真菌用YNBP培养基培养（含有缓冲剂的酵母氮基 础，含0.5%的葡萄糖，采用DIFCO方法产生），28。C培养48小时。结果如表1。
表l.化合物（1)的抗真菌活性
测试菌株 具有抑制活性的最小浓度（Mg/ml)
Cam/iWa a/6!'ca?w TIMM1768 0.2
表1显示，本发明的化合物（1)有很好的抗真菌活性。
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